CN102251014A - 一种细胞凋亡检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞凋亡检测试剂盒。本发明通过克隆293细胞的Annexin V基因，实现了Human Annexin V基因在原核细胞中高表达。在此基础上，将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)接入读码框，获得了Annexin V-EGFP融合蛋白。以Annexin V-EGFP融合蛋白为检测蛋白的细胞凋亡检测试剂盒，可检测细胞早期凋亡。与进口的凋亡检测试剂盒相比，具有高效、低成本、使用方便的优点。

Description

一种细胞凋亡检测试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医用检测试剂技术领域，是一种用于检测细胞凋亡的试剂试剂盒。

背景技术

细胞凋亡(Apoptosis)又称为细胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)是细胞在感受到细胞内外部环境刺激信号时发生的自主性、受调控的细胞死亡。在胚胎发育、免疫细胞调控、病原微生物感染以及癌症生发、心血管衰老等生理过程中扮演重要的生理功能。细胞凋亡概念是1972年由Kerr等三位科学家正式提出，在过去三十多年里一直是生命科学研究的一个热点前沿。细胞受到凋亡刺激信号时，胞内一系列凋亡相关调控基因表达，启动或者抑制凋亡的进程，其中既有Bc1-2家族、Caspase家族蛋白的正调控，也有XIAP等蛋白的负调控，因此是一个严格的受调控生理过程，与细胞死亡等被动过程区分明显。凋亡发生后，会发生多种形态变化以及生物化学变化。形态变化主要有：细胞皱缩，细胞质密度增加，线粒体通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，形成凋亡小体。生物化学变化主要有：染色体断裂，不同凋亡调控蛋白的表达与降解。

在细胞凋亡的研究过程中，产生了多种研究凋亡的手段。主要形态学观察、生化免疫检测以及分子生物学检测。其中针对染色体断裂和细胞膜皱缩外翻的检测已经有成套的试剂盒(Detecting Kit)出售。前者称为TUNEL方法，主要利用染色体断裂后3’端增多，可以用末端转移酶(TdT)进行标记，后者称为Annexin V方法，主要使用化学荧光标记的Annexin V可以结合细胞膜外翻后暴露的磷脂分子。

Annexin V是一类保守性较高的依赖钙的磷脂结合蛋白，具体生理功能仍不清楚，早期研究曾发现它是一种有较强的抗凝血功能的血管蛋白。现在已经知道，Annexin V在多种细胞内均有表达。人的Annexin V蛋白分子量约为35.5kDa，此前已经证实可以在原核大肠杆菌中表达，纯化后使用FITC、Cy3/5等荧光分子标记后即可用作凋亡检测。带有化学标记荧光的Annexin V是细胞凋亡检测的重要手段之一，由于化学荧光分子易于发生光淬灭并且荧光标记Annexin V时可能造成Annexin V结合磷脂分子能力下降，同时需要一定的操作经验，所以要制备化学荧光标记的Annexin V对一般的实验室较为困难。而且，通常购买进口的成套Kit使用，价格昂贵。因此需要一种更稳定、更易制备的融合荧光蛋白来代替化学荧光标记的Annexin V用于凋亡检测。

目前已上市的Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒的组分除了AnnexinV-EGFP，还包含碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。但是，当前进口的100次该凋亡检测试剂盒需要1900元左右，对于实验室使用来说，成本不低。

专利申请02155024.7公开了一种用于检测细胞凋亡的试剂盒。现有的Annexin V检测试剂盒为进口产品，检测用蛋白为Annexin V，价格昂贵。该发明试剂盒检测用蛋白为Annexin B1，Annexin B1与Annexin V同属膜联蛋白家族，但Annexin B1在大肠杆菌中表达量高，且为可溶性表达，故生产工艺简单，生产成本低廉，且该发明试剂盒同样具有检测细胞量多、敏感性高和快捷等优点。

专利申请200910148569.1公开了一种新型细胞凋亡检测试剂及相关试剂盒的研制。基于现代生物工程技术，将谷胱甘肽硫转移酶(GST)与人膜联蛋白V(ANNEXIN V)偶联起来形成一种新型重组融合蛋白GPPAN-V(其蛋白质一级结构示意图如附图1所示)。含有GPPAN-V重组基因表达载体的大肠杆菌宿主菌诱导后的高效表达产物GPPAN-V重组融合蛋白质以可溶形式存在，通过亲和层析纯化即可制备出具有较高纯度的GPPAN-V重组融合蛋白质。GPPAN-V重组融合蛋白质与荧光素异硫氰酸酯(FITC)进行化学偶联后形成可用于细胞凋亡检测的新型细胞凋亡检测试剂FITC-GPPAN-V。以FITC-GPPAN-V为核心形成的新型细胞凋亡检测试剂盒，具有经济、灵敏、高效的优点。

专利申请02120427.6公开了一种基于绿色荧光蛋白检测细胞凋亡的方法。提供一种荧光蛋白构建体来用于检测在细胞凋亡中蛋白酶或半胱天冬酶的激活。该构建体含有一个供体荧光蛋白；一个受体荧光蛋白；以及一个连接头肽，其中的连接头肽含有半胱天冬酶的底物序列。连接头肽位于供体和受体蛋白之间。本发明还提供了该编码荧光蛋白构建物的核酸，含有该核酸的表达构建体以及含有这些核酸的基因传递载体。所述方法通过在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养含有上述核酸和/或蛋白的宿主细胞的样本并检测样本中的荧光特性，其中细胞程序性死亡在样本细胞中的存在导致供体蛋白和受体蛋白之间的荧光共振能量转移的程度的变化。

本发明通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)接入Annexin V读码框的方法，得到的Annexin V-EGFP融合蛋白具有Annexin V-FITC一样的效果，且无需专门的化学标记操作。特别的是，本发明实现了融合蛋白在大肠杆菌中高可溶表达以及一步纯化，将大大降低对进口凋亡检测试剂盒的需求，具有市场应用前景。

发明内容

本发明提供一种细胞凋亡检测试剂盒。试剂由增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Annexin V融合蛋白和结合缓冲液组成。与上述Annexin V检测试剂盒主要不同之处在于检测用蛋白的不同。本发明通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)接入Annexin V读码框的方法，得到Annexin V-EGFP融合蛋白。

本发明还提供一种细胞凋亡检测试剂盒的制备方法，包括构建表达载体，融合蛋白Annexin V-EGFP的表达与纯化，细胞凋亡的诱导与检测。其中，所述的表达载体为pET-28a-HAV-EGFP。制备菌为大肠杆菌。

本发明还提供了所述Annexin V-EGFP融合蛋白作为检测蛋白的细胞凋亡试剂盒在识别早期凋亡细胞中的应用。

Annexin V-EGFP作为检测用蛋白，具有Annexin V-FITC一样的效果，且无需专门的化学标记操作。特别的是，本发明成功实现了融合蛋白在大肠杆菌中高可溶表达以及一步纯化，将大大降低对进口凋亡检测试剂盒的需求，具有市场应用前景。

附图说明

图1表示使用Trizol RNA抽提试剂盒从293细胞中制备的总RNA电泳图

(使用的分子量标准为DL2000，大小见右侧标注)。

图2表示Human Annexin V基因的PCR扩增产物Agarose电泳图。

图3表示pET-28a-HAV质粒在大肠杆菌中的表达情况SDS-PAGE电泳图。

图4表示pET-28a-HAV-EGFP载体的构建示意图。

图5表示Annexin V-EGFP融合蛋白的表达与纯化电泳图。

图6表示使用Annexin V-EGFP对早期凋亡细胞进行染色观察。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

1材料与仪器

1.1主要材料

胎牛血清、DMEM培养基、青链霉素双抗、胰酶、PBS缓冲液、Trizol RNA抽提试剂盒、cDNA反转录试剂盒购自美国Invitrgen公司；293细胞株购自美国ATCC；KOD酶购自日本Toyobo公司；oligo-dT以及特异性引物由上海生工生物公司合成；NcoI、BamHi、XhoI、连接酶为Fermentus公司产品；酵母膏、蛋白胨为Oxide公司产品；His-tag蛋白纯化试剂盒为上海悦克生物技术公司产品；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒为美国BD公司产品；试剂用水为Millpore水机制备的超纯水；细胞培养耗材、PCR管、移液器吸头为Axygen公司产品；其它常规生化试剂及耗材均为国产。

1.2主要仪器

CO2培养箱(美国Thermo)，台式冷冻离心机、梯度PCR仪(德国Ependorf)，凝胶电泳系统、凝胶成像仪(上海天能)，控温摇床(海门其林贝尔)，冷冻离心机(美国Beckman)，荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS IX51)，SDS-PAGE电泳系统(美国Biorad)，流式细胞仪(美国BD)，其他小型仪器均为国产。

2实验方法

2.1细胞培养

293细胞购自美国ATCC，选用DMEM作为培养液。细胞复苏后，分散在6cm细胞培养皿中培养。培养条件为：DMEM培养液(补充10％胎牛血清，100U青链霉素双抗)，在37℃，5％CO2条件下培养。

2.2RNA抽提

分盘的293细胞培养24小时以后，细胞密度达到80％底面面积，移去培养液使用PBS洗涤一次后，胰酶消化1分钟，用移液器将细胞从培养皿上吹下。3000g，4℃冷冻离心5分钟，吸取上清及残液。按照每一个6厘米培养皿的细胞量加入1ml的量进行Trizol裂解，混合均匀后室温高速震荡10分钟加入200ul氯仿，震荡混匀后离心5分钟，转移上清至新的离心管中加入500ul异丙醇沉淀RNA。70％乙醇洗涤两次后，放置晾干，加入DEPC水55℃，震荡30分钟充分溶解。吸取2ul，进行琼脂糖电泳检测带型以及吸光度定量。

2.3cDNA合成及PCR扩增

按照逆转录试剂盒使用说明书，配制逆转录反应体系，25ul溶液中含有1ug RNA，加入oligo-dT后高温变性30分钟，放置冰上。加入逆转录酶后，42℃反应30分钟后，终止反应。反应产物用作下一步PCR扩增的模板。

按照KOD酶的使用说明，配制50ul PCR扩增体系，使用人Annexin V基因两端特异性互补序列为引物，分别使用1ul，2ul，5ul RT产物为模板，扩增Annexin V基因目的片段。Agarose电泳鉴定条带大小后，切胶，使用胶回收试剂盒回收目的片段。

使用质粒小抽试剂盒从含有pEGFP-C1质粒的DH5a菌种中抽提pEGFP-C1质粒，定量后稀释成50ng/ul用作模板，使用EGFP特异性互补序列做引物，扩增EGFP基因。引物序列如下：

Human Annexin V引物序列(5’→3’)：

HAV-NcoI+：TCGCCATGGCACAGGTTCTCAGAGGCAC

HAV-BamHI-：ATCGGATCCGTCATCTTCTCCACAGAGCAGCAG

EGFP引物序列(5’→3’)：

EGFP-BamHI+：CGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG

EGFP-XhoI-：ACTCGAGGCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA

2.4pET-28a-HAV-EGFP表达载体的构建

使用胶回收试剂盒回收Human Annexin V的扩增片段，使用NcoI，BamHi双酶切后，电泳，胶回收目的片段备用。质粒小抽试剂盒制备pET-28a质粒，电泳鉴定纯度后，取1ug使用NcoI，BamHi进行双酶切。酶切完成后，电泳，胶回收载体大片段备用。将目的片段以及载体大片段使用连接酶连接30分钟后，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜后，挑取克隆培养制备质粒进行酶切鉴定。获得pET-28a-HAV表达载体。

取正确的克隆的质粒，使用BamHI，XhoI双酶切，制备载体大片段。使用同样的限制性内切酶切EGFP基因的PCR扩增产物，制备外源小片段。再次连接后，涂盘筛选阳性克隆。测序正确后，获得pET-28a-HAV-EGFP表达载体。

2.5Annexin V及Annexin V-EGFP融合蛋白的小量表达

将构建成功的pET-28a-HAV载体和pET-28a-HAV载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂盘后37℃培养过夜，获得单克隆。分别挑取两个克隆在含有50ug/ml卡那霉素抗生素的LB培养基中培养4-6小时，待OD600＝0.4-0.6时，制备甘油菌放置-80℃保存。在剩余的菌液中加入IPTG(终浓度10uM)进行诱导4小时。离心收菌后，SDS-PAGE电泳检测是否有表达条带。

2.6Annexin V-EGFP融合蛋白的纯化

选择小量诱导表达成功的克隆进行接种，小量培养过夜，用作种子菌。将过夜菌按照1∶200接种到含有1LLB培养基(含有卡那霉素抗生素)的三角烧瓶中放大培养，2小时候左右，OD600达到0.6后加入IPTG，37℃诱导4小时。离心收菌后，加入40ml TBS分散菌体。

50瓦功率，间隔5秒，超声破菌10分钟。离心收集上清，用于上镍柱。纯化过程按照His-tag纯化试剂盒说明书进行。主要步骤包括，4℃冷库上样(2ml/m)；含有20mM咪唑的TBS洗杂蛋白30ml；含有50mM咪唑的TBS洗杂蛋白10ml；

使用含有200mM咪唑的TBS洗脱目标蛋白10ml，分管收集，1.2ml/管。电泳鉴定纯度，合并浓缩蛋白后，透析到TBS中，使用Bradford方法测定蛋白浓度。调整到1mg/ml，-80℃冷冻保存备用。

2.7细胞凋亡诱导及检测

将293细胞传代培养于12孔细胞培养板中，培养到36小时后，移去培养基换用无血清培养基培养12小时，加入肿瘤坏死因子(TNF-α，50U/ml)以及放线菌酮(CHX，4ug/ml)诱导3小时后，收集细胞。按照说明书，使用BD试剂盒中的Annexin V-FITC/PI双染色，进行流式细胞仪分析，确定凋亡的发生。

同样方法，处理细胞。使用自制Annexin V-EGFP染色，荧光显微镜观察。具体方法如下：胰酶消化，吹下细胞后，进行细胞计数。每个样本使用1×106个细胞。用孵育缓冲液洗涤1次，500^-1000r/min离心5min。用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10^-15min，重复洗涤1次后加入AnnexinV-FITC/PI或者Annexin V-EGFP，溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测P。

检测EGFP使用EGFP专用荧光通道。

3实验结果

3.1构建pET-28a-HAV-EGFP载体

从293细胞中抽的RNA经过电泳检测有三条主带，分别对应28S RNA、18SRNA和5S RNA效果较好没有明显的降解(见附图1)。两管使用70ul DEPC水溶开的RNA经过测定浓度分别为0.45ug/ul和0.91ug/ul。取浓度较高的一管进行RT反应以后，使用Human Annexin V特异性引物扩增目的片段，使用三种浓度的RT产物作为模板，均可以获得很特异的目的条带(见附图2)。使用的反应程序是：98℃2分钟，98℃15秒，56℃15秒，68℃40秒，30个循环。在250bp的下方可以看到明显的引物二聚体条带。

我们将扩增的Annexin V基因扩增片段以及pET-28a载体使用NcoI，BamHI双酶切以后，胶回收连接，转化大肠杆菌DH5a，获得了七个单克隆。这些克隆经过培养、抽质粒、酶切鉴定，发现有一个克隆含有Annexin V的外源片段，转化大肠杆菌后也可以被IPTG诱导表达，并且是以可溶形式存在与上清中(见附图3)。分子量大小比预期稍大(38kDa)，主要原因可能是终止密码子距离BamHI酶切位点还有一段距离。

到这一步获得的Human Annexin V实际上进行FITC或者PE等化学荧光标记，即可以用于细胞早期凋亡的检测。我们为了简化化学荧光标记的过程，采用增强型绿色荧光蛋白EGFP和Annexin V组成融合蛋白来避免化学荧光的标记。我们认为融合蛋白可以更好地保留Annexin V对磷脂分子的亲和力。使用已经制备成功的pET-28a-HAV作为载体，BamHi，XhoI双酶切载体和EGFP外源片段后连接，转化大肠杆菌，培养过夜得到了多个单克隆，测序证实的获得的pET-28a-HAV-EGFP正确(pET-28a-HAV-EGFP载体的构建示意图见附图4)。

3.2融合蛋白Annexin V-EGFP的表达与纯化

将测序正确的pET-28a-HAV-EGFP载体转化大肠杆菌表达株BL21(DE3)以后，培养过夜，挑取的单克隆按照实验方法中所述进行小量表达鉴定。发现在22℃，30℃，37℃条件下，表达产物的相对总菌体蛋白的百分比没有太多差别，可溶部分也区别不明显。而不同浓度的IPTG(5uM-100uM)诱导对表达量影响也不大。因此我们选择了37℃，10uM IPTG作为表达条件。诱导表达的融合蛋白在此条件下约有85％是可溶部分，表达量达到了30mg/LLB培养菌体(见附图5)。

在融合蛋白的C端，我们设计了His-tag用于蛋白纯化。按照实验方法中所述，我们使用Ni-IDA亲和柱成功实现了一步纯化，纯化的蛋白纯度达到了95％以上，只有1条较为明显的杂带(可能是降解带)。咪唑洗脱的蛋白经过浓缩以及透析除去咪唑后，使用Bradford测定总蛋白发现。每1L培养基可以纯化20mg融合蛋白。这一纯化过程很方便，并且由于融合蛋白带有明显的荧光，裸眼就可以看见融合蛋白是否与亲和柱结合。

3.3细胞凋亡的诱导与检测

使用放线菌酮CHX可以抑制细胞内的蛋白表达，此时再使用TNF-α刺激细胞，可以导致细胞凋亡。我们摸索条件后发现，在无血清培养中加入一定量的CHX和TNF-α可以在3小时左右诱导细胞凋亡发生。流式细胞仪的检测结果也证实了这两种试剂的组合用用，可以诱导细胞凋亡。在此基础上，我们使用制备的融合荧光蛋白和诱导凋亡的细胞孵育，荧光显微镜下观察可见荧光主要集中在凋亡细胞的外膜上(见附图6)。浓度实验显示，每一个反应需要的Annexin V-EGFP仅为80ng左右，也就是说1L培养基获得融合蛋白可以做25万次凋亡检测。

4讨论

本发明不仅实现了人的Annexin V基因在原核中高效表达，也完成了Annexin V-EGFP融合荧光蛋白在大肠杆菌中的可溶表达以及一步纯化，更重要的是，验证了自制的融合荧光蛋白能够和早期凋亡细胞的外膜结合，可以替代进口试剂盒中的Annexin V-FITC或者Annexin V-PE荧光蛋白。尤其重要的是，本发明实现了1L培养基纯化的融合蛋白能够进行25万次凋亡检测。当前进口的100次凋亡检测试剂盒需要1900元左右，一旦本研究中制备的融合蛋白推向市场，可以大大降低成本。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种细胞凋亡检测试剂盒，试剂由Annexin V-EGFP融合蛋白和结合缓冲液组成。

2.根据权利要求1所述的细胞凋亡检测试剂盒，其特征在于，所述检测蛋白为Annexin V-EGFP。

3.权利要求1所述的细胞凋亡检测试剂盒的制备方法，包括构建表达载体，融合蛋白Annexin V-EGFP的表达与纯化，细胞凋亡的诱导与检测，其特征在于，所述的表达载体为pET-28a-HAV-EGFP。

4.根据权利要求3所述的细胞凋亡检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备菌为大肠杆菌。

5.权利要求1所述的细胞凋亡检测试剂盒在识别早期凋亡细胞中的应用。

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