CN102230007A - 一种分子信标荧光定量pcr检测邻苯二甲酸酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括将从鲤鱼肝脏中提取含有受体的细胞溶质与不同浓度的邻苯二甲酸酯结合形成复合物后，再与用特异性引物合成的结合DNA结合形成配体-受体-DNA复合物，用核酸外切酶III和S1核酸酶消解。酶切后的产物作为模板，进行分子信标荧光定量PCR扩增，得到加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程，结合定量DNA标准曲线，经线性回归分析，得到邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，可进行不同浓度邻苯二甲酸酯的检测。本发明具有灵敏度高，检出限低，特异性强的特点，可用于快速检测大批量样本中的邻苯二甲酸酯的含量，具有良好的应用前景。

Description

一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法

技术领域

本发明属于邻苯二甲酸酯的检测领域，特别涉及一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯(PAEs)是塑料的增塑剂，是世界上生产量大，应用面广的人工合成有机化合物，它广泛应用于塑料工业。这类污染物已大量进人环境，普遍存在于土壤、底泥、水体、生物、空气及大气降尘物等环境样品中。由于PAEs的广泛存在，其对环境的影响渐渐凸显。研究证明，PAEs具有急性毒性、致癌性和致畸性等多种生物毒性。环境行为和生态效应研究表明，邻苯二甲酸酯水解和光解速率都非常缓慢，已成为一种全球性的环境有机污染物，被中国环境检测总站和美国EPA列为优先控制污染物。

关于邻苯二甲酸酯的检测有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)、荧光法等。用色谱法检测不但昂贵费时，而且分析过程繁琐冗长。近年来，随着生物技术的发展产生了许多邻苯二甲酸酯的生物检测方法。

荧光定量PCR是近年来出现的具有高灵敏度的定量PCR方法。PAEs于细胞质中的雌激素结合后，进一步与结合DNA复合后，形成PCR扩增的模板。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，该方法具有灵敏度高，检出限低，特异性强的特点，可用于快速检测大批量样本中的邻苯二甲酸酯的含量，具有良好的应用前景。

本发明的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括：

(1)将喂养于含邻苯二甲酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入体积与肝脏质量比为4mL∶1g的HEDG缓冲液匀浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；

(2)将pUC19质粒稀释50倍作为模板，PCR扩增制得结合DNA，将结合DNA于琼脂糖凝胶电泳分离，最后纯化回收；

(3)将邻苯二甲酸酯倍比稀释为10^-1g/L-10^-9g/L，取10μL与250μL的细胞溶质混合，于20℃振荡温育2h；

(4)从上述混合物中取20μL加入1.5mLEP管中，20℃温育15min后，再加入2μL结合DNA，继续20℃温育15min得配体-受体-DNA复合物；从复合物中取12μL再加入2μL ExoIII(核酸外切酶III)缓冲液和6μL HEDG缓冲液，混匀后37℃温育15min，再加入ExoIII100U，混匀后37℃温育15min进行初次消解；取经初步消解的溶液5μL，加入15μL S1核酸酶混合液，于37℃温育30min进行再次消解；再加入1μL S1核酸酶停止液，70℃灭活15min；得到分子信标PCR的模板；

(5)以上述模板进行分子信标荧光定量PCR扩增，分子信标PCR循环40次后在72℃延伸5min，得加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程；其中，引物碱基序列为：上游引物R1：5′CAGGTC AGAGTGACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3′；下游引物R2：5′GTCCAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3′，分子信标探针的序列为：5′FAM-CTTGG CAAGCAGCAGATTACGCCCAAG-DABCYL 3′；

(6)根据结合DNA标准曲线进行线性回归分析，得邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，测定样品Ct值计算得邻苯二甲酸酯浓度。

所述步骤(1)中的KCl溶液浓度为0.15～0.2mol/L。

所述步骤(2)中的PCR扩增引物碱基序列为上游引物F1：5′CAG GTC AGA GTG ACCTGC TTC CTC GCT CAC TG 3′，下游引物F2：5′GTC CAG TCT CAC TGGACA GGC AAC TATGGATG 3’。

所述步骤(2)中的琼脂糖凝胶质量百分比浓度为1％。

所述步骤(4)中的S1核酸酶停止液含0.3mol/L的Tris碱和1.35mol/L的EDTA。

所述步骤(5)中的分子信标荧光定量PCR扩增体系为：每50μl体系中包括含25μmol/LMgCl₂的反应缓冲液5μL、1.25mmol/L dNTP 4μL、50μmol/L上下游引物各0.2μL、TaqDNA聚合酶0.3μL、探针0.3μL、模板5μL和灭菌双蒸水35.8μL，TaqDNA聚合酶浓度为3U/μl。

所述步骤(5)中的分子信标PCR循环步骤为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。

本发明将从鲤鱼肝脏中提取的雌激素受体与不同浓度的邻苯二甲酸酯结合形成复合物后，再与用特异性引物合成的结合DNA结合形成配体-受体-DNA复合物，用核酸外切酶III和S1核酸酶消解。酶切后的产物作为模板，进行分子信标荧光定量PCR扩增，结合定量DNA标准曲线，得到邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系。将外切酶保护与分子信标荧光定量PCR方法结合，制备分子信标PCR模板时，经核酸外切酶III和S1核酸酶消解，使游离的DNA不能被扩增，从而提高PCR检测准确度及灵敏度，加入了分子信标探针，使检测更具有特异性。

有益效果

本发明具有灵敏度高，检出限低，特异性强的特点，可用于快速检测大批量样本中的邻苯二甲酸酯的含量。

附图说明

图1是实施例1标准模板分子信标荧光定量PCR扩增曲线；

图2是实施例1标准模板分子信标荧光定量PCR模板浓度-Ct值关系曲线；

图3是实施例1不同浓度邻苯二甲酸酯诱导结合DNA的分子信标荧光定量PCR扩增曲线图；

图4是实施例1邻苯二甲酸酯浓度的对数与Ct值关系曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一、雌激素受体的提取及配体-受体复合物的制备

1、含雌激素受体的细胞溶质的提取

取在邻苯二甲酸酯浓度为0.01mg/L的水中驯养的鲤鱼，用5mg/L的苯坐卡因麻醉。取其肝脏，用0.15mol/L冰上预冷的KCl溶液洗去肝脏外血液，再用灭菌的滤纸吸干表面水分，按照m(肝脏)∶v(缓冲液)＝1∶4比例加入HEDG缓冲液(冰上预冷)于玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于15000g离心一小时，小心吸取上清，即为含有受体的细胞溶质，分装后于-80℃保存备用。

2、邻苯二甲酸酯-雌激素受体复合物的制备及纯化

将1g/L的邻苯二甲酸酯稀释为10^-1g/L-10^-9g/L，各取10μL，加入细胞溶质250μL，于20℃振荡温育2h。当配体受体反应结束后，加入0.2mL60％的HAP混匀，冰浴30min，每10min混匀一次，以便HAP充分吸附受体蛋白，在4℃，3500rpm条件下离心1min，弃上清。沉淀颗粒加入1mL含0.05％T-80的HEDG缓冲液，混合洗涤，同样条件下离心15min。重复3次，最后一次弃上清后，加入0.4mL0.2mol/L的磷酸缓冲液，间歇振荡三次，再离心15min，取上清。此时溶液中为较纯的配体受体复合物。

二、配体-受体-结合DNA复合物的制备及外切酶消解

1、结合DNA的制备

将pUC19质粒稀释50倍作为模板，常规PCR方法扩增制得结合DNA。利用premier5.0引物设计软件设计含有反应元件(下划线部分)的上下游引物。引物序列如下：上游引物F1：5′CGGAG TTCCG TGAGA AGA GG ATAAC GCAGG AAAGA ACATG 3′；下游引物F2：5′GTC CAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3’。产物于1％琼脂糖凝胶电泳分离，用PCR产物快速纯化试剂盒纯化回收。此结合DNA(1036bp)的核苷酸序列如下：

5′CAGGTCAGAGTGACCTGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGTCCAGTGAGACTGGAC 3’。

2、配体-受体-结合DNA复合物的制备

从上述每管中取出20μl于1.5mlEP管中，加入1μg poly(dI.dC)于20℃温育15min后，再加入2μl结合DNA，继续20℃温育15min，此时溶液中为配体-受体-DNA复合物。

3、外切酶消解

取12μL配体-受体-DNA复合物，加入2μL ExoIII buffer，6μL HEDG缓冲液，使其体积为20μL，混匀后37℃温育15min。再加入ExoIII 100U，混匀后于37℃温育15min。取出5μL酶切产物，加入15μlS1混合液(50U)，37℃温育30min。再加入1μLS1停止液(0.3mol/L Tris碱，1.35mol/L EDTA)，70℃灭活10min。得到分子信标PCR的模板。

三、分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯标准曲线的建立

1、定量标准曲线

以不同浓度的标准模板进行分子信标荧光定量PCR扩增。PCR扩增条件：每50μL体系中包含有10×buffer5μL(含25mmol/L MgCl₂)，1.25mmol/L dNTP 4μL，50μmol/L引物各0.2μL，TaqDNA聚合酶(3U/μL)0.3μL，探针0.3μL，模板5μL，灭菌双蒸水35μL；分子信标荧光定量PCR循环步骤：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环40次；最后在72℃延伸5min，得出一条定量标准曲线，见附图1、2及表1。在10³-10⁸copies/μL范围内，Ct值与起始模板浓度的对数之间有很好的线性关系。两者关系式为y(Ct)＝-3.008x(模板初始拷贝值的对数)+28.855，相关系数R²＝0.99120。

表1标准曲线的不同定量模板起始拷贝数与Ct值

2、分子信标荧光定量PCR检测

以不同浓度的邻苯二甲酸酯与雌激素受体-结合DNA制备的复合物，经过酶切保护处理，作为荧光定量PCR模板，进行PCR扩增。根据标准曲线，得出邻苯二甲酸酯剂量-效应关系为：y(邻苯二甲酸酯浓度的对数)＝1.6455x(标准DNA拷贝数的对数)+9.523。邻苯二甲酸酯-受体-结合DNA复合物中，加入邻苯二甲酸酯浓度在10^-8～10^-2g/L范围时，邻苯二甲酸酯浓度与结合DNA含量之间具有很好的线性关系。结合标准曲线和邻苯二甲酸酯与Ct值剂量-效应关系，得到Ct值和加入邻苯二甲酸酯浓度的关系：y(Ct)＝-1.828x(邻苯二甲酸酯浓度对数值)+11.447，R²＝0.99523。见附图3、4及表2。

表2不同浓度邻苯二甲酸酯诱导的复合物模板起始拷贝数与Ct值

SEQUENCE LISTING

<110>东华大学

<120>一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法

<130>1

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>引物F1

<400>1

caggtcagag tgacctgctt cctcgctcac tg                                              32

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>引物F2

<400>2

gtccagtctc actggacagg caactatgga tg                                              32

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>引物R1

<400>3

caggtcagag tgacctgctt cctcgctcac tg                                              32

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>引物R2

<400>4

gtccagtctc actggacagg caactatgga tg                                              32

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>分子信标探针

<400>5

cttggcaagc agcagattac gcccaag                                                    27

<210>6

<211>1036

<212>DNA

<213>结合DNA

<400>6

caggtcagag tgacctgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg     60

gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa    120

cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc    180

gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc    240

aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag    300

ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct    360

cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta    420

ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc    480

cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc    540

agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt    600

gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct    660

gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc    720

tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca    780

agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta    840

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa    900

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg     960

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg    1020

tccagtgaga ctggac                                                    1036

Claims (7)

1.一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括：

(1)将喂养于含邻苯二甲酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入体积与肝脏质量比为4mL∶1g的HEDG缓冲液匀浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；

(2)将pUC19质粒稀释50倍作为模板，PCR扩增制得结合DNA，将结合DNA于琼脂糖凝胶电泳分离，最后纯化回收；

(3)将邻苯二甲酸酯倍比稀释为10^-1g/L-10^-9g/L，取10μL与250μL的细胞溶质混合，于20℃振荡温育2h；

(4)从上述混合物中取20μL加入1.5mLEP管中，20℃温育15min后，再加入2μL结合DNA，继续20℃温育15min得配体-受体-DNA复合物；从复合物中取12μL再加入2μL ExoIII buffer和6μL HEDG缓冲液，混匀后37℃温育15min，再加入ExoIII100U，混匀后37℃温育15min进行初次消解；取经初步消解的溶液5μL，加入15μL S1核酸酶混合液，于37℃温育30min进行再次消解；再加入1μL S1核酸酶停止液，70℃灭活15min；得到分子信标PCR的模板；

(5)以上述模板进行分子信标荧光定量PCR扩增，分子信标PCR循环40次后在72℃延伸5min，得加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程；其中，引物碱基序列为：上游引物R1：5′CAGGTC AGAGTGACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3′；下游引物R2：5′GTCCAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3′，分子信标探针的序列为：5′FAM-CTTGG CAAGCAGCAGATTACGCCCAAG-DABCYL 3′；

(6)根据结合DNA标准曲线进行线性回归分析，得邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，测定样品Ct值计算得邻苯二甲酸酯浓度。

2.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的KCl溶液浓度为0.15～0.2mol/L。

3.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增引物碱基序列为上游引物F1：5′CAG GTC AGA GTG ACC TGCTTC CTC GCT CAC TG 3′，下游引物F2：5′GTC CAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TATGGA TG 3′。

4.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的琼脂糖凝胶质量百分比浓度为1％。

5.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的S1核酸酶停止液含0.3mol/L的Tris碱和1.35mol/L的EDTA。

6.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的分子信标荧光定量PCR扩增体系为：每50μl体系中包括含25μmol/L MgCl₂的反应缓冲液5μL、1.25mmol/L dNTP 4μL、50μmol/L上下游引物各0.2μL、TaqDNA聚合酶0.3μL、探针0.3μL、模板5μL和灭菌双蒸水35.8μL，TaqDNA聚合酶浓度为3U/μl。

7.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的分子信标PCR循环步骤为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。

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