CN102228573A

CN102228573A - 利尿中药在制备防治骨质疏松症药物中的应用

Info

Publication number: CN102228573A
Application number: CN 201110174195
Authority: CN
Inventors: 李青南; 陈珺; 陆幸妍; 杨国柱; 卢丽
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2011-06-27
Filing date: 2011-06-27
Publication date: 2011-11-02

Abstract

本发明公开了利尿中药在制备治疗骨质疏松症药物中的应用，属于传统中药的新用途。本发明采用利尿中药车前草、车前子、灯芯草和白茯苓分别培养成骨细胞，发现它们对于成骨细胞增殖和分化都具有促进作用，并能上调成骨功能指标基因的表达，对防治骨质疏松症具有一定的治疗作用，提供了利尿中药的新用途，同时为骨质疏松症治疗提供一种新的候选药物。

Description

利尿中药在制备防治骨质疏松症药物中的应用

技术领域

本发明涉及利尿中药灯芯草、车前草、车前子、白茯苓的新用途，即在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。

背景技术

加尼福尼亚大学骨质研究表明，连续四周每天摄取食盐量为6000毫克的妇女对钙质的吸收量会从原来正常的1500毫克减少了42毫克左右——过量的Na盐摄入会导致血液中钙含量的降低，从而引发骨质疏松症。而上皮钠通道蛋白（epithelial sodium channel，ENaC）通道是调节体内钠盐的膜蛋白，ENaC广泛分布在人体细胞中，调控细胞内的钠离子平衡。上皮钠通道蛋白通道是非电压门控的阿米洛利敏感性异侧离子通道。ENaC由四个同源亚基α、β、γ、δ组成多聚体，多数的结构为复合体。阿米洛利是一种上皮细胞钠离子通道阻滞药，一种作用于肾小管远端ENaC的保钾利尿药。阿米洛利及其衍生物都会抑制上皮细胞钠离子通道。有实验研究发现阿米洛利的衍生物Phenamil的小分子能诱导成骨细胞的分化和矿化。

在我国中药里面有很多具有清热利尿作用（与阿米洛利和Phenamil的利尿作用相似）的药材，但是这方面的药材作为治疗骨质疏松症的用途还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供利尿中药在制备防治骨质疏松症疾病药物中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的

针对背景技术中阿米洛利的衍生物Phenamil的小分子能诱导成骨细胞的分化和矿化的启示，我们从利尿中药当中找到了几个和阿米洛利衍生物Phenamil有类似利尿作用的中药来做实验，试验它们是否对成骨细胞有影响。本实验用乳鼠的头盖骨来做成骨细胞，将不同浓度的车前草、车前子、灯芯草、白茯苓培养成骨细胞。观察不同浓度的车前草、车前子、灯芯草、白茯苓对成骨细胞的影响，发现这几味中药具有促进成骨细胞增殖和分化的作用，能够用于制备防治骨质疏松症的药物。

利尿中药在制备促进成骨细胞增殖和/或促进成骨细胞分化的药物中的应用，所述利尿中药为车前草、车前子、灯芯草或白茯苓。

利尿中药在制备抑制OC基因表达、促进Coll-Ia基因表达和/或促进ALP基因表达的药物中的应用，所述利尿中药为车前草、车前子或灯芯草。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明证实了利尿中药对于成骨细胞增殖和分化都具有促进作用，并能上调成骨功能指标基因的表达，对防治骨质疏松症具有一定的治疗作用，提供了利尿中药的新用途，同时为骨质疏松症治疗提供一种新的候选药物。

附图说明

图1. 不同浓度的含药（车前草、灯芯草、白茯苓）血清刺激下成骨细胞增殖影响分析图；

图2. 不同浓度含药（车前子）血清对成骨细胞增殖影响分析图，其中N.S为生理盐水；

图3. 不同浓度的含药（车前草、灯芯草、白茯苓）血清刺激对成骨细胞AKP的影响分析图；

图4. 不同浓度含药（车前子）血清对成骨细胞增殖影响分析图，其中N.S为生理盐水；

图5. 不同浓度的含车前草血清和含灯芯草血清对成骨细胞相关基因表达影响电泳图；

图6.不同浓度的含药（车前子）血清对成骨细胞相关基因表达影响的电泳图。

具体实施方式

实施例 1 利尿中药对成骨细胞增殖的影响

1.利尿中药提取液制备

取200g车前草、灯芯草、白茯苓干药材煮两次，第一次加入2L蒸馏水，浸泡5min后加热沸腾30min，过滤，滤渣加入1.2L蒸馏水煎煮，沸腾20min，煮完后再过滤，最终把两次滤液合并，浓缩成200ml，4℃保存待用。

取40g车前子加400ml蒸馏水，浸泡5min，加热沸腾30min，过滤，留滤液与滤渣，回收滤渣，加入400ml蒸馏水煎煮第二次，沸腾20min，过滤，留滤液。将两次所得的滤液浓缩成400mL，4℃保存待用。

2.含药血清制备

分别用浓度为1mg/mL的车前草、灯芯草、白茯苓提取液、生理盐水1日2次灌胃大鼠（早上9：00、傍晚17：00），每次灌量1 mL/100g。连续3.5 d。最后一次灌胃1小时后，动物给予乙醚麻醉，心脏穿刺取血，将大鼠血以4000 rpm离心15min取血清，每组血清摇匀，-80℃保存，用时过滤除菌，用无血清DMEM配成所需浓度的含药血清培养基。

3. 成骨细胞培养

取新生SD大鼠75%酒精浸泡15min处死，沿耳朵两侧，将皮肤翻开，小心剪出头盖骨，置于PBS的培养皿中，并刮除结缔组织及骨膜，直至骨头发白。剪碎加入消化液（胶原酶：PBS=20 mg：10 ml）消化，经过两次37 ℃水浴30 min、1500rpm离心7min后弃上清，再37℃ 水浴1h， 1500 rpm离心7 min，弃上清，即可加入基础培养基（含10%体积胎牛血清的DMEM）置37℃、5% CO₂培养箱培养。48 h后换液，以除去未贴壁血细胞，此后每3 d换液一次，细胞生长至90%融合时采用0.25%胰酶消化传代，以1.0×10⁵cell/mL接种于培养皿中。P₂代细胞开始用诱导培养基（含10%胎牛血清的DMEM液中添加1×10^-2mol/Lβ-甘油磷酸钠、1×10^-8 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C）培养，使头盖骨细胞向成骨细胞转化。取P₃-P₅代细胞用于各项实验。

4. 细胞增殖功能测定（CCK-8）：

步骤3所得细胞以1×10⁴cell/mL接种于96孔培养板内(弃周围一圈，改加PBS，防止水分丢失)每孔100 μL，37℃、5% CO₂培养箱内培养24 h。细胞贴壁后弃去原培养基，分别加入对照组培养基（含5%、10%、20%和30%空白血清培养基，按体积百分浓度计算，下同）100 μL和含药血清培养基（含5%、10%、20%和30%车前草血清培养基；含5%、10%、20%和30%灯芯草血清培养基；含5%、10%、20%和30%白茯苓血清培养基）100μL，每组平行做6孔，置37℃、5% CO₂培养箱内培养2 d后，用CCK-8试剂盒检测，加入10 μL的CCK-8，37℃孵育60 min后（车前子组培养2h），在酶标仪470 nm波长处分别测定各管成骨细胞吸光度（OD）值。

实验结果见表1和图1。

表1 不同浓度含利尿中药血清对成骨细胞增殖的影响（CCK-8）1小时

组别	0%（DMEM）	5%血清浓度	10%血清浓度	20%血清浓度	30%血清浓度
						对照组	0.372±0.005	0.375±0.026	0.420±0.065	0.398±0.035	0.347±0.012
车前草		0.459±0.008^**	0.483±0.026	0.456±0.018	0.350±0.016
						灯芯草		0.533±0.038^**	0.410±0.018	0.437±0.042	0.343±0.026
白茯苓		0.496±0.030^**	0.470±0.060	0.418±0.055	0.339±0.078

注：与同浓度对照组比 ^*P<0.05，^**P<0.01。

表2不同浓度车前子含药血清对成骨细胞增殖的影响（CCK-8）2小时

组别	5%血清浓度	10%血清浓度	20%血清浓度	30%血清浓度
					对照组	0.923±0.058	0.854±0.039	0.824±0.042	0.797±0.098
车前子组	0.918±0.059	0.950±0.048^**	1.000±0.036^**	1.054±0.078^**

注：与同浓度对照组比 ^*P<0.05，^**P<0.01。

加入药物干预培养后，成骨细胞增殖呈双向趋势，基本在含药血清浓度为5~10%时数值最高，然后随着浓度上升，OD值降低。T检测结果显示，表3中三种清热利尿药均都只有含药血清浓度为5%有统计学意义（P<0.01），且有较明显的增加作用。虽然三种药含药血清10%、20%浓度时都有促进作用，但均无显著性差异；含药血清浓度为30%对细胞增殖无影响。而从表2和图2可以看出，在含车前子血清浓度为10%、20%时增殖最为明显。

5. 细胞分化功能测定（AKP）：

细胞接种、分组给药方法同4，给药并置于37℃、5% CO₂培养箱内培养48 h后，按碱性磷酸酶（AKP）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）方法，在酶标仪520 nm波长处测定吸光度（OD）值，实验结果见表3、表4；同时计算各管成骨细胞的碱性磷酸酶水平，结果见图3、图4。

表3 车前草、灯芯草、白茯苓含药血清对成骨细胞分化的影响（AKP）

组别	0%（DMEM）	5%血清浓度	10%血清浓度	20%血清浓度	30%血清浓度
						对照组	13.082±0.646	16.514±0.646	20.619±1.008	28.186±3.302	37.745±1.701
车前草		14.645±1.523	16.911±1.595^*	20.833±2.999^*	29.075±1.933^**
						灯芯草		14.583±0.463^*	16.268±0.694^**	21.293±0.281^*	24.632±0.159^**
白茯苓		16.881±0.212	21.415±0.933	32.353±3.782	33.119±3.927

注：与同浓度对照组比^*P<0.05，^**P<0.01。

表4 车前子含药血清对成骨细胞分化的影响（AKP）

	5%血清浓度	10%血清浓度	20%血清浓度	30%血清浓度
					对照组	6.603±0.205	6.607±0.285	7.399±0.202	7.156±0.070
车前子	6.906±0.150^**	7.392±0.287^**	8.972±0.592^**	8.748±0.468^**

注：与同浓度对照组比^*P<0.05，^**P<0.01。

以上实验结果表明，与同浓度对照组比，车前草含药血清浓度为10%、20%、30%，灯芯草度含药血清为5%、10%、20%、30%时均有统计学意义，对碱性磷酸酶活性有抑制作用；而白茯苓含药血清4种浓度对碱性磷酸酶活性无影响。加入车前草、灯芯草、白茯苓含药血清干预培养后，成骨细胞碱性磷酸酶活性随着浓度的增加而升高。但是与同浓度对照组相比，数据都呈现变小趋势（见表3）。从表3和图3得到，车前草、灯芯草对碱性磷酸酶活性有抑制作用。而从表4和图4可以看出，车前子对碱性磷酸酶活性有促进作用。

6、RT-PCR测定成骨相关基因的mRNA表达

采用RT-PCR方法测定药物作用后成骨功能指标基因Coll-Ia、OC、ALP、ON表达量的变化。

成骨细胞生长至近融合时，分别给予对照组培养基（含5%、10%空白血清培养基）和含药血清培养基（分别为含车前子血清、车前草血清、灯芯草血清、白茯苓血清浓度为5%、10%的培养基），并置于37℃、5% CO₂培养箱内培养24 h后，Trizol提取总RNA，按PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒说明进行逆转录直接合成DNA。RT-PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统测定标本的灰度值，与内参照β-actin灰度值比较，相对定量。实验结果见图5、图6。

从图5可以看出，2.5%、5%、10%浓度的含车前草血清和含灯芯草血清对Coll-Ia基因有较明显促表达作用；浓度为10%的含灯芯草血清抑制OC基因表达，其他浓度对OC基因表达无影响。浓度为2.5%的含车前草血清和含灯芯草血清较明显促进ALP基因表达。t检验结果显示，浓度为10%的含灯芯草血清抑制OC基因表达有统计学意义（P<0.05）；而浓度为2.5%的含灯芯草血清较明显促进ALP基因表达（ALP/β-actin），也有显著性差异（P<0.05）。

图6显示，浓度为5%的车前子含药血清能明显上调OC、ALP、Osteopontin的表达水平（与β-actin灰度值比较进行相对定量），与空白对照组相比有显著性差异（P<0.01；P<0.05；P<0.01），浓度为10%的含车前子血清亦能促进ALP基因的表达，与空白对照组相比有极显著的差异（P<0.01）。

Claims

1.利尿中药在制备治疗骨质疏松症药物中的应用，所述利尿中药为车前草、车前子、灯芯草或白茯苓。

2.利尿中药在制备促进成骨细胞增殖和/或促进成骨细胞分化的药物中的应用，所述利尿中药为车前草、车前子、灯芯草或白茯苓。

3.利尿中药在制备抑制OC基因表达、促进Coll-Ia基因表达、促进ALP基因表达和/或促进Osteopontin基因表达的药物中的应用，所述利尿中药为车前草、车前子或灯芯草。