CN102220433B - 一种细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶的快速检测方法，步骤是：A、裂解或提取测试菌中的DNA用于PCR反应的模板；B、设计PCR引物，扩增全长的新德里β-内酰胺酶基因；C、浓缩扩增的bla NDM-1基因片段并定量；D、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达bla NDM-1酶；F、测定表达的新德里β-内酰胺酶（NDM-1）降解抗生素的活性。在于使用一对PCR引物和测定降解抗生素的活性来达到检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶。同时公开了扩增全长bla NDM-1基因又适合小麦胚芽无细胞表达系统表达NDM-1的引物序列。方法易行，本发明能快速检测，灵敏度高，操作简便，使用一对PCR引物和测定降解抗生素的活性来达到检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统用于耐药基因新德里β-内酰胺酶检测和表征的方法。可用于检测和确认临床各种菌中的耐药基因新德里β-内酰胺酶。
背景技术
耐药基因新德里β-内酰胺酶（NDM-1）于2009年由英国卡迪夫大学的蒂莫西•沃尔什确认。他在一名瑞典病人身上分离的多耐药大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中找到了bla NDM-1.. 研究发现由bla NDM-1编码的新德里β-内酰胺酶(NDM-1)能够分解碳青霉烯抗生素，而后者是目前抗感染治疗中抗菌谱最广、抗菌活性最强的一类抗生素，广泛应用于重症感染患者的治疗。研究还发现，NDM-1广泛存在于印度和巴基斯坦的病例中，多为大肠杆菌或者肺炎克雷伯菌，属于革兰氏阴性菌。携带有该耐药基因的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，对目前的绝大多数抗生素都具有高度耐药性，如阿米卡星（amikacin）， 妥布霉素（Tobramycin）, 环丙沙星（ciprofloxacin）
庆大霉素gentamicin等。只有粘杆菌素(colistin)和替加环素（tigecycline）对带这种基因的病菌有一定的抗菌作用。更为严重的是，初步判断bla NDM-1基因存在于细菌的质粒上，能够在微生物中发生“水平基因转移”而广泛传播。理论上，任何细菌只要获得这种质粒，就会产生相应的超级耐药性。目前含有该基因的超级耐药细菌已经在世界多个国家报道，如美国，以色列，日本，中国等等。因此，它的出现已经引起了全球卫生界的高度关注。快速，灵敏，特异检测bla NDM-1基因对超级耐药细菌的早期诊断、有效治疗和控制传播都有极其重要的意义。
目前bla NDM-1基因检测的主要手段为PCR和PCR测序技术。由于bla NDM-1基因已经扩散到各种类型的菌中，单靠PCR技术只能确定是否有相当大小的片段扩增出来，而不能保证一定扩增的是bla NDM-1基因，因此往往需要PCR后加一个序列测定来确认扩增的序列的确是bla NDM-1基因。由于测序仪目前还比较昂贵，限制该方法在普通临床微生物实验室的使用。
体外蛋白质无细胞表达系统是一种以外源DNA为模板,利用细胞抽提物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系,通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质体外快速表达的系统。经常使用的有兔网织红血球（rabbit
reticulocyte）、小麦胚芽 (wheat germ)、大肠杆菌(E. Coli)的细胞裂解液。使用体外蛋白质无细胞表达系统在研究一些蛋白质功能和一些耐药检测中，如测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，得到了广泛应用。但采用体外蛋白质无细胞表达系统用于bla NDM-1基因的检测还未见报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶的快速检测方法（PCR引物设计方法和引物序列），方法易行，本发明能快速检测（ 24 小时内），灵敏度高，特异检测样品菌中是否含有bla NDM-1基因，并对其编码的酶进行性质表征，具有操作简便，无需细菌培养和昂贵测序仪等特点。其特征在于使用一对PCR引物和测定降解抗生素的活性来达到检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶。
一种检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶的快速检测方法，其步骤是：
A、裂解或提取测试菌中的DNA用于PCR反应的模板；裂解菌的方法包括加热煮沸法、超声破碎法、压力法等，其目的是将测试细菌的细胞壁破碎，释放测试菌中的DNA；然后直接使用裂解液作为模板，或者进一步提取DNA后，再作为模板。
B、设计PCR引物，扩增全长的新德里β-内酰胺酶基因（bla NDM-1）；在于PCR引物序列根据新德里β-内酰胺酶基因（bla NDM-1）的末端上下游序列来设计，同时在于PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子；
C、浓缩扩增的新德里β-内酰胺酶基因（bla NDM-1）基因片段并定量；浓缩方法包括常用的乙醇沉淀法、吸附提取法等；定量方法包括测定260纳米波长吸收的紫外吸收法、使用与DNA结合荧光染料的荧光定量法等，具体的浓缩和定量步骤，可以参考常用的分子生物学实验手册，例如分子克隆实验技术操作手册等。在于控制用于表达新德里β-内酰胺酶的基因模板量；
D、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达新德里β-内酰胺酶；表达时间调节1-24小时；
E、测定表达的新德里β-内酰胺酶降解抗生素的活性，或与其它物质，例如新德里β-内酰胺酶抑制剂乙二胺四乙酸（EDTA），混合后测定降解抗生素的活性。在于通过活性测定来确证所要检测的菌或样品菌中是否含有bla NDM-1基因和表征其编码的酶的性质。
所述的一种检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶的快速检测方法，其特征在于：所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为T7启动子，增强表达子为5’端非编码区增强子和/或3’端非编码区增强子。所述的T7启动子为：5'TAATACGACTCACTATAGG
所述的一种检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶的快速检测方法，其特征在于：所述的样品菌中扩增全长bla NDM-1基因适合小麦胚芽无细胞表达系统表达新德里β-内酰胺酶的含T7启动子的引物对序列：上游引物序列5’
TAATACGACTCACTATAGG ATGGAATTGCCCAATATTATGCA 3'， 下游引物序列：5' TCAGCGCAGCTTGTCGGCCATGC 3'。
所述的一种检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶的快速检测方法，其特征在于：所述的样品菌中扩增全长bla NDM-1基因适合小麦胚芽无细胞表达系统表达新德里β-内酰胺酶的含T7启动子和5’端非编码区增强子的引物对序列：列举三套含不同5’端非编码区增强子的上游引物序列
5'TAATACGACTCACTATAGGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACAATGGAATTGCCCAATATTATGCA3'；
5'TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCAGTCGATGGAATTGCCCAATATTATGCA3'；
以及
5'TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCATGGAATTGCCCAATATTATGCA
3'；
下游引物序列：5'TCAGCGCAGCTTGTCGGCCATGC3'。
通过采用本发明提供的以上方法和PCR引物，就可以在24小时内实现对样品菌中的新德里β-内酰胺酶耐药基因检测及其编码酶的表征方法。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
与常用的PCR方法相比，本发明增加了一个体外转录后降解抗生素的功能验证，能有效确认PCR是否特异扩增，排除非特异的扩增。与PCR后再序列测定确认的方法相比，本方法不需要昂贵的DNA序列测定仪，还能提供对其编码酶的功能测定，适合在更广泛的临床实验室中使用，特别是资源有限的基层医院检验室。本发明能特异检测和确认样品菌中是否含有bla NDM-1基因，无需细菌培养和DNA序列测定仪，还能对bla NDM-1基因编码的酶进行酶活力、抑制剂抑制效果等性质的表征。
附图说明
图1为一种检测和表征细菌中新德里β-内酰胺酶耐药基因的检测及其编码酶的表征方法示意图
图2为一种PCR引物含适合小麦胚芽无细胞表达系统启动子示意图
图3为一种PCR引物含适合小麦胚芽无细胞表达系统启动子和增强子示意图。
A、含有启动子和5’非编码区增强子的引物示意图。 B、含有启动子和3’非编码区增强子的引物示意图。C、同时含有启动子，5’非编码区增强子和3’非编码区增强子的引物示意图。
图4为一种分别采用只带启动子的PCR引物以及带有启动子和5’非编码区增强子的PCR引物扩增bla NDM-1基因凝胶电泳图。图中： 1，含有启动子扩增的bla NDM-1基因；2，含有启动子和5’非编码区增强子扩增的bla NDM-1基因；M，marker。
只带启动子的上游引物序列：TAATACGACTCACTATAGGATGGAATTGCCCAATATTATGCA 3'， 下游引物序列：5' TCAGCGCAGCTTGTCGGCCATGC 3'。
带有启动子和5’非编码区增强子的PCR引物上游引物序列：5'TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCATGGAATTGCCCAATATTATGCA
3'；
下游引物序列：5'TCAGCGCAGCTTGTCGGCCATGC3'。
图5为一种分别采用只带启动子的PCR引物以及带有启动子和5’非编码区增强子的PCR引物扩增bla NDM-1基因体外表达新德里β-内酰胺酶降解抗生素亚胺培南的效果图。
图6一种 EDTA（乙二胺四乙酸）抑制剂对体外表达的新德里β-内酰胺酶活性影响的效果图。
具体实施方式：
一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统用于新德里β-内酰胺酶耐药基因的检测及其编码酶的表征方法，下面结合附图图对本发明作进一步详细描述。
实施例1：
一种检测和表征细菌中耐药基因新德里β-内酰胺酶的快速检测方法（采用含T7启动子PCR扩增全长bla NDM-1基因用于新德里β-内酰胺酶耐药基因的检测及其编码酶的表征），其步骤是：
1.煮沸裂解结核分枝杆菌快速制备用于PCR反应的模板：
取少量（约100 – 10000个菌）含有bla NDM-1基因的菌株（如：含有bla NDM-1基因的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和臭鼻克雷伯菌等等）加入100ul双蒸水煮沸10min,然后13000rpm,离心5min，小心吸取上清作为扩增bla NDM-1基因的模板。
2.
PCR扩增bla NDM-1基因的引物设计。上游引物序列P1：TAATACGACTCACTATAGGATGGAATTGCCCAATATTATGCA
3'， 下游引物序列：5'
TCAGCGCAGCTTGTCGGCCATGC 3'。
PCR扩增条件：
采用Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase（购自美国NEB公司）作为PCR反应中的DNA聚合酶。98℃预变性30s，变性98℃10s,退火70℃ 1min 延伸72℃ 30s 共37个循环。
采用以上引物对大肠杆菌（取样于广州人民医院）bla NDM-1基因的扩增，经凝胶电泳，典型结果如图4，可见得到了很好的扩增。
3. 浓缩扩增的bla NDM-1基因片段：
(1) 取上述PCR扩增后的 DNA 溶液；
(2) 加入 1/10 体积的 3 M
CH3COONa（pH=5.2）溶液，均匀混合；
(3) 加入 4 μl 的 DNAmate 溶液，均匀混合；
(4) 加入 2.5 倍体积的-20℃预冷无水乙醇，充分混匀；
(5) 12,000 rpm 4℃离心 15 分钟；
(6) 弃溶液，留白色沉淀；
(7) 加入-20℃预冷的 70%
(V/V，以下相同)乙醇 1 ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀。
(8)
12,000 rpm 4℃离心 5分钟后小心弃去乙醇。
(9) 再加入-20℃预冷的 70%(V/V)乙醇 1 ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀。
(10)
12,000 rpm 4℃离心 5分钟后小心弃去乙醇，真空干燥。
4. 采用BioTek 公司Take3
Multi-Volume Plate精确定量浓缩的bla NDM-1基因片段浓度。适合的bla NDM-1基因片段浓度一般为0.1- 100微克/毫升。
5. 采用美国5 PRIMER公司生产的RTS 100 Wheat
Germ CECF Kit试剂盒体外无细胞24℃反应1 -
20小时。表达目的蛋白：新德里β-内酰胺酶。
6. 降解抗生素亚胺培南的测定：
体外表达完成后，取体系中的5ul加入到500ul
100μM浓度的亚胺培南（imipenem）(购自Sigma公司)，缓冲液为50mM二甲胂酸钠。亚胺培南在299nm处有特异性的吸收峰，由于新德里β-内酰胺酶能降解亚胺培南，可以采用分光光度计在299nm测定酶反应后溶液的吸收值的变化。
对新德里β-内酰胺酶活性检测结果如图5所示，可见与空白对照相比，短短30分钟内大部分的亚胺培南被降解。
实施例2：
采用含T7启动子和5’非编码区增强子PCR扩增全长bla NDM-1基因用于新德里β-内酰胺酶耐药基因的检测及其编码酶的表征：
1.煮沸裂解结核分枝杆菌快速制备用于PCR反应的模板：
取少量（约100 – 10000个菌）含有bla NDM-1基因的菌株（如：含有bla NDM-1基因的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和臭鼻克雷伯菌等等）加入100ul双蒸水煮沸10min,然后13000rpm,离心5min，小心吸取上清作为扩增bla NDM-1基因的模板。
2.
PCR扩增bla NDM-1基因的引物设计。上游引物序列P2：5'TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCATGGAATTGCCCAATATTATGCA
3'；
下游引物序列：5'TCAGCGCAGCTTGTCGGCCATGC3'。
PCR扩增条件：
采用Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase（购自美国NEB公司）作为PCR反应中的DNA聚合酶。98℃预变性30s，变性98℃10s,退火70℃ 1min 延伸72℃ 30s 共37个循环。
采用以上引物对大肠杆菌（取样于广州人民医院）bla NDM-1基因的扩增，经凝胶电泳，典型结果如图4，可见得到了很好的扩增。
3. 浓缩扩增的bla NDM-1基因片段：
(1) 取上述PCR扩增后的 DNA 溶液；
(2) 加入 1/10 体积的 3 M
CH3COONa（pH=5.2）溶液，均匀混合；
(3) 加入 4 μl 的 DNAmate 溶液，均匀混合；
(4) 加入 2.5 倍体积的-20℃预冷无水乙醇，充分混匀；
(5) 12,000 rpm 4℃离心 15 分钟；
(6) 弃溶液，留白色沉淀；
(7) 加入-20℃预冷的 70%
(V/V，以下相同)乙醇 1 ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀。
(8)
12,000 rpm 4℃离心 5分钟后小心弃去乙醇。
(9) 再加入-20℃预冷的 70%(V/V)乙醇 1 ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀。
(10)
12,000 rpm 4℃离心 5分钟后小心弃去乙醇，真空干燥。
4. 采用BioTek 公司Take3
Multi-Volume Plate精确定量浓缩的bla NDM-1基因片段浓度。适合的bla NDM-1基因片段浓度一般为0.1- 100微克/毫升。
5. 采用美国5 PRIMER公司生产的RTS 100 Wheat
Germ CECF Kit试剂盒体外无细胞24℃反应1 -
20小时。表达目的蛋白：新德里β-内酰胺酶。
6. 降解抗生素亚胺培南的测定：
体外表达完成后，取体系中的5ul加入到500ul
100μM浓度的亚胺培南（imipenem）(购自Sigma公司)，缓冲液为50mM二甲胂酸钠。亚胺培南在299nm处有特异性的吸收峰，由于新德里β-内酰胺酶能降解亚胺培南，可以采用分光光度计在299nm测定酶反应后溶液的吸收值的变化。
结果如图5所示，可见新德里β-内酰胺酶活性高，短短30分钟内大部分的亚胺培南被降解。与采用没有增强子引物序列进行扩增的实施例一比较，亚胺培南降解的速度更快，这显然是由于表达产生了更多的新德里β-内酰胺酶。
Claims (1)
1.一种细菌中耐药基因blaNDM-1的快速检测方法，其步骤是：
A、裂解或提取样品菌中的DNA用于PCR反应的模板；裂解菌的方法为加热煮沸法、超声破碎法或压力法，将菌壁破碎，释放菌基因组；以直接裂解液作为模板，或进一步提取DNA后，再作为模板；
B、设计PCR引物，扩增全长的blaNDM-1基因，所述blaNDM-1基因编码新德里β-内酰胺酶；在于PCR引物序列根据blaNDM-1基因的上下游末端序列来设计，同时在于PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子和表达增强子；
C、浓缩扩增的blaNDM-1基因片段并定量；浓缩方法为乙醇沉淀法或吸附提取法；定量方法为紫外吸收法或荧光定量法，在于控制用于表达新德里β-内酰胺酶的blaNDM-1基因的模板量；
D、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达新德里β-内酰胺酶；表达时间调节为1-24小时；
E、测定表达的新德里β-内酰胺酶降解抗生素的活性，或与新德里β-内酰胺酶抑制剂乙二胺四乙酸混合后测定降解抗生素的活性，在于通过活性测定来确证样品菌中含有blaNDM-1基因和表征其编码的酶的性质；
所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为T7启动子，表达增强子为5’端非编码区增强子；
所述的样品菌中扩增全长blaNDM-1基因适合小麦胚芽无细胞表达系统表达新德里β-内酰胺酶的引物对序列为：上游引物序列5′TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCATGGAATTGCCCAATATTATGCA 3′；下游引物序列：5′TCAGCGCAGCTTGTCGGCCATGC3′。
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