CN102212130A

CN102212130A - 高通量抗血清析出及纯化制备方法

Info

Publication number: CN102212130A
Application number: CN2010101410486A
Authority: CN
Inventors: 李华
Original assignee: SHANGHAI WENYUANGE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: SHANGHAI WENYUANGE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2010-04-07
Filing date: 2010-04-07
Publication date: 2011-10-12

Abstract

本发明公开了一种高通量抗血清析出及纯化制备方法，将整只兔子的血液注入5ml含有多糖的羧基或羟基的一种到几种物质和某种无机盐的溶液I的器皿中室温放置30分钟，得上层抗血清；然后倒入流穿亲和纯化柱，用PBS溶液洗两次，再依次用等体积的含有三种酸根和含羟基物质的溶液II和溶液III洗脱抗体，最后用同一个收集管收集该两个组分，即得纯化的抗体。可不借助离心机，省去透析和添加保护剂，血清得率、抗体活性高，适宜保存，且极大地降低了生产成本。

Description

高通量抗血清析出及纯化制备方法

技术领域

本发明涉及一种医药抗体的析出及纯化制备方法，特别是涉及一种高通量兔血抗血清析出及抗体纯化制备方法。

背景技术

在目前的抗血清制备和纯化生产领域，主要沿用实验室条件下的操作方法：

在血清制备阶段，首先将血液置于离心管中，待血液凝固后(37℃静置2h，或4℃放置过夜)，通过离心机离心获得血清。此类方法存在诸多问题，例如，当需要处理的血清比较多时，离心管需要量也要相应增多；离心管的标记、离心前的平衡、离心机对放入的离心管数目的限制、离心机每次20分钟的运行时间、离心后血清的转移及新的器皿的标记、含有血块的离心管的清洗和处理等。这些操作会造成血清处理费时费力，并且很容易混淆出错。

在血清亲和纯化阶段，传统方法使得血清穿过亲和柱，PBS溶液洗两次，最后用tris-glycine(PH 2.5或PH 3.0)的溶液将结合在亲和柱上的抗体洗脱下来，利用透析袋在无氨基和羧基的某种缓冲液(如PBS)中过夜透析后，加入甘油后保存。然而，传统tris-glycine洗脱液对抗体活性损伤很大，不同抗体表现的不一致，经常会造成洗脱后的抗体发生变性沉淀，或效价相比于纯化前的血清急剧下降的情况。当抗体生产量大时，透析和添加保护剂等步骤也非常费时和费力。

发明内容

为解决上述传统方法在抗血清制备和纯化过程中存在的问题，本发明的目的是提出一种新的抗血清提取和纯化技术，采用三种特制的溶液，可不借助离心机，快速、高通量地获得用于亲和纯化的抗血清，并且可摆脱透析和添加保护剂的步骤，使纯化的抗体效价提高。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案是：一种高通量抗血清析出及纯化制备方法，依次包括以下步骤：

一、在任何器皿中预先加入5ml溶液I，再把整只兔子的血液注入其中；

二、室温放置30分钟，血清便自动析出，分成两层，上层为血清，下层为血块，将上层血清分离，即得抗血清，血清产量比传统的离心法高出近20％；其下层的血块与传统方法产生的血块不同，可轻松甩出器皿，之后用自来水稍加冲洗就可清洗干净；

三、将步骤二得到的上层抗血清倒入流穿亲和纯化柱，用PBS溶液洗两次，然后依次用等体积的溶液II和溶液III洗脱抗体，最后用同一个收集管收集该两个组分，即得纯化的抗体。

溶液I含有羧基或羟基的一种到几种物质和某种无机盐，其中的一种物质为多糖，这些物质与血液发生作用，使得血清快速析出，溶液中的盐离子又能保证血细胞不破裂，血液较长时间不变质。

溶液II和溶液III不含羧基、氨基、醛基物质，但含有三种酸根和含羟基的物质，这些物质可以防止抗体在纯化过程中变性，也可以很好地解离蛋白之间的相互作用，还不影响抗体氨基、羧基的标记。

步骤二得到的两层结构，如果不想立即进行血清纯化，可在4℃条件下保存14天，不影响抗体质量，也不会出现溶血和腐败现象，而传统法会出现溶血，变质现象。

步骤三得到的抗体溶液可直接冷冻保存，无需PH中和，无须透析，也不需要额外添加甘油进行保护，且抗体活性很高。

本发明的有益效果是：通过使用溶液I、II和III这三种溶液，可高通量并且高质量的完成抗血清的析出和纯化，并且极大的降低了生产成本。与现有的传统方法相比，本发明无需使用离心机离心及其他专用器皿即可获得血清，血清产量比传统的离心法高出近20％；分离出的血块与传统方法产生的血块不同，可轻松甩出器皿，之后用自来水稍加冲洗就可清洗干净，省工省力；如果不想立即进行血清纯化，可在4℃条件下保存14天，不影响抗体质量，也不会出现溶血和腐败现象，而传统法会出现溶血，变质现象；抗体溶液可直接冷冻保存，无需PH中和，无须透析，也不需要额外添加甘油进行保护，且抗体活性很高，是传统方法抗体效价的3到10倍，有些抗体达到100倍。

为进一步说明本发明区别传统方法的显著的优点，现结合具体实验效果和数据进行对比：

参见附图1、2，图1是本发明血清制备的效果图，将兔血放入含有溶液I的管子中，室温放置30分钟的效果。从图中可见上层血清量明显多于用传统方法得到的血清量，一般相比离心法可提高20％。图2是本发明抗体洗脱的数据对比图，总共测试了8种抗血清(标记为I-VIII，见图中表A)，每种血清平均分成两份，序号1，3，5，7，9，11，13，15为传统方法洗脱结果，序号2，4，6，8，10，12，14，16为使用溶液II和溶液III进行纯化的结果，表A反映118的纯化物的抗体含量(OD₂₈₀值正比于抗体浓度)，可见使用本发明的方法，抗体含量明显高于传统方法；图中图B表示这16种抗体的效价比较，使用本发明提供的溶液II和溶液III进行抗体纯化，可有效的防止抗体蛋白在纯化过程中的变性，平均抗体效价提高3～10倍，少数可提高100倍。

又例如，若一个人按传统离心法每天要获得40个兔子的血清，假设使用50ml离心管，需要120根管子离血清，60根管子盛放离心好的血清。一般离心机每次可容纳6只管子，由于离心时需要平衡管，所以每次只能离3根血。除离心15分钟外，再加上减速用时间，平衡，标记管子，倾倒等时间，差不多120根血要用了20个小时。由于离心管成本很高，需要反复使用，而离心后的血块紧紧结合在离心管底，清洗较困难。120根管子清洗，及每根管子标记的清除，额外又需要4个小时。

用了本发明的溶液I，40个兔子只需要40个干净的矿泉水瓶(或类似的便宜器皿)来收集兔血。室温静置30分钟后，血清自动析出，可立即倒出血清纯化，也可不必倒出血清在4℃长期保存以待需要时再使用。对于矿泉水瓶底的剩余的血细胞沉淀可不必清洗，直接连瓶扔掉，如果需要清洗，只需甩掉沉淀，自来水冲洗三遍即可。可见，使用溶液I后，不仅采血方便，而且取消了整个血清制备的中间过程，直接进入到将上层血清倒入纯化柱的纯化阶段，整个制备流程大大简化。

按照传统的方法纯化40个抗血清，4％-10％纯化产品会出现沉淀或溶液不是十分透明(抗体已变性)，在透析袋加入和取出样品，标记样品都很费力，费时，也很容易造成抗体量或质的损失，加入甘油后要充分混匀才可进行冰冻保存，即使这样，传统方法纯化的有些抗体在冷冻保存时，抗体效价会随时间快速下降，造成很多抗体在最后的纯化一步中功亏一篑。而使用本专利提供的溶液II和溶液III进行抗体纯化，可有效的防止抗体蛋白在纯化过程中的变性，平均抗体效价提高3-10倍，少数提高100倍。

另外，溶液I在将来很可能可以用于临床样品的血清快速检测(如常规手段，或蛋白芯片等新手段)，溶液II和溶液III不仅适合抗体纯化，也适合利用抗体柱进行抗原亲和纯化，对于科研和生产企业都有一定的价值。

附图说明

图1是本发明血清制备的效果图。

图2是本发明抗体洗脱的数据对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明作进一步说明。

一种高通量抗血清析出及纯化方法，可依次按照以下步骤制备：

一、在例如干净的矿泉水瓶或任何器皿中，预先加入5ml溶液I，再把一整只兔子的血液注入其中；

二、室温放置30分钟，血清便自动析出，分成两层，上层为血清，下层为血块，将上层血清分离，即得抗血清；其下层的血块与传统方法产生的血块不同，可轻松甩出器皿，之后用自来水稍加冲洗就可清洗干净；如果不想立即进行血清纯化，可在4℃条件下保存14天，不影响抗体质量，也不会出现溶血和腐败现象；

三、将步骤二得到的上层抗血清倒入流穿亲和纯化柱，用PBS溶液洗两次，然后依次用等体积的溶液II和溶液III洗脱抗体，最后用同一个收集管收集该两个组分，即得纯化的抗体；抗体溶液可直接冷冻保存，无需PH中和，无须透析，也不需要额外添加甘油进行保护。

本方法使用的溶液I含有羧基或羟基的一种到几种物质和某种无机盐，其中的一种物质为多糖，这些物质与血液发生作用，使得血清快速析出，溶液中的盐离子又能保证血细胞不破裂，血液较长时间不变质。溶液II和溶液III不含羧基、氨基、醛基物质，但含有三种酸根和含羟基的物质，这些物质可以防止抗体在纯化过程中变性，也可以很好地解离蛋白之间的相互作用，还不影响抗体氨基、羧基的标记。

Claims

1.一种高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是依次包括以下步骤：

二、室温放置30分钟，血清便自动析出，分成两层，上层为血清，下层为血块，将上层血清分离，即得抗血清；

2.根据权利要求1所述的高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是溶液I含有羧基或羟基的一种到几种物质和某种无机盐，其中的一种物质为多糖。

3.根据权利要求1所述的高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是溶液II和溶液III不含羧基、氨基、醛基物质，但含有三种酸根和含羟基的物质。

4.根据权利要求1所述的高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是步骤二得到的两层结构的保存方法是在4℃、最长放置14天。

5.根据权利要求1所述的高通量抗血清析出及纯化制备方法，其特征是步骤三得到的抗体溶液可直接冷冻保存。