CN102203606A - 生物标记物 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于鉴定具有增加的发生心脏病症的风险的心肌梗死患者的方法。

Description

生物标记物
发明领域
本发明涉及一组用于评估患者中(特别是患有心肌梗死(myocardial infarction，MI)后的患者中)心力衰竭(Heart Failure，HF)或心室重构(ventricular remodeling)的风险或严重性的新型生物标记物，和用于测量这些生物标记物水平的诊断试剂盒。
发明背景
心力衰竭(HF)不是一种具体的疾病，而是一些体征和症状的集合(compilation)，其全部是由心脏不能随需要适当增加心输出量所引起的。患者典型地表现出气促、水肿和疲劳。HF已经成为一种流行比例疾病，影响3％的成年人群。HF的死亡率高于很多类型的癌症，其五年存活低于30％。心肌梗死(MI)是引发HF的主要原因之一。63％的患者在MI后6年内发生HF。左心室重构在很大程度上促进HF。因为HF在老年人中更普遍，因此受影响的个体数量将随着我们老龄化人口而持续上升。
近十年来的广泛研究已经对HF的病理生理学带来了更好的理解。同时，已经确定了许多新型治疗靶标，尽管其中只有少数具有潜在的治疗用途。这些靶标中的一些在其预后值被证实时，被称为“预后生物标记物”或“生物标记物”。
生物标记物可以分为三类。可以帮助护理表面健康个体的生物标记物称为“筛选生物标记物”。在怀疑患有疾病的患者中观察到的生物标记物称为“诊断生物标记物”，且在患有明显疾病的患者中观察到的生物标记物称为“预后生物标记物”。虽然在临床实践中使用诊断生物标记物，诸如关于MI的肌钙蛋白I和肌钙蛋白T和关于心力衰竭的脑钠肽(BNP)，但是这些生物标记物作为预后生物标记物来调整针对个体患者的治疗(“个性化医学”)的潜在用途尚未得到证实。
必须注意，越早确定患者在MI后发生HF的倾向可以使得越有效的调节治疗。然而，使用单独生物标记物的主要局限性在于不是所有患者都可以独立地表现出所述风险因子。因此，已经证明患者在MI后倾向于发生HF的早期确定将相当大地受益于生物标记物的倍增和整合。
血管内皮生长因子(VEGF)，即一个生长因子亚家族，是一个广泛的术语，其涵盖许多来自于许多家族的蛋白。主要研究了这些生长因子的血管生成特性。迄今为止已经鉴别了多种生长因子，其中最充分已知的是VEGFA。VEGFA经常被简称为“VEGF”(Ferrara等″The biology of VEGF and its receptors(VEGF及其受体的生物学)″Nat Med.(自然医学)2003年6月；9(6)：669-676)。本发明提议的生物标记物之一，VEGFB，是血管内皮生长因子家族的一部分，但是与VEGFA不同。
发明目的
本发明的目的是：
1.为了提供预后工具
本发明的目的是提供用于早期预后HF发生的工具，从而改善存活和减少恶化HF发生。
本发明的另一个目的是使用该预后工具来确定处于发生心室重构和心力衰竭的风险的患者。
本发明的另一个目的是使用该预后工具来调节治疗，从而更好地预防MI后发生心室重构和HF。
2.为了提供新型诊断试剂盒
本发明的目的是提供能够测量生物液体中标记物浓度的试剂盒，从而协助早期预后HF发生，以改善存活和减少恶化HF的发生。
本发明的另一个目的是提供用于确定处于发生心室重构和HF的风险的患者的新型诊断试剂盒。
本发明的另一个目的是提供用于调节治疗的新型诊断试剂盒，从而调整治疗以更好地预防MI后发生心室重构和HF。
此外，本发明还有一个目的是提供可以用于在MI后筛选患者，以获得患者发生HF或心室重构的易感性的生物标记物。
令人意外地，我们已经发现以下蛋白VEGFB、THBS1和PGF的mRNA和血浆水平在MI后变化并且是患者继续发生HF和/或心室重构的可能性的优秀指示。
因此，这些生物标记物可以用于筛选MI患者，并且特别地，提供用于确定那些患有MI的患者处于增加的当时继续发生HF和/或心室重构的风险的早期预后工具。还提供用于测量这三种生物标记物水平的诊断试剂盒，并且它们有效用于在MI背景下预测HF和/或心室重构的发生。
发明概述
根据第一方面，本发明提供确定具有增加的发生心脏病症风险的心肌梗死患者的方法，包括：
-在梗死后，测定来自患者的体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)、血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-将所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平与来自参考样品的相应VEGFB，THBS1和/或PGF水平进行比较，所述参考样品具有已知的临床结果；和
-基于所述比较确定所述患者是否具有增加的发生心脏病症风险。
还提供确定具有增加的发生心脏病症风险的心肌梗死患者的方法，包括：
-在梗死后，测定来自患者的体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)、血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-将所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平与对照的相应VEGFB，THBS1和/或PGF水平进行比较；和
-基于所述比较确定所述患者是否具有增加的发生心脏病症风险。
在一些实施方案中，以下各项中至少一项指示所述患者患有所述心脏病症的增加的可能性：
-与VEGFB对照水平相比，在测定的患者中更低的VEGFB水平；
-与THBS1对照水平相比，在测定的患者样品中更高的THBS1水平；和/或
-与PGF对照水平相比，在测定的患者样品中更高的PGF水平。
优选地，心脏病症可以是心肌梗死、急性冠脉综合征(acute coronary syndrome)、缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy)或非缺血性心肌病(non-ischemic cardiomyopathy)。更优选地，患者可以继续发生或患有心力衰竭。优选地，患者可以经历心室重构。应该理解许多心肌梗死患者经历心室重构并且随后，或同时，发生称为心力衰竭的病症。因此，在心室重构和心力衰竭之间存在明显的相关性，并且优选地，经历心室重构的心肌梗死患者也会发生心力衰竭。
还优选的是取自患者的体液样品是血液样品、组织液样品、血浆样品、血清样品或尿液样品。
优选地，测定的VEGFB，THBS1和/或PGF水平是mRNA水平。这些可以通过测定红血细胞和/或白血细胞中的mRNA来确定。优选地，血细胞是白细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板、或红细胞。
优选地，VEGFB，THBS1和/或PGF可以在来自血细胞的mRNA水平，通过任何能够量化mRNA的技术，最优选定量PCR，最优选微阵列来测量。还优选的是，VEGFB，THBS1和/或PGF可以在血浆中的蛋白水平，通过任何能够量化蛋白的技术，最优选ELISA来测量。mRNA测定结果可以与血浆蛋白测定结果组合使用，以进行更精确的评估。
优选地，仅测定PGF水平，所述PGF优选地可以是SEQ ID NOS 7-9中给出的任意PGF序列，或其片段。还优选的是，仅测定THBS1水平，所述THBS1优选地是可以是SEQ ID NOS 4-6中给出的任意THBS1序列，或其片段。然而，更优选的是，测定THBS1和PGF二者的水平。
特别优选的是，测定VEGFB水平，所述VEGFB优选地可以是SEQ ID NOS 1-3中给出的任意VEGFB序列，或其片段。其可以单独地或与THBS1和/或PGF组合。优选地，VEGFB可以是剪接变体VEGFB 186、剪接变体VEGFB 167或二者。
优选地，mRNA水平在心肌梗死当天测定。在其他优选的实施方案中，用于测定的mRNA或血浆蛋白样品在第1天，即心肌梗死后的那天获得。优选地，测定在第1天或第2或第3或第4或第5或第6或第7天，或梗死后直至1个月内的任何时刻获得的后继样品。
优选地，后继样品在第1天获得自患者并且将来自第1天的测定值与参考样品进行比较。然而，优选的是，后继样品在第1天获得自患者，并且将来自第1天的测定值与来自梗死当天的样品的测定水平进行比较。这对于VEGFB是最优选的。换言之，特别优选的是，测定对照样品、第一MI后样品和后继样品的VEGFB水平并比较这些VEGFB水平。来自参考样品的VEGFB水平到第1或2天的增加在确定患者处于更低的发生所述病症的风险是特别有用的。类似地，来自对照样品的VEGFB水平到第1或2天的降低于在确定患者处于更高的发生所述病症的风险是特别有用的。
然而，还优选的是来自第0或1天的第一MI后样品与第1或2天的随后样品(MI后)的VEGFB水平进行比较，因为从第0或1天到第1或2天的VEGFB增加高度指示患者具有降低的发生所述病症的风险。在第0天和第2天之间或第1天和第3天之间测量到VEGFB变化是特别优选的。
实际上，我们发现血浆VEGFB水平在MI后第0天和第1天的高EF组和低EF组之间是类似的。然而，在第2天，VEGFB水平在高EF患者中增高(与第0天相比为2倍)，而它们在低EF患者中下降(与第0天相比为2.5倍)(图9)。这些数据与高EF患者中的VEGFB mRNA上调相一致(图8)。这些结果提示能够在MI后增加其VEGFB产生的患者更倾向于具有有利结果。
从第0或1天到第1或2天，且特别是从第0天到第2天的VEGFB减少高度指示患者具有升高的发生所述病症的风险。
本发明测量某些生物标记物的表达或流行程度(prevalence)水平的变化，而非有时在现有技术的情形中仅测量其存在或不存在。为了测量所述水平的变化，需要建立参考点。这可以优选地是另一种样品中，特别是较早期样品，优选在梗死当天(第0天)或在梗死后第1或第2天获得样品中的水平。优选地，对照样品分别是梗死当天VEGFB、THBS1或PGF的基础水平。
备选地，对照可以是可获自具有已知临床结果范围的梗死患者群体的参考值。数据库可以由来自梗死患者的数据构建，并且一旦针对年龄、性别等校准，可以针对这样的患者来确定平均(认为模式、平均或中值是适当的)值或平均值范围，所述患者具有某种标准(例如性别、体重和年龄)，在梗死后特定时刻来测量，并具有已知的临床结果(即，心力衰竭或不心力衰竭)。来自测定的患者的数据然后可以与该参考值或参考范围进行比较，以确定被测定患者具有一种或其他临床结果的可能性。例如，如果确定在梗死后第1天测量的年龄为55-60岁的梗死男性患者血浆中VEGFB水平低于约“X”微克/ml给出50％的心力衰竭可能性，然后测定样品可以在第1天获取自相应的男性，并与该值进行比较，以确定50％的可能性是否适用于该患者。
该确定步骤可以通过合适的统计学分析，例如，“最近邻”比较技术，诸如Kstar和SVM程序。特别优选的实例是使用数据模拟平台，诸如Weka。这之后可以是分级聚类(hierarchical clustering)，优选利用具有算术平均值和相关系数的未加权配对组法进行。然后可以使用GEPAS进行聚类显示。任选地，统计学显著性测试、Pearson相关性值、和绘图(graphical plots)可以使用Statistica包(v.6.0)生成。
所述方法还可以包括针对一名或多名MI患者收集数据，所述数据优选包括三种mRNA和/或血浆蛋白(VEGFB，THBS1和/或PGF)中至少一种的水平或数值，和优选每一种的水平或数值和该患者的相关临床结果。这用于创建与特定临床结果相关的VEGFB，THBS1和/或PGF的特征/值数据。
随后，可以使用来自各个体的数据组建数据库。这些已知的数值可以称为参考(或“已见(seen)”)样品。
“查询”或“未见(unseen)”样品数据(即例如来自近期梗死新患者的样品数据)输入并针对数据库中的参考数据查询。这些查询数据获自由刚患有MI并需要建立其发生心力衰竭的可能性的患者收集的样品。换言之，关于该患者的临床结果是未知的并且操作者要求该程序预测该患者的结果(MI后增加或降低的HF风险)。
该程序使未见/查询样品数据与参考数据组进行比较并使其预测患者的临床结果。
在参考是以上mRNA的情况下，应该理解同样适用于血浆蛋白水平。
优选分类器(classifier)用来确定预后。所述分类器可以包括公知用于以不同方式进行预测的程序，诸如PAM，Kstar和SVM。然而，通常仍存在“未见”样品与一种或多种“已见”数据点的mRNA(或蛋白)数据的比较，例如当搜索“最近邻”时。例如，Kstar和SVM使用不同的运算法则，但是基本以相似的方式通过将查询数据或值针对最近参考值组进行比较来工作。
因此，优选的是，分类器搜索数据库并比较查询/未见数据和已知/已见数据。由于已经发现，数据库中的“最近匹配”(例如当分析全部三种mRNA或血浆蛋白水平时以3-D意义)，该程序基于最近匹配的临床结果建立其关于查询患者的临床结果预测。
还提供一种方法，包括：
-分析来自MI后患者体液的VEGFB，THBS1和/或PGF的mRNA或血浆蛋白水平，以确定该患者的特征数据，使该特征数据与所述患者中发生心力衰竭相关的特定临床结果相关联，并将该特征数据输入数据库；
-针对许多MI后患者重复所述分析，以组建数据库，使所述数据库包含关于HF发生和VEGFB，THBS1和/或PGF水平之间的关系的参考信息；
-确定具有未知预后的MI后患者的特征数据；和
-处理来自所述患者的VEGFB，THBS1和/或PGF特征数据，以使其与数据库中的特征数据进行比较；和
-取决于所述比较的结果输出关于MI后未知预后患者的可能预后。
根据本发明的第一方面方法中还可包括这些步骤。
可能的预后可以是增加或降低的HF风险，其可以然后影响临床医生关于患者的进一步处方(proscribed)治疗。术语预后和诊断可以交换使用，除非明显不同。
还提供包括来自MI患者的特征数据的数据库，所述特征数据包括与MI后测定的VEGFB、THBS1和PGF中至少一种和优选全部三种匹配的患者的临床结果，如本文中所述。本发明还提供比较装置，诸如用于访问数据库和/或处理查询的计算机。本发明还提供一种系统，其包括数据库和至少一台用于访问和/或操作该数据库的计算机。一台或该台计算机也可以用于使用待测患者的特征数据来处理或执行数据库的查询。
数据库可以集中存储，例如，存储在服务器中，或可以保持在用于测定VEGFB，THBS1和/或PGF水平的实验室或野外设备中，或与所述设备相连的计算机中，如下讨论。计算机还可以与服务器集中设置或远程设置，例如，设置在中间实验室中，或设置在野外设备中。
还提供一种试剂盒，其可以包括用于测定来自患者的样品的实验室或野外设备。所述设备可以包括数据库或可以仅包括分析结果的显示器或读数器。所述设备可以具有远程，例如，通过因特网网络或因特网，无论通过有线或无限广播的方式，联系数据库的能力。
本发明还提供由患者获得特征数据的方法，所述方法通过测定VEGFB，THBS1和/或PGF水平和优选使该水平数据与患者相关联，例如通过使用患者标识符，诸如代码来实现。
还提供接收来自患者的关于VEGFB，THBS1和/或PGF水平的特征数据以使其与数据库中的特征数据进行比较的方法。该数据可以通过接收器来处理或传输到处理器。
因此，本发明还提供处理来自患者的关于VEGFB，THBS1和/或PGF水平的特征数据并使其与数据库中的特征数据进行比较的方法。患者的可能的预后可以由处理器，根据该比较的结果输出，并可以任选地通过网络、因特网和通过有线或无线传输而传输到单独的计算机和/或上述试剂盒或设备。
数据库也可以保存在载体介质，诸如磁盘或记忆装置上。因此，本发明还提供包括数据库的载体介质，所述数据库被安排为当使用来自患者的关于VEGFB，THBS1和/或PGF水平的特征数据查询时导致计算机确定患者在MI后发生HF的可能性。
VEGFB，THBS1和/或PGF的水平可以被认为是数值或比率，且不必须是体积或质量/单位体积等。
优选地，参考样品来自与所述患者类似的人口统计组、基因型组或表型组。参考样品可以被认为处于与梗死的患者相同的人口统计组，条件是达到任何数量的以下标准：性别、年龄、人种或种族背景、和病史。合适的基因型或表型对照样品可以基于任何数量的合适的选择标准来选择，所述选择标准诸如在一个或多个基因座处，特别是已知与梗死患者、心力衰竭和/或心室重构有关的那些基因座处确定患者的基因型。
确定基因型可以包括检测MMP-9(基质金属蛋白酶9)的血红素结合蛋白结构域序列中氨基酸变化的存在，所述结构域中氨基酸变化的存在指示在心肌梗死后对所述心脏病症的易感性。优选地，所述检测的序列包含或编码与MMP-9的血红素结合蛋白结构域的位置148相对应的位置处的谷氨酰胺(Gln)或精氨酸(Arg)氨基酸残基。优选地，所检测的序列是SEQ ID NO.13，其来自处于风险中(易感)组的MMP-9的血红素结合蛋白结构域的氨基酸序列(在氨基酸位置148处显示Arg)，或编码它的多核苷酸序列。MMP-9基因的编码序列中存在的单核苷酸多态性(SNP)在心肌梗死后具有好或差的心力衰竭预后的患者中以不同的频率存在，并可以导致转录的和活性的MMP-9蛋白的血红素结合蛋白结构域中单氨基酸改变，由此导致MMP-9上与金属蛋白酶-1(TIMP-1)的组织抑制剂结合的位点中的静电变化。这是显著的，因为TIMP-1是MMP-9活性的最重要的抑制剂。因此，其可以有效用于确定本患者是否具有以上SNP，并且然后，如果它具有SNP，则比较VEGFB，THBS1和/或PGF水平(在本发明的测定的样品中)和来自也已知具有以上SNP的患者的样品中的水平，或反之亦然。
优选地，降低的心脏病症风险的确定与分别具有相对高水平VEGFBmRNA(＞-1.4)、相对低水平THBS1(＜0)和/或许多低水平PGF(＜-0.1)的那些梗死参考患者有关。这些数值表示为对数比(患者RNA/参考RNA)。相反的内容适用于增加的发生心脏病症的风险。
以上数值源自表4，尽管优选地，这些可以通过至少1或2％，更优选至少5％，更优选至少7％，更优选至少10％，更优选至少15％，更优选至少20％，更优选至少25％，更优选至少30％，更优选至少40％，和甚至多达50％而变化。
由于唯一确定的HF(心力衰竭)生物标记物是BNP(脑钠肽)前体，所以此处公开的3种生物标记物的组的预后性能与N端脑钠肽前体(NT-pro-BNP)的预后性能进行比较。在MI后一天测量的N端脑钠肽前体的血浆水平的预后性能是中等的(AUC＝0.63，表5)。因此，此处公开的3种生物标记物的组明显胜过N端脑钠肽前体的预后价值。然而，优选地，BNP还可以在本发明的方法中测定，从而增加准确性或验证确定的预后。该BNP测定的水平可以与本文中公开的BNP基础或参考水平进行比较。
关于BNP前体的核苷酸和蛋白序列以SEQ ID Nos 10-11来提供。
还提供确定关于心肌梗死患者的预后的方法，所述方法包括：
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)水平和血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-将所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平与来自参考样品的相应VEGFB，THBS1和/或PGF水平相比较，所述参考样品具有已知的临床结果；和
-基于所述比较确定所述患者的预后。
血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)的水平优选是低血浆水平。
还提供确定关于心肌梗死患者的预后的方法，所述方法包括
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)水平和血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-将所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平与对照相比较；和
-基于所述比较确定所述患者的预后。
这可以通过比较所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平和来自参考样品的相应VEGFB，THBS1和/或PGF水平实现；
其中以下至少一项表示所述患者不利预后增加的可能性：
-与VEGFB对照水平相比，测定的患者样品中更低的VEGFB水平；
-与THBS1对照水平相比，测定的患者样品中更高的THBS1水平；和/或
-与PGF对照水平相比，测定的患者样品中更高的PGF水平。还提供确定关于心肌梗死患者的预后的方法，所述方法包括
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)水平和血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-使用所述VEGFB、THBS1和PGF水平对以前构建的统计学程序(也称为“分类器”)进行查询；
-高VEGFB水平和低THBS1和PGF水平与增加的发生所述心脏病症的可能性相关；和
-该分类器将指示患者是否具有增加的发生所述心脏病症的可能性。
血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)的水平优选是低血浆水平。
不利的预后优选是患者具有增加的患有所述心脏病症的可能性。
本发明还提供确定心肌梗死患者发生心脏病症的可能性的方法，其包括以上步骤。
根据另一方面，本发明提供鉴定具有减小的发生心脏病症的风险的心肌梗死患者的方法，其包括：
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)水平和血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-比较所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平和来自参考样品的相应VEGFB，THBS1和/或PGF水平，所述参考样品具有已知的临床结果；和
-基于所述比较确定所述患者是否具有减小的风险。
根据另一方面，本发明提供鉴定具有减小的发生心脏病症的风险的心肌梗死患者的方法，其包括：
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)水平和血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-比较所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平和来自对照的相应VEGFB，THBS1和/或PGF水平；和
-基于所述比较确定所述患者是否具有减小的风险。
该方法可以被修改为包括比较所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平和参考中的相应VEGFB，THBS1和/或PGF水平；
其中以下至少一项表示所述患者患有所述心脏病症的降低的可能性：
-与VEGFB对照水平相比，测定的患者样品中更高的VEGFB水平；
-与THBS1对照水平相比，测定的患者样品中更低的THBS1水平；和/或
-与PGF对照水平相比，测定的患者样品中更低的PGF水平。
该方法可以被修改为包括：
-使用所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平对以前构建的统计学程序(也称为“分类器”)进行查询；
其中
-高VEGFB水平和低THBS1和PGF水平与降低的发生所述心脏病症的可能性相关；和
-该分类器将指示患者是否具有降低的发生所述心脏病症的可能性。
本发明还提供筛选心肌梗死患者以获得用于评估每名患者可以发生心脏病症的风险的患者的方法。这可以是增加的风险或减小的风险。
本发明的方法将一种或多种生物标记物的测量与MI后更好的临床结果相关联。最优选地，所述生物标记物是VEGFB，并且如果其水平在MI后第1天时高，则该患者具有MI后更有利的临床结果。最优选地，所述生物标记物是THBS1，并且如果其水平在MI后第1天时低，则该患者具有MI后更有利的临床结果。最优选地，所述生物标记物是PGF，并且如果其水平在MI后第1天时低，则该患者具有MI后更有利的临床结果。
应该理解，本方法有效用于通过使多种生物标记物的组合评估(其根据它们的水平可以指示MI后更好的临床结果)相关联来确定患有MI的患者中的预后的方法。
本发明还可以用于个人化的医学设置。在本发明的另一方面，提供一种基于鉴定处于发生心脏病症风险的那些患者来提供或改进MI后患者的治疗策略的方法。这可以通过分析血细胞mRNA水平和VEGFB，THBS1和/或PGF的血浆蛋白水平进行。
用于本发明的诊断试剂盒对于THBS1和PGF容易获得，诸如可获自R&D Systems.Inc(R&D系统公司)的那些。然而，对于VEGFB，必须构建我们自己的诊断试剂盒，讨论如下。事实上，唯一的可商购VEGFB试剂盒(来自USCNLIFE，VEGFB E0144h)灵敏度不足以检测低VEGFB血浆水平。利用增强的化学发光作为检测方法和使用生物素-链霉抗生物素蛋白的扩增步骤，我们的试剂盒的检测极限是10pg/mL，而利用经典比色检测的USCNLIFE试剂盒的检测基线被发现为约100pg/mL。
因此，本发明还提供用于测定样品中VEGFB水平的方法，其包括：
(a)使样品与固定于支持物的至少一种捕获试剂相接触，以形成固定的捕获试剂-样品复合物；
(b)将样品与所述至少一种固定的捕获试剂分开；
(c)使固定的捕获试剂-样品复合物与特异于VEGFB的第二抗体相接触并任选地使第二抗体与特异于该第二抗体的第三抗体相接触；
(d)使第二抗体或第三抗体与缀合于检测设备的结合分子，诸如链霉抗生物素蛋白相接触；和
(e)利用所述检测设备测量与捕获试剂结合的第二抗体或第三抗体的水平。
优选地，所述捕获试剂是抗体，最优选是与抗人VEGFB的抗体小鼠单克隆的克隆58013识别相同表位的抗体，所述单克隆抗体优选特异性结合VEGFB 167和/或VEGFB 186。
优选地，所述第二抗体是与特异性结合VEGFB 167和/或VEGFB 186的抗体山羊多克隆识别相同表位的抗体。优选地，所述第三抗体是特异于第二抗体的生物素-缀合的抗体，例如驴抗山羊Ab。优选地，所述检测设备包括碱性磷酸酶活性。
因此，在优选的实施方案中，本发明提供用于测定样品中VEGFB水平的方法，其包括：
(a)使样品与固定于固体支持物的捕获试剂相接触和，任选地一起温育，其中所述捕获试剂是与抗人VEGFB的抗体小鼠单克隆的克隆58013识别相同表位的抗体，所述单克隆抗体优选特异性结合VEGFB 167和/或VEGFB 186，以形成固定的捕获试剂-VEGFB复合物；
(b)将样品与固定的捕获试剂分开；
(c)使固定的捕获试剂-VEGFB复合物与第二抗体相接触，其中所述第二抗体是与特异性结合VEGFB 167和VEGFB 186的抗体山羊多克隆识别相同表位的抗体；
(d)使第二抗体与第三抗体相接触，其中所述第三抗体是特异于第二抗体的生物素-缀合的驴抗山羊抗体；
(e)利用第三抗体与缀合于碱性磷酸酶的链霉抗生物素蛋白相接触；
(f)利用检测设备测量与捕获试剂结合的VEGFB 186或VEGFB 167的可检测抗体的水平。
另外，我们提供用于测量生物液体中VEGFB 186和VEGFB 167水平的ELISA试剂盒及其作为用于鉴定处于在MI后发生HF风险的患者的诊断工具的应用。
所述试剂盒优选包括；
(a)至少一种固定于支持物的捕获试剂；
(b)特异于VEGFB 186和/或VEGFB 167的第二抗体；
(c)任选地，特异于所述第二抗体的第三抗体；
(d)与检测设备缀合的结合分子，诸如链霉抗生物素蛋白；和
(e)设备，其用于利用检测设备测量与捕获试剂结合的第二抗体或第三抗体水平。
如上，优选地，所述捕获试剂是抗体，最优选是与抗人VEGFB的抗体小鼠单克隆的克隆58013识别相同表位的抗体，所述单克隆抗体优选特异性结合VEGFB 167和/或VEGFB 186。优选地，所述第二抗体是与特异性结合VEGFB 167和/或VEGFB 186的抗体山羊多克隆识别相同表位的抗体。优选地，所述第三抗体是特异于第二抗体的生物素-缀合的抗体，例如驴抗山羊Ab。优选地，所述检测设备包括碱性磷酸酶活性。
所述生物样品可以，优选地，由人类受试者分离并可以是血浆或血清。还优选地，固定的捕获试剂涉及包被在微量滴定板上。优选地，所述检测通过化学发光试剂来扩增。纯化的人VEGFB 167可以作为抗原标准提供。
我们对我们的VEGFB试剂盒和我们发现的唯一可商购VEGFB试剂盒(USCNLIFE VEGFB E0144h)进行比较。我们的试剂盒更灵敏并因此容许比USCNLIFE试剂盒测量更多患者中的VEGFB。
根据另一方面，本发明提供鉴定具有降低的发生心脏病症风险的心肌梗死患者的方法，其包括：
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)、血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；和
-使用所述VEGFB、THBS1和PGF水平对以前构建的统计学程序(也称为“分类器”)进行查询；
其中
-高VEGFB水平和低THBS1和PGF水平与降低的发生所述心脏病症的可能性相关；和
-该分类器将指示患者是否具有降低的发生所述心脏病症的可能性。
我们具有大的急性MI患者数据库，其具有超过20种临床参数和4个月和1年的随访。除其他临床参数以外，心脏的射血分数(EF)，其代表心脏将血液泵至外周动脉的能力，通过超声心动描记术，在梗死当日，4个月后和1年后进行测量。假设4个月的EF≤40％的患者患有重构，而4个月的EF＞40％的患者正常复原。我们实验室中进行的若干方案使用所述数据库，通过不同方法来鉴定MI后HF发生的早期生物标记物。通过两种基础不同的方法鉴定的生物标记物组合并且最具预见性的生物标记物的组合定义为“预后组”。
第一种方法涉及DNA微阵列技术。循环的血细胞的生物标识(Biosignature)或基因表达特征由在MI当日抽取的血样分析。该技术容许鉴定在两组具有极端表型的患者之间受到不同调节的基因，即第一组患者在MI后具有有利的临床结果(高EF组，EF＞40％)，且一组在MI后具有不利的结果(低EF组，EF≤40％)。我们已经表征了来自32名患者(高EF和低EF组各16名)的血细胞的生物标识。利用SAM运算法则(微阵列统计分析(Statistical Analysis of Microarrays))和倍数变化1.3，发现525种基因在2组患者罕见区别性表达(假发现率24.5％)。在这些基因中，9种具有关于HF的显著预后价值。
第二种方法基于人MI中血管生成的蛋白-蛋白相互作用网络的生物信息特征。事实上，血管生成是在MI后发生在心脏中的有益的修复过程之一并且血管生成中的缺陷可以导致HF。该网络使用来自人蛋白参考数据库(Human Protein Reference Database)的有注解的蛋白-蛋白相互作用构建。这种综合的网络由556个点(即蛋白)和686个边(即相互作用)组成。在随后的基于网络的和基因表达分析后，38个网络来源的基因显示显著的预后价值。有趣地，基于基因表达的分类模型与基于网络的分类模型的组合与分别考虑各方法相比，产生减少数量的具有极大改善的预后价值的候选生物标记物。曲线下面积(AUC)，其代表生物标记物的预后能力，关于基于基因表达的分类模型为0.56-0.72，且关于基于网络的分类模型为0.56-0.73。当两种模型组合时，实施AUC为0.82的3种生物标记物的组(其关于HF的发生具有强预后价值)：该组在此处称为“预后组”。这3种生物标记物是：血小板反应蛋白-1(THBS1)，胎盘生长因子(PGF或PlGF)，和血管内皮生长因子B(VEGFB)。虽然THBS1具有抗-血管生成特性，但是VEGFB和PGF将其促-血管生成能力归功于血管内皮细胞生长和增殖的刺激。
然后，我们检验通过微阵列在mRNA水平观察到的基因表达的差异在蛋白水平有效。为了该目的，3种生物标记物的血浆水平通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来测量。这些实验证明THBS1和PGF的蛋白水平在具有高EF和低EF的患者之间可显著区别。
由于发现可商购的VEGFB ELISA试剂盒的灵敏度不足以检测我们的血浆样品中的VEGFB，我们设计我们自己的试剂盒，该试剂盒容许量化生物液体诸如人血浆中的VEGFB。
通过“有利结果”，应该理解这意指患者继续发生心脏病症，诸如心力衰竭和/或患有左心室重构的更低的风险。认为右心室重构不太相关，因此其不是优选的。
通过“不利结果”，应该理解这意指患者继续发生心脏病症，诸如心力衰竭和/或患有左心室重构的更高的风险。
还应该理解虽然心力衰竭和左心室重构的风险是相关的，但是这些是单独的病症并且，因此患者可以患有一种而不患有另一种。因此，增加的心力衰竭或心室重构风险是不利的。
应该理解序列表中给出的RNA序列包括胸腺嘧啶(T)，因为它们是这样在NCBI网站上表示的。在各情形中，清楚地预期T被尿嘧啶(U)替代。
附图简述
图1是使用SAM运算法则解释的微阵列数据图示。
图2显示人MI中血管生成的蛋白-蛋白相互作用网络。
图3图示用于基于基因表达的分类模型与基于网络的分类模型的组合分析的策略。
图4显示图示具有高(H)和低(L)射血分数的患者中生物标记物的表达(微阵列)差异的热量图(heat-map)。
图5显示图示射血分数和通过微阵列和ELISA测定的生物标记物表达之间的关系的分位数-分位数图(quantile-quantile plots)。
图6显示图示射血分数和通过微阵列和ELISA测定的生物标记物表达之间的关系的散布图(scatter-plots)。
图7表示梗死当日(第0天)和后一日(第1天)之间VEGFB血浆水平的进展。在具有低EF患者中血浆VEGFB在第0天和第1天之间减少(-10％)，具有高EF的患者具有增加的VEGFB水平(+15.4％)。
图8A显示关于高EF和低EF患者使用定量PCR和微阵列的VEGFB表达值。
图8B显示在VEGFB表达和射血分数之间观察到的显著相关性。
图9显示MI后第0天、第1天和第2天时高EF组和低EF组之间的VEGFB水平。
表1总结基于VEGFB、THBS1和PGF的mRNA水平的分类模型的预测性能。
表2总结支持本发明的实验中获得的结论。
表3总结为了比较具有高EF的患者和具有低EF的患者之间的VEGFB、THBS1和PGF水平进行的统计学。
表4总结两组中3种生物标记物的mRNA水平之间的比较的统计学。
表5总结N端脑钠肽前体的预测性能。
表6是在高EF组和低EF组之间差别性表达的28种血管生成基因的列表。
表7显示利用两种机器学习模型的预测性能。
详述
心力衰竭(HF)是心肌梗死(MI)的主要并发症。近期数据显示63％的患者在MI后6年内发生HF。血管生成是MI后参与修复心肌的关键现象。血管生成受到被大量血管生成因子控制的平衡的密切调节，一些血管生成因子是促血管生成的且另一些是抗血管生成的。该平衡的反常可以导致不适当的血管生成并可以为MI发作后发生HF创造条件。
近期的报告明确指出患者倾向于在MI后患有HF的早期确定可以显著改善治疗策略对各患者的适应(“个人化医学”)。如许多其他心血管病症，HF是多因子病。因此，使用单一生物标记物预测MI后HF的发生具有有限的价值。因此预后生物标记物的增加对精细预测HF可以是感兴趣的。
首先，我们假设可以通过分析循环血细胞的生物标识来鉴定一组预后生物标记物。第二，我们假设基于蛋白-蛋白相互作用网络的方法还可以具有突出HF的预后生物标记物的潜力。并且第三，我们测试由这两种独立的方法获得的数据的组合是否将容许获得比单独进行的各方法更高的预后水平。
为了该目的，我们选择两组患有MI的患者(n＝16/组)，一组患者在MI后具有有利结果(射血分数(EF)＞40％)且一组患者具有不利结果(EF≤40％)。选择这种选择“极端表型”的策略来增加在不需要大样本尺寸的条件下，发现两组之间差别性表达的基因的机会。RNA由分离自这些患者的外周血的全细胞提取。生物标识通过微阵列特征来确定。若干次标准化、过滤和统计学程序后，发现一组525种基因在两组患者之间差别性表达(倍数变化1.3；假发现率24.5％)。其中，通过分类模型鉴定一簇47种具有中等预后价值的基因，其最大AUC为0.72。进一步过滤这些基因导致一簇9个具有等价预后价值的基因(AUC 0.68)。
为了试图增加由微阵列实验重新获得的基因提供的预测的强度，并考虑血管生成在MI后修复心脏中的重要性，绘制人MI中血管生成的蛋白-蛋白相互作用网络。该网络通过从公共数据库中提取已知参与该过程和相应的(curated)蛋白-蛋白相互作用的基因来装配。该网络的聚类分析报告与细胞生长和生长调节显著相关的模块。在该聚类中，发现38种基因在EF种类之间显著差别性表达。使用这38种基因构建的不同的独立分类器报告中等预后价值(最大AUC＝0.73)，其等价于由微阵列获得的预后价值。有趣地，进一步过滤这些基因(基于相关性的特性选择)产生一组3种具有较强预后价值的基因(利用基于实例的学习者，AUC＝0.82，表1)。这3种基因，即VEGFB、THBS1和PGF，在此处作为新的HF的生物标记物“预后组”来检查。这3种基因的差别性表达通过定量PCR来确认。另外，测量这3种生物标记物的血浆水平。
在一种发现中，我们显示能够确定(mount)针对MI的显著应答、特征为血管内皮生长因子B(VEGFB)的高mRNA或血浆蛋白水平和血小板反应蛋白-1(THBS1)和胎盘生长因子(PGF或PlGF)的低血浆水平的患者具有发生HF和/或经历心室重构的低易感性。这三种生物标记物的血浆水平的测量因此可以起用于预测MI后发生HF和/或心室重构的有效工具的作用。
表1.基于3种生物标记物的mRNA水平的分类模型的预测性能。
  输入类型   分类模型  典型准确性*(％)   AUC*
  只有基于SAM的生物标记物   K*  65   0.63
  基于网络的生物标记物   K*  84   0.82
  只有基于SAM的生物标记物   SVM  68   0.68
  基于网络的生物标记物   SVM  75   0.75
*基于留一法交叉验证(leave-one-out cross-validation)。
所用的潜在生物标记物：SAM-来源的(9种基因)和基于网络的(3种基因)。
AUC：(ROC)曲线下面积；SVM：支持载体机器(Support Vector Machine)。
因此，我们提议一种基于一簇3种生物标记物，即VEGFB、THBS1和PGF的测量来鉴定MI后处于发生HF风险的患者的新策略。这些测量可以由提取自血细胞的RNA或由相应蛋白的血浆水平来进行。
表2总结支持本发明的特定发现。
表2.3种生物标记物的mRNA和血浆水平与EF之间的关联。
Figure BPA00001354877400201
mRNA水平通过微阵列，在MI当日收获的血样中测量。
血浆水平通过ELISA，在MI后一天测量。
本文中引用的全部参考文献由此在不与本发明相冲突的程度下，整体引入。
现将在所附非限制性实施例中更详细地描述本发明。
实施例
实施例1
患者和方法
患者
患有急性MI的患者使用急诊经皮冠状动脉介入术(primary percutaneous coronary intervention)来治疗。急性MI通过存在胸痛＜12小时、显著ST段抬高和阳性心肌酶(cardiac enzymes)来定义。血样在机械再灌注时(用于微阵列和定量PCR分析)和MI后一天(用于血浆水平确定)获得。所有患者签署告知同意书。
微阵列
为了增加我们在心室重构背景下检测相关生物标记物的机会，我们选择两组在MI后具有“极端”表型的患者，即梗死后有利地进展的患者(EF≥45％，平均61％)和不利地进展的患者(EF≤40％，平均33％)。各组包含16名患者。
总RNA通过PAXgeneTM技术，由全血细胞提取。抽取在PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytix
Figure BPA00001354877400211
BD Europe(BD欧洲)，Erembodegem，比利时)中的血液保存在-20℃直至RNA提取。使用PAXgeneTM血液RNA试剂盒(Qiagen，Courtaboeuf，法国)，根据制造商的说明书来进行提取。RNA量利用ND-1000分光光度计(NanoDrop
Figure BPA00001354877400212
 Technologies(纳米滴
Figure BPA00001354877400213
技术)，Wilmington，USA)来测量。RNA质量利用2100 Bioanalyzer
Figure BPA00001354877400214
仪(Agilent Technologies(安捷伦技术)，Massy，法国)，使用RNA 6000Nano芯片来评估。仅考虑高质量RNA(OD260/OD280＞1.9和OD260/OD230＞1.7)和未降解RNA进行进一步分析。
常见的参考RNA(通用人参考RNA，Stratagene Europe，Amsterdam，荷兰)，即来自11种细胞系的RNA的混合物在所有以下步骤中与患者的RNA联合使用，从而提供用于跨阵列比较相对基因表达水平的内部参考标准。
信使RNA利用氨基烯丙基信使AmpTM试剂盒(Amino Allyl MessageAmpTM kit)(Ambion
Figure BPA00001354877400215
，Cambridgeshire，英国)，根据制造商的流程，以1μg总RNA开始来扩增。5μg各种氨基烯丙基aRNA使用Cy3或Cy5(Amersham，Buckinghamshire，英国)来标记。与氨基烯丙基aRNA偶联的染料利用ND-1000 NanoDrop
Figure BPA00001354877400216
分光光度计来测量。染料偶联产率＞5％是进一步分析的先决条件。用Cy3或Cy5标记的750ng各种氨基烯丙基aRNA(参考RNA或供体RNA)在包含25,000个基因的泛基因组(pangenomic)寡核苷酸微阵列(Genomic Platform(基因组平台)，Illkirch，法国)上组合和杂交。杂交四个微阵列/患者并进行染料-交换(2微阵列患者-Cy3/参考-Cy5和2微阵列患者-Cy5/参考-Cy3)。杂交步骤利用Agilent Technologies(安捷伦技术)系统。简言之，RNA使用片段化缓冲液进行片段化，随后与杂交缓冲液混合。微阵列使用处于50mM硼酸盐缓冲液pH＝9.0中的50mM乙醇胺来封闭。使用安捷伦(Agilent)杂交室和旋转烤箱，在60℃，4rpm下进行杂交17h。微阵列在6X SSC，0.005％Triton X-102中洗涤10分钟，在0.1X SSC，0.005％Triton X-102中洗涤5分钟，并然后通过离心来干燥，随后利用Axon 4000B微阵列扫描仪和GenePix Pro 6
Figure BPA00001354877400221
软件(Molecular Devices(分子装置)，Berks，UK)来扫描。在扫描过程中容许自光电倍增器(Selfphotomultiplicator)增益调整和0.1％饱和点。
关于每名患者的全部四个微阵列的点发现和原始数据量化利用MAIA
Figure BPA00001354877400222
免费软件(Institut Curie，法国)，以批次分析进行。该软件分配给每个点9种质量参数，所述质量参数容许确定4个微阵列中的“良好质量点”。仅保留良好的点进行进一步分析。使用Acuity
Figure BPA00001354877400223
软件(Molecular Devices(分子装置))来进行Lowess非线性标准化步骤，以补偿不均匀的Cy3-Cy5分布。在随后的步骤中使用标准化的Cy3/Cy5对数比。然后进行过滤步骤，以除去在4个微阵列中的至少3个种不存在的基因。使用ANOVA来评价4个微阵列/患者中的每一个的质量和再现性，并使用Acuity软件绘制相关系数和自组织映射图(Self Organizing Map)。数据保存在基于网络的微阵列数据管理器MEDIANTE中。
在统计学分析前，滤出在至少50％患者中不存在的基因。利用两种互补的方法进行受监督的分析。第一种方法涉及微阵列显著性分析(SAM)软件，该软件使基因表达与外变量诸如EF值相关联。使用两类不配对测试。使用10个邻近物(neighbour)，通过K-近邻算法(K-Nearest Neighbour algorithm)，进行基因缺失值填充(Gene missing-values imputation)。
蛋白-蛋白相互作用网络
已知与心肌梗死种血管生成相关的一组核心基因由Entrez-Gene数据库检索；查询：“人AND心脏AND血管生成AND心肌AND梗死”。与这些核心基因相关的注释蛋白-蛋白相互作用由人蛋白参考数据库(Human Protein Reference Database(HPRD))检索。
进行网络聚类分析，以鉴定潜在功能网络模块。通过(Cytoscape plug-in)MCODE网络聚类运算法则来鉴定。
关于THBS1、PGF和N端脑钠肽前体的生物化学测定
在来自46名患者的样品中，通过分别使用Quantikine DTSP10和DPG00试剂盒的ELISA测量THBS1和PGF血浆水平(R&D Systems(R&D系统)，Oxon，UK)。该测定的检测限对于THBS1是0.35ng/mL且对于PGF是7p/mL。利用Elecsys 2010免疫学装置(Roche Diagnostics(罗氏诊断)，Meylan，法国)来测量BNP前体(N-端-BNP前体，N端脑钠肽前体)的血浆水平。该测定的检测限是20pg/mL。
VEGFB诊断试剂盒的设置
开发夹心式ELISA来检查VEGFB 167和VEGF-B 186。微量滴定板(Lumitrac 600，Greiner，比利时)包被以100μl小鼠抗-VEGF-B单克隆抗体(PBS中2μg/ml，MAB751，R&D systems(R&D系统)，UK)在4℃过夜。三次洗涤后，用300μl 5％BSA-PBS在500rpm和室温下封闭板1小时。由处于1％BSA-PBS中的具有VEGFB 167(751-VE，R&D Systems(R&D系统))的2000pg/ml-15.6pg/mL来生成标准曲线。封闭后，板被洗涤3次，并用100μl血浆、空白或标准物在500rpm和室温下温育温育2小时。3次洗涤后，将100μl山羊多克隆VEGF-B抗体(400ng/ml，在1％BSA-PBS中，AF751，R&D Systems(R&D系统))加入至各孔并在500rpm和室温下温育1小时。3次洗涤后，将100μ生物素缀合驴抗山羊抗体(1∶27500，在1％BSA-PBS中，705-065-147，Jackson，USA)加入至各孔并在500rpm和室温下温育1小时。3次洗涤后，将100μl链霉抗生物素蛋白缀合的碱性磷酸酶(2μg/ml，在1％BSA-PBS中，016-050-084，Jackson)加入至各孔并在500rpm和室温下温育1小时。用添加有吐温20(pH 7.5)的Tris缓冲盐水洗涤板4次，随后用100μl Lumiphos 530TM(Lumigen，USA)/孔，在500rpm、室温下并避光温育30分钟。利用Polarstar Optima(BMG Labtech(BMG实验室技术)，巴黎，法国)来检测化学发光。
统计学分析
关于各组输入，评价不同的标准统计学和机器学习分类器，例如，关于微阵列的预测分析(PAM)，支持载体机器(SVM)和K*技术。K*是基于实例的模型，该模型基于由其在训练数据组中的最相关(最近)邻近物提供的类型信息来对新样品进行分类。K*应用基于熵的距离测量来评价邻近物组。模型以完全混合(global blend)＝20和用于评价缺失值的平均柱熵曲线来进行。
关于基于网络的基因数据的进一步过滤以使用“最佳第一搜索”(BF)策略的基于相关性特征选择(CFS)运算法则来进行(图3)。CFS是发现最大化基因-类型相关性同时最小化基因-基因相关性的特征(即基因)子集的过滤特征选择法。过滤特征选择法不依赖于任何分类模型来进行。BF策略基于使用子集倒向追踪(backtracking)增加的greedy上升。
分类评价结果利用留一法(leave-one-out)交叉验证(LOO)策略，以及10倍交叉验证来评估。使用交叉验证的ROC(受体操作特征曲线)的评估的曲线下面积(AUC)来总结评估的分类器分类性能。
EF组之间的统计学差异(基于各生物标记物)通过Student′s t检验来进行，并使用非参数检验来证实。使用标准Pearson系数来评估三种生物标记物和EF值之间的相关性(表2)。
软件
使用Weka(v.3.4)数据模拟平台进行机器学习模型执行和统计学评价。分分级的聚类利用非加权配对算术平均法和相关系数来进行。使用GEPAS进行聚类显示。使用Statistica package(v.6.0)生成统计学显著性检验、Pearson相关性值和绘图。
结果
1.微阵列的统计学分析(SAM)图显示525种基因在低EF组和高EF组之间差别性表达(图1)。选择倍数变化的阈值为1.3倍并获得24.5％的FDR。红点代表在低EF组中上调的基因，绿点代表高EF组中上调的基因，和黑点代表两组间倍数变化＜1.3的基因。
2.人MI中血管生成的蛋白-蛋白相互作用网络(图2)。由此产生的网络由556个点(蛋白)和686条边(相互作用)组成。网络聚类分析始终强调存在具有与细胞生长和生长调节有关的(Gene Ontology(基因存在论))生物学过程的高度显著过表现(over-representation)的网络簇(53种蛋白)。
3.图3显示基于基因表达的分类模型与基因网络的分类模型的组合分析容许鉴定3种具有比单独的基于基因表达的分类模型(0.56＜AUC＜0.72)或单独的基于网络的分类模型(0.56＜AUC＜0.73)更高的预后价值(最大AUC＝0.82)的基因。已经使用基于实例的学习模型K*获得了迄今所获得的最高预后性能(基于这3种基因)。
4.热量图显示生物标记物在具有高(H)和低(L)射血分数的患者中的表达差异(通过微阵列获得)(图4)。颜色(红、粉、浅蓝、深蓝)显示表达值的范围(高、中、低、最低)。白色表示不可检测的值。VEGFB明显在具有高EF的患者组中更多表达，而THBS1和PGF在低EF组中更多表达。
5.分位数-分位数图(图5)和散布图(图6)表示由微阵列和ELISA评估的射血分数和生物标记物表达之间的统计学依赖性。所示的线性关系提示这些变量遵从类似的数据分布。来自Student′s t检验的结果和与这些图相对应的线性系数相关性总结中表3中。VEGFB与EF正相关，而THBS1和PGF与EF负相关。使用微阵列和ELISA对THBS1和PGF获得一致的结果。通过微阵列技术发现VEGFB mRNA水平在低EF患者中比在低EF患者中显著更高。
表3
Figure BPA00001354877400251
t：t统计量
r：线性相关系数
统计学针对通过微阵列在MI当日收获的血样中测量的mRNA水平和通过ELISA在MI后一天测量的血浆水平来进行。
6.两组HF患者中3种生物标记物的mRNA水平的描述统计学显示与低EF患者相比，在高EF患者中更高的VEGFB mRNA水平和更低的THBS1和PGF水平(表4)。该表中还提供如由图5和6中确定的与高EF(＞40％)或低EF(≤40％)相关的mRNA水平的理论阈值。例如，在本研究使用的EF患者群中，VEGFB mRNA水平高于-1.4，THBS1 mRNA水平低于0和PGF mRNA水平低于-0.1的患者更倾向于具有高EF。相反，VEGFB mRNA水平低于-1.4，THBS1 mRNA水平高于0和PGF mRNA水平高于-0.1的患者更倾向于具有低EF。换言之，生物标记物水平与已经针对一定范围的临床结果校准的参考样品来比较。重要的是提到3种生物标记物的组合而非单独的各种生物标记物或2种生物标记物的组合更精确地与EF相关。
表4.两组中的3种生物标记物的mRNA水平的描述统计学。
Figure BPA00001354877400261
t：t统计量
p：概率值
SD：标准偏差
7.利用在相同的32名患者中，在MI后一天测量的VEGBF、THBS1和PGF血浆水平的分类器的另外的测试，所述患者已经用于构建产生AUC 0.75的分类器。这提示该分类器的预测性能即使在使用编码其他类型的测量(例如，血浆水平)的不同数据组时也是良好的。
8.由于位于确定的HF的生物标记物是BNP前体，所以本文中公开的3种生物标记物组的预后性能与N端脑钠肽前体的预后性能进行比较。在MI后一天测量的N端脑钠肽前体的血浆水平的预后性能是中等的(AUC＝0.63，表5)。因此，本文中公开的3种生物标记物组明显胜过N端脑钠肽前体的预后价值。
表5.N端脑钠肽前体的预测性能
输入类型         分类模型    典型精确性*(％)    AUC*
N端脑钠肽前体    K*          50                 0.52
N端脑钠肽前体    SVM         63                 0.63
*基于留一法交叉验证。
AUC：(ROC)曲线下面积；SVM：支持载体机器。
实施例2
患者和方法
患有急性MI的患者参与国家MI登记并使用急诊经皮冠状动脉介入术(primary percutaneous coronary intervention)来治疗。急性MI通过存在胸痛＜12小时、显著ST抬高和肌酸激酶和肌钙蛋白I增加至大于正常上限的2倍来定义。血样在机械再灌注时(用于RNA和血浆分离)，MI后一天或两天(用于血浆)获得。方案已经被地区道德委员会批准并且已经从所有患者获得告知同意书。
290名MI患者的验证组来自在University Hospitals of Leicester NHS Trust(莱斯特NHS信托大学医学院)(UK)进行的前瞻性研究。超声心动描记术在遣散(discharge)时和MI后6个月时进行。LV末期舒张容积(LVEDV)利用二面改良的Simpson规则，由顶部2和4室视图来评估。LV重构的程度由遣散和随访中间的LVEDV(□EDV)变化来评估。
微阵列
全血细胞的转录组学特征利用代表25,000个基因的寡核苷酸微阵列获得。数据可以Gene Expression Omnibus database(基因表达精选数据库)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的编号GSE8723来获得。利用微阵列显著性分析(SAM)软件进行受监督的分析。基因组中基因存在论(Gene Ontology，GO)术语的过表示的统计学显著性使用DAVID数据库来评估。利用Gene Set Enrichment Analysis(基因组富集分析，GSEA)软件绘制热量图。
测量VEGFB表达
MI当日获得的血细胞中的VEGFB mRNA表达通过定量PCR来确定。开发自制的夹心式ELISA来测量VEGFB的血浆水平。
患者分类模型
评价支持载体机器(SVM)和K*计算分类模型，以检验VEGFB表达水平的预后显著性。使用以下参数进行用于训练SVM分类器的SMO(连续最小最优化)运算法则：复杂性参数C＝1.0，ε＝1.0E-12，多项式核函数的幂阶＝1.0。模型以完全混合＝20和用于评价缺失值的平均柱熵曲线来进行。分类评价结果利用留一法(leave-one-out)交叉验证(LOO)策略来评估。使用受体操作特征曲线下面积(AUC)来总结评估的分类器分类性能。
统计学分析
两组患者的手段之间的比较关于高斯数据使用双尾不配对t检验和关于非高斯数据使用Mann-Whitney检验来进行。分类变量利用Fisher精确检验来比较。生物标记物水平和EF类型之间的相关性使用Spearman检验来评估。机器学习模型执行使用Weka(v.3.4)数据挖掘平台来进行。分级的聚类利用非加权配对算术平均法和相关系数来进行。使用GEPAS进行聚类显示。使用Statistica package(v.6.0)生成统计学显著性检验。认为P值＜0.05是统计学显著的。
结果
患者选择和特征
我们招收由机械再灌注治疗的、表现出急性ST升高MI的的患者。关于转录组学分析，两组16名患有急性MI的患者基于其在MI后1个月的EF来选择。一组患者在MI后具有保护的LV收缩功能，其具有高EF(＞40％，中值63％，范围45-73)，且另一组削弱的LV功能，其具有低EF(≤40％，中值35％，范围20-40)。
血细胞的转录组学分析
在再灌注时分离的全血细胞的基因表达特征利用25,000个基因的微阵列来获得。其中，发现525种基因在高EF和低EF患者之间通过SAM差别性表达，其具有1.3倍数变化阈值和假发现率24.5％。226种基于在高EF组中上调且299种基因在低EF组中上调。在这525种基因中，GSEA重获50种与一组患者或另一组患者最显著相关的基因。
与MI后临床结果相关的血管生成基因
遵从我们的工作假说，即血管生成可以在MI后心脏修改中起显著作用，我们试图由这525种在高EF患者和低EF患者之间差别性表达的基因中鉴定与血管生成相关的那些基因。为了该目的，我们使用以下查询即“血管生成”AND“智人(homo sapiens)”，由Entrez基因数据库重获一列494种已知与人中血管生成相关的基因。这525种差别性表达的基因中，发现28种在该494种血管生成基因的列表中：20种在低EF组中上调且8种在高EF组中上调(表6)。
表6.在高EF组和低EF组之间差别性表达的28种血管生成基于的列表。
Figure BPA00001354877400301
q值：基因被称为显著的时的最低假发现率(如“p值”适合于分析大量基因)。注意：该表中的基因总数是28，因为血小板反应蛋白1(THBS1)既促血管生成也抗血管生成。
使用这28种基因绘制的热量图显示MI后的临床结果与连接于血管生成的不同生物标识相关。
在试图评价该生物标识是否与血管生成的刺激和抑制相关时，我们查询Entrez基因数据库，以获得在两组MI患者之间差别性表达的28种血管生成基因的促血管生成或抗血管生成特性。如表6中所示，已知促血管生成和抗血管生成因子之间的平衡对于低EF患者倾向于偏向促血管生成一侧，尽管仅可以推测这与血管生成的刺激相关。
我们然后进一步缩小我们关于VEGFB的研究，因为：(1)在高EF组中过表达(并由此潜在地参与有利的心脏重构)的4种促血管生成基因中，利用查询“血管生成AND智人AND心脏”，通过Entrez基因数据库仅重获VEGFB；和(2)高EF患者和低EF患者中VEGFB表达之间才差别在促血管生成基因中最显著(表6)。
VEGFB表达与MI后的结果相关
使用定量PCR来验证关于VEGFB的微阵列数据。两种16名MI患者之间的表达值在微阵列和定量PCR之间进行比较。这两种技术报告与低EF患者相比，在高EF患者中更高的VEGFB mRNA表达水平：关于微阵列是1.3倍(t＝3.35；P＝0.004)，和关于定量PCR是1.7倍(t＝3.35；P＝0.003)(图8A)。图8B显示在VEGFB表达和EF之间观察到的显著相关性(r＝0.39；P＝0.03)。因此，血细胞中的VEGFB表达似乎与MI后的结果相关。
VEGFB的血浆水平与MI后的临床结果相关
我们然后测量140名MI患者的血浆中的VEGFB，所述患者分为2组，即在MI后1个月具有保护的(LVEF中值57％，范围45-89)和削弱的(中值37％，范围17-44)LV功能的那些。采血在MI当日(n＝77)，MI后一天(n＝65)或MI后两天(n＝12)进行。血浆VEGFB水平在MI后第0天和第1天时，在高EF组和低EF组之间类似。然而，在第2天，VEGFB水平在高EF患者中增加(与第0天相比为2倍)而它在低EF患者中下降(与第0天相比为2.5倍)(图9)。这些数据与高EF患者中VEGFB mRNA的上调(图8)相一致。这些结果提示能够在MI后增加其VEGFB产量的患者更倾向于具有有利的结果。
独立验证
使用290名MI患者的独立组来进一步研究VEGFB血浆水平和MI后LV重构之间的关系。已经公开了该患者群的临床特征。平均血浆VEGFB在其中ΔEDV(n＝138)在经过该时期显示下降的患者(n＝138)中，与在其中ΔEDV增加的患者中(n＝152)相比，是64％更高(U统计量＝8128，P＜0.001)。这些数据证实我们的观察，即VEGFB与MI后LV重构相关。
VEGFB的预后性能
我们的结果提示VEGFB可以表示MI后重构的潜在生物标记物。使用两个使用若干数据组(通过微阵列、定量PCR或血浆确定获得)构建的机器学习模型来测试VEGFB的预后性能。结果显示在表7中。最佳性能在基于K*实例的学习者使用通过微阵列由32名测试组的患者的血细胞中测量的VEGFB表达水平来构建。该模型达到特异性75％(16名低EF患者中的12名正确分类)，灵敏度50％(16名高EF患者中的8名正确分类)，和总精确度62％(32名患者中的20名正确分类)。AUC是0.75。当使用来自验证组(290名患者)的血浆VEGFB水平构建时，最大预后显著性提供AUC 0.52。
表7.VEGFB的预后性能。
Figure BPA00001354877400321
AUC：受体操作特征(ROC)曲线下面积。
特异性表示正确分类的低EF患者的百分比；灵敏度表示正确分类的高EF患者的百分比；精确度表示正确分类的高EF患者和低EF患者的百分比。
Figure IPA00001354876900011
Figure IPA00001354876900021
Figure IPA00001354876900031
Figure IPA00001354876900041
Figure IPA00001354876900051
Figure IPA00001354876900061
Figure IPA00001354876900071
Figure IPA00001354876900081
Figure IPA00001354876900091
Figure IPA00001354876900101
Figure IPA00001354876900121
Figure IPA00001354876900131
Figure IPA00001354876900141
Figure IPA00001354876900151
Figure IPA00001354876900161

Claims (25)

1.一种用于鉴定具有增加的发生心脏病症风险的心肌梗死患者的方法，所述方法包括：
-在梗死后，测定来自患者的体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)、血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-将所述VEGFB、THBS1和/或PGF水平与对照进行比较；和
-基于所述比较确定所述患者是否具有增加的发生心脏病症的风险。
2.根据权利要求1的方法，其中所述对照是获自具有一定范围的临床结果的梗死患者群体的参考值。
3.根据权利要求1的方法，其中所述对照是来自所述患者的另一份样品的相应VEGFB、THBS1和/或PGF水平。
4.根据权利要求3的方法，其中所述另一份样品是来自所述患者的早期样品，并且以下至少一项表示所述患者患有所述心脏病症的增加的可能性：
-与VEGFB早期样品相比，在测定的患者样品中更低的VEGFB水平；
-与THBS1早期样品相比，在测定的患者样品中更高的THBS1水平；和/或
-与PGF早期样品相比，在测定的患者样品中更高的PGF水平。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述心脏病症是心肌梗死、急性冠脉综合征、缺血性心肌病或非-缺血性心肌病，或其中所述患者发生或患有心力衰竭或心室重构。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中取自患者的体液样品是血液样、组织液样品、血浆样品、血清样品或尿液样品。
7.根据前述任一项权利要求的方法，其中测定的VEGFB、THBS1和/或PGF水平是mRNA水平或血浆蛋白水平。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中在心肌梗死的当日测定VEGFB、THBS1和/或PGF水平。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述确定通过最近邻统计学分析比较技术进行。
10.根据前述任一项权利要求的方法，还包括收集关于一名或多名MI患者的数据，包括分析VEGFB、THBS1和/或PGF中至少一种的水平或数值和该患者的相关临床结果，以创建与特定临床结果相关的VEGFB、THBS1和/或PGF特征数据。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中使用分类器来确定预后，所述分类器包括程序诸如PAM、Kstar和SVM。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其中测定所述体液样品的VEGFB水平并与VEGFB参考水平相比较，并且任选地测定所述体液样品的THBS1或PGF之一或二者的水平并与相应的THBS1或PGF参考水平相比较。
13.一种用于鉴定具有增加的发生心脏病症风险的心肌梗死患者的方法，所述方法包括：
-分析来自MI后患者体液样品的VEGFB、THBS1和/或PGF的mRNA或血浆蛋白水平，以确定该患者的特征数据，使该特征数据与所述患者中发生心力衰竭相关的特定临床结果相关联，并将该特征数据输入数据库；
-针对许多MI后患者重复所述分析，以组建数据库，使所述数据库包含关于HF和VEGFB、THBS1和/或PGF水平之间的关系的参考信息；
-确定具有未知预后的MI后患者的特征数据；和
-处理来自所述患者的VEGFB、THBS1和/或PGF水平的特征数据，以使其与数据库中的特征数据进行比较；和
-根据所述比较的结果输出关于所述患者的可能预后。
14.根据前述任一项权利要求的方法，其中增加的心脏病症风险的确定与那些梗死的参考样品有关，所述梗死的参考样品与查询的样品相比，分别具有相当高水平的VEGFB mRNA(对数比＞-1.4)，相对低水平的THBS1(对数比＜0)和/或相对低水平的PGF(对数比＜-0.1)。
15.根据权利要求14的方法，其中比值以选自由以下各项组成的组的量来变化：至少1或2％，至少5％，至少7％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，和直至50％。
16.根据前述任一项权利要求的方法，还包括测定BNP水平并使其与BNP参考样品来比较。
17.一种确定心肌梗死患者的预后的方法，所述方法包括：
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)水平和血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；和
-将所述VEGFB，THBS1和/或PGF水平与对照进行比较；和
-基于所述比较确定所述患者的预后。
18.一种确定心肌梗死患者的预后的方法，所述方法包括：
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)水平和血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；和
-使用所述VEGFB、THBS1和PGF水平对以前构建的统计学程序(也称为“分类器”)进行查询；
其中
-高VEGFB水平和低THBS1和PGF水平与降低的发生所述心脏病症的可能性相关；和
-所述分类器将指示该患者是否具有降低的发生所述心脏病症的可能性。
19.一种鉴定具有降低的所述心脏病症风险的心肌梗死患者的方法，其包括：
-在梗死后，测定来自患者体液样品的血管内皮生长因子B(VEGFB)水平、和血小板反应蛋白-1(THBS1)和/或胎盘生长因子(PGF)水平；
-将所述VEGFB、THBS1和PGF水平与对照进行比较；和
-基于所述比较确定所述患者是否具有降低的发生心脏病症的风险。
20.一种用于测定样品中VEGFB水平的方法，包括：
(a)使样品与固定于支持物的至少一种捕获试剂相接触，以形成固定的捕获试剂-样品复合物；
(b)将样品与所述至少一种固定的捕获试剂分开；
(c)使所述固定的捕获试剂-样品复合物与特异于VEGFB的第二抗体相接触，并且任选地使第二抗体与特异于该第二抗体的第三抗体相接触；
(d)使第二抗体或第三抗体与缀合于检测设备的结合分子相接触，该结合分子如链霉抗生物素蛋白；和
(e)利用所述检测设备测量与捕获试剂结合的第二抗体或第三抗体的水平。
21.一种用于测量生物液体中VEGFB 186和VEGFB 167水平的ELISA试剂盒，其包括：
(a)至少一种固定于支持物的捕获试剂；
(b)特异于VEGFB 186和/或VEGFB 167的第二抗体；
(c)任选地，特异于所述第二抗体的第三抗体；
(d)与检测设备缀合的结合分子，诸如链霉抗生物素蛋白；和
(e)设备，其用于利用检测设备测量与捕获试剂结合的第二抗体或第三抗体水平。
22.一种包括来自MI患者的特征数据的数据库，所述数据包括与MI后测定的VEGFB、THBS1和PGF水平中至少一种相匹配的患者的临床结果。
23.根据权利要求22的数据库，其中所述患者的临床结果与MI后测定的VEGFB水平相匹配。
24.一种比较装置，其用于访问根据权利要求22或23中任一项的数据库和/或处理查询。
25.一种系统，其包括根据权利要求22或23中任一项的数据库和至少一种根据权利要求24的比较装置，该比较装置用于访问和/或操作所述数据库。
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