CN102203261A - 提高植物水分利用效率的方法和手段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过对植物内部基因表达的操作，获得所需植物表型的方法。该方法涉及抑制PK220基因的表达水平或者活性的手段，相对于野生型对照植物，其中所需的表型例如水分利用率有所提高。本发明还涉及到核酸序列以及有用的构建物等方法，以及构建和分离具有降低的PK220表达或活性的植物的方法。

Description

提高植物水分利用效率的方法和手段
相关申请参考
本申请要求2008年6月13日提出的U.S.S.N.61/132,067的权益，其内容在这里全部纳入参考。
发明领域
本发明是在植物分子生物学领域，涉及到有新的表型的转基因植物，生产此类植物的方法和以此方法生产有用的多核苷酸和多肽。更明确的是，本发明涉及抑制蛋白激酶以及具有抑制蛋白激酶活性的转基因植物。
发明背景
水是植物的生存，生长和繁殖必不可少的。经过光合作用的二氧化碳的同化直接关系到水通过气孔的流失。与生物质生产密切相关的作物生产力，依赖于植物水分利用效率(WUE)，尤其是在水分限制的条件下(Passioura 1994 and Sinclair 1994，in Physiology and Determination of Crop Yield)。植物的生长周期中的水分利用效率，可使用每单位水蒸腾量生成的生物质量比例进行计算(Sinclair 1994)。水分利用效率瞬时测量亦可通过使用气体交换测量法测定二氧化碳的吸收与蒸腾的比率来确定(Farquhar and Sharkey 1994，in Physiology and Determination of Crop Yield)。由于作物产量和水分利用效率密切相关，人们已作出许多努力，来学习和理解这种关系以及密切相关的基因组成。为了实现作物产能和产量的最大化，人们努力设法提高植物的水分利用效率(Condon et al.，2002，Araus et al.，2002，Davies et al.，2002)。较高的水分利用效率可以通过提高生物质生产量和二氧化碳同化或通过减少蒸腾水分流失来实现。减少蒸腾作用，尤其是在非限水环境下，可能随之降低生长速度，从而减少作物产量。这就带来了一个两难选择，如何在水有限的条件下提高作物的产能和产量，同时在灌溉水或非限水条件下还能保持产量(Condon et al.，2002)。
对于水分利用效率的改善，到目前为止，都采用植物育种方法进行，藉此，将水分利用率较高的品种与高产能但水分利用率较低的品种进行杂交，在限水条件下以期改善作物的产量(Condon et al.，2002，Araus et al.，2002)。使用数量性状定位(QTL)的方法来确定水分利用效率的组成是历史上最普遍的方法(Mian et al.，1996，Martin et al.，1989，Thumma et al.，2001，Price et al.，2002)，最近，人们尝试通过分子遗传学手段来构建优良植物品种。
第一个与水分利用效率相关的基因是ERECTA。ERECTA基因是在花序发育和器官形态中作为功能基因首次被发现的(Torii el al.，1996)。后来通过QTL定位发现，它是蒸腾效率的一个重要贡献因子，蒸腾效率被定义为每吸收一个二氧化碳蒸腾的水，在拟南芥中，作为一个与水分利用效率相反的指标(Masle el al.，2005)。ERECTA基因编码一个假定的富含亮氨重复的类受体激酶(LRR-RLK)。尽管有人提出，至少在某种程度上，其对气孔密度，表皮细胞扩张，叶肉细胞增殖和细胞间的联系有影响，但LRR-RLK的调控机制有待理解。在eracta突变体中，使用野生型ERECTA进行互补，可以恢复正常的蒸腾效率。然而，不能确定的是，在转基因拟南芥中过表达ERECTA是否会降低蒸腾效率或提高水分利用效率。这是唯一的报告，显示植物类受体激酶与蒸腾效率或水分利用效率相关。
另一个与水分利用效率相关的拟南芥基因是HARDY基因，是通过对活化标签突变体库的表型筛选而发现的(Karaba el al.，2007)。在水稻中过表达HARDY，通过提高光合吸收和减少蒸腾，最终导致了水分利用效率的改善。增强表达HARDY的转基因水稻在最佳水环境下发芽生物量有所增强，在限水条件下出根生物量有所增强。过量表达HARDY，在拟南芥中产生了含有更多的叶肉细胞的厚叶片，在水稻中提高了叶片和束叶细胞的生物量。这些修饰有助于提高光合活性和效率(Karaba et al.，2007)。
蛋白激酶是一个大家族酶系，通过添加磷酸基团(磷酸化)修饰蛋白除。在所有真核基因中，蛋白激酶约占2％，其中许多介导了真核细胞对外界刺激的响应。所有的单亚基蛋白激酶在羧基端附近含有一个共同的催化结构域，而氨基端起着调节作用。
植物类受体激酶为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其含有，氨基端的一段预知信号肽，一段跨膜域和一段胞浆激酶域。在拟南芥中，有超过610种的潜在编码类受体激酶(Shiu and Bleecker 2001)。类受体激酶往往是信号级联反应的一部分。他们在信号级联反应中解释胞外信号，通过配体结合，磷酸化目标，从而影响到下游的细胞过程，如基因的表达(Hardie 1999)。
可被操作用来提供有益特征的基因的鉴定是非常可取的。使用已确定的基因来评价所需要的特征也是同样的方法和手段。在TAIR数据库中被定义为At2g25220的类受体激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是拟南芥中超过600名的成员的类受体激酶基因大家族中的一员(Shiu et al.，2001)。然而，除了作为一种激酶进行了序列的注释，并没有对At2g25220基因进行功能和作用的披露。在本发明中，确定了高水分利用效率基因(HWE)，当其表达或活性受到抑制时，会导致有益的表型，例如，相对于用水量，提高了植物生物量的积累。在限水条件或非限水条件下均可发生这种情况，并且确保更好的增长，因此植物有更大的生产率。
发明内容
本发明是基于以下发现，PK220基因的突变导致了植物表型的改变，例如，与未突变的植物相比，水分利用效率提高，耐旱性增强，对低温的敏感性降低、低氮条件下幼苗生长抑制性降低等等。
更具体地说，本发明涉及一种突变植物的鉴定，包含PK220基因的突变，在这里也称为HWE基因。该PK220基因是一种类受体蛋白激酶。在植物中抑制PK220基因的表达或活性提供了有益的表型，例如改进了植物的水分利用效率。改善的植物水分利用效率表型导致植物耐旱性增强。
在一方面，发明提供了一种获得转基因植物的方法，通过使用载体来转化植物、植物组织培养物、或植物细胞，载体中含有一种核酸构建物能够抑制PK220基因的表达或活性，从而获得PK220表达或活性水平降低的植物、组织培养物或植物细胞。从植物组织培养物或植物细胞中培育或再生植物，其中水分利用效率提高的植物被制备。
因此，本发明提供了一种具有改良属性的植物的生产方法，其中所述方法包括，抑制内源性PK220基因的表达或活性，其中所产生的植物具有有益的表型或改良的属性。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种用于生产水分利用效率提高的植物的方法，其中所述方法包括，转基因植物的形成以及使用所述方法进行植物基因组的修饰。
水分利用效率是指，当使用重力法测量时，生成的生物质的总量与单位水蒸腾量之间的比率，以及当使用气体交换定量法测量时，光合作用速率与叶片或枝条的蒸腾速率之间的比率。本文中所使用的术语“提高的水分利用效率“指的是，当与相应的野生型植物的水分利用效率相比时，植物水分利用效率是野生型的2，4，5，6，8，10，20或更多倍。举例来说，具有提高的水分利用效率的植物相比野生型植物，可能有5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％或更高的水分利用效率。
本发明的方法包括抑制或降低内源性基因的表达或活性，例如PK220，其中产生的植物具有有益的表型或改良的属性，例如提高的水分利用效率。一方面，本发明提供了一种植物的生产方法，该植物相对于野生型植物有提高的水分利用效率，通过在植物细胞中引入一个核酸构建物来抑制或降低PK220的表达或活性。举例来说，相对于野生型植物，具有提高的水分利用效率的植物由以下几步产生：a)提供一种抑制PK220的活性的核酸构建物，该核酸构建物含有一个联结于其上的合适启动子；b)将核酸构建物掺入到载体中；c)将该载体转化至植物、组织培养物或者植物细胞中，来制备具有PK220活性降低的植物、组织培养物或者植物细胞；d)从组织培养物或植物细胞中培育或再生植物，在此过程中制备该植物，与野生型植物相比，该植物的水分利用效率有所提高。该构建物包括一个启动子，例如组成型启动子、组织特异性启动子或者诱导性启动子。优选的是，组织特异性启动子为根茎启动子。优选的诱导型启动子为干旱诱导型启动子。
术语“核酸构建物“是指一个全长基因序列或部分序列，其中一部分是最好至少有19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100或150个核苷酸长，或其互补体。或者，它可能是一个寡核苷酸，单链或双链，由DNA或RNA或DNA-RNA双链组成。在一个具体实施方案中，核酸构建物包含PK220全长基因序列，或其中一部分，其中的一部分PK220序列至少是19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100或150个核苷酸长，或其互补体。
本发明也提供了一种转基因植物，具有有益的表型或者改良的属性，例如提高的水分利用效率，通过本文描述的方法制备。
在另一个方面，本发明提供了一种植物，该植物在PK220基因中具有一个非天然存在的突变，其中，所述植物具有降低的PK220表达或活性，并且与野生型对照相比，具有提高的水分利用效率。PK220的表达或活性降低，是指与野生型PK220相比，在DNA、RNA或者蛋白质水平上，降低2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，或75倍或更多，或者与野生型PK220活性相比，降低2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，或75倍。PK220活性包括但不限于多肽底物的丝氨酸和/或苏氨酸残基处的激酶活性，那是它参与磷酸化反应的位置。
本发明进一步提供了转基因种子，由本发明的转基因植物制备，其中种子产生的植物，具有有益的表型或者改良的属性，例如与野生型植物相比，具有提高的水分利用效率。
在另一实施例中，发明提供了核酸用于在植物细胞中表达该核酸，来制备转基因植物，该植物具有有益的表型或者改良的属性，例如提高的水分利用效率。
在本发明中某些方面发现使用的编码野生型PK220基因或其中的一部分的模板序列由以下序列号描述：SEQ ID 1，7，9，11，12，13，24，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，84，86，88，90，92，94，96，98，100，153，161和193。编码突变的PK220基因由SEQ ID 3和5描述。用于下调PK220表达和活性的对构建物有用的模板序列由以下序列号描述：SEQ ID 12，13，147，149，153，161，168和174。本发明进一步提供了一些组合，包含本发明的核酸，用于在植物中进行表达，制备所述的转基因植物。
除非另有界定，此处使用的所有的技术和科学术语，具有与本发明所属领域中技术人员所熟知的含义相同的含义。虽然与此处所述类似的或相同的方法和材料可用于实践或检验本发明，合适的方法和材料如下所述。所有出版物，专利申请，专利和本文提及的其他文献全部引用作为参考。在冲突的情况下，以本发明说明书，包括定义，为准。此外，材料，方法及实例仅用于阐述目的而作为对本发明的限制。
本发明其他的特点和优势，将是显而易见的，并由下面的详细说明书和权利要求书涵盖。
具体实施方式
除非另有界定，此处使用的所有的技术和科学术语，具有与本发明所属领域中技术人员所熟知的含义相同的含义。虽然与此处所述类似的或相同的方法和材料可用于实践或检验本发明，合适的方法和材料如下所述。所有出版物，专利申请，专利和本文提及的其他文献全部引用作为参考。在冲突的情况下，以本发明说明书，包括定义，为准。此外，材料，方法及实例仅用于阐述目的而作为对本发明的限制。
为方便起见，在本发明的进一步说明前，这里先进行用于说明、示例及要求的特定术语的规定。这些定义应当由本领域技术人员很容易阅读并理解。
“启动子序列”或“启动子”，是指在植物细胞中，能够诱导可操作基因序列转录的核酸序列。启动子包括，例如(但不限于)组成型启动子、组织特异性启动子，例如根茎启动子、诱导型启动子，例如干旱诱导型启动子、或内源性启动子，例如与兴趣基因即PK220基因相关的启动子。
术语“表达盒”是指载体构建物，其中一个基因或核酸序列被转录。此外，所表达的基因可能被翻译成多肽。
术语“表达”或“过表达”可以互换使用，都指的是，基因的表达也就是转基因的表达。相对于野生型细胞，细胞中的表达总水平可升高。
所谓“非天然存在突变″指的是任何方法，在一种植物或植物种群引入基因突变。例如，化学诱变，如磺酸甲乙酯或甲磺酸乙酯，快中子诱变，DNA插入诱变如T-DNA插入或定点突变的方法。
术语“干旱胁迫″是指这样一种情况，相对水非受限情况，植物生长或产量受到抑制。术语“水分-胁迫”与干旱水分胁迫同义可互换。
术语“耐旱性”是指植物能够超越野生型植物的能力，在干旱胁迫条件下，或限水条件下，或相对于野生型植物在成长和发展过程中使用更少的水。
术语“水分利用效率”是一个比率表达式，当使用重力法测量时，指的是生成的生物质的总量与单位水蒸腾量之间的比率，当使用气体交换定量法测量时，指的是光合作用速率与叶片或枝条的蒸腾速率之间的比率。
术语“干重”是指已被干燥去除大部分细胞水的植物组织，与术语“生物质”这个词同义可互换。
术语“空”定义为，同胞基因分离的转基因线，已经失去掺入的转基因，因此作为对照线。
说明书中使用了各种标准缩写，例如g，克；WT，野生型；DW，干重；WUE，水分利用效率；d，天。
术语“hwe116”指的是含有PK220基因突变的植物。
HWE基因指的是PK220基因序列，由PK220基因编码的蛋白质指的是PK220多肽或蛋白质。术语HWE和PK220是同义词。
术语“PK220核酸″是指至少有一部分PK220核酸。同样的，术语“PK220蛋白质”或“PK220多肽”是指至少有一部分蛋白质。一部分对于核酸来说是指至少21个核苷酸长，对于蛋白质或多肽来说是至少有7个氨基酸。术语“AtPK220”指的是拟南芥PK220基因，术语“BnPK220”指的是一个甘蓝型油菜PK220基因。
本发明部分地取决于有改良农艺属性植物的发现基础上的，例如，相对于野生型对照，水分利用效率提高，耐旱性增加，敏感性低温降低以在低氮条件下幼苗生长抑制降低。有益表型所对应的基因已被确定并证明是一种抑制PK220基因。
制备具有提高的水分利用效率的植物的方法在本说明书中详细进行了描述，包括突变植物、转基因植物、或者遗传修饰植物。具体来说，本发明确定了PK220基因的功能，当其表达或者活性受到抑制时，可制备具有有益表型的植物。
两个或两个以上序列同源性的确定
要确定两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的同源性百分比，为实现最佳比较目的，所有序列被对齐。(例如，可以在用于最优对齐比较的两个序列任一个中引入间隔)。将氨基酸残基或相应的氨基酸位点的核苷酸或核苷酸位点进行比较。当第一个序列中的某个位点被第二个序列中相应位置的同样的氨基酸残基或核苷酸占据，那么这两个分子在此处是同源的(即这里所用的氨基酸或核酸“同源性“相当于氨基酸或核酸的“一致性“)。
核酸序列同源性，可以两个序列之间一致性的程度来确定。同源性也可使用本领域熟知的计算机程序来确定，如GCG程序包提供的GAP软件，见Needleman and Wunsch(1970)。使用GCG-GAP软件进行如下设定用于核酸序列比较：GAP创建点为5.0，GAP延伸点为0.3，类似的核酸序列的编码区域参照上面提到的，与序列号SEQ ID1显示的DNA序列的编码序列部分一致性程度最好至少是70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，或99％。
术语“序列一致性”指的是当进行特定区域比较时，在“残基-残基“基础上两个多核苷酸或多肽序列的一致性程度。术语“序列一致性百分比”通过所对比的区域中，比较两个最佳相似序列来计算，测定两个序列中相同核酸碱基(例如A，T，C，G，U，或I，在核酸的情况下)同时存在的位点的数量来得出匹配位点的数量，除以比较区域(例如窗口尺寸)的总位点数，然后将结果乘以100得出序列一致性百分比。这里所用的术语“实质同一性”是指一个多核苷酸序列特征，其中与对照区域的参考序列相比，该多核苷酸包括的序列中至少有80％的序列一致性，最好是至少85％，经常是90-95％，更常见的是至少99％。术语“阳性残基百分比”通过所对比的区域中，比较两个最佳相似序列来计算，测定两个序列中相同和保守氨基酸残基，如上所述，同时存在的位点的数量来得出匹配位点的数量，除以比较区域(例如窗口尺寸)的总位点数，然后将结果乘以100得出阳性残基百分比。
内源性PK220表达及活性的抑制
本发明的一方面，是关于抑制或降低PK220基因的表达和活性的方法和手段，任意地，导致PK220蛋白表达和活性的抑制或降低。术语“PK220表达或活性”包括抑制或减少这两个层次。PK220的表达或活性降低，是指与野生型PK220相比，在DNA、RNA或蛋白质水平上降低2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60或75倍或更多，或者与野生型PK220活性相比，PK220蛋白活性降低2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60或75倍。PK220活性包括但不限于多肽底物的丝氨酸和/或苏氨酸残基处的激酶活性，那是它参与磷酸化反应的位置。测定丝氨酸/苏氨酸激酶活性的方法是本领域人员众所周知的。
对于本领域的技术人员来说，目前已有很多方法来实现这种抑制作用，通过影响基因表达途径中各种步骤，例如转录调控，后转录和翻译调控。这些方法包括但不限于，反义核酸的方法，RNA干扰构建物，包括所有的发夹结构和有用的RNAi构建物，通过双链RNA指导的DNA甲基化抑制或者通过mRNA的降解抑制，或翻译抑制，小RNA(miRNA)，包括人工miRNA的(amiRNA)(Schwab et al.，2006)的技术，突变和TILLING方方法，在体内特定位点突变技术以及显性/隐性抑制方法。
基因抑制的一种优选方法包括RNA抑制(RNAi)技术也被称为发夹结构。拟抑制的基因的一部分被使用，并以正义和反义方向克隆，在正义和反义部分具有一定的间隔。该部分基因的大小应至少为20个核苷酸长，间隔可能为13个核苷酸长(Kennerdell and Carthew，2000)，可能是内含子序列，编码或非编码序列。
反义是一种常见的方法，即目标基因，或其中一部份，以一种反义方向表达，导致内源基因表达和活性的抑制。反义部分不需要一个全长基因，也不需要100％相同。只要反义序列与内源目的基因至少大约70％或更多相同，核苷酸长度至少为19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100，或150。优选的是，核苷酸长度为50或更长，将取得预期的抑制作用。
在制备构建体时，编码野生型PK220基因及其中的部分序列对于PK220抑制是有用的，包括以下序列，例如，SEQ ID序列号：1，7，9，11，12，13，24，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，84，86，88，90，92，94，96，98，100，153，161和193。为了下调PK220的表达或活性，对于构建体有用的模版序列由以下序列号所述：SEQ ID 12，13，147，149，153，161，168和174。
当使用反义策略下调，抑制内源基因的活性可有选择性的针对特定基因或所选的基因群，通过合适的选择用于反义表达的片段或部分基因。选择目的基因序列中存在，而相关基因群(非目的基因)中不存在或与非目的序列保守性小于70％的序列将会导致特异性基因抑制作用。
另外，amiRNA抑制可以用来抑制基因的表达和活性，以一种比其他RNAi方法更特异的方式。与需要小分子RNA和目标mRNA之间完美匹配的siRNA相反，amiRNA允许多达5个不匹配，只要不超过2个连续不匹配。amiRNA的构建需要满足一定的标准，如Schawab et al.(2006)所述。这就提供了一种下调目的基因表达或活性的方法，使用的基因片段包含PK220中的至少21个核苷酸序列。
显性/阴性抑制类似于生化反应中的竞争性抑制。修饰的或突变的缺乏全功能的多肽的表达会与野生型或内源性多肽竞争，从而降低总的基因/蛋白的活性。例如，一个表达的蛋白质可能会结合到蛋白复合体或酶亚基上从而产生一个非功能复合物。或者，表达的蛋白可能与底物结合，但没有活性去执行天然的功能。非活性蛋白的表达水平足以降低或抑制整体功能。
表达PK220基因产生缺失活性的PK220蛋白可用于基因活性的显性/阴性下调。这类似于竞争性抑制。例如，产生的PK220蛋白可能与目的分子联合或绑定，但缺乏内源性活性。这样的无活性PK220的一个例子是，分离自hwe116突变体的AtPK220序列，如序列号SEQ ID NO：3所示。目的分子可以是核酸序列的相互作用蛋白。在这种方式下，内源性蛋白PK220被有效稀释，下游响应将被衰减。
体内位点的特异性突变是可得到的，据此，可以在细胞的基因组中引入一个突变来产生特异性突变。该方法可见Dong et al.(2006)详细描述，或者在美国专利申请公布号20060162024中，其中提到了寡核苷酸定向基因修复的方法。另外一种方法，可以利用嵌合RNA/DNA寡核苷酸，如Beetham(1999)所描述。因此，可能在细胞的内源性基因中产生未成熟终止密码，从而产生一种特异性无效突变。另外，突变可能会干扰初始转录的拼接，从而产生无翻译能力的mRNA，或者是一种产生可变多肽的mRNA，该多肽不具备内源性活性。优选的突变，能够造成PK220表达或活性减少或降低，包括，在核酸位点874处的C到T的转变，与序列号SEQ ID NOs：1或3一致，或者核酸突变导致了氨基酸位点292处的氨基酸转变，从亮氨酸(L)编码(CTT)变成了苯丙氨酸(F)编码(TTT)，与序列号SEQ ID NOs：2或4一致。
TILLING是一种在已知基因中分离突变的方法，来自于EMS-诱变库群。使用(Greene et al.，2003)所详细描述的方法筛选诱变库群。
基因抑制的其他策略，对于本领域熟练的工作者，包括那些在这里没有讨论的以及未来发展的，都将是显而易见的。
AtPK220同源性的鉴定
拟南芥PK220(AtPK220)的同源性通过使用数据库序列搜索工具被确定，例如基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.，1990 and Altschul et al.，1997)。该tblastn或blastn序列分析程序使用BLOSUM-62得分矩阵进行工作(Henikoff and Henikoff，1992)。BLAST报告的输出提供一个分数，考虑到类似或相同的残基，以及为了保持序列对齐所需的任何间隙。得分矩阵指定一个分数用于对齐任何可能的序列对。P值反映的是希望看到一个分数偶然出现的次数。优选分数较高者，以及低阈值P值。这些都是序列相似性的标准。tblastn序列分析程序是用于查询数据库中的多肽序列，与核苷酸数据库中的六道翻译序列比对。选中P值小于-25，优选少于-70，更优选不到-100的，确定为同源序列(模板序列选择标准)。Blastn序列分析程序是用于查询核苷酸序列数据库中的核苷酸序列。在这种情况下，也优选得分较高者，首选P阀值小于-13，优选小于-50，更优选小于-100。
通过标准的PCR扩增技术可以分离PK220基因。使用PK220基因的保守区域引物和PCR扩增产生所需基因的片段或全长拷贝。模板可以是DNA，基因组或cDNA文库，或是RNA或mRNA，使用逆转录PCR(RtPCR)技术。保守区域，可使用如BLAST或如CLUSTALW序列对比工具来确定。合适的引物被应用，并在本申请的其他地方进行了描述。
或者，一个来自于PK220基因的序列片段被随机引物进行32P放射性标记(Sambrook et al.，1989)，用于筛选植物基因组文库(模板检测核苷酸)。作为示例，根据Stockinger等人的方法，分离了来自于拟南芥，烟草，番茄，苦茴芹，甜樱桃，桃樱，黄瓜，或水稻的总植物DNA(Stockinger et al.，1996)。每种DNA样品大约取2到10微克进行限制性消化，转印至尼龙膜上(Micron Separations，Westboro，Mass)进行杂交。杂交条件为：42℃，50％甲酰胺，5×SSC，20mM磷酸缓冲液1×Denhardt’s，10％硫酸葡聚糖和100微克/毫升鲱鱼精DNA。室温下用2×SSC，0.05％肌酸钠和0.02％焦磷酸钠缓冲液低严格清洗四次，然后在55℃下使用0.2×SSC，0.05％肌酸钠和0.01％焦磷酸钠缓冲液高严格清洗，直到按照Walling等人的方法，在冲洗液中检测不到(Walling et al.，1988)。阳性分离物进行鉴定，纯化和测序。其他方法也可用于杂交，例如Clonetech公司提供的ExpressHybTM杂交溶液。
PK220重组表达载体以及宿主细胞
本发明的另一个方面涉及到载体，优选的表达载体，含有一种编码PK220蛋白质的核酸，PK220基因或基因组序列或其中的部分类似序列或其同源序列。本文中所使用的术语表达载体包括被设计用于提供核酸序列转录的载体。转录序列可以被设计用于抑制与转录序列相关的内源性表达或内源性基因的活性。或者，转录核酸不需要翻译，而是以反义或发夹下调的方法抑制内源性基因的表达。此外，转录的核酸可能被翻译成多肽或蛋白质产物。多肽可能是一个非全长，突变或修饰后的内源性蛋白的变体。本文中所使用的术语“载体”是指一种核酸分子，具有运送被链接于其上的另一种核酸的能力。一种载体类型是“质粒”，它指的是环形双链DNA，附加的DNA片段可以被连接到其中。另一种载体类型是病毒载体，其中，附加的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体)。其他载体整合到被导入的宿主细胞的基因组中，并因此随宿主细胞的基因组的复制而被复制。此外，某些载体能够指导被操作连入的基因的表达。这种载体，在此统称为“表达载体”。一般来说，在重组DNA技术中通用的表达载体效用往往是质粒的形式。在目前的规范中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体最常用的形式。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，如病毒载体或植物转化载体，二元的或其他方式，它们提供相同的功能。
本发明的重组表达载体包括本发明中的核酸以一种合适的形式在一个宿主细胞中进行表达，这意味着重组表达载体包括一个或多个调控序列，该序列基于对用于表达的宿主细胞的选择，也就是操作链接到被表达的核酸序列上。在一个重组表达载体中，“操作链接”是为了表示插入的核苷酸序列是被链接到调控序列上，以一种允许核苷酸序列表达的方式(例如，在一种体外转录/翻译系统中或者在宿主细胞中，当载体被导入到宿主细胞中时)。
术语“调控序列”意在包括启动子，增强子和其他表达调控元件(例如，多聚腺苷酸(polyA)信号)。例如，这种调控序列在Goeddel(1990)被描述。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列进行组成型表达的序列，以及那些只在某些宿主细胞中指导核苷酸表达的序列(如组织特异性调控序列)或诱导启动子(例如，对非生物因素的响应诱导，如环境条件，热，干旱，营养状况或细胞的生理状况，或生物的例如病原响应)。合适的启动子的例子包括，例如组成型启动子，ABA诱导型启动子，组织特异性启动子以及非生物或生物诱导的启动子。这对于设计表达载体的技术人员将是不胜感激的，他们可以依靠这样的因子，选择被转化的宿主细胞，选择目的蛋白的表达水平，以及选择表的的时间和位置，等等。本发明的表达载体可以被引入到宿主细胞，从而产生由本发明所述的核酸编码的蛋白质或多肽，包括融合蛋白或多肽(例如，PK220蛋白，PK220蛋白突变形式，融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可被设计用于在原核或真核细胞中表达PK220基因，PK220蛋白质，或其中的部分。例如，PK220基因或PK220蛋白质可以在细菌细胞中表达，如大肠杆菌，昆虫细胞(用杆状病毒表达载体)，酵母细胞，植物细胞或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞中在Goeddel(1990)进一步讨论。另外，重组表达载体可在体外转录和翻译，例如，使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
在一个实施例中，使用植物表达载体，本发明的核酸在植物细胞中表达。植物表达载体系统的例子包括肿瘤诱导(Ti)质粒，或部分来自于农杆菌，花椰菜花叶病毒DNA(CaMV)，以及如pBll21载体。
对于植物表达，重组表达盒将包含，除PK220核酸外，还有能在植物细胞中发挥功能的启动子区域，转录起始位点(假如缺乏转录编码序列)，和可选的转录终止/加尾序列。终止/加尾区域可从与启动子序列相同的基因或不同的基因中获得。在表达盒的5’和3’端引入独特的限制性内切酶位点，为便于允许插入一个预先存在的载体。
合适的启动子的例子包括来自于植物病毒启动子，如来自于从菜花花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Odell et al.，1985)，来自于基因的启动子，例如水稻肌动蛋白(McElroy et al.，1990)，泛素(Christensen et al.，1992)，pEMU(Last et al.，1991)，MAS(Velten et al.，1984)，玉米H3组蛋白(Lepetit et al.，1992 and Atanassvoa et al.，1992)，衍生自农杆菌T-DNA的5′-或3′-启动子，Smas启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(U.S.Pat.No.5,683,439)，Nos启动子，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶启动子，GRP1-8启动子，ALS启动子(WO 96/30530)，合成启动子，例如Rsyn7，SCP和UCP启动子，核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶，水果特异性启动子，热休克启动子，种子特异性启动子以及其他来自于各种植物基因的转录起始区域，例如，包括不同的植物碱转录起始区域，例如，章鱼碱，甘露碱和胭脂碱。在某些情况下，与插入基因(如PK220)相关的启动子可能被用来表达插入的结构目的基因，例如野生型AtPK220启动子(PpK)。与PK220编码核酸序列连接的用于在植物细胞中表达的调控元件包括，终止子，加尾序列和核酸序列编码信号肽，使蛋白在植物细胞中定位或从细胞中分泌。这些调控元件的添加以及将这些元件与PK220基因的调控元件进行交换的方法是已知，包括但不限于，3’终止和/或加尾区域，例如，农杆菌胭脂碱合成酶基因(Nos)的3’终止和/或加尾区域(Bevan et al.，1983)；马铃薯蛋白酶抑制基因II(PIN II)(Keil et al.，1986)，以及此处引用的文献)；以及An et al.(1989)；以及CaMV 19S基因(Mogen et al.，1990)。
植物信号序列，包括但不限于，信号肽编码DNA/RNA序列，引导蛋白至植物细胞外的基质中(Dratewka-Kos et al.，1989)和皱叶烟草的延伸基因(De Loose et al.，1991)，或是将蛋白引导至液泡中的信号肽，如甘薯储藏蛋白基因(Matsuoka et al.，1991)和大麦外源凝集素基因(Wilkins et al.，1990)，或是造成蛋白质分泌的信号，例如PRIb(Lund et al.，1992)，或那些引导蛋白至质体的信号，例如油菜籽enoyl-ACP还原酶(Verwoert et al.，1994)对于本发明都是有用的。
在另一个实施方案中，重组表达载体，能够指导优选核酸序列在特定细胞型中表达(例如，组织特异性调控元件用于表达核酸)。组织特异性调控元件在本领域中众所周知。例如，与TAIR数据库中定义为At2g44790(P4790)的编码序列相关的启动子是一个根特异性启动子。与本发明中的核酸序列尤其有关的是在植物中具有可操作性的表达系统。其中包括，在组织特异性启动子控制下的表达系统，以及那些在各种植物组织中具有可操作性的启动子所涉及的系统。各种发起人于各种植物组织可操作..
器官特异性启动子也是众所周知的。例如，查尔酮合成酶-A基因(van der Meer et al.，1990)或二氢黄酮醇-4-还原酶(dfr)启动子(Elomaa et al.，1998)指导的在特定花卉组织中表达。此外，同样可用的启动子还包括patatin class I启动子，仅在马铃薯块茎转录激活，可用于目的基因在块茎(Bevan，1986)中的表达。另一个马铃薯特异性启动子是颗粒-绑定的淀粉合成酶(GBSS)启动子(Visser et al.，1991)。
适合目的器官的其他器官特异性启动子可以利用已知的程序进行分离。这些控制序列通常在目的器官中伴随着基因独特的表达。在典型的高等植物中，每个器官含有成千上万的mRNA，而这些mRNA在其他器官系统中是没有的(Goldberg综述，1986)。
由此产生的表达系统被连接入或者构建引入德奥重组载体中，该载体适用于植物转化。载体可能还包含一个选择标记基因，通过它可以培养鉴定转化的植物细胞。标记基因可以编码抗生素抗性。这些抗性标记包括G418，潮霉素，博莱霉素，卡那霉素和庆大霉素。或者标记基因可以编码除草剂抗性基因，能够耐受草铵膦或草甘膦类型的除草剂。转化植物细胞后，那些含有载体的细胞可以通过它们在含有特定抗生素或除草剂的培养基中的生长能力来确定。通常，也包括允许载体被克隆至细菌或噬菌体宿主中的细菌或病毒的复制起始序列，优选包括广泛宿主范围的原核起始复制。对于细菌，还应包括合适的选择标记，允许进行含有目标构建体的细菌细胞的筛选。合适的原核筛选标记还包括对于如卡那霉素或四环素等抗生素的抗性。
其他的编码附加功能的DNA序列也可以含在载体中，在本领域中是众所周知的。例如，在农杆菌转化的情况下，也将包括T-DNA的序列，用于随后的植物染色体的转化。
本发明的另一个方面涉及到宿主细胞，本发明的重组表达载体被引入其中。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”是可以互换使用的。据了解，这些术语不仅指特定的主体细胞，同样也指此细胞的后代或潜在的后代。由于要么突变或环境影响，某些修饰可能存在于随后的子代中，这样的后代事实上可能不会与亲代细胞相同，但仍然包括在此处所用的这个词的范围内。
载体DNA可以被引入到原核或真核细胞中，通过传统的转化或转染技术。如本文所用的，术语“转化”和“转染”的本意指的是各种公认的技术，用于将外来的核酸(如DNA)引入宿主细胞。
本发明的宿主细胞，例如培养中的原核或真核宿主细胞，可用于生产(即表达)本发明所述的多肽，该多肽由本发明所述的多核苷酸的开放阅读框所编码。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞用于生产多肽的方法。在一项具体实施方案中，该方法包括在合适的培养基中，培养本发明的宿主细胞(其中编码本发明的多肽的重组表达载体已被引入)，使细胞产生多肽。在另一项实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离多肽的方法。
许多的细胞类型可以作为合适的宿主细胞用于表达本发明中的多肽，多肽由多核苷酸形式的开放阅读框编码。植物宿主细胞包括，例如，能够作为合适的宿主细胞用于表达本发明的多核苷酸的植物细胞，包括，表皮细胞，叶肉和其他地面组织，叶片、茎、花器官中的维管组织，和各种植物的物种的根，如拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、玉米、水稻、棉花和大豆。
编码非全功能的PK220蛋白的PK220核酸的表达，在显性/隐性抑制方法中会很有用。PK220突变多肽，或其部分，在植物中表达，使其拥有部分的功能。突变的多肽，例如，可以具有结合到其他分子的能力，但阻止复合体的适当活性，从而造成PK220活性的总体抑制。
转化的植物细胞以及转基因植物
本发明包括原生质体，植物细胞，植物组织和植物(如单子叶和双子叶植物)，使用PK220核酸、含有PK220核酸的载体或含有PK220核酸的表达载体进行转化。本文所用的“植物”是指不仅包括完整植物，同样也包括其中的部分(即，细胞和组织，包括例如叶，茎，芽，根，花，果实和种子)。
该植物可以是任何植物类型，包括，例如，来自于以下属类的物种：拟南芥，油菜，水稻，玉米，高粱，短柄，芒草，棉花，小麦，大豆，豌豆，绿豆，番茄，红车轴，大麻，南瓜，罗莎，葡萄，核桃，草莓，莲花，苜蓿，红豆草，葫芦，豇豆，柑橘，亚麻，天竺葵，木薯，胡萝卜，萝卜，芥，颠茄，辣椒，曼陀罗，天仙子，烟草，马铃薯，矮牵牛，洋地黄，马约喇纳，菊苣，向日葵，莴苣，雀麦，芦笋，金鱼草，萱草，Nemesis，天竺葵，稷，狼尾草，毛茛属，千里光，美人襟，黄瓜，Browaalia，黑麦草，燕麦，大麦，黑麦，云杉，可可，胡杨。
本发明还包括细胞，组织，例如包括叶，茎，芽，根，花，果实和种子，以及从转化的植物中衍生的后代。
已知有多种方法用于将外源基因引入植物中，这些方法可用于将基因插入到植物宿主中，包括生物和物理的植物转化标准步骤(见，例如Miki et al.，(1993)“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”，In：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick and Thompson，eds.，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pages 67-88；Andrew Bent in，Clough SJ and Bent AF，(1998)“Floral dipping：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”)。随宿主植物的不同选择不同的方法，包括化学转染方法，例如钙磷酸，聚乙二醇(PEG)转化，微生物介导的基因转移，如农杆菌(Horsch et al.，1985)，电穿孔转化，原生质体转化，微注射，花浸渍和基因枪法。
农杆菌介导的转化
将表达载体引入植物中最广泛使用的方法是建立于根瘤农杆菌和发根农杆菌的天然转化系统上的，农杆菌是植物病原细菌，病原细菌可遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质粒，分别携带用于植物遗传转化的响应基因(见，例如，Kado，1991)。农杆菌载体系统的详述和农杆菌介导的基因转移的方法请见Gruber et al.(1993)和Moloney et al.，(1989)。
转基因拟南芥植株可容易制备，通过浸泡开花植物到农杆菌培养基中的方法，该方法是建立在Andrew Bent in，Clough SJ and Bent AF，1998的方法基础上的。《花卉浸渍：一种简化方法用于农杆菌介导转化拟南芥》。野生型植物生长到同时含有未开和已开的花朵。将植物倒置如农杆菌培养溶液中1分钟，该溶液含有合适的基因构建体。然后将植物向左水平放置在托盘中，加盖两天保持湿度，然后向右翻转装到袋子中，继续生长和萌发种子。然后收获成熟的种子。
直接基因转移
一个普遍适用的植物转化方法是基因枪微粒介导的转化，其中DNA置于大小为1至4微米的微粒表面。使用基因枪装置将表达载体引入到植物组织中，基因枪将微粒加速到300-600米/秒，足以穿透植物细胞壁和细胞膜(Sanford et al.，1993；Klein et al.，1992)。
植物转化也可以通过气溶胶束注入器(ABI)的方法来实现，见U.S.Pat.5,240,842和U.S.Pat.6,809,232所述。气溶胶束技术是用来加速湿或干粒子的速度使粒子穿透活细胞。气溶胶束技术利用惰性气体射流扩展，它从一个高气压区域通过一个小孔，进入低气压区。膨胀气体加速气溶胶液滴，其中包含的核酸分子被导入细胞或组织中。加速粒子定位于冲击首选的目标，例如植物细胞。这些粒子被构建成一个个尺寸足够小的液滴，使得细胞能忍受渗透压。使用本应用领域中人员所周知的标准技术，使转化的细胞或组织生长来制备植物。
转化子的再生
从任一单一植物原生质体或不同的外植体开发或再生植株的技术是众所周知的(Weissbach and Weissbach，1988)。这种再生和成长过程通常包括的步骤有，转化细胞的选择，通过植株扎根阶段的胚胎发育，培养这些分化的细胞。转基因胚胎和种子以同样方式再生。由此产生的转基因根苗然后种植于适当的植物生长培养基中，如土壤等。
可以通过本领域熟知的方法，见(Horsch et al，1985)，实现含有外源基因的植物的开发和再生，该基因编码的有益多肽是由农杆菌介导从叶片外植体引入的。在此过程中，在含有筛选试剂的培养基中培养转化子，培养基能够诱导被转化的植株的根系的再生，如(Fraley et al.，1983)所述。特别的是，U.S.Pat.No.5,349,124(本文特别纳入参考文献)详细介绍了基因转化的生菜细胞和由此的得到的植株的制备方法，该植物表达了对鳞翅目幼虫具有杀虫活性的杂种晶体蛋白。
此过程通常会在两到四个月内生芽，然后将这些芽转移到适当的根诱导培养基中，培养基含有选择性试剂剂和抗生素，以防止细菌滋生。为了形成植株，然后将在含有选择性试剂下生根的小芽转培至土壤或其他培养基中来促使在根的生产。这些步骤不尽相同，主要依赖于所用的特定植株，这些不同的方法是本领域众所周知的。
优选的是，再生植株是自花授粉，以提供纯合转基因植物，或者由再生植株的获得花粉，与重要农艺性状的种-生植物杂交，优选自交系植物。相反地，来自于重要系品植物的花粉用于给再生植株授粉。本发明中含有目的多肽的转基因植物的种植使用的是本领域技术人员所周知的方法。
优选的转基因植物是一种独立分裂的，能够将PK220基因构建体转移至其后代。更优选的是，转基因植物对于基因构建体是纯合的，能够在性状分配时，将此基因构建体转移至所有的后代。从转基因植物得到的种子可以生长在外地或温室中国，以及由此产生的性成熟的转基因植物是自授粉的从而产生真正的的自交产生真正的育种植物。从这些植物得到的后代变成了真正的育种系，可用于评估PK220基因表达的降低。
制备转基因植物的方法
本发明还包括生产转基因植物的方法，相对于野生型植物，转基因植物具有以下特点：增加的水分利用效率，降低的低温敏感性以及在低氮条件下，幼苗生长抑制减少。该方法包括在一个或多个植物细胞中引入一种化合物，该化合物抑制或降低植物中PK220基因的表达或活性，产生转基因植物细胞，以及从转基因细胞中再生转基因植物。该化合物可以是，例如，(i)PK220多肽；(ii)PK220核酸，类似物，同系物，同源基因，部分基因，变种或其互补序列；(iii)降低PK220核酸表达的核酸。降低PK220核酸表达的核酸可以包括启动子或增强子元件。该PK220核酸可以是内源性的或外源性的，例如，拟南芥的PK220核酸可以导入甘蓝型油菜和玉米种中。优选的是，对于被转化物种，该化合物是PK220内源性核酸序列。另外，对于被转化物种，该化合物可以是PK220外源性核酸序列，并且，相对于内源性靶序列，该化合物具有至少70％，75％，80％，85％，90％或更高的同源性。
与野生型植物(即未转化的)相比，转基因植物在不同的方面的有不同的表型。通过不同的表型，意味着该植物具有一个或多个特点，与野生型植物不同。例如，当转基因植物与一种化合物接触，该化合物降低了PK220核酸的表达或活性，那么该植物相对于野生型植物，具有一种表型，如增加的水分利用效率，降低的低温敏感性以及在低氮条件下，幼苗生长抑制减少。
该植物可以是任何植物类型，包括，例如，来自于以下属类的物种：拟南芥，油菜，水稻，玉米，高粱，短柄，芒草，棉花，小麦，大豆，豌豆，绿豆，番茄，红车轴，大麻，南瓜，罗莎，葡萄，核桃，草莓，莲花，苜蓿，红豆草，葫芦，豇豆，柑橘，亚麻，天竺葵，木薯，胡萝卜，萝卜，芥，颠茄，辣椒，曼陀罗，天仙子，烟草，马铃薯，矮牵牛，洋地黄，马约喇纳，菊苣，向日葵，莴苣，雀麦，芦笋，金鱼草，萱草，Nemesis，天竺葵，稷，狼尾草，毛茛属，千里光，美人襟，黄瓜，Browaalia，黑麦草，燕麦，大麦，黑麦，云杉，可可，胡杨。
实施例
高水分利用效率突变株hwe116的鉴定
一株拟南芥EMS突变体(哥伦比亚背景)最初被确定为具有耐旱属性。该突变体用于测试最佳和干旱条件下的水分利用效率。结果表明，该突变体耐旱的性质是由于其具有较高的水分利用效率，无论在水胁迫或最佳水分条件下。因此，此突变株被命名为hwe116。
基于图谱的hwe116克隆
通过hwe116突变株与拟南芥的兰茨贝格生态型(Ler)交叉，产生F2种群，用于基于图谱的克隆，通过测定突变株的耐旱性，以及因此确认突变株具有高水分利用效率特点。经5天干旱处理，测定F2种群的单位干重失水率水，得到的数据进行常规化，用于QTL分析，与hwe116突变株和两种野生型生态型对比，每单位F2植株干燥失重是衡量一在5天的干旱处理和数据分析的QTL是相对于hwe116突变体和野生型的两个生态型，兰茨贝格株和哥伦比亚株。收集表型实验中来自于所有的F2和对照植物的叶片组织，用于基因型分析。用Mapmaker3.0和WinQTLCart2进行QTL分析。为了进一步确定QTL峰内的突变，使用了芹菜内切酶I(CEL I)。
使用CEL I核酸酶的突变检测
芹菜内切酶I(CEL I)，能够在碱基对替换的位点高度的异性的切割DNA，而碱基对替换造成了野生型和突变体的等位基因之间的错配，因此芹菜内切酶I被报道用于检测EMS突变株中的突变位点(Yang et al.，2000；Oleykowski et al.，1998)。
使用hwe116或亲代哥伦比亚株基因组DNA为模板，通过优化的PCR扩增得到约5kb的DNA片段。扩增产物等量混合在一起，然后进行一个变性和退火循环形成异源双链DNA。42℃下使用CEL I温浴20分钟，在异源双链DNA的突变点处切割。使用1％琼脂糖凝胶电泳和EB染色观察DNA片段。
使用此方法扩增5kb的PCR产物，引物为：SEQ ID NO：102和SEQ ID NO：104，模板为：hwe116，和哥伦比亚型对照。形成的异源双链PCR产物经CEL I酶切后产生了小片段(1.4和3.6kb)。使用引物SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105扩增重叠的亚片段(约3kb)，进一步确定突变位点。亚片段经测序后，发现hwe116中的C核苷酸突变为T核苷酸。
由于核酸序列SEQ ID NO：1和3中的874位核苷酸的C到T的转变，产生了氨基酸的改变，292位的氨基酸由亮氨酸(L)的密码子(CTT)改变为苯丙氨酸(F)的密码子(TTT)，因此有益突变被鉴定。含有突变的基因被确定是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser/Thr PK)。野生型基因被确定为与GenBank登录号At2g25220相同。该丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在本文中被称为AtPK220，hwe116的确定突变形式被称为AtPK22oL292F。
转录评估
Northern分析和RT-PCR检测表明，相对于野生型对照，hwe116中的AtPK220基因的表达水平和转录尺度未发生改变。
部分AtPK220L292F和AtPK220序列的初始克隆
基于TAIR的注释，AtPK220L292F(AtPK220L292F(p))的部分序列和AtPK220AtPK220(P))的部分序列采用RT-PCR反应进行扩增，使用如下引物：SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107，分别含有BamH I和Pst I酶切位点用于克隆，模板的RNA分别分离自hwe116和对照植物(哥伦比亚型)。产生的部分AtPK220L292F核苷酸序列见SEQ ID NO：5，对应的氨基酸序列见SEQ ID NO：6。产生的部分AtPK220核苷酸序列见SEQ ID NO：7，对应的氨基酸序列见SEQ ID NO：8。
大肠杆菌表达的部分AtPK220L292F蛋白的激酶活性分析
PCR产物用BamH I和Pst I消化，并插入到表达载体pMAL-c2(New England Biolabs，Beverly，MA)中与malE基因形成一种符合读码框的融合蛋白，用于表达麦芽糖结合蛋白：MBP-AtPK220L292F(p)和MBP-AtPK220(P)。融合蛋白在大肠杆菌中表达，采用淀粉亲和层析法进行纯化，如制造商(New England Biolabs)所述。含有融合蛋白的组分经汇集和浓缩(Centriprep-30浓缩器，Amicon)。采用SDS-PAGE电泳方法分析其表达水平，融合蛋白的大小和纯度。
活性分析参照(Huang et al.，2000)的方法进行。激酶自动磷酸化分析混合物(30μl)包含：激酶反应缓冲液中蛋白激酶(50mM Tris，pH 7.5，10mM MgCl2，10mM MnCl2)，1μCi[γ-32p]ATP以及10ng纯化的AtPK220L292F(P)或MBP-AtPK220(P)。对于反磷酸化分析，每个检测反应中添加髓鞘碱性蛋白(3μg)。通过添加酶起始反应。室温下孵育30分钟后，加入30μl Laemmli样品缓冲液终止反应(Laemmli，1970)。样品在95℃反应5分钟，然后上样于15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。使用考马斯亮蓝R-250进行凝胶染色，然后脱色，烘干。采用Kodak X-Omat AR膜检测32P标记的条带。
野生型的MBP-AtPK220(p)融合蛋白能够在体外活性检测中磷酸化人工底物，表明检测系统是有效的，MBP-AtPK220(p)融合蛋白具有活性能力。与此相反，hwe116的突变形式，MBP-AtPK220L292F(p)，不能催化模式底物的磷酸化反应。单点突变足以消除hwe116的AtPK220(p)基因的活性。
AtPK220全长cDNA序列的分离
TAIR数据库中AtPK220(At2g25220)的注释确定了5′起始密码子，终止信号和3′UTR序列。注释序列的5′部分分析表明了可选的5′序列和启动子的位置。为了确定AtPK220基因的5′区域以及类似的起始密码子，使用了SMART RACE方法(快速cDNA末端扩增，CloneTech)。
设计特异性的引物SEQ ID NO：108，用于5’RACE，得到了450bp的PCR产物。由450bp的PCR产物测序得到的数据表明，TAIR中注释的AtPK220缺失了5’端的186bp，其中包括39bp的5′UTR区序列和147bp的编码序列。在TAIR的基因组注释中，还缺失了一个位于AtPK220起始密码ATG的上游324bp的内含子。
将5′RACE结果和TAIR数据库注释相组合，得到全长的AtPK220的cDNA序列(SEQ ID NO：9)。该序列被确定长度为1542bp，其中包括39bp的5′UTR，204bp的3′UTR和1299bp的编码区。该AtPK220编码区被确定为序列SEQ ID NO：1，编码432个氨基酸的蛋白质，如序列SEQ ID NO：2所示。比较AtPK220和其最接近的同源基因，At4g32000，结果显示在AtPK220中存在51bp的额外序列，包括序列SEQ ID NO：9的368-418核苷酸序列。这个序列提供了一个用于下调构建体的靶序列，该构建体被设计用来专门下调AtPK220基因，而不是非-靶基因，如At4g32000。
AtPK220的序列分析表明，该丝氨酸/苏氨酸激酶属于类受体蛋白激酶家族，具有信号肽(1-29)，胞外域(30-67)，单跨膜域(68-88)，ATP结合域(152-175，由Prosite测定)，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性域(267-279，由InterPro法测定)以及一个激活环(289-298，303-316)。
AtPK220恢复hwe116突变株
构建野生型AtPK220表达的构建体，并将之转化至hwe116突变株。构建体在CaMV 35S启动子作用下进行组成型表达，并称构建体为35S-AtPK220。
35S-AtPK220
使用引物对SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110，扩增的片段包含全长的AtPK220开放阅读框(ORF)。使用引物对SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：110，扩增的片段包含AtPK220的一部分ORF。扩增的片段用限制性内切酶Sma I和BamH I消化，并克隆至经相同的限制性内切酶消化的pEGAD载体。经PCR及随后的限制性酶切产生的包含AtPK220全长开放阅读框的片段如序列SEQ ID NO：10所示。经PCR及随后的限制性酶切产生的包含部分AtPK220的ORF的片段如序列SEQ ID NO：11所示。
35S-AtPK220构建体转化至拟南芥hwe116中。转基因株被恢复并推进到T3纯合品系。测试这些品系的抗旱性和水分利用效率特征。35S-AtPK220构建体恢复了野生型的表型。
T-DNA敲除品系及生理评估
AtPK220及两个相近的的同源基因的SALK T-DNA敲除品系，通过ABRC获得并推进纯合性。两个基因的TAIR登录号为AT4G32000(SEQ ID NO：16)和AT5G11020(SEQ ID NO：18)。它们如下所列；
AtPK220：SALK147838；
AtPK32000(AT4G32000)：SALK_060167，SALK_029937 and SALK_121979；
AtPK1 1020(AT5G1 1020)：SAIL_1260_H05
经RT-PCR或Northern检测分析基因的表达水平，结果表明，敲除株的目的基因显着减少或者完全消失。这些基因敲除品系用于生理评估。只有AtPK220(SAL_147838)的基因敲除品系具有有显着的抗旱性和较高的水分利用效率，表明AtPK220是目的基因并负责hwe116的水分利用效率表型。密切相关的基因AT4G32000和AT5G11020是非功能性冗余的，这些基因的抑制不足以产生hwe116表型型。
拟南芥中PK220蛋白活性的抑制
基因活性的抑制可以通过多种方式的技术方法获得，例如，反义表达，RNAi或发夹结构，体内突变，显性负向途径或者制备突变种群，通过筛选方法选择适当的品系等。所提供的例子说手段，这里提供的所述方法的离子用于制备具有抑制PK220基因的表达或活性的植物。
通过RNAi下调PK220
使用发夹(HP)构建体设计用于PK220的RNAi抑制。构建体由AtPK220 cDNA序列的288bp或154bp组成，分别称之为(270)PK220和(150)PK220。288bp的(270)PK220片段含有10bp的内含子序列，在构建这些PCR产物的过程中包含在PCR引物中。可以使用这些片段构建载体，在所选的启动子的控制下来驱动表达，此过程对于本领域的技术人员是显而易见。在这些实施例中，组成型启动子(35S CaMV)，或天然AtPK220启动子(PPK)被使用。AtPK220基因的两个片段，或部分被选择，以最接近的同源At4g32000为对照，AtPK220的不同区域被选定，首先是288bp的(270)PK220片段(SEQ ID NO：13)，第二是154bp的(150)PK220片段(SEQ ID NO：12)。
35S-HP-At(270)PK220及35S-HP-At(150)PK220
发夹结构(HP)35S-HP-At(270)PK220和35S-HP-At(150)PK220构建体的生成如下。分别采用引物对SEQ ID NO：134/SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：114/SEQ ID NO：115进行RT-PCR扩增，得到(270)PK220和(150)PK220的正义片段。PCR产物经Sac I酶切，并分别插入到二元载体pBI121tGUS的Sac I位点。由此产生的载体随后用于亚克隆(270)PK220和(150)PK220的反义片段，反义片段分别采用引物对SEQ ID NO：112/SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：116/SEQ ID NO：117进行RT-PCR扩增得到。载体和PCR产物都用BamH I和Xba I消化用于亚克隆。
PPK-HP-At(270)PK220及PPK-HP-At(150)PK220
PPK-HP--At(270)PK220和PPK-HP-At(150)PK220构建体分别由35S-HP-At(270)PK220或35S-HP-At(150)PK220制备得到，通过使用AtPK220启动子序列(SEQ ID NO：14)替换35S启动子序列。通过Hind III和Xba I双酶切将35S启动子序列从35S-HP-At(270)PK220和35S-HP-At(150)PK220除去。线性化的质粒然后用DNA聚合酶I的Klenow片段产生平末端并自我连接，形成一个新的质粒，其中的Xba I位点恢复，而Hind III位点消失。使用该恢复的Xba I位点，一个AtPK220启动子的NheI DNA片段被克隆至HP-At(270)和HP-At(150)序列的上游，产生最终的质粒PPK-HP--At(270)PK220和PPK-HP-At(150)PK220。AtPK220启动子序列(SEQ ID NO：14))从拟南芥(哥伦比亚型)的基因组中进行PCR扩增，使用引物对SEQ ID NO：135/SEQ ID NO：136。
P4790-HP-At(270)PK220
为了特异性下调内源性AtPK220，强力的根系启动子P4790被鉴定发现在拟南芥的根中能高表达，特别是在内皮层，周皮层和轴管中。P4790启动子与At2g44790编码序列相关，P4790的表达特征与野生型AtPK220的表达是相似的。该P4790用于替换35S-HP-At(270)PK220中的35S启动子。以拟南芥(Col)为模板，使用引物SEQ ID NO：151和SEQ ID NO：152扩增At2g44790。扩增的启动子片段为1475bp长，正好位于TAIR注释中At2g44790的起始密码子ATG的上游。1475bp的P4790片段被确定为SEQ ID NO：150。通过引物设计在启动子的5’和3’端引入Hind III和Xba I酶切位点。通过HindIII/XbaI双酶切，将启动子序列替换35S-HP-At(270)PK质粒中的35S启动子，得到最终的构建体pBI-P4790-HP-At(270)PK。
使用RNAi下调油菜中的BnPK220
35S-HP-Bn(340)PK
为了下调油菜种属中的AtPK220同源基因，制备了一个发夹结构，采用BnPK220的338bp的片段(SEQ ID NO；153)作为正义和反义部分，pBI300tGUS作为载体。根据BnPK220序列设计两对具有独特酶切位点的引物SEQ ID NO：154/SEQ ID NO：155；以及SEQ ID NO：156/SEQ ID NO：157。以甘蓝型油菜的cDNA为模板分别用两对引物扩增338bp长的PCR片段。SacI片段插入到pBI300tGUS载体的SacI位点，以反义方向位于tGUS间隔区的下游。产生的质粒，随后在XbaI和BamHI位点用于以正义的方向克隆XbaI-BamI片段。载体pBIl21tGUS经内部的NPTII筛选标记基因修饰，命名为pBI300。pBIl21载体内的NPT II基因含有一个点突变(3383位置的G到T，氨基酸改变E182D)。为了将基因恢复到野生型版本，该载体的NheI-BstBI片段(2715-3648位置)被来自于质粒pRD400的相应的NheI-BstBI片段所替换(PNAS，87：3435-3439，1990；Gene，122：383-384，1992)。
P4790-HP-Bn(340)PK
At2g44790的P4790启动子用于控制发夹结构的表达来下调油菜种属的内源性BnPK220。质粒35S-HP-Bn(340)PK经Hind III和Xba I酶切后，用P4790启动子替换35S启动子。
通过反义下调PK220
制备构建体35S--antisenseAtPK220用来通过反义下调AtPK220的表达。使用引物对SEQ ID NO：106/SEQ ID NO：113进行PCR产生反义片段。合成的产物用BamHI和XbaI消化产生一个1177bp的序列，含有1160bp的AtPK220基因(SEQ ID NO：11)。包括有，5′端10bp的内含子序列，以及从PCR引物中保留的3′端7bp的3′UTR序列。以与35S启动子反义的方向，将1177bp的片段克隆到pBI121 w/oGUS载体上的BamHI和XbaI位点。
通过AmiRNA下调PK220
构建一个人造小RNA(amiRNA)用于在拟南芥中下调AtPK220的表达。以拟南芥(Col)基因组为模板，利用PCR扩增拟南芥中包含microRNA319a基因的DNA片段(SEQ ID NO：148)，引物为SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142。miR319a的骨架然后用于构建amiRPK220(SEQ ID NO：149)，其中，利用重组PCR方法将miRNA319a中正义及反义方向的21bp的片段用AtPK220中的21bp的DNA片段替换。设计三对引物用于构建过程：SEQ ID NO：141/SEQ ID NO：144；SEQ ID NO：143/SEQ ID NO：146以及SEQ ID NO：145/SEQ ID NO：142。最后的PCR产物用BamHI和XbaI酶切，然后克隆到载体pBI121w/oGUS中，用于转化拟南芥或选择的其他植物物种。
通过显性-隐性策略抑制PK220
35S-AtPK220L292F
为了非功能AtPK220序列的表达，用RT-PCR扩增来自hwe 116的AtPK220L292F，采用正向和反向引物：SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：110。PCR产物用限制性内切酶BamHI和XbaI消化(SEQ ID NO：121)，连入双元载体pBl121w/oGUS。SEQ ID NO：121的序列包含AtPK220L292F开放阅读框(SEQ ID NO：3)，在5′端多了3bp，以及3′端多了7bp，这是从UTR序列(SEQ ID NO：121)中衍生出来的。最终的构建体，35S-AtPK220L292F，用于产生拟南芥和油菜转基因植株，进一步得到纯合体用于生理评估。此外，载体用来转化所选的植物品种，可以是双子叶植物或单子叶植物。
P4790-AtPK220L292F
根启动子P4790的HindlII-XbaI酶切片段，用于替换pBI300中的35S启动子，然后AtPK220L292F序列通过XbaI和BamHI消化置于P4790的下游，来产生P4790-驱动的显性-隐形构建体。所得的质粒，然后用于油菜的转化。此外，载体用来转化所选的植物品种，可以是双子叶植物或单子叶植物。
利用RNAi下调单子叶植物的AtPK220同源基因
PBdUBQ--HP--Bd(272)PK
构建一个表达盒，插入到连个不用的载体骨架中，第一个是插入到pUCAP载体的PacI-AscI位点，第二个是插入到pBF012载体的PacI-AscI位点。pBF012与pBINPLUS/ARS是基本相同的，除了通过FseI消化及自我连接，切除了马铃薯-Ubi3驱动的NPTII表达盒。
二穗短柄草的PK220(BdPK220)被扩增，使用不同的引物组合SEQ ID NO：158(bWET XbaI F)加SEQ ID NO：159(bWET BamHI R)，引物中分别含有XbaI位或BamHI位点，以及SEQ ID NO：158(bWET XbaI F)加SEQ ID NO：160(bWET ClaI R)，引物中分别含有XbaI位或ClaI位点。PCR产物经相应的限制性内切酶消化后，得到272bp的片段(SEQ ID NO：161)。
发夹间隔序列，BdWx内含子1(SEQ ID NO：164)，被扩增，使用引物SEQ ID NO：162(bWx BamHI F)加SEQ ID NO：163(bWx ClaI R)，引物中分别含有BamHI位点或ClaI位点，然后用相应的限制性内切酶消化。二穗短柄草的Wx基因是水稻蜡质基因GBSS的同源基因，尽管内含子的保守性较小。
三个片段连接到一起，插入到pUCAP载体的多克隆位点，产生了两侧分别为方向相反的Bd(272)PK220靶序列包围的BdWx内含子1序列。二穗短柄草泛素(BdUBQ)启动子包含一个内部的BamH I位点，因此，使用引物SEQ ID NO：200(bWET BamH I end1)和SEQ ID NO：165(bWET BamH I end2)扩增RNAi结构盒，这会产生BamH I粘性末端而不需要消化。RNAi的BamH I片段，然后连接至pUCAP的BamH I位点，载体中已经包含BdUBQ启动子和BdUBQT终止子，产生中间克隆pBF067。使用引物SEQ ID NO：166(BdUBQ PvuI F)和SEQ ID NO：167(BdUBQT PacI R)扩增pBF067中完整的插入片段，经PVuI和PacI消化，随后连接至pUCAP或pBF012载体的PacI位点，载体中在AscI-PacI位点处已经包含一个BdGOS2驱动的突变NPTII筛选标签，分别得到质粒pBF108和pBF109。该NPTII突变基因常见于克隆载体。只有一个碱基对与野生型不同。
此表达盒位于pUCAP的PacI-AscI位点，用于构建穿梭/轰炸载体PBF108，以及位于pBF012的PacI-AscI位点用于构建双元载体PBF109。
PBdUBQ--HP--Pv(251)PK
构建了一个表达盒插入到两个不同的载体骨架中，第一个是插入到pUCAP载体的PacI-AscI位点，第二个是插入到pBF012载体的PacI-AscI位点。柳枝稷的PK220基因中长251bp的片段(Pv(251)PK220)被定义为SEQ ID NO：168，用不同的引物组合进行扩增：SEQ ID NO：169(PvWET XbaI F)加SEQ ID NO：170(PvWET BamHI R)以及SEQ ID NO：169(PvWET XbaI F)加SEQ ID NO：171(PvWET ClaI R)。PCR产物经相应的限制性内切酶消化。因为关于PVWx内含子1序列的信息不存在，所以在本构建物中BdWx内含子1被用来作为间隔序列。该序列使用引物SEQ ID NO：162(bWx BamHI F)加SEQ ID NO：163(bWx ClaI R)进行扩增并用相应的限制性内切酶消化。
三个片段连接到一起，插入到pUCAP载体的多克隆位点的XbaI处，产生了两侧分别为方向相反的Pv(251)PK220靶序列包围的BdWx内含子1序列。因为没有可用的PvUBQ启动子序列，因此在本构建体中使用了BdUBQ的启动子和终止子。该BdUBQ子含有一个内部的BamH I位点，因此，使用引物SEQ ID NO：172(PvWET BamHI end1)和SEQ ID NO：173(PvWET BamHI end2)扩增RNAi结构盒，这会产生BamH I粘性末端而不需要消化。RNAi的BamH I片段，然后连接至pUCAP的BamH I位点，载体中已经包含BdUBQ启动子和BdUBQT终止子，产生中间克隆pBF152。使用引物SEQ ID NO：166(BdUBQ PvuI F)和SEQ ID NO：167(BdUBQT PacI R)扩增pBF152中完整的插入片段，经PVuI和PacI消化，随后连接至pUCAP或pBF012载体的PacI位点，载体中在AscI-PacI位点处已经包含一个BdGOS2驱动的野生型NPTI，分别得到质粒pBF169和pBF170。
PSbUBQ--HP--Sb(261)PK
构建了一个表达盒插入到两个不同的载体骨架中，第一个是插入到pUCAP载体的PacI-AscI位点，第二个是插入到pBF012载体的PacI-AscI位点。双色高粱PK220基因(SbPK220)中长261bp的片段(Sb(261)PK220)被定义为SEQ ID NO：174，用不同的引物组合进行扩增：SEQ ID NO：175(SbWET XbaI F)加SEQID NO：176(SbWET BamHI R)以及SEQ ID NO：175(SbWET XbaI F)加SEQ ID NO：177(SbWET ClaI R)。PCR产物经相应的限制性内切酶消化得到Sb(261)PK220片段。发夹间隔序列，SbWx内含子1(SEQ ID NO：178)，被扩增，使用引物SEQ ID NO：179(SbWxBamHI)加SEQ ID NO：180(SbWx ClaI R)，然后用相应的限制性内切酶消化。三个片段连接到一起，插入到pUCAP载体的多克隆位点的XbaI处，产生了两侧分别为方向相反的SbWET靶序列包围的SbWx内含子1序列。使用引物SEQ ID NO：181(SbWET BamHI end 1)和SEQ ID NO：182(SbWET BamHI end2)，通过PCR扩增在RNAi表达盒上加上BamH I粘性末端。RNAi的BamH I片段，然后连接至pUCAP的BamH I位点，载体中已经包含BdUBQ启动子和BdUBQT终止子，产生中间克隆pBF151。使用引物SEQ ID NO：192(SbUBQ PvuI F)和SEQ ID NO：167(BdUBQT PacI R)扩增pBF151中完整的插入片段，经PVuI和PacI消化，随后连接至pUCAP或pBF012载体的PacI位点，载体中在AscI-PacI位点处已经包含一个BdGOS2驱动的野生型NPTII，分别得到质粒pBF158和pBF171。
使用引物SEQ ID NO：184(SbGOS2 HindlII F)和SEQ ID NO：185(SbGOS2 HindlII R)，利用PCR扩增来自于高粱基因组序列中被鉴定为SbGOS2启动子的序列，GOS2启动子的一个1000bp的片段，被确定SEQ ID NO：183，用PCR扩增并使用HindlII酶切位点克隆。
使用引物SEQ ID NO：187(SbUBQ PstI F)和SEQ ID NO：188(SbUBQ PstI R)，利用PCR扩增来自于高粱基因组序列中被鉴定为SbUBQ启动子的序列，UBQ启动子的一个1000bp的片段，被确定SEQ ID NO：186，用PCR扩增并使用Pst I酶切位点克隆。
使用引物SEQ ID NO：190(SbUBQT KpnI F)和SEQ ID NO：191(SbUBQT KpnI R)，利用PCR扩增来自于高粱基因组序列中被鉴定为SbUBQ终止子的序列，UBQ终止子的一个239bp的片段，被确定SEQ ID NO：189，用PCR扩增并使用Kpn I酶切位点克隆。
巨芒草(MgPK220)RNA干扰
通过发夹策略设计用于下调的表达载体的构建可遵循同样的策略制定，如上所述。得到的构建体可能包含以下元件，一个BdGOS2-wtNPTII-BdUBQT筛选标签表达盒以及一个BdUBQ-(MgPK220发夹-RNAi表达盒)-BdUBQT，位于所选的载体中，例如pUCAP和pBF012。
AtPK220启动子的分离和克隆
使用拟南芥(哥伦比亚生态型)基因组DNA为模板，用PCR的方法分离AtPK220启动子。5′端引物，SEQ ID NO：119，依据相邻基因设计，3′端引物，SEQ ID NO：120，位于AtPK220基因起始密码子ATG上游25bp处。将扩增产物用BamH I和Sma I消化，克隆至pB1101中。酶切消化片段，SEQ ID NO：14，长度为1510bp。得到的构建体命名为PAtPK220-GUS。
使用GUS分析检测AtPK220启动子的活性
利用花朵浸渍法将PAtPK220-GUS转化至拟南芥植物中，转基因植株进步至T3纯合性。收集T3开花植物的各种组织，包括幼苗，叶，茎，花，角果和根，在X-Gluc溶液中37℃过夜染色，用乙醇溶液脱色，在显微镜下检查。结果表明，AtPK220启动子主要在根组织的内皮层和周皮层细胞中表达，也在叶毛和萌发种子的种皮中有所发现。观察结果的重要意义在于，PAtPK220-GUS基因的表达是受到水分胁迫抑制的。
拟南芥AtPK220蛋白的亚细胞定位
在转基因拟南芥中表达一个全长野生型AtPK220-GFP用于测定天然蛋白的亚细胞定位。由引物对SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110扩增产生的片段用Sma I和BamH I消化，得到一段含有AtPK220全长开放阅读框的片段，如SEQ ID NO：10所示，克隆至pEGAD质粒的SmaI和BamHI位点，位于绿色荧光蛋白(GFP)下游，编码框相对应。此外，使用引物对SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199，扩增AtPK220编码序列，通过Age I酶切pEGAD质粒及扩增的AtPK220片段，将AtPK220插入GFP的上游，并与GFP编码框相对应。
将35S-GFP-AtPK220和35S-AtPK220-GFP构建体，转化至拟南芥植株中，纯合的转基因植株(根组织)被用于在荧光共焦显微镜下进行GFP信号的筛查。结果发现，沿细胞质膜检测到绿色荧光，这表明AtPK220蛋白是与根的细胞膜有关，并且AtPK220的功能可能是，作为对感知的受体激酶或环境信号传感器。
通过5′和3′RACE分离甘蓝型油菜的BnPK220
为了从油菜中分离AtPK220的同源基因，利用AtPK220序列在NCBI核苷酸数据库(nr/nt，est)以及TIGR(DFCI)甘蓝型油菜EST数据库中进行BLAST搜索(BlastN)。基于最高相似度的序列，设计一对引物，SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：123，用来PCR扩增BnPK220的一部分片段。使用甘蓝油菜叶片中分离的mRNA和基因组DNA作为这些扩增反应的模板。通过PCR，以油菜基因组DNA为模板，得到一个约500bp的DNA片段。该PCR产物序列分析表明，它与AtPK220的核苷酸序列以及内含子组成方面具有高度同源性。
基于BnPK220的部分序列，进行了5′和3′RACE用来分离BnPK220的全长cDNA。对于3′RACE，使用正向引物SEQ ID NO：124，以及嵌套引物SEQ ID NO：125。对于5′RACE，设计了向引物SEQ ID NO：126，以及嵌套引物SEQ ID NO：127。用于3′RACE或5′RACE的RACE-ready cDNA是由甘蓝型油菜嫩叶片中分离的RNA制备的。
5′RACE产生的扩增DNA片段长度约为650bp；3′RACE产生的约为1kb大小。这两种RACE片段额序列分析表明，其与AtPK220具有高度的序列相似性。通过组合5′RACE、部分BnPK220片段以及3′RACE产物，得到BnPK220序列的全长mRNA。
使用PCR引物SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：129，通过RT-PCR方法扩增BnPK220的全长cDNA。该cDNA含有1302个核苷酸组成的开放阅读框(SEQ ID NO：25)，编码433个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：26)。使用来自甘蓝型油菜的cDNA，进行RT-PCR扩增，得到另一个BnPK220的全长cDNA。该cDNA(SEQ ID NO：193)与SEQ ID NO：25的同源性为98.6％，编码的蛋白质(SEQ ID NO：194)与SEQ ID NO：26的同源性为99.3％。
利用5′RACE分离大豆的全长GmPK220
通过NCBI的EST数据库的BlastN分析检索，发现一个AtPK220的同源物，是大豆(橹豆)的EST基因，登录号为CX709060.1。根据这个同源物，从大豆EST数据库中检索到含有13个EST的单一基因簇。由这13个EST组成的一个重叠群，涵盖了大多数的基因序列。
通过该重叠群以及5′RACE和3′RACE结果的组合，确定了GmPK220的全长序列(SEQ ID NO：41)。进行5′RACE，引物SEQ ID NO：130用于首次RACE PCR，引物SEQ ID NO：131用于嵌套RACE PCR。进行3′RACE，引物SEQ ID NO：137用于首次RACE PCR，引物SEQ ID NO：138用于嵌套RACE PCR。GmPK220编码的蛋白质如SEQ ID NO：42所示。
通过数据库检索分离OsPK220(大米)序列
水稻基因组(Oryza sativa，粳稻品种)已经完全测序并公开提供。通过水稻EST数据库的BLAST搜索以及基因组序列数据库的BLASTp搜索，确定了AtPK220在水稻中的同源基因。具有最高得分的目的序列被确定为登录号Os05g0319700。
Os05g0319700简称为OsPK220，如SEQ ID NO：59所示，编码的蛋白质如SEQ ID NO：60所示。
ZmPK220(玉米)序列的分离
通过TIGR的EST数据库的BLAST搜索，发现了两个候选同源基因，一个是单一基因登录号TC333547，第二个登录号是C0439063。
登录号TC333547的长度为2125个核苷酸，包含一个1377个核苷酸的开放阅读框(SEQ ID NO：77)，编码458个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：78)。翻译的蛋白是全长的，比AtPK220稍大。C-端激酶结构域与拟南芥和玉米的蛋白序列是高度保守的，然而，N-端序列的变数较多。
C0439063是一个简短的EST序列，缺少了5′端的序列。通过RACE方法获得缺失的序列。依据C0439063和AtPK220之间的对比校准，设计两个5′RACE引物。首次5′RACE引物为SEQ ID NO：132和嵌套5′RACE引物为SEQ ID NO：133。同样进行3′RACE，引物SEQ ID NO：139用于首次RACE PCR，引物SEQ ID NO：140用于嵌套RACE PCR。基于5’RACE和3’RACE结果以及C0439063EST序列，组合得到ZmPK220(SEQ ID NO：79)序列。相应的蛋白质序列如SEQ ID NO：80所示。
序列分析表明，与TC333547相比，C0439063与水稻OsPK220有较高的序列相似性。
二穗短柄草(Bd)BdPK220序列的分离
短柄草是模式单子叶植物之一，主要用于功能基因组研究。从公共ESTs或GSSs组合得到重叠群，根据同源比对，它涵盖了BdPK220的3′部分。根据重叠群设计引物Bd81RAR1(SEQ ID NO：195)和Bd81RAR2(SEQ ID NO：196)，使用短柄草叶片的cDNA进行RACE反应，得到了约650bp的单一片段。将RACE序列和重叠群进行组合，得到了全长BdPK220序列(SEQ ID NO：24)，它编码一个461个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：197)。
通过数据库检索确定GsPK220(棉花)序列
通过棉花(Gossypium)TIGR-EST数据库的BLAST搜索，确定了一个序列簇，定义登录号TC79117，其与AtPK220具有很高的相似性。这个序列簇具有有两个重叠的EST序列，TC79117在这里被称为GsPK220，由1086个核苷酸的开放阅读框组成(SEQ ID NO：81)。最大的开放阅读框编码361个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：82)。
在限水条件下，hwe116突变体耐旱表型的发现，以及在干旱和最适条件下具有高水分利用效率
两组植物生长(每个3英寸的盆5株，装有等量的无土栽培混合液)在最适条件的生长箱中(22℃，18hr光照，150uE，相对湿度70％)，直到开花的第一天(n＝6/项目/处理)。从第一朵花开，所有的植物提供相同数量的水(最优级)，但一组植物用于最适处理，另一组用于干旱处理。在最适处理中，每天称量盆重，测定每日的水分损失，然后浇水回升到最适水平。在干旱处理中，每天称量盆重，测定水分损失，并允许干旱。在第0，2和4天收获干旱和最适处理条件下的植物，来进行芽苗生物量测定。与对照相比，在干旱条件下，相对于芽苗干重，较低的水分损失表示耐旱的表型。在处理期间，累积的芽苗干重与水分损失的比率，提供了水分利用效率(WUE)的测定方法。植物hwe116推迟了1至2天开花。在干旱条件下，hwe116的相对芽苗生物量的水损失值，明显比亲本对照低(22％)。这一结果表明，该突变体是耐旱的。另外还发现，在最适条件下，hwe116突变株的相对芽苗生物量的水损失值，同样明显比亲本对照低(41％)。这一结果与较高的水分利用效率的表型是一致的。效率的计算表明，在干旱(表1)和最适(表2)两种条件下，突变体hwe116水分利用更有效，因为它用较少的水积累了更多的芽苗生物量(干旱)，或同样的生物量而使用较少的水(最适)。
表1干旱条件下的水分利用效率(WUE)
表2最适条件下的水分利用效率(WUE)
Figure BPA00001310246000462
突变株水分利用效率提高的最终结果是，更高的芽苗干重生物量，如表3所示(从第一朵花后四天收获)。
表3最终芽苗干重生物量
Figure BPA00001310246000463
hwe116突变株在干旱处理过程中保持较高的土壤水含量，达到水分胁迫条件更晚，以及在开花期中，相对于对照植物，在干旱压力条件下，显示出产量保护能力。
在装有等量的无土栽培混合液的4英寸的盆中种植5株植物，进行了一项实验。两组植物生长(最适和干旱)生长在最适条件的生长箱中(22℃，18hr光照，150uE，相对湿度70％)，直到开花的第一天(n＝9/项目/处理)。从第一朵花开，所有的植物提供相同数量的水，随后，对于干旱处理组进行停水。最适条件组还像之前一样每天浇水。在干旱处理组中，每天称量盆重，共处理6天，来测定土壤水含量。6天干旱处理后，重新给植物浇水，允许它们完成生命周期，与最适条件下的最适组一样。在成熟期，收获每盆中的种子，测定最适条件和干旱处理条件下的植物的种子产量。测定干旱处理过程中土壤水份含量变化的结果。土壤水含量以占盆中初始水量的百分比来表示。结果表明，该突变株能够保持盆中的水更长的时间，因此它达到了胁迫水平(约25％的土壤水含量)的时间比对照晚一天，而且比对照晚一天枯萎。这种处理造成突变株比最适水平减产了17％，而对照减产了1％。因此，突变株显示出24％的产量保护，相对于对照在干旱处理条件时。
hwe116突变株的幼苗表显示出较少的冷应激敏感性。
两组植物，每项8个重复实验，每盆3株，在3寸的盆中生长在最适条件下的生长箱中，22℃，减少白天时间来延长营养生长和延迟开花(10hr光照，150uE，14hr黑暗)，70％的相对湿度。在生长的第10天(幼苗从琼脂板移植到土壤后的3天)，将冷处理组置于8℃的生长箱，继续生长11天，而最适条件组保持在22℃。在生长的第21天收获植物用于测定芽苗干重(DW)。结果见表4。在最适条件下，hwe116突变株比对照组的幼苗要小，但冷处理后，芽苗干重与亲代的干重相等，当以最适干重的百分比评价时，它比两个对照组分别高9％和15％，这表明突变株的生长没有像对照组那样受到寒冷的抑制。
表4最适和寒冷条件下的芽苗干重
Figure BPA00001310246000481
hwe116突变株具有更厚的叶片，单位叶片面积的叶绿素含量更高。突变株显示出延缓叶片衰老和氧化胁迫抗性。
植物们生长在最适条件下，每3英寸盆1株，在生长箱中(16hr光照，300uE，22℃，相对湿度70％)。初进开花时，从三个最新鲜的完全长成的叶片中取三个叶盘(每个86.6um2)，放入含有滤纸的平板培养皿中，滤纸上有5μM的N，N-二甲基-4，4′-联吡啶二氯(百草枯)溶液作为氧化剂。含有叶片盘的平板在150uE光照下连续25小时。这导致叶绿素漂白。通过测量叶片盘的叶绿素含量来定量测定突变株和对照组漂白程度的区别。同样从没有被百草枯处理的叶片中取一小叶盘，测定最佳叶片叶绿素含量。同时称重这些叶盘。结果表明，突变株具有较高的单位叶面积总叶绿素含量(见表5)，不过突变株的叶片较厚(与对照组相比，突变株叶盘要重15至24％)。每克新鲜叶片组织叶绿素的含量，因此没有什么不同。目前在突变株与对照组之间的叶绿素a和叶绿素b的比率还没有什么差异。hwe116突变株显示了氧化胁迫抗性，随着百草枯处理，叶绿素含量提高了5至7％(见表5)。hwe116突变株的叶片衰老也被延缓(数据未显示)。
表5氧化胁迫对叶片叶绿素含量的影响
Figure BPA00001310246000491
在低氮培养基上，突变的hwe116幼苗生长显示出较少的的抑制作用
十二株幼苗生长在含有1/2MS培养基的琼脂平板上(每项6个平板)，培养基中含有最适的(20mM)或低的(0.3mM)氮含量。将平板放入生长室中，以18hr的光照期(100UE)垂直培养6天，然后平板水平放置，幼苗再生长4天，收获芽苗。计算每块平板上经过10天生长的幼苗的平均芽苗干重。结果见表6。生长在最适条件下的hwe116突变株的芽苗干重明显降低，但当在低氮水平下生长时，没有显着差异。与最适氮水平相比，低氮水平的突变株的芽苗干重比对照组高3至7％。这表明突变株可能有更好的氮源利用效率。
表6.氮源对幼苗芽苗干重的影响
PK220基因敲除突变株显示出耐旱趋势及在干旱处理是具有较高的水分利用效率
从SALK研究所获得的AtPK220基因T-DNA敲除的植物品系(SALK_147838)生长(每个3”盆5株)在最适条件下的生长室中(18hr光照，150uE，22℃，相对湿度60％)直到第一次开花(n＝8/项目/收获)。通过使用相同数量的水浇灌所有的植物以及停止进一步浇水来起始干旱处理。每天称量盆重，在干旱处理的第0，2，4天收获植物用于测定芽苗干重。结果表明：与野生型对照相比，基因敲除突变株相对于第2天的芽苗干重，盆的第2天水分损失明显降低(13％)，第2天的芽苗干重显著提高(24％)。此结果与耐旱表型一致。
结果表明，该基因敲除突变株的水分利用效率比对照-野生型高，这是由于当使用相同的数量的水作为对照时(表7)，基因敲除突变株能够在处理的第2天积累更多的芽苗生物量。
表7.干旱处理条件下的水分利用效率
Figure BPA00001310246000511
35S--HP-At(270)PK220构建体在拟南芥的转基因株系中显示耐旱性
植物生长(每盆5株，8盆/项/收获)在最适条件下的生长室中(18hr光照，150uE，22℃，60％相对湿度)，直到开花的第一天。通过使用相同数量的水浇灌所有的植物以及停止进一步浇水来起始干旱处理。每天称量盆重，在干旱处理的第4天收获植物用于测定芽苗干重。结果(表8)显示，13个转基因品系中的11个表现出耐旱表型(相对于4日的芽苗生物量，2天的水分损失较少)。这些品系中的四株表现出了开花期的延迟(1天)，与hwe116突变株一样。与野生型对照相比，大部分转基因品系植物在第4天的最终芽苗生物量有所提高。这些结果都是转基因品系PK220表达下调的耐旱表型的指标。作为示例，前三个品系65-4，38-5，和59-3的AtPK220表达水平分别下降低了75％，47％和58％。
表8.35S-HP-At(270)PK220转基因品系的耐旱性和芽苗干重(4天)，相对于野生型(WT)以及hwe116突变株相对于亲代对照。
  38-5   116％   124％
  59-3   112％   119％
  33-7   111％   114％
  54-11   108％   115％
  56-3   107％   115％
  43-11   107％   113％
  23-8   106％   111％
  12-2   106％   110％
  63-4   104％   110％
  32-1   104％   109％
  30-3   101％   104％
  74-2   101％   107％
  hwe116   100％   100％
  野生型   186％   106％
  亲本   100％   100％
35S--HP-At(270)PK220转基因品系拟南芥的耐旱性以及增强的水分利用效率被确认
35S-HP-At(270)PK220转基因品系，每盆5株生长在最适条件下的生长室中(18hr光照，150uE，22℃，60％相对湿度)，直到开花的第一天(n＝8)。通过使用相同数量的水浇灌所有的植物以及停止进一步浇水来起始干旱处理。干旱处理的4天每天称量盆重，在干旱处理的第0，2，4天收获植物用于测定芽苗干重。结果证实，相对于对照组，5个转基因品系的相对于2天的芽苗生物量的2天的水分损失较低，确认了它们的耐旱表型(表9)。5个转基因品系的第2天芽苗干重较大。
表9.35S-HP-At(270)PK220转基因株系的耐旱性和芽苗干重
Figure BPA00001310246000531
在4天干旱处理过程中，三种转基因品系的水分利用效率比对照要高，增强的水分利用效率是由于芽苗干重积累变大了(表10)。
表10.35S--HP-At(270)PK220转基因品系在干旱处理过程中第0天和第4天的水分利用效率。
Figure BPA00001310246000532
拟南芥35S--HP--At(270)PK220转基因品系具有相对于芽苗生物量来说较低的水分损失以及在最适条件下具有增强的水分利用效率。
各种植物，35S-HP-At(270)PK220转基因株系65-7和59-5，野生哥伦比亚型，hwe116突变株及其亲本，生长(每3英寸盆5株)在最适条件下的生长箱中(22℃，18hr光照，200uE，60％相对湿度)，直到第一朵花开(n＝8/组项目/收获)。第1朵花开时，限水条件组的所有盆用相同数量的水浇灌(前4天一个盆重120克，后3天升至130克，由于植物越涨越大，他们需要更多的水)。每天称量盆重，来确定每日水分损失量，在该处理条件下的第0天和第7天收获植物。通过芽苗生物量与水分损失的比率来计算水分利用效率(WUE)。结果如表11所示。
表11.最适条件下的水分利用效率
Figure BPA00001310246000541
结果表明，在最适水分条件下，两种转基因品系以及突变株具有增强的水分利用效率。
最适和限水条件下，35S--HP-At(270)PK220转基因拟南芥的生长速率均大于对照组
35S-HP-At(270)PK220转基因株系65-4和野生哥伦比亚型植物，生长(每3英寸盆5株)在最适条件下的生长箱中(22℃，18hr光照，150uE，60％相对湿度)，直到第一朵花开(n＝8/项目/处理/收获)。第1朵花开时，限水条件组的所有盆用相同数量的水浇灌(至盆重95g)，进一步的浇水停止2天。对于限水条件组植物，需要2天才能达到初始土壤含水量的约30％(约55克总盆重)，这被称为前处理。在那时限水条件处理已被视为已开始(处理的0日)，植物每天浇水至总盆重55克，连续3天，并在随后的4天加到65克(直到处理第7天)。最适组维持在最适条件下，在预处理的2天以及处理的前3天每日浇水至总盆重100克，处理的后4天每日浇水至总盆重130克(因为植物越长越大他们需要更多的水)。测量所有植物的每日水分损失，在处理的第0，1，2，3，5和7天收获两组中的植物来进行芽苗干重测定。相对于芽苗生物量(耐旱型)的水分损失，由在处理开始前的最初2天，处理的前3天及处理的后4天叠加计算。在最适条件(表12)和限水条件(表13)下的结果显示如下。转基因株系65-4在最适和限水条件下，相对于芽苗生物量，失去的水比野生型少。在限水条件下，这与增强的抗旱性表型一致。
表12.最适条件下水分损失(g)/芽秒干重(g)
Figure BPA00001310246000551
表13.限水条件下水分损失(g)/芽秒干重(g)以及耐旱性(以野生型百分比表示)。
Figure BPA00001310246000561
两种处理情况下分别计算了七天中的植物的生长率。结果表明，在两种处理条件下，转基因株系65-4比野生型的植物更大(高达24％)。转基因品系的生长速率(7天处理过程中每天几倍的芽苗干重)，在最适条件和限水两种条件下(分别为63.3毫克苗/天和21.3毫克苗/天)，比野生型(分别为58.3毫克苗/天和20.4毫克苗/天)略有提高。
在限氮条件下，拟南芥35S--HP-At(270)PK220转基因品系以及hwe116突变株比对照组生长的更好。
35S-HP-At(270)PK220转基因株系65-5，其隔离的空对照(空65-1)和野生型(WT)，再加上hwe116突变株及其亲本对照，在最适和限氮条件下，进行幼苗生长的特征分析。氮含量指的是植物生长可用的氮元素，包括硝酸盐和和铵盐氮源。幼苗生长在琼脂板上(每板10株，每个项目每处理条件5块板)，平板中含有最适养分(包括20mM氮源)或低(限制生长)氮(除了氮源为0.5mM外，其他所有营养为最适条件)。板被放置在一个18hr光照，200μE和22℃的生长箱中。幼苗生长14天后，收获芽苗生物量(8苗)，并测定叶绿素(2苗)。在最适条件平板中，平均幼苗芽苗生物量没有差别，除了hwe116突变株，如之前所示，芽苗生物量干重略小(不显着)。在低氮平板中，hwe116突变株有明显增大的芽苗干重，与亲代相比，生长抑制减少了30％。转基因株系65-5显示比对照组稍大的芽苗干重，比对照的生长抑制降低5％至7％(表14)。
表14.氮源对幼苗干重的影响
Figure BPA00001310246000571
生长在低氮水平下的幼苗叶绿素总含量反映了芽苗干重的结果。叶绿素含量与可用氮源的关系非常密切，植物在氮源缺乏时的主要症状之一就是是叶萎黄或漂白。表15显示，转基因品系65-5和突变株hwe116的叶绿素含量的降低比对照要少。
表15.氮源对幼苗芽总叶绿素含量的影响
Figure BPA00001310246000572
  hwe116   1006   51   376   37   37％
  亲本   836   59   208   47   25％
这些结果证实，hwe116突变株在限氮条件下生长的更好，转基因株系表现出同样的趋势。因此，植物中PK220基因的下调看来导致了氮源利用效率的增加(每单位可用氮源积累更多的生物量)。
拟南芥35S--HP-At(270)PK220转基因品系以及hwe116突变株发芽更快，在寒冷条件下发芽率较高
在寒冷(10℃)条件下进行发芽实验，含有35S--HP-At(270)PK220构建体的转基因株系65-5相对于野生型对照，以及hwe116突变株相对于其亲本对照，生长在含有最优培养基的琼脂平板上。每个项目四个平板，每个平板30粒种子，置于10℃，18hr光照(200μE)的生长箱中。以能萌发的种子的百分比评价发芽率(胚根的出现)，从种子放入平板的第5天开始(前5天没有发芽)，每天记录两次发芽率，连续5天。一旦观察不到发芽的进一步变化，将所有平板均放置在22℃的生长箱中以检查那些尚未发芽的种子的发育能力。所有项目显示出98至100％的种子发芽能力，hwe116突变株具有94％的发芽能力。在10℃下(表16)发芽的评估结果表明，转基因株系65-5发芽早于它的野生型对照。该hwe116突变株在寒冷条件下的发芽速率比其亲本对照的要高。这些数据，再加上在寒冷条件下突变株生长更好的证据表明，在低温胁迫下，种子和幼苗的活力更强。
表16.10℃时可萌发的种子的发芽百分比
Figure BPA00001310246000591
最适条件下的气体交换测量数据支持了35S--HP--At(270)PK220转基因拟南芥的更高水分利用效率
在最适条件下，两种转基因株系和野生型植物生长在四英寸直径的盆中(每盆一株)，生长箱为18hr光照(200uE)，22℃，相对湿度60％。从第一次开花后8天，进行气体交换测量，测量最新鲜的，充分发展的叶片，每个项目重复10至11次。在环境生长光照和温度条件以及400ppm二氧化碳下，使用Li-6400和拟南芥叶管测定培养箱中的光合作用和蒸腾速率。从光合作用与蒸腾作用的比值，计算瞬时水分利用效率(WUE)。结果列于表17。转基因株系中的水分利用效率野生型的要高11和18％。这个数据与之前的水分利用效率测量的结果是一致的，那是在几天时间内使用生物量积累与水分损失的比率来测定蒸腾作用中的水分利用效率。
表17.最适条件下测定光合作用(umol二氧化碳/m2/s)，蒸腾作用(mmol H2O/m2/s)和水分利用效率
Figure BPA00001310246000601
35S--HP--At(270)PK220转基因拟南芥的耐旱性导致在干旱胁迫下种子产量和生物量的保护。
两种转基因株系和野生型植物生长(每3英寸盆5株，含有等量土壤)在最适条件下的生长箱中(22℃，18hr光照200uE，相对湿度60％)，直到第一朵花开。在第一朵花开时，到一半植物采用干旱处理，而另一半则在最适条件下保持到成熟。干旱处理包括浇灌所有的植物至同样的饱和水位。然后每天对植物进行称重，来监测盆中的水分损失，每日通过浇灌所有的盆补偿它们的水含量与最重的盆一致。结果是，土壤水分含量下降，达到胁迫水平，植物在第4天萎蔫。在胁迫水平下再维持植物2天，在第6天重新浇灌所有的植物，并在最适条件下维持其生命周期的其余部分。成熟后，收获最适条件和干旱处理的植物，用于种子和芽苗生物量分析。通过比较最适条件和干旱处理的植株，确定干旱胁迫对种子产量和芽苗生物量的影响。结果如表18所示。在最适条件下，转基因植株的种子产量和最终的芽苗生物量比野生型高7至10％。在开花期伴随干旱胁迫，转基因植物种子产量和芽苗生物量的降低没有像野生型那么厉害，造成5-7％的种子产量保护和4％的芽苗生物量保护。通过转基因和野生型的种子产量或芽苗生物量与最适条件的百分比的区别来计算保护效果。
表18.最适及干旱胁迫植物的种子产量和最终芽苗生物量，n＝10
Figure BPA00001310246000611
在hwe116.2中过表达野生型AtPK220其背景可以恢复至野生型
35S-AtPK220转基因植物(在hwe116.2中)生长(每3英寸盆5株)在最适条件下的生长箱中，如之前所描述，直至第一朵花开。通过浇灌所有的植物至相同的饱和水平来进行干旱处理。停止进一步浇水。每天称重植物，以确定每日的水分损失，在处理的第4天收获所有植物，届时所有植物萎蔫。使用相对于最终芽苗生物量的水分损失来计算耐旱性，其中野生型假定为100％。数据如表19所示。三个转基因株系变现出的耐旱性比突变株水平有所降低，以相对于芽苗生物量，水分损失增加来表示。三个转基因株系开花也早于突变系，而类似与野生型的开花时间。这些结果支持这样的结论：在hwe116.2中的AtPK220基因突变造成了表型的改变，野生型基因的表达恢复了突变植物的野生型特征。
表19.相对于芽苗生物量的水分损失以及耐旱性，n＝8
Figure BPA00001310246000621
利用AtPK220-启动子(PPK)在拟南芥中下调AtPK220导致植物的耐旱性增强
PPK-HP-At(270)PK220拟南芥植株生长(每3英寸盆5株)在最适条件下的生长箱中，如前所述，直到第一个朵花开。通过浇灌所有的植物至相同的饱和水平来进行干旱处理。停止进一步浇水。每天称重植物，以确定每日的水分损失，在处理的第4天收获所有植物(所有植物萎蔫)。使用相对于最终芽苗生物量的水分损失来计算耐旱性，其中野生型假定为100％。研究的结果如表20所示。
表20.相对于芽苗生物量的水分损失以及耐旱性，n＝8
其中一个转基因株系，14-04，表现出比野生型对照更强的耐旱性，以相对于芽苗生物量，水分损失减少来表示。这一结果被14-04品系的数据支持，14-04品系的PK220基因表达几乎完全被抑制。相对于野生型，根部的AtPK220表达量下降了近96％。这些结果表明，在根部下调PK220足以得到显着的耐旱性表型以及大概提高的水分利用效率。
在拟南芥hwe116突变株中过表达油菜PK220可以恢复其野生型
35S-BnPK220转基因植物(在hwe116中)加上两个空对照(转基因品系中分离的同胞，不含转基因，因此为hwe116突变株)生长(每3英寸盆5株)在最适条件下的生长箱中，如前所述，直到第一个朵花开。通过浇灌所有的植物至相同的饱和水平来进行干旱处理。停止进一步浇水。每天称重植物，以确定每日的水分损失，在处理的第4天收获所有植物(所有植物萎蔫)。使用相对于最终芽苗生物量的水分损失来计算耐旱性，其中野生型假定为100％。研究的结果如表20所示。结果表明，与空对照(hwe116突变株背景)相比，6种品系的植株耐旱性降低8％或更多，因此恢复至野生型。这表明BnPK220是具有功能的，可以在拟南芥中发挥作用。
表21.相对于芽苗干重的水分损失以及耐旱性，n＝8
Figure BPA00001310246000631
  74-12   157±5   92％
  38-7   160±5   90％
  70-2   161±2   89％
  97-3   164±5   87％
  31-6   165±4   87％
  93-8   172±4   82％
  空对照38-10   146±3   100％
  空对照90-7   135±5   107％
含有35S-AtPK220L292F构建体的转基因油菜品系显示出耐旱性和较高的水分利用效率
使用显性-阴性策略在甘蓝型油菜中表达突变的AtPK220等位基因，证实了内源性PK220活性的下调。三种含有拟南芥突变AtPK220L292F基因的转基因油菜品系，以及相对应的每个空对照品系(转基因品系中分离的同胞，不含转基因)生长在4.5英寸直径的盆中，含有等量的无土栽培混合物(Sunshine Professional Organic Mix#7)，最适条件为16hr光照(400uE)，日温22℃夜温18℃。在四叶期，分别采用两种处理。在最适处理中，植物被浇灌至饱和，用塑料袋覆盖盆，以防止水从盆中蒸发损失。这些植物每天称重连续7天，确定盆中因蒸腾作用导致的水分损失量，然后每天往每个盆中加入相同量的水保持植物处于最适水分条件下。在干旱处理中，所有植物浇灌至饱和水平。用塑料袋覆盖盆，每天称重。但是，这些盆每天只浇灌到最重的花盆水平。这种处理进行7天，土壤含水量逐步达到胁迫水平。第5天植物开始枯萎。在结束的第7天，收获两组植物用于测定芽苗生物量。
在干旱处理的第3天和第4天，进行了两种转基因品系植物以及它们的空对照的气体交换测量。采用Li-6400测量了处于400uE光照，400ppm二氧化碳及22℃稳定状态生长条件下，叶片3的光合作用和蒸腾作用。从光合作用于蒸腾作用的比率来计算水分利用效率(WUE。干旱处理的植物用来计算耐旱性(与空对照的百分比)。使用第3天到第7天之间累积的每日蒸腾水分损失，相对于最终芽苗干重，进行计算，并将其校准到空对照(设置为100％)。
表22的结果表明，转基因品系具有更强的耐旱性趋势。这是相对于芽苗干重水分损失较少的结果，这也是最适条件下显示出的一个表型。
气体交换数据(表23)显示，干旱处理的第3和第4天，转基因植株的水分利用效率比对照组稍高(4至16％)。
从光合作用与蒸腾作用的比率计算出的水分利用效率，只提供了一个单点瞬时测量而不是处理期间的累计测量，其结果可能不是很重要。
总之，35S-AtPK220L292F转基因甘蓝型植物的数据表明，当使用来自外源物种的AtPK220L292F基因时，水分利用效率技术可转移到甘蓝型油菜。
表22.在最适和干旱处理中，相对于最终的芽苗干重，第3天到第7天之间的水分损失。耐旱性(适当的空对照的百分比)。n＝8
Figure BPA00001310246000661
表23.干旱处理中第3天和第4天的光合作用(umol二氧化碳/m2/s)，蒸腾作用(mmol H2O/m2/s)和水分利用效率(光合作用/蒸腾作用)。n＝8
Figure BPA00001310246000662
序列ID参考表
  种类   序列号   参考
  拟南芥   SEQIDNO：1   AtPK220   NT   1299
  拟南芥   SEQIDNO：2   AtPK220   AA   432
  拟南芥   SEQIDNO：3   AtPK220L292F   NT   1299
  拟南芥   SEQIDNO：4   AtPK220L292F   AA   432
  拟南芥   SEQIDNO：5   AtPK220L292F_partial   NT   1160
  拟南芥   SEQIDNO：6   AtPK220L292F_partial_orf   AA   383
  拟南芥   SEQIDNO：7   AtPK220_partial   NT   1160
  拟南芥   SEQIDNO：8   AtPK220_partial_orf   AA   383
  拟南芥   SEQIDNO：9   AtPK220_with_UTR   NT   1542
  拟南芥   SEQIDNO：10   AtPK220_for_35s-AtPK220   NT   1309
  拟南芥   SEQIDNO：11   AtPK220_partial   NT   1177
  拟南芥   SEQIDNO：12   At(150)PK   NT   154
  拟南芥   SEQIDNO：13   At(270)PK   NT   288
  拟南芥   SEQIDNO：14   AtPK220_promoter   NT   1510
  拟南芥   SEQIDNO：15   At4g32000_UTR   NT   157
  拟南芥   SEQIDNO：16   At4g32000   NT   1257
  拟南芥   SEQIDNO：17   At4g32000   AA   418
  拟南芥   SEQIDNO：18   At5g11020   NT   1302
  拟南芥   SEQIDNO：19   At5g11020   AA   433
  拟南芥   SEQIDNO：20   At2g25440   NT   2016
  拟南芥   SEQIDNO：21   At2g25440   AA   671
  拟南芥   SEQIDNO：22   At2g23890   NT   1662
  拟南芥   SEQIDNO：23   At2g23890   AA   553
  二穗短柄草   SEQIDNO：24   BdPK220   NT   1386
  油菜   SEQIDNO：25   BnPK220   NT   1302
  油菜   SEQIDNO：26   BnPK220   AA   433
  苦苣   SEQIDNO：27   EL362007.1   NT   657
  苦苣   SEQIDNO：28   EL362007.1_ORF   AA   218
  克莱门柚   SEQIDNO：29   CX290402.1   NT   474
  克莱门柚   SEQIDNO：30   CX290402.1_ORF   AA   157
  橙   SEQIDNO：31   CK934154.1   NT   770
  橙   SEQIDNO：32   CK934154.1_ORF   AA   257
  中粒咖啡   SEQIDNO：33   DV708241.1   NT   621
  中粒咖啡   SEQIDNO：34   DV708241.1_ORF   AA   206
  加利桉   SEQIDNO：35   CT986101.1   NT   411
  加利桉   SEQIDNO：36   CT986101.1_ORF   AA   136
  高羊茅   SEQIDNO：37   DT714073   NT   522
  高羊茅   SEQIDNO：38   DT714073_ORF   AA   173
  银杏   SEQIDNO：39   EX942240.1   NT   740
  银杏   SEQIDNO：40   EX942240.1_ORF   AA   247
  橹豆   SEQIDNO：41   GmPK220   NT   1254
  橹豆   SEQIDNO：42   GmPK220   AA   418
  绢毛葵   SEQIDNO：43   EE622910.1   NT   702
  绢毛葵   SEQIDNO：44   EE622910.1_ORF   AA   233
  种类   序列号   参考
  蓝茎向日葵   SEQIDNO：45   EL429543.1   NT   752
  蓝茎向日葵   SEQIDNO：46   EL429543.1_ORF   AA   251
  HELIANTHUS EXILIS   SEQIDNO：47   EE654885.1   NT   630
  HELIANTHUS EXILIS   SEQIDNO：48   EE654885.1_ORF   AA   209
  大麦芽   SEQIDNO：49   TC151622   NT   780
  大麦芽   SEQIDNO：50   TC151622_ORF   AA   259
  甘薯   SEQIDNO：51   EE883089.1   NT   816
  甘薯   SEQIDNO：52   EE883089.1_ORF   AA   272
  莴苣   SEQIDNO：53   DW125133.1   NT   867
  莴苣   SEQIDNO：54   DW125133.1_ORF   AA   288
  蒺藜苜蓿   SEQIDNO：55   Contig   NT   804
  蒺藜苜蓿   SEQIDNO：56   Contig   AA   267
  烟草   SEQIDNO：57   BP131484.1   NT   636
  烟草   SEQIDNO：58   BP131484.1   AA   211
  水稻   SEQIDNO：59   NM_001061720.1   NT   1437
  水稻   SEQIDNO：60   NP_001055185.1   AA   478
  小立碗藓   SEQIDNO：61   EDQ75046.1_cds   NT   891
  小立碗藓   SEQIDNO：62   EDQ75046.1   AA   297
  云杉   SEQIDNO：63   TC12392   NT   1065
  云杉   SEQIDNO：64   TC12392_orf   AA   354
  松属   SEQIDNO：65   CT578985.1   NT   596
  松属   SEQIDNO：66   CT578985.1_ORF   AA   199
  杨属   SEQIDNO：67   TC76879   NT   1377
  杨属   SEQIDNO：68   TC76879_ORF   AA   459
  甘蔗   SEQIDNO：69   TC46535   NT   693
  甘蔗   SEQIDNO：70   TC46535_ORF   AA   230
  黄鹰苜蓿   SEQIDNO：71   DR169688.1   NT   414
  黄鹰苜蓿   SEQIDNO：72   DR169688.1_ORF   AA   137
  普通小麦   SEQIDNO：73   TC254793   NT   1140
  普通小麦   SEQIDNO：74   TC254793_ORF   AA   380
  葡萄   SEQIDNO：75   CAO44295.1_cds   NT   978
  葡萄   SEQIDNO：76   CAO44295.1   AA   325
  玉米   SEQIDNO：77   TC333547   NT   1377
  玉米   SEQIDNO：78   TC333547_ORF   AA   458
  玉米   SEQIDNO：79   ZmPK220   NT   1188
  玉米   SEQIDNO：80   ZmPK220   AA   396
  棉   SEQIDNO：81   TC79117   NT   1086
  棉   SEQIDNO：82   TC79117_ORF   AA   361
  番茄   SEQIDNO：83   Contig3   NT   1089
  耧斗菜   SEQIDNO：84   DR918821   NT   875
  耧斗菜   SEQIDNO：85   DR918821_ORF   AA   292
  斑点矢车菊   SEQIDNO：86   EL933228.1   NT   696
  斑点矢车菊   SEQIDNO：87   EL933228.1_ORF   AA   231
  菊苣   SEQIDNO：88   EH693146.1   NT   842
  种类   序列号   参考
  菊苣   SEQIDNO：89   EH693146.1_ORF   AA   281
  甜瓜   SEQIDNO：90   AM742189.1   NT   495
  甜瓜   SEQIDNO：91   AM742189.1_ORF   AA   164
  曲画眉草   SEQIDNO：92   EH186232.1   NT   375
  曲画眉草   SEQIDNO：93   EH186232.1_ORF   AA   124
  非洲菊   SEQIDNO：94   AJ753651.1   NT   414
  非洲菊   SEQIDNO：95   AJ753651.1_ORF   AA   137
  向日葵   SEQIDNO：96   EL488199.1   NT   498
  向日葵   SEQIDNO：97   EL488199.1_ORF   AA   165
  大花牵牛   SEQIDNO：98   BJ566706.1   NT   612
  大花牵牛   SEQIDNO：99   BJ566706.1_ORF   AA   203
  NUPHAR ADVENA   SEQIDNO：100   DT603238.1   NT   708
  NUPHAR ADVENA   SEQIDNO：101   DT603238.1_ORF   AA   235
  合成引物   SEQIDNO：102   747F   NT   30
  合成引物   SEQIDNO：103   747R   NT   34
  合成引物   SEQIDNO：104   C747F2   NT   32
  合成引物   SEQIDNO：105   C747R2   NT   31
  合成引物   SEQIDNO：106   A220BamF1   NT   42
  合成引物   SEQIDNO：107   A220PstR   NT   40
  合成引物   SEQIDNO：108   K188R   NT   30
  合成引物   SEQIDNO：109   A220A1SmaF2   NT   53
  合成引物   SEQIDNO：110   A220BamR   NT   38
  合成引物   SEQIDNO：111   A220SmaF   NT   41
  合成引物   SEQIDNO：112   A220BamF2   NT   41
  合成引物   SEQIDNO：113   A220XbaR   NT   39
  合成引物   SEQIDNO：114   K116SacF   NT   35
  合成引物   SEQIDNO：115   K270SacR   NT   37
  合成引物   SEQIDNO：116   K116BamF   NT   37
  合成引物   SEQIDNO：117   K270XbaR   NT   40
  合成引物   SEQIDNO：118   PK81A1XbaF   NT   52
  合成引物   SEQIDNO：119   K81PmBamF   NT   47
  合成引物   SEQIDNO：120   Pm81SmaR2   NT   41
  拟南芥   SEQIDNO：121   AtPK220L292F_with_UTR   NT   1309
  合成引物   SEQIDNO：122   Bn81F   NT   25
  合成引物   SEQIDNO：123   Bn81R   NT   32
  合成引物   SEQIDNO：124   Bn81RAF1   NT   32
  合成引物   SEQIDNO：125   Bn81RAF2   NT   32
  合成引物   SEQIDNO：126   Bn81RAR1   NT   31
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  种类   序列号   参考
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  拟南芥   SEQIDNO：148   At4g23713_w_genomic   NT   399
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  拟南芥   SEQIDNO：150   Promoter At2g44790   NT   1475
  合成引物   SEQIDNO：151   P790-H3-F   NT   31
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  油菜   SEQIDNO：153   BnPK220   NT   338
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  甜高粱   SEQIDNO：174   Sb(261)PK220   NT   261
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  甜高粱   SEQIDNO：178   SbWx intron 1   NT   273
  合成引物   SEQIDNO：179   SbWx BamHI   NT   30
  合成引物   SEQIDNO：180   SbWx ClaI R   NT   34
  种类   序列号   参考
  合成引物   SEQIDNO：181   SbWET BamHI end1   NT   24
  合成引物   SEQIDNO：182   SbWET BamHI end2   NT   21
  甜高粱   SEQIDNO：183   SbGOS2 promoter   NT   1000
  合成引物   SEQIDNO：184   SbGOS2 HindIII F   NT   28
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  甜高粱   SEQIDNO：186   SbUBQ promoter   NT   1000
  合成引物   SEQIDNO：187   SbUBQ PstI F   NT   26
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  甜高粱   SEQIDNO：189   SbUBQ terminator   NT   239
  合成引物   SEQIDNO：190   SbUBQT KpnI F   NT   27
  合成引物   SEQIDNO：191   SbUBQT KpnI R   NT   27
  合成引物   SEQIDNO：192   SbUBQ PvuI F   NT   34
  油菜   SEQIDNO：193   BnPK220   NT   1302
  油菜   SEQIDNO：194   BnPK220   AA   433
  合成引物   SEQIDNO：195   Bd81RAR1   NT   31
  合成引物   SEQIDNO：196   Bd81RAR2   NT   32
  二穗短柄草   SEQIDNO：197   BdPK220   AA   461
  合成引物   SEQIDNO：198   A200A1AgeF   NT   53
  合成引物   SEQIDNO：199   A220AgeR   NT   39
  合成引物   SEQIDNO：200   bWET BamHI end1   NT   18
序列表
>SEQIDNO：4
MRELLLLLLLHFQSLILLMIFITVSASSASNPSLAPVYSSMATFSPRIQMGSGEEDRFDAHKKLLIGLIISFSSL
GLIILFCFGFWVYRKNQSPKSINNSDSESGNSFSLLMRRLGSIKTQRRTSIQKGYVQFFDIKTLEKATGGFKES
SVIGQGGFGCVYKGCLDNNVKAAVKKIENVSQEAKREFQNEVDLLSKIHHSNVISLLGSASEINSSFIVYEL
MEKGSLDEQLHGPSRGSALTWHMRMKIALDTARGLEYLHEHCRPPVIHRDLKSSNILLDSSFNAKISDFGF
AVSLDEHGKNNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLGRRPVEKLTPAQCQSLVTWAM
PQLTDRSKLPNIVDAVIKDTMDLKHLYQVAAMAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSLVPLVPVELGGTLRLTR
>SEQIDNO：5
ATGGGAAGTGGTGAAGAAGATAGATTTGATGCTCATAAGAAACTTCTGATTGGTCTCATAATCAGTTT
CTCTTCTCTTGGCCTTATAATCTTGTTCTGTTTTGGCTTTTGGGTTTATCGCAAGAACCAATCTCCAAAA
TCCATCAACAACTCAGATTCTGAGAGTGGGAATTCATTTTCCTTGTTAATGAGACGACTTGGCTCGATT
AAAACTCAGAGAAGAACTTCTATCCAAAAGGGTTACGTGCAATTTTTCGATATCAAGACCCTCGAGAA
AGCGACAGGCGGTTTTAAAGAAAGTAGTGTAATCGGACAAGGCGGTTTCGGATGCGTTTACAAGGGTT
GTTTGGACAATAACGTTAAAGCAGCGGTCAAGAAGATCGAGAACGTTAGCCAAGAAGCAAAACGAGA
ATTTCAGAATGAAGTTGACTTGTTGAGCAAGATCCATCACTCGAACGTTATATCATTGTTGGGCTCTGC
AAGCGAAATCAACTCGAGTTTCATCGTTTATGAGCTTATGGAGAAAGGATCATTAGATGAACAGTTAC
ATGGGCCTTCTCGTGGATCAGCTCTAACATGGCACATGCGTATGAAGATTGCTCTTGATACAGCTAGA
GGACTAGAGTATCTCCATGAGCATTGTCGTCCACCAGTTATCCACAGAGATTTGAAATCTTCGAATATT
CTTCTTGATTCTTCCTTCAACGCCAAGATTTCAGATTTCGGTTTTGCTGTATCGCTGGATGAACATGGCA
AGAACAACATTAAACTCTCTGGGACACTTGGTTATGTTGCCCCGGAATACCTCCTTGACGGAAAACTG
ACGGATAAGAGTGATGTTTATGCATTTGGGGTAGTTCTGCTTGAACTCTTGTTGGGTAGACGACCAGTT
GAAAAATTAACTCCAGCTCAATGCCAATCTCTTGTAACTTGGGCAATGCCACAACTTACCGATAGATC
CAAGCTTCCAAACATTGTGGATGCCGTTATAAAAGATACAATGGATCTCAAACACTTATACCAGGTAG
CAGCCATGGCTGTGTTGTGCGTGCAGCCAGAACCAAGTTACCGGCCGTTGATAACCGATGTTCTTCACT
CACTTGTTCCACTGGTTCCGGTAGAGCTAGGAGGGACTCTCCGGTTAACAAGATGATTCACAGA
>SEQIDNO：6
MGSGEEDRFDAHKKLLIGLIISFSSLGLIILFCFGFWVYRKNQSPKSINNSDSESGNSFSLLMRRLGSIKTQRR
TSIQKGYVQFFDIKTLEKATGGFKESSVIGQGGFGCVYKGCLDNNVKAAVKKIENVSQEAKREFQNEVDLL
SKIHHSNVISLLGSASEINSSFIVYELMEKGSLDEQLHGPSRGSALTWHMRMKIALDTARGLEYLHEHCRPP
VIHRDLKSSNILLDSSFNAKISDFGFAVSLDEHGKNNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLE
LLLGRRPVEKLTPAQCQSLVTWAMPQLTDRSKLPNIVDAVIKDTMDLKHLYQVAAMAVLCVQPEPSYRPL
ITDVLHSLVPLVPVELGGTLRLTR
>SEQIDNO：7
ATGGGAAGTGGTGAAGAAGATAGATTTGATGCTCATAAGAAACTTCTGATTGGTCTCATAATCAGTTT
CTCTTCTCTTGGCCTTATAATCTTGTTCTGTTTTGGCTTTTGGGTTTATCGCAAGAACCAATCTCCAAAA
TCCATCAACAACTCAGATTCTGAGAGTGGGAATTCATTTTCCTTGTTAATGAGACGACTTGGCTCGATT
AAAACTCAGAGAAGAACTTCTATCCAAAAGGGTTACGTGCAATTTTTCGATATCAAGACCCTCGAGAA
AGCGACAGGCGGTTTTAAAGAAAGTAGTGTAATCGGACAAGGCGGTTTCGGATGCGTTTACAAGGGTT
GTTTGGACAATAACGTTAAAGCAGCGGTCAAGAAGATCGAGAACGTTAGCCAAGAAGCAAAACGAGA
ATTTCAGAATGAAGTTGACTTGTTGAGCAAGATCCATCACTCGAACGTTATATCATTGTTGGGCTCTGC
AAGCGAAATCAACTCGAGTTTCATCGTTTATGAGCTTATGGAGAAAGGATCATTAGATGAACAGTTAC
ATGGGCCTTCTCGTGGATCAGCTCTAACATGGCACATGCGTATGAAGATTGCTCTTGATACAGCTAGA
GGACTAGAGTATCTCCATGAGCATTGTCGTCCACCAGTTATCCACAGAGATTTGAAATCTTCGAATATT
CTTCTTGATTCTTCCTTCAACGCCAAGATTTCAGATTTCGGTCTTGCTGTATCGCTGGATGAACATGGC
AAGAACAACATTAAACTCTCTGGGACACTTGGTTATGTTGCCCCGGAATACCTCCTTGACGGAAAACT
GACGGATAAGAGTGATGTTTATGCATTTGGGGTAGTTCTGCTTGAACTCTTGTTGGGTAGACGACCAGT
TGAAAAATTAACTCCAGCTCAATGCCAATCTCTTGTAACTTGGGCAATGCCACAACTTACCGATAGAT
CCAAGCTTCCAAACATTGTGGATGCCGTTATAAAAGATACAATGGATCTCAAACACTTATACCAGGTA
GCAGCCATGGCTGTGTTGTGCGTGCAGCCAGAACCAAGTTACCGGCCGTTGATAACCGATGTTCTTCA
CTCACTTGTTCCACTGGTTCCGGTAGAGCTAGGAGGGACTCTCCGGTTAACAAGATGATTCACAGA
>SEQIDNO：8
MGSGEEDRFDAHKKLLIGLIISFSSLGLIILFCFGFWVYRKNQSPKSINNSDSESGNSFSLLMRRLGSIKTQRR
TSIQKGYVQFFDIKTLEKATGGFKESSVIGQGGFGCVYKGCLDNVKAAVKKIENVSQEAKREFQNEVDLL
SKIHHSNVISLLGSASEINSSFIVYELMEKGSLDEQLHGPSRGSALTWHMRMKIALDTARGLEYLHEHCRPP
VIHRDLKSSNILLDSSFNAKISDFGLAVSLDEHGKNNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLE
LLLGRRPVEKLTPAQCQSLVTWAMPQLTDRSKLPNIVDAVIKDTMDLKHLYQVAAMAVLCVQPEPSYRPL
ITDVLHSLVPLVPVELGGTLRLTR
>SEQIDNO：9
ATCAAAAACTTTTCTTTTCTTAGCAAAAAAAACAAAAAAATGAGAGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT
CATTTTCAGTCTCTAATTCTTTTGATGATCTTCATCACTGTCTCTGCTTCTTCTGCTTCAAATCCTTCTTT
AGCTCCTGTTTACTCTTCCATGGCTACATTCTCTCCTCGAATCCAAATGGGAAGTGGTGAAGAAGATAG
ATTTGATGCTCATAAGAAACTTCTGATTGGTCTCATAATCAGTTTCTCTTCTCTTGGCCTTATAATCTTG
TTCTGTTTTGGCTTTTGGGTTTATCGCAAGAACCAATCTCCAAAATCCATCAACAACTCAGATTCTGAG
AGTGGGAATTCATTTTCCTTGTTAATGAGACGACTTGGCTCGATTAAAACTCAGAGAAGAACTTCTATC
CAAAAGGGTTACGTGCAATTTTTCGATATCAAGACCCTCGAGAAAGCGACAGGCGGTTTTAAAGAAAG
TAGTGTAATCGGACAAGGCGGTTTCGGATGCGTTTACAAGGGTTGTTTGGACAATAACGTTAAAGCAG
CGGTCAAGAAGATCGAGAACGTTAGCCAAGAAGCAAAACGAGAATTTCAGAATGAAGTTGACTTGTT
GAGCAAGATCCATCACTCGAACGTTATATCATTGTTGGGCTCTGCAAGCGAAATCAACTCGAGTTTCA
TCGTTTATGAGCTTATGGAGAAAGGATCATTAGATGAACAGTTACATGGGCCTTCTCGTGGATCAGCT
CTAACATGGCACATGCGTATGAAGATTGCTCTTGATACAGCTAGAGGACTAGAGTATCTCCATGAGCA
TTGTCGTCCACCAGTTATCCACAGAGATTTGAAATCTTCGAATATTCTTCTTGATTCTTCCTTCAACGCC
AAGATTTCAGATTTCGGTCTTGCTGTATCGCTGGATGAACATGGCAAGAACAACATTAAACTCTCTGG
GACACTTGGTTATGTTGCCCCGGAATACCTCCTTGACGGAAAACTGACGGATAAGAGTGATGTTTATG
CATTTGGGGTAGTTCTGCTTGAACTCTTGTTGGGTAGACGACCAGTTGAAAAATTAACTCCAGCTCAAT
GCCAATCTCTTGTAACTTGGGCAATGCCACAACTTACCGATAGATCCAAGCTTCCAAACATTGTGGAT
GCCGTTATAAAAGATACAATGGATCTCAAACACTTATACCAGGTAGCAGCCATGGCTGTGTTGTGCGT
GCAGCCAGAACCAAGTTACCGGCCGTTGATAACCGATGTTCTTCACTCACTTGTTCCACTGGTTCCGGT
AGAGCTAGGAGGGACTCTCCGGTTAACAAGATGATTCACAGAAACACGCCAAAAGAAATCCAAAGCC
ATTTAGATGATTTTCTTTTATCCTTTGCCTTTATATTTTTTTGTATAGGGTTATGATCCACTCATCTGAAA
GTTTGGGGGTAAGAATGTGAGAATATAAGTTTTCAGGGTTGTTGAGTTCTATATAATTATATTTGTTTC
TTTTTATTGTCAAATATAATTATATTTTTGT
>SEQIDNO：10
AAAATGAGAGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCATTTTCAGTCTCTAATTCTTTTGATGATCTTCATCAC
TGTCTCTGCTTCTTCTGCTTCAAATCCTTCTTTAGCTCCTGTTTACTCTTCCATGGCTACATTCTCTCCTC
GAATCCAAATGGGAAGTGGTGAAGAAGATAGATTTGATGCTCATAAGAAACTTCTGATTGGTCTCATA
ATCAGTTTCTCTTCTCTTGGCCTTATAATCTTGTTCTGTTTTGGCTTTTGGGTTTATCGCAAGAACCAAT
CTCCAAAATCCATCAACAACTCAGATTCTGAGAGTGGGAATTCATTTTCCTTGTTAATGAGACGACTTG
GCTCGATTAAAACTCAGAGAAGAACTTCTATCCAAAAGGGTTACGTGCAATTTTTCGATATCAAGACC
CTCGAGAAAGCGACAGGCGGTTTTAAAGAAAGTAGTGTAATCGGACAAGGCGGTTTCGGATGCGTTTA
CAAGGGTTGTTTGGACAATAACGTTAAAGCAGCGGTCAAGAAGATCGAGAACGTTAGCCAAGAAGCA
AAACGAGAATTTCAGAATGAAGTTGACTTGTTGAGCAAGATCCATCACTCGAACGTTATATCATTGTT
GGGCTCTGCAAGCGAAATCAACTCGAGTTTCATCGTTTATGAGCTTATGGAGAAAGGATCATTAGATG
AACAGTTACATGGGCCTTCTCGTGGATCAGCTCTAACATGGCACATGCGTATGAAGATTGCTCTTGATA
CAGCTAGAGGACTAGAGTATCTCCATGAGCATTGTCGTCCACCAGTTATCCACAGAGATTTGAAATCT
TCGAATATTCTTCTTGATTCTTCCTTCAACGCCAAGATTTCAGATTTCGGTCTTGCTGTATCGCTGGATG
AACATGGCAAGAACAACATTAAACTCTCTGGGACACTTGGTTATGTTGCCCCGGAATACCTCCTTGAC
GGAAAACTGACGGATAAGAGTGATGTTTATGCATTTGGGGTAGTTCTGCTTGAACTCTTGTTGGGTAG
ACGACCAGTTGAAAAATTAACTCCAGCTCAATGCCAATCTCTTGTAACTTGGGCAATGCCACAACTTA
CCGATAGATCCAAGCTTCCAAACATTGTGGATGCCGTTATAAAAGATACAATGGATCTCAAACACTTA
TACCAGGTAGCAGCCATGGCTGTGTTGTGCGTGCAGCCAGAACCAAGTTACCGGCCGTTGATAACCGA
TGTTCTTCACTCACTTGTTCCACTGGTTCCGGTAGAGCTAGGAGGGACTCTCCGGTTAACAAGATGATT
CACAG
>SEQIDNO：11
TCTGTGTCAGGAATCCAAATGGGAAGTGGTGAAGAAGATAGATTTGATGCTCATAAGAAACTTCTGAT
TGGTCTCATAATCAGTTTCTCTTCTCTTGGCCTTATAATCTTGTTCTGTTTTGGCTTTTGGGTTTATCGCA
AGAACCAATCTCCAAAATCCATCAACAACTCAGATTCTGAGAGTGGGAATTCATTTTCCTTGTTAATGA
GACGACTTGGCTCGATTAAAACTCAGAGAAGAACTTCTATCCAAAAGGGTTACGTGCAATTTTTCGAT
ATCAAGACCCTCGAGAAAGCGACAGGCGGTTTTAAAGAAAGTAGTGTAATCGGACAAGGCGGTTTCG
GATGCGTTTACAAGGGTTGTTTGGACAATAACGTTAAAGCAGCGGTCAAGAAGATCGAGAACGTTAGC
CAAGAAGCAAAACGAGAATTTCAGAATGAAGTTGACTTGTTGAGCAAGATCCATCACTCGAACGTTAT
ATCATTGTTGGGCTCTGCAAGCGAAATCAACTCGAGTTTCATCGTTTATGAGCTTATGGAGAAAGGAT
CATTAGATGAACAGTTACATGGGCCTTCTCGTGGATCAGCTCTAACATGGCACATGCGTATGAAGATT
GCTCTTGATACAGCTAGAGGACTAGAGTATCTCCATGAGCATTGTCGTCCACCAGTTATCCACAGAGA
TTTGAAATCTTCGAATATTCTTCTTGATTCTTCCTTCAACGCCAAGATTTCAGATTTCGGTCTTGCTGTA
TCGCTGGATGAACATGGCAAGAACAACATTAAACTCTCTGGGACACTTGGTTATGTTGCCCCGGAATA
CCTCCTTGACGGAAAACTGACGGATAAGAGTGATGTTTATGCATTTGGGGTAGTTCTGCTTGAACTCTT
GTTGGGTAGACGACCAGTTGAAAAATTAACTCCAGCTCAATGCCAATCTCTTGTAACTTGGGCAATGC
CACAACTTACCGATAGATCCAAGCTTCCAAACATTGTGGATGCCGTTATAAAAGATACAATGGATCTC
AAACACTTATACCAGGTAGCAGCCATGGCTGTGTTGTGCGTGCAGCCAGAACCAAGTTACCGGCCGTT
GATAACCGATGTTCTTCACTCACTTGTTCCACTGGTTCCGGTAGAGCTAGGAGGGACTCTCCGGTTAAC
AAGATGATTCACAG
>SEQIDNO：12
TCGCAAGAACCAATCTCCAAAATCCATCAACAACTCAGATTCTGAGAGTGGGAATTCATTTTCCTTGTT
AATGAGACGACTTGGCTCGATTAAAACTCAGAGAAGAACTTCTATCCAAAAGGGTTACGTGCAATTTT
TCGATATCAAGACCCTC
>SEQIDNO：13
TCTGTGTCAGGAATCCAAATGGGAAGTGGTGAAGAAGATAGATTTGATGCTCATAAGAAACTTCTGAT
TGGTCTCATAATCAGTTTCTCTTCTCTTGGCCTTATAATCTTGTTCTGTTTTGGCTTTTGGGTTTATCGCA
AGAACCAATCTCCAAAATCCATCAACAACTCAGATTCTGAGAGTGGGAATTCATTTTCCTTGTTAATGA
GACGACTTGGCTCGATTAAAACTCAGAGAAGAACTTCTATCCAAAAGGGTTACGTGCAATTTTTCGAT
ATCAAGACCCTC
>SEQIDNO：14
TGTTAAAAGCGATTTATAATTTACACCGTTTTGGTGTATATTTCTATCTATCCTTTTACAAGACCTATAT
ATGTTATGTTATGGTGGTGTACTATTTTAAGTGAGCGACATAGTATTTTCTTCATATAGCTAATTAATC
AACAACAATTTCCCAACTTACAACTATTTGCGTACTTTAAACTTATATTGAAAGAGAACTACAAAATTA
TTTTTTTGTACAAGAGAATTATGGTCTTCGGATCAATAATTTCTCTAGATATAATATGTAAAGCCAACC
CTATAATTTGTAAAATCCATGATTTGATATAATTTTCTTTTAAAATTGTGAATTGGCAGACAAAAACAA
CATTACATTTTGATTTAAATTCATAACTTTGACTTGCTAAGGAAACACCATGATTCATTTTTTGTCATTT
GTTACATCATCACTAGAAATATTTGATCTAACTTTATTATGATAATAGACTACATACTACATATGCAGT
TACGATTTTAAATACTACATATTTAAGCGTGTTTAAACTGTAACCATATCATATAAAATGACATATCTA
AAAGTGATTTTCAATATTTTGATATGATATGTGTTGTAGCACGGATAATGATCTAATTTTTAAGTAATA
AGCTTGTTCATTACAAAAGAGAAGAAAGTAGTATTGGGCCATGATTATGTAAGGACAAAATAGGAAG
ATGTGGAAGAAGCCATTCGAGGGTTTTATTACAAAAACAGAGTATATAATTGGTCATAATGTTTTATTC
ACTTAATTTAACATTATTGCATTATATTTTCATGAACACATATTTCTTTAACTAAAAATATACACATATT
TCTTATTGTAGATGAAGTGAAAAGAACAATATTTGGGTTCACATCTATGGGTGAATCCTTTTAATCACC
CCCTAAAATAAAAAAGGTGCCATATTTCTATTTTTAGAGAAAGATATAGAGCACCATTGGAGTGGTTT
TGCTCCAAATATAGAGTTTAGAGAAATATATAATACACCATTGGAGATGCTCTAAAATGAATTTATTT
ATTTATTTAGATGGAAGATTCTAATTGGTTAGAAAAAGAGGAAGTGAATAATAGGATTCACCTATAAG
AGTGAACCCAAGTATTTTTAAGAGATAATGTGTAAAGTAAATAGATGGTCATTGTGTGAATTATGAAT
AGAACCATGGTTTTCCATTTTTAATTGCTTAACATAGGGTAATCAACAATGGGGTTTAATATGTCAATA
GACAATAGTAAAGAAAGTATTTGATCTATCCCAAATCTTTCTTCGTTCGTTAGTTCATCACTTTCTTTCT
TTTTGGTTATATTAATGGTAGAGAACTAAAAATTCAACTTTTTATTCAAAAGCTCCCTTTCTCTTTCCCT
CCTTTATTTGCCATAAAAGTGATTTCAAGAAGACAGCGAGAGAGAAAGTGATAGTTCGTTCACTCTTC
GCTTTCTCAAGAATTTCAAAACACCAAAAAAGTCTTTAGATTGAATTTCATCAAAAACTTTTC
>SEQIDNO：15
AGACAAGAAAAAAGGAAACAAAATTTTATGAAAGAGATCTCCATTAGAGAAAGAGAGAGCGAGAGA
GAGATTAATCTTGGAAGAGCAATCTCACATTCTCACACTGCTCTTAGAAAATCTCTCTTTCACCATTAA
AAATCCCAAAGAGTCTGGAGAA
>SEQIDNO：16
ATGGGAAAGATTCTTCATCTTCTTCTTCTTCTTCTTAAGGTCTCTGTTCTTGAATTCATCATTAGTGTTTC
TGCTTTTACTTCACCTGCTTCACAGCCTTCTCTTTCTCCTGTTTACACTTCCATGGCTTCCTTTTCTCCAG
GGATCCACATGGGCAAAGGCCAAGAACACAAGTTAGATGCACACAAGAAACTTCTAATCGCTCTCAT
AATCACCTCATCTTCTCTAGGACTAATACTTGTATCTTGTTTATGCTTTTGGGTTTATTGGTCTAAGAAA
TCTCCCAAAAACACCAAGAACTCAGGTGAGAGTAGGATTTCATTATCCAAGAAGGGCTTTGTGCAGTC
CTTCGATTACAAGACACTAGAGAAAGCAACAGGCGGTTTCAAAGACGGTAATCTTATAGGACGAGGC
GGGTTCGGAGATGTTTACAAGGCCTGTTTAGGCAACAACACTCTAGCAGCAGTCAAAAAGATCGAAA
ACGTTAGTCAAGAAGCAAAACGAGAATTTCAGAATGAAGTTGATTTGTTGAGCAAGATTCACCACCCG
AACATCATCTCATTGTTTGGATATGGAAATGAACTCAGTTCGAGTTTTATCGTCTACGAGCTGATGGAA
AGCGGATCATTGGATACACAGTTACACGGACCTTCTCGGGGATCGGCTTTAACATGGCACATGCGGAT
GAAGATTGCTCTTGATACAGCAAGAGCTGTTGAGTATCTCCACGAGCGTTGTCGTCCTCCGGTTATCCA
CAGAGATCTTAAATCGTCAAATATTCTCCTTGATTCTTCCTTCAACGCCAAGATTTCGGATTTTGGTCTT
GCGGTAATGGTGGGGGCTCACGGCAAAAACAACATTAAACTATCAGGAACACTTGGTTATGTTGCTCC
AGAATATCTCCTAGATGGAAAATTGACGGATAAGAGTGATGTTTATGCGTTTGGTGTGGTTTTACTTGA
ACTCTTGTTAGGAAGACGGCCGGTTGAGAAATTGAGTTCGGTTCAGTGTCAATCTCTTGTCACTTGGGC
AATGCCCCAACTTACGGATAGATCAAAGCTTCCGAAAATCGTGGATCCGGTTATCAAAGATACAATGG
ATCATAAGCACTTATACCAGGTGGCAGCCGTGGCAGTGCTTTGTGTACAACCAGAACCGAGTTATCGA
CCGTTGATAACCGATGTTCTTCACTCACTAGTTCCATTGGTTCCGGTAGAGCTAGGAGGGACTCTCCGG
TTAATACCATCATCGTCTTGA
>SEQIDNO：17
MGKILHLLLLLLKVSVLEFIISVSAFTSPASQPSLSPVYTSMASFSPGIHMGKGQEHKLDAHKKLLIALIITSSS
LGLILVSCLCFWVYWSKKSPKNTKNSGESRISLSKKGFVQSFDYKTLEKATGGFKDGNLIGRGGFGDVYKA
CLGNNTLAAVKKIENVSQEAKREFQNEVDLLSKIHHPNIISLFGYGNELSSSFIVYELMESGSLDTQLHGPSR
GSALTWHMRMKIALDTARAVEYLHERCRPPVIHRDLKSSNILLDSSFNAKISDFGLAVMVGAHGKNNIKLS
GTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLGRRPVEKLSSVQCQSLVTWAMPQLTDRSKLPKIVDP
VIKDTMDHKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSLVPLVPVELGGTLRLIPSSS
>SEQIDNO：18
ATGAAGCAAATTGTTATAACAGCTCTTGTTTTACTACAAGCTTATGTTCTTCATCAATCCACATGTGTT
ATGTCCCTTACTACACAAGAATCTCCTTCTCCTCAACCTTCTGCTTTCACTCCCGCCTTATCTCCTGATT
ATCAACAGAGAGAGAAGGAATTGCATAAACAAGAGAGTAACAACATGAGACTGGTTATTTCACTAGC
AGCTACATTTTCCTTAGTTGGTATAATCTTACTTTGCTCTCTGCTTTATTGGTTTTGCCATAGGAGAAGA
AACCTCAAGAGCTCAGGTTGTGGGTGTAGTGGAATCACATTCTTGAATCGGTTTAGTCGCTCAAAAAC
ATTAGACAAGAGAACTACAAAGCAGGGAACAGTGTCATTGATCGATTACAATATACTAGAAGAAGGA
ACTAGTGGTTTCAAGGAGAGTAACATTTTGGGTCAAGGTGGATTTGGATGTGTATATTCTGCCACATTA
GAGAACAACATTTCAGCTGCGGTTAAGAAGCTAGACTGTGCCAATGAAGATGCAGCAAAGGAATTTA
AGAGTGAGGTTGAGATATTGAGTAAGCTCCAGCACCCGAATATAATATCCCTTTTGGGTTATAGCACG
AATGATACTGCGAGATTCATTGTCTATGAGCTGATGCCAAACGTTTCTCTGGAATCTCATTTACACGGA
TCTTCTCAGGGTTCGGCGATCACATGGCCTATGAGGATGAAGATTGCTCTTGATGTAACAAGGGGATT
AGAATATTTGCATGAACATTGTCATCCAGCAATCATTCACAGGGACTTGAAATCATCCAACATCTTATT
AGATAGCAATTTCAATGCTAAGATTTCAGATTTTGGTCTAGCTGTTGTTGATGGGCCAAAGAACAAGA
ACCATAAACTTTCCGGGACAGTTGGCTACGTTGCACCAGAGTATCTTCTCAACGGCCAATTGACAGAA
AAGAGCGACGTGTATGCTTTTGGAGTAGTGTTATTAGAGCTTTTACTCGGGAAAAAACCTGTGGAGAA
ACTAGCTCCCGGTGAATGCCAATCCATCATCACTTGGGCAATGCCTTATCTCACTGATAGAACCAAGTT
ACCAAGCGTCATAGATCCTGCGATTAAAGATACGATGGACTTGAAACACCTTTACCAGGTAGCGGCAG
TGGCGATTTTGTGCGTGCAGCCAGAACCGAGTTATAGACCGTTGATTACAGACGTCTTGCATTCTCTTA
TACCTTTGGTTCCAATGGAACTTGGTGGAACCTTAAAAACCATCAAATGTGCTTCAATGGATCACTGTT
AA
>SEQIDNO：19
MKQIVITALVLLQAYVLHQSTCVMSLTTQESPSPQPSAFTPALSPDYQQREKELHKQESNNMRLVISLAATF
SLVGIILLCSLLYWFCHRRRNLKSSGCGCSGITFLNRFSRSKTLDKRTTKQGTVSLIDYNILEEGTSGFKESNI
LGQGGFGCVYSATLENNISAAVKKLDCANEDAAKEFKSEVEILSKLQHPNIISLLGYSTNDTARFIVYELMP
NVSLESHLHGSSQGSAITWPMRMKIALDVTRGLEYLHEHCHPAIIHRDLKSSNILLDSNFNAKISDFGLAVV
DGPKNKNHKLSGTVGYVAPEYLLNGQLTEKSDVYAFGVVLLELLLGKKPVEKLAPGECQSIITWAMPYLT
DRTKLPSVIDPAIKDTMDLKHLYQVAAVAILCVQPEPSYRPLITDVLHSLIPLVPMELGGTLKTIKCASMDH
C
>SEQIDNO：20
ATGAAGACTATGTCCAAATCGTCTTTGCGTTTGCATTTTCTCTCGCTACTCTTACTTTGTTGTGTCTCCC
CTTCAAGCTTTGTCATTATAAGATTCATTACACATAATCATTTTGATGGTCTAGTACGTTGTCATCCCCA
CAAGTTTCAAGCCCTTACGCAGTTCAAGAACGAGTTTGATACCCGCCGTTGCAACCACAGTAACTACT
TTAATGGAATCTGGTGTGATAACTCCAAGGTGCGGTCACAAAGCTACGACTACGGGACTGTCTCAGTG
GAACTCTCAAATCAAACAGTAGCCTCTTCCAGTTTCATCATCTTCGCTACCTTGATCTCTCTCACAACA
ACTTCACCTCCTCTTCCCTCCCTTCCGAGTTTGTTTCCCACTTTGCGGAATCTAACCAAGCTCACAGTTT
TAGACCTTTCTCATAATCACTTCTCCGGAACTTTGAAGCCCAACAATAGCCTCTTTGAGTTACACCACC
TTCGTTACCTTAATCTCGAGGTCAACAACTTCAGTTCCTCACTCCCTTCCGAGTTTGGCTATCTCAACAA
TTTACAGCACTGTGGCCTCAAAGAGTTCCCAAACATATTCAAGACCCTTAAAAAAATGGAGGCTATAG
ACGTATCCAACAATAGAATCAACGGGAAAATCCCTGAGTGGTTATGGAGCCTTCCTCTTCTTCATTTAG
TGAATATTTTAAATAATTCTTTTGACGGTTTCGAAGGATCAACGGAAGTTTTAGTAAATTCATCGGTTC
GGATATTACTTTTGGAGTCAAACAACTTTGAAGGAGCACTTCCTAGTCTACCACACTCTATCAACGCCT
TCTCCGCGGGTCATAACAATTTCACTGGAGAGATACCTCTTTCAATCTGCACCAGAACCTCACTTGGTG
TCCTTGATCTAAACTACAACAACCTCATTGGTCCGGTTTCTCAATGTTTGAGTAATGTCACGTTTGTAA
ATCTCCGGAAAAACAATTTGGAAGGAACTATTCCTGAGACTTTCATTGTCGGTTCCTCGATAAGGACA
CTTGATGTTGGATACAATCGACTAACGGGAAAGCTTCCAAGGTCTCTTTTGAACTGCTCATCTCTAGAG
TTTCTAAGCGTTGACAACAACAGAATCAAAGACACATTTCCTTTCTGGCTCAAGGCTTTACCAAAGTTA
CAAGTCCTTACCCTAAGTTCAAACAAGTTTTATGGTCCTATATCTCCTCCTCATCAAGGTCCTCTCGGG
TTTCCAGAGCTGAGAATACTTGAGATATCTGATAATAAGTTTACTGGAAGCTTGTCGTCAAGATACTTT
GAGAATTGGAAAGCATCGTCCGCCATGATGAATGAATATGTGGGTTTATATATGGTTTACGAGAAGAA
TCCTTATGGTGTAGTTGTCTATACCTTTTTGGATCGTATAGATTTGAAATACAAAGGTCTAAACATGGA
GCAAGCGAGGGTTCTCACTTCCTACAGCGCCATTGATTTTTCTAGAAATCTACTTGAAGGAAATATTCC
TGAATCCATTGGACTTTTAAAGGCATTGATTGCACTAAACTTATCGAACAACGCTTTTACAGGCCATAT
TCCTCAGTCTTTGGCAAATCTTAAGGAGCTCCAGTCACTAGACATGTCTAGGAACCAACTCTCAGGGA
CTATTCCTAATGGACTCAAGCAACTCTCGTTTTTGGCTTACATAAGTGTGTCTCATAACCAACTCAAGG
GTGAAATACCACAAGGAACACAAATTACTGGGCAATTGAAATCTTCCTTTGAAGGGAATGTAGGACTT
TGTGGTCTTCCTCTCGAGGAAAGGTGCTTCGACAATAGTGCATCTCCAACGCAGCACCACAAGCAAGA
CGAAGAAGAAGAAGAAGAACAAGTGTTACACTGGAAAGCGGTGGCAATGGGGTATGGACCTGGATTG
TTGGTTGGATTTGCAATTGCATATGTCATTGCTTCATACAAGCCGGAGTGGCTAACCAAGATAATTGGT
CCGAATAAGCGCAGAAACTAG
>SEQIDNO：21
MKTMSKSSLRLHFLSLLLLCCVSPSSFVIIRFITHNHFDGLVRCHPHKFQALTQFKNEFDTRRCNHSNYFNGI
WCDNSKVRSQSYDYGTVSVELSNQTVASSSFIIFATLISLTTTSPPLPSLPSLFPTLRNLTKLTVLDLSHNHFS
GTLKPNNSLFELHHLRYLNLEVNNFSSSLPSEFGYLNNLQHCGLKEFPNIFKTLKKMEAIDVSNNRINGKIPE
WLWSLPLLHLVNILNNSFDGFEGSTEVLVNSSVRILLLESNNFEGALPSLPHSINAFSAGHNNFTGEIPLSICT
RTSLGVLDLNYNNLIGPVSQCLSNVTFVNLRKNNLEGTIPETFIVGSSIRTLDVGYNRLTGKLPRSLLNCSSL
EFLSVDNNRIKDTFPFWLKALPKLQVLTLSSNKFYGPISPPHQGPLGFPELRILEISDNKFTGSLSSRYFENWK
ASSAMMNEYVGLYMVYEKNPYGVVVYTFLDRIDLKYKGLNMEQARVLTSYSAIDFSRNLLEGNIPESIGLL
KALIALNLSNNAFTGHIPQSLANLKELQSLDMSRNQLSGTIPNGLKQLSFLAYISVSHNQLKGEIPQGTQITG
QLKSSFEGNVGLCGLPLEERCFDNSASPTQHHKQDEEEEEEQVLHWKAVAMGYGPGLLVGFAIAYVIASY
KPEWLTKIIGPNKRRN
>SEQIDNO：22
ATGACTTCCTCTCGCCGTCTTCTTCTTCCTCTCGGAGCATCGCTCACTAGAGGAAGATTTTCTTCCGATC
AAATCCGAAATGGATTTCTAAGAAACTTCCGTGGATTCGCCACCGTAACTTCGTCGGAACCGGCCTTA
GCCAATCTGGAAGCGAAATATGCCGTAGCGTTGCCAGAATGTTCAACAGTAGAGGACGAGATCACGA
AGATCCGTCATGAATTCGAGTTAGCGAAACAGAGGTTTCTTAATATCCCTGAAGCTATTAATAGTATG
CCGAAGATGAATCCTCAAGGGATATATGTGAATAAGAATCTGAGATTGGATAATATACAAGTTTATGG
ATTTGATTATGATTACACTTTGGCACATTACTCTTCTCACTTACAGAGTTTGATCTATGATCTTGCCAAG
AAACATATGGTTAATGAGTTTAGATATCCTGATGTTTGCACTCAGTTTGAGTATGATCCTACTTTTCCA
ATCCGTGGGTTGTACTATGATAAACTAAAAGGATGCCTCATGAAATTGGATTTCTTCGGTTCAATCGAG
CCAGATGGGTGTTATTTTGGTCGTCGTAAGCTTAGTAGGAAGGAAATAGAAAGCATGTATGGAACGCG
GCACATAGGTCGTGATCAAGCGAGAGGTTTGGTGGGATTGATGGATTTCTTCTGTTTTAGCGAGGCGT
GTCTTATAGCAGACATGGTGCAATATTTTGTTGACGCCAAACTTGAGTTTGATGCCTCTAACATCTACA
ATGATGTCAATCGTGCTATTCAACATGTCCATAGAAGTGGATTGGTTCATAGAGGAATTCTTGCTGATC
CCAACAGATATTTGCTAAAAAATGGTCAGCTTCTACGTTTCCTGAGAATGCTAAAAGATAAAGGAAAG
AAGCTTTTTTTGCTGACCAACTCTCCGTATAATTTTGTTGATGGCGGAATGCGCTTTCTAATGGAGGAA
TCTTTTGGCTTCGGAGATTCCTGGCGAGAACTCTTTGATGTTGTGATTGCTAAAGCAAATAAACCAGAA
TTTTACACATCTGAGCACCCTTTCCGTTGTTATGATTCGGAGAGGGATAATTTGGCATTTACAAAAGTG
GATGCATTTGACCCAAAGAAAGTTTATTATCATGGTTGTCTTAAATCCTTCCTTGAAATCACAAAGTGG
CATGGCCCTGAGGTGATTTATTTCGGAGATCACTTATTTAGTGATCTAAGAGGGCCTTCAAAAGCTGGT
TGGCGAACTGCTGCCATAATTCATGAGCTCGAGCGAGAGATACAGATACAAAATGATGATAGCTACCG
GTTTGAGCAGGCCAAGTTCCATATTATCCAAGAGTTACTCGGTAGATTTCACGCGACTGTATCAAACA
ATCAGAGAAGTGAAGCATGCCAATCACTTTTGGATGAGCTGAACAATGCGAGGCAGAGAGCAAGAGA
CACGATGAAACAAATGTTCAACAGATCGTTTGGAGCTACATTTGTCACAGACACTGGTCAAGAATCAG
CATTCTCTTATCACATCCACCAATACGCAGACGTTTATACCAGTAAACCTGAGAACTTTCTGTTATACC
GACCTGAAGCCTGGCTTCACGTTCCTTACGATATCAAGATCATGCCACATCATGTCAAGGTTGCTTCAA
CCCTTTTCAAAACCTGA
>SEQIDNO：23
MTSSRRLLLPLGASLTRGRFSSDQIRNGFLRNFRGFATVTSSEPALANLEAKYAVALPECSTVEDEITKIRHE
FELAKQRFLNIPEAINSMPKMNPQGIYVNKNLRLDNIQVYGFDYDYTLAHYSSHLQSLIYDLAKKHMVNEF
RYPDVCTQFEYDPTFPIRGLYYDKLKGCLMKLDFFGSIEPDGCYFGRRKLSRKEIESMYGTRHIGRDQARGL
VGLMDFFCFSEACLIADMVQYFVDAKLEFDASNIYNDVNRAIQHVHRSGLVHRGILADPNRYLLKNGQLL
RFLRMLKDKGKKLFLLTNSPYNFVDGGMRFLMEESFGFGDS WRELFDVVIAKANKPEFYTSEHPFRCYDSE
RDNLAFTKVDAFDPKKVYYHGCLKSFLEITKWHGPEVIYFGDHLFSDLRGPSKAGWRTAAIIHELEREIQIQ
NDDSYRFEQAKFHIIQELLGRFHATVSNNQRSEACQSLLDELNNARQRARDTMKQMFNRSFGATFVTDTG
QESAFSYHIHQYADVYTSKPENFLLYRPEAWLHVPYDIKIMPHHVKVASTLFKT
>SEQIDNO：24
ATGGAGATTCCGGCGGCGCCGCCGCCTCCATTGCCGGTGCTGTGCTCGTACGTCGTCTTC
TTGCTGCTGCTGTCTTCGTGCTCACTGGCCAGAGGGAGGATCGCGGTTTCTTCCCCGGGC
CCGTCGCCTGTGGCCGCCGCCGTTACAGCCAATGAGACCGCTTCATCCTCTTCTTCTCCG
GTGTTTCCGGCCGCTCCTCCCGTCGTGATCACAGTGGTGAGGCACCACCATTACCACCGG
GAGCTGGTCATCTCCGCTGTCCTCGCCTGCGTCGCCACCGCCATGATCCTCCTCTCCACA
CTCTACGCCTGGACGATGTGGCGGCGGTCTCGCCGGACCCCCCACGGCGGCAAGGGCCGC
GGCCGGAGATCAGGGATCACACTGGTGCCAATCCTGAGCAAGTTCAATTCAGTGAAGATG
AGCAGGAAGGGGGGCCTTGTGACGATGATCGAGTACCCGTCGCTGGAGGCGGCGACAGGC
AAGTTCGGCGAGAGCAATGTGCTCGGTGTCGGCGGCTTCGGTTGCGTTTATAAGGCGGCG
TTTGATGGCGGTGCCACCGCCGCCGTGAAGAGGCTTGAAGGCGGCGGGCCGGATTGCGAG
AAGGAATTCGAGAATGAGCTGGATTTGCTTGGCAGGATCAGGCACCCAAACATAGTGTCT
CTCCTGGGCTTCTGTGTCCATGGTGGCAATCACTACATTGTTTATGAGCTCATGGAGAAG
GGATCATTGGAGACACAGCTGCATGGGTCTTCACATGGATCTGCTCTGAGCTGGCACGTT
CGGATGAAGATCGCGCTCGATACGGCGAGGGGATTAGAGTATCTTCATGAGCACTGCAAT
CCACCTGTGATCCATAGGGATCTGAAACCTTCTAATATACTTTTAGATTCAGACTTCAAT
GCTAAGATTGCAGATTTTGGCCTTGCGGTCACCGGTGGGAATCTCAACAAAGGGAACCTG
AAGCTTTCCGGGACCTTGGGTTATGTAGCCCCTGAGTACTTATTAGATGGGAAGTTGACT
GAGAAGAGCGATGTATACGCATTTGGAGTAGTGCTTCTAGAGCTCCTGATGGGAAGGAAG
CCTGTTGAGAAAATGTCACCATCTCAGTGCCAATCAATTGTGTCATGGGCTATGCCTCAG
CTGACCGACAGATCGAAGCTCCCCAACATAATTGACCTGGTGATCAAGGACACCATGGAC
CCAAAACACTTGTACCAAGTTGCAGCAGTGGCTGTTCTATGTGTGCAGCCCGAACCGAGC
TACAGACCACTGATAACAGATGTTCTCCACTCTCTTGTTCCTCTAGTGCCTGCGGAGCTC
GGAGGAACACTCAGGGTTGCAGAGCCACCTTCACCTTCTCCAGACCAAAGACATTATCCT
TGTTGA
>SEQIDNO：25
ATGAAGAAACTGGTTCATCTTCAGTTTTTGTTTCTTGTCAAGATCTTTGCTACTCAATTCCTCACTCCTT
CTTCATCATCTTTTGCTGCTTCAAATCCTTCTATAGCTCCTGTTTACACCTCCATGACTACTTTCTCTCCA
GGAATTCAAATGGGAAGTGGTGAAGAACACAGATTAGATGCACATAAGAAACTCCTGATTGGTCTTAT
AATCAGTTCCTCTTCTCTTGGTATCATAATCTTGATTTGCTTTGGCTTCTGGATGTACTGTCGCAAGAAA
GCTCCCAAACCCATCAAGATTCCGGATGCCGAGAGTGGGACTTCATCATTTTCAATGTTTGTGAGGCG
GCTAAGCTCAATTAAAACTCACAGAACATCTAGCAATCAGGGTTATGTGCAGCGTTTCGATTCCAAGA
CGCTAGAGAAAGCGACAGGCGGTTTCAAAGACAGTAATGTAATCGGACAGGGCGGTTTCGGATGCGT
TTACAAGGCTTCTTTGGACAGCAACACTAAAGCAGCGGTTAAAAAGATCGAAAACGTTACCCAAGAA
GCAAAACGAGAATTTCAGAATGAAGTTGAGCTGTTGAGCAAGATCCAGCACTCCAATATTATATCATT
GTTGGGCTCTGCAAGTGAAATCAACTCGAGTTTCGTCGTTTATGAGTTGATGGAGAAAGGATCCTTAG
ATGATCAGTTACATGGACCTTCGTGTGGATCCGCTCTAACATGGCATATGCGTATGAAGATTGCTCTAG
ATACAGCTAGAGGACTAGAGTATCTCCATGAACATTGTCGTCCACCAGTTATCCACAGGGACCTGAAA
TCGTCTAATATTCTTCTTGATTCTTCCTTCAATGCCAAGATTTCAGATTTTGGTCTGGCTGTATCGGTTG
GAGTGCATGGGAGTAACAACATTAAACTCTCTGGGACACTTGGTTATGTTGCCCCGGAATATCTCCTA
GACGGAAAGTTGACGGATAAGAGTGATGTCTATGCATTTGGGGTGGTTCTTCTTGAACTTTTGTTGGGT
AGGCGGCCGGTTGAGAAATTGAGTCCATCTCAGTGTCAATCTCTTGTGACTTGGGCAATGCCACAACT
TACCGATAGATCGAAACTCCCAAACATCGTGGATCCGGTTATAAAAGATACAATGGATCTTAAGCACT
TATACCAAGTAGCAGCCATGGCTGTGCTGTGCGTACAGCCAGAACCGAGTTACCGGCCGCTGATAACC
GATGTTCTTCATTCACTTGTTCCATTGGTTCCGGTAGAGCTAGGAGGGACTCTCCGGTTAACCCGATGA
>SEQIDNO：26
MKKLVHLQFLFLVKIFATQFLTPSSSSFAASNPSIAPVYTSMTTFSPGIQMGSGEEHRLDAHKKLLIGLIISSSS
LGIIILICFGFWMYCRKKAPKPIKIPDAESGTSSFSMFVRRLSSIKTHRTSSNQGYVQRFDSKTLEKATGGFKD
SNVIGQGGFGCVYKASLDSNTKAAVKKIENVTQEAKREFQNEVELLSKIQHSNIISLLGSASEINSSFVVYEL
MEKGSLDDQLHGPSCGSALTWHMRMKIALDTARGLEYLHEHCRPPVIHRDLKSSNILLDSSFNAKISDFGL
AVSVGVHGSNNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLGRRPVEKLSPSQCQSLVTWAM
PQLTDRSKLPNIVDPVIKDTMDLKHLYQVAAMAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSLVPLVPVELGGTLRLTR
>SEQIDNO：27
ATTTTTGGTGTTGAAATGATGCACAACGGATCTTTGGAATCCCAATTGCATGGTCCGTCTCATGGAACT
GGCTTAAGCTGGCAGCATCGAATGAAAATTGCACTTGATATTGCACGAGGACTAGAGTATCTTCACGA
GCGCTGTACCCCGCCTGTGATTCATAGAGATCTGAAATCGTCCAACATTCTTCTAGGTTCGAACTACAA
TGCTAAACTTTCTGATTTCGGGCTCGCGATTACTGGTGGGATTCAGGGCAAGAACAACGTAAAGCTTT
CGGGAACATTAGGTTATGTAGCTCCAGAATACCTCTTAGATGGTAAACTTACTGATAAAAGTGATGTT
TATGCGTTTGGAGTTGTACTTCTTGAACTTTTGATAGGTAGAAAACCAGTGGAGAAAATGTCACCATCT
CAATGCCAATCTATCGTTACATGGGCAATGCCTCAACTAACCGACCGATCAAAGCTTCCTAACATCGTT
GATCCCGTGATTAGAGATACAATGGACTTGAAGCACTTGTATCAAGTTGCTGCGGTTGCTGTGCTATGT
GTACAACCGGAACCGAGTTACAGGCCATTGATAACAGATGTTTTGCATTCGTTCATCCCACTTGTACCT
GTTGAGCTTGGAGGGTCGCTAAGAGTTACCGAATCTTGA
>SEQIDNO：28
IFGVEMMHNGSLESQLHGPSHGTGLSWQHRMKIALDLARGLEYLHERCTPPVIHRDLKSSNILLGSNYNAK
LSDFGLAITGGIQGKNNVKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLIGRKPVEKMSPSQCQSIV
TWAMPQLTDRSKLPNIVDPVIRDTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSFIPLVPVELGGSLRV
TES
>SEQIDNO：29
AATTCGGCACGAGGGCTGGATTCCAGTTTTAATGCAAAGCTTTCAGATTTTGGCCTTTCTGTGACTGCT
GGAACCCAGAGTAGGAATGTTAAGATCTCTGGAACTCTGGGTTATGTTGCCCCGGAGTACCTATTAGA
AGGAAAACTAACTGATAAAAGTGATGTATATGCTTTCGGAGTTGTATTGCTGGAACTTTTGATGGGGA
GAAGGCCTGTGGAAAAGATGTCACCAACTCAATGTCAATCAATGGTCACATGGGCCATGCCTCAGCTC
ACCGATAGATCAAAGCTTCCAAACATTGTGGATCCAGTAATTAGAGACACAATGGATTTAAAGCACTT
ATACCAGGTAGCCGCTGTGGCAGTGCTATGTATACAACCTGAACCAAGTTATAGGCCATTGATAACCG
ACGTTCTGCATTCCCTCATTCCTCTTGTACCTACCGACCTTGGAGGGTCACTCCGAGTGACCTAA
>SEQIDNO：30
NSARGLDSSFNAKLSDFGLSVTAGTQSRNVKISGTLGYVAPEYLLEGKLTDKSDVYAFGVVLLELLMGRRP
VEKMSPTQCQSMVTWAMPQLTDRSKLPNIVDPVIRDTMDLKHLYQVAAVAVLCIQPEPSYRPLITDVLHSL
IPLVPTDLGGSLRVT
>SEQIDNO：31
GGATTGTGTTTGTGGCTTTATCATTTGAAGTACTCCTTCAAATCCAGTAACAAGAATGCAAAGAGCAA
AGATTCTGAGAATGGAGTTGTGTTATCATCATTTTTGGGCAAATTCACTTCTGTGAGGATGGTTAGTAA
GAAGGGATCTGCTATTTCATTTATTGAGTATAAGCTGTTAGAGAAAGCCACCGACAGTTTTCATGAGA
GTAATATATTGGGTGAGGGTGGATTTGGATGTGTTTACAAGGCTAAATTGGATGATAACTTGCACGTC
GCTGTCAAAAAATTAGATTGTGCAACACAAGATGCCGGCAGAGAATTTGAGAATGAGGTGGATTTGCT
GAGTAATATTCACCACCCAAATGTTGTTTGTCTGTTGGGTTATAGTGCTCATGATGACACAAGGTTTAT
TGTTTATGAATTGATGGAAAATCGGTCCCTTGATATTCAATTGCATGGTCCTTCTCATGGATCAGCATT
GACTTGGCATATGCGAATGAAAATTGCTCTTGATACCGCTAGAGGATTAGAATATTTACATGAGCACT
GCAACCCTGCAGTCATTCATAGAGATCTGAAATCCTCCAATATACTTCTAGATTCCAAGTTTAATGCTA
AGCTCTCAGATTTTGGTCTTGCCATAACCGATGGATCCCAAAACAAGAACAATCTTAAGCTTTCGGGC
ACTTTGGGATATGTGGCTCCCGAGTATCTTTTAGATGGTAAATTGACAGACAAGAGTGATGTCTATGCT
TTTGGAGTTGTGCTTCT
>SEQIDNO：32
GLCLWLYHLKYSFKSSNKNAKSKDSENGVVLSSFLGKFTSVRMVSKKGSAISFIEYKLLEKATDSFHESNIL
GEGGFGCVYKAKLDDNLHVAVKKLDCATQDAGREFENEVDLLSNIHHPNVVCLLGYSAHDDTRFIVYEL
MENRSLDIQLHGPSHGSALTWHMRMKIALDTARGLEYLHEHCNPAVIHRDLKSSNILLDSKFNAKLSDFGL
AITDGSQNKNNLKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLL
>SEQIDNO：33
GCATTGACATGGCATCTTAGGATGAAAATTGCCCTTGATGTAGCTAGAGGATTAGAATTTTTGCATGA
GCACTGCCACCCAGCAGTGATCCATAGAGATCTGAAATCATCTAATATCCTTCTGGATTCAAATCTCAA
TGCTAAGCTATCTGATTTTGGTCTTGCCATTCTTGATGGGGCTCAAAATAAGAACAACATCAAGCTTTC
TGGAACCTTGGGCTATGTAGCTCCAGAGTACCTCTTAGATGGTAAATTGACTGACAAGAGTGATGTTT
ATGCTTTTGGAGTGGTGCTTTTGGAGCTTCTCCTGAGAAGAAAGCCTGTGGAGAAGCTGGCACCAGCT
CAATGCCAATCTATAGTCACATGGGCTATGCCTCAGCTGACAGATAGATCAAAGCTTCCAAACATCGT
GGATCCTGTGATTAGAAATGCTATGGATATAAAGCACTTATTCCAGGTTGCTGCAGTCGCTGTGCTATG
CGTGCAGCCTGAACCAAGCTATCGACCACTGATAACAGATGTGTTGCATTCCCTTGTTCCCCTTGTTCC
TATGGAGCTTGGCGGGACGCTCAGAGTTGAACGACCTGCTTCTGTGACCTCTCTGTTGATTGATTCTAC
CTGA
>SEQIDNO：34
ALTWHLRMKIALDVARGLEFLHEHCHPAVIHRDLKSSNILLDSNLNAKLSDFGLAILDGAQNKNNIKLSGT
LGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLRRKPVEKLAPAQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIVDPVIR
NAMDIKHLFQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSLVPLVPMELGGTLRVERPASVTSLLIDST
>SEQIDNO：35
ACTGAGGTGACCCGGAAGAAAAACAGGGTAAAGCTATCGGGCACTTTGGGTTATGTAGCCCCAGAAT
ATGTCTTGGATGGTAAATTGACTGATAAGAGTGATGTCTATGCCTTTGGAGTTGTGCTTTTGGAGCTCC
TTTTGAGAAGAAGGCCTCTTGAGATAGTAGCACCCACTCAGTGCCAGTCTATTGTTACATGGGCCATG
CCTCAGCTGACCGACCGAACTAAGCTTCCAGATATTGTGGATCCTGTAATTAGAGATGCGATGGATGT
CAAGCACTTATACCAGGCAGCTGCTGTTGCTGTTTTGTGTCTGCAACCAGAACCGATCTACCGGCCACT
GATAACGGATGTACTCCACTCTCTCATTCCACTTGTACCCGTTGAACTTGGGGGAACGCTGAAGACCTA
G
>SEQIDNO：36
TEVTRKKNRVKLSGTLGYVAPEYVLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLRRRPLEIVAPTQCQSIVTWAMPQ
LTDRTKLPDIVDPVIRDAMDVKHLYQAAAVAVLCLQPEPIYRPLITDVLHSLIPLVPVELGGTLKT
>SEQIDNO：37
ACGAGGCCTCGTGCCATACTTTTGGATTCAGATTTCAATGCCAAGATTTCGGATTTCGGTCTTGCAGTG
TCAAGTGGAAATCGCACCAAAGGTAATCTGAAGCTTTCCGGAACTTTGGGCTATGTTGCTCCTGAGTA
CTTATTAGACGGGAAGTTGACAGAGAAGAGTGATGTATATGCGTTCGGAGTAGTACTTCTTGAGCTTT
TGTTAGGAAGGAGGCCAATTGAGAAGATGGCCCCATCTCAATGCCAATCAATTGTTACATGGGCCATG
CCTCAGCTAATTGACAGATCAAAGCTCCCAACCATAATTGACCCCGTGATCAGGAACACGATGGACCT
GAAGCACTTGTACCAAGTTGCTGCAGTGGCTGTGCTCTGTGTGCAGCCAGAACCAAGTTATAGGCCAC
TAATCACAGATGTGCTCCACTCTCTGATTCCCCTGGTGCCCATGGAGCTCGGAGGGTCACTGAGGGCT
ACCTTGGAATCGCCTCGCGTATCACAACATCGTTCTCCCTGCTGA
>SEQIDNO：38
TRPRAILLDSDFNAKISDFGLAVSSGNRTKGNLKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTEKSDVYAFGVVLLELLLG
RRPIEKMAPSQCQSIVTWAMPQLIDRSKLPTIIDPVIRNTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHS
LIPLVPMELGGSLRATLESPRVSQHRSPC
>SEQIDNO：39
CCTTTATTGAATAGATTGAACTCCTTCCGTGGTTCTAGGAGAAAGGGATGTGCATATATAATTGAATAT
TCTCTGCTGCAAGCAGCCACAAATAATTTTAGTACAAGTGACATCCTTGGAGAGGGTGGTTTTGGGTG
TGTATACAGAGCTAGGTTAGATGATGATTTCTTTGCTGCTGTGAAGAAGTTAGATGAGGGCAGCAAGC
AGGCTGAGTATGAATTTCAGAATGAAGTTGAACTAATGAGCAAAATCAGACATCCAAATCTTGTTTCT
TTGCTGGGGTTCTGCATTCATGGGAAGACTCGGTTGCTAGTCTACGAGCTCATGCAAAATGGTTCTTTG
GAAGACCAATTACATGGGCCATCTCATGGATCCGCACTTACATGGTACCTGCGCATGAAAATAGCCCT
TGATTCAGCAAGGGGTCTAGAACACTTGCACGAGCACTGCAATCCTGCTGTGATTCATCGTGATTTCA
AATCATCAAATATCCTTCTGGATGCAAGCTTCAATGCCAAGCTTTCAGATTTTGGTCTTGCAGTAACAG
CTGCAGGAGGTATTGGTAATGCTAATGTCGAGCTACTGGGCACTTTGGGATATGTAGCTCCAGAATAC
CTGCTTGATGGCAAGTTGACGGAGAAAAGTGATGTCTATGGATTTGGAGTTGTTCTTTTGGAGCTAATT
ATGGGAAGAAAGCCAGTTGATAAATCTGTGGCAACTGAAAGTCAATCGCTAGTTTC
>SEQIDNO：40
PLLNRLNSFRGSRRKGCAYIIEYSLLQAATNNFSTSDILGEGGFGCVYRARLDDDFFAAVKKLDEGSKQAE
YEFQNEVELMSKIRHPNLVSLLGFCIHGKTRLLVYELMQNGSLEDQLHGPSHGSALTWYLRMKIALDSARG
LEHLHEHCNPAVIHRDFKSSNILLDASFNAKLSDFGLAVTAAGGIGNANVELLGTLGYVAPEYLLDGKLTE
KSDVYGFGVVLLELIMGRKPVDKSVATESQSLVS
>SEQIDNO：41
ATGAAAATGAAGCTTCTCCTCATGCTTCTTCTTCTTGTTCTTCTTCTTCACCAACCCATTTGGGCTGCAG
ACCCTCCTGCTTCTTCTCCTGCTTTATCTCCAGGGGAGGAGCAGCATCACCGGAATAATAAAGTGGTAA
TAGCTATCGTCGTAGCCACCACTGCACTTGCTGCACTCATTTTCAGTTTCTTATGCTTCTGGGTTTATCA
TCATACCAAGTATCCAACAAAATCCAAATTCAAATCCAAAAATTTTCGAAGTCCAGATGCAGAGAAGG
GGATCACCTTAGCACCGTTTGTGAGTAAATTCAGTTCCATCAAGATTGTTGGCATGGACGGGTATGTTC
CAATAATTGACTATAAGCAAATAGAAAAAACGACCAATAATTTTCAAGAAAGTAACATCTTGGGTGA
GGGCGGTTTTGGACGTGTTTACAAGGCTTGTTTGGATCATAACTTGGATGTTGCAGTCAAAAAACTAC
ATTGTGAGACTCAACATGCTGAGAGAGAATTTGAGAACGAGGTGAATATGTTAAGCAAAATTCAGCAT
CCGAATATAATATCTTTACTGGGTTGTAGCATGGATGGTTACACGAGGCTCGTTGTCTATGAGCTGATG
CATAATGGATCATTGGAAGCTCAGTTACATGGACCTTCTCATGGCTCGGCATTGACTTGGCACATGAG
GATGAAGATTGCTCTTGACACAGCAAGAGGATTAGAATATCTGCACGAGCACTGTCACCCTGCAGTGA
TCCATAGGGATATGAAATCTTCTAATATTCTCTTAGATGCAAACTTCAATGCCAAGCTGTCTGATTTTG
GTCTTGCCTTAACTGATGGGTCCCAAAGCAAGAAGAACATTAAACTATCGGGTACCTTGGGATACGTA
GCACCGGAGTATCTTCTAGATGGTAAATTAAGTGATAAAAGTGATGTCTATGCTTTTGGGGTTGTGCTA
TTGGAGCTCCTACTAGGAAGGAAGCCAGTAGAAAAACTGGTACCAGCTCAATGCCAATCTATTGTCAC
ATGGGCCATGCCACACCTCACGGACAGATCCAAGCTTCCAAGCATTGTGGATCCAGTGATTAAGAATA
CAATGGATCCCAAGCACTTGTACCAGGTTGCTGCTGTAGCTGTGCTGTGCGTGCAACCAGAACCTAGT
TACCGTCCACTGATCATTGATGTTCTTCACTCACTCATCCCTCTTGTTCCCATTGAGCTTGGAGGAACAC
TAAGAGTTTCACAAGTAATT
>SEQIDNO：42
MKMKLLLMLLLLVLLLHQPIWAADPPASSPALSPGEEQHHRNNKVVIAIVVATTALAALIFSFLCFWVYHH
TKYPTKSKFKSKNFRSPDAEKGITLAPFVSKFSSIKIVGMDGYVPIIDYKQIEKTTNNFQESNILGEGGFGRVY
KACLDHNLDVAVKKLHCETQHAEREFENEVNMLSKIQHPNIISLLGCSMDGYTRLVVYELMHNGSLEAQL
HGPSHGSALTWHMRMKIALDTARGLEYLHEHCHPAVIHRDMKSSNILLDANFNAKLSDFGLALTDGSQSK
KNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLSDKSDVYAFGVVLLELLLGRKPVEKLVPAQCQSIVTWAMPHLTDRSKLP
SIVDPVIKNTMDPKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLIIDVLHSLIPLVPIELGGTLRVSQVI
>SEQIDNO：43
ACTCAAGCATCAAAATATTGTAAATCTTTTGGGTATTGTGTTCATGATGACACAAGGTTTTTGGTCTAT
GAAATGATGCATCAAGGCTCTTTGGACTCACAATTGCATGGACCAACTCATGGAACCGCATTAACCTG
GCATCGAAGAATGAAAGTCGCACTTGATATTGCTCGAGGATTAGAGTATCTTCATGAACGATGCAACC
CGCCTGTGATTCATAGAGATCTTAAGTCATCGAACATTTTGCTAGATTCCAATTTCAATGCTAAAATTT
CGAATTTTGCACTTGCTACCACTGAGCTCCATGCGAAGAACAAAGTTAAGCTTTCGGCTACTTCTGGTT
ATTTGGCTCCGGAATACCTATCAGAAGGTAAACTTACCGATAAAAGCGACGTATATGCATTCGGAGTA
GTACTTCTTGGGCTTTTAATCGGTAGAAAACCAGTGGAGAAAATGTCACCATCTTTATTTCAATCTATT
GTCACATGGGCAATGCCTCAGTTAACAGACCGGTCAAAGCTTCCAAACATCGTTGACCCTGTGATTAG
AGATACAATGGACCTGAAGCACTTATATCAAGTTGCTGCTGTAGCCGTACTTTGCGTGCAACCCGAAC
CAAGTTACAGACCGTTGATTACAGACGTACTACACTCATTCATTCCACTCGTACCCGTTGATCTTGGAG
GGTCATTAAGAGCTTAA
>SEQIDNO：44
TQASKYCKSFGYCVHDDTRFLVYEMMHQGSLDSQLHGPTHGTALTWHRRMKVALDIARGLEYLHERCNP
PVIHRDLKSSNILLDSNFNAKISNFALATTELHAKNKVKLSATSGYLAPEYLSEGKLTDKSDVYAFGVVLLG
LLIGRKPVEKMSPSLFQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIVDPVIRDTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLIT
DVLHSFIPLVPVDLGGSLRA
>SEQIDNO：45
CGATCATTTCGTTGCGGCTGTAAAAAACTCCATGGTCCAGAACCAGATGCCCAAAAAGGGTTTGAGAA
TGAAGTAGATTGGTTAGGTAAACTCAAGCATCAAAATATTGTAAATTTTTTGGGTTATTGTGTTCATGA
TGACACAAGGTTTTTGGTCTATGAAATGATGCATCAAGGCTCTTTGGACTCACAATTGCATGGACCAA
CTCATGGAACCGCATTAACCTGGCATCGAAGAATGAAAGTCGCACTTGATATTGCTCGAGGATTAGAG
TATCTTCATGAACGATGCAACCCGCCTGTGATTCATAGAGATCTCAAGTCATCGAACATTTTGCTAGAT
TCCAATTTCAATGCTAAAATTTCGAATTTTGCACTTGCTACCACTGAGCTCCATGCGAAGAACAAAGTT
AAGCTTTCGGGTACTTCTGGTTATTTGGCTCCGGAATACCTATCCGAAGGTAAACTTACCGATAAAAGT
GATGTATATGCATTCGGAGTAGTACTTCTTGAGCTTTTAATCGGTAGAAAACCAGTGGAGAAAATGTC
ACCATCTTTATTTCAATCTATTGTCACATGGGCAATGCCTCAGCTAACAGACCGGTCAAAGCTTCCAAA
CATTGTTGACCCTGTGATTAGAGATACAATGGACCTGAAGCACTTGTATCAAGTTGCTGCTGTAGCCGT
ACTTTGCGTGCAACCCGAACCAAGTTACAGACCGTTGATTACAGACGTACTACACTCATTCATTCC
>SEQIDNO：46
RSFRCGCKKLHGPEPDAQKGFENEVDWLGKLKHQNIVNFLGYCVHDDTRFLVYEMMHQGSLDSQLHGPT
HGTALTWHRRMKVALDIARGLEYLHERCNPPVIHRDLKSSNILLDSNFNAKISNFALATTELHAKNKVKLS
GTSGYLAPEYLSEGKLTDKSDVYAFGVVLLELLIGRKPVEKMSPSLFQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIVDPVI
RDTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSFIP
>SEQIDNO：47
ATGATGCATCAAGACTCTTTGGACTCACAATTGCATGGACCAACTCATGGAACCGCATTAACCTGGCA
TCGAAGAATGAAAGTCGCACTTGATATTGCTCGAGGATTAGAGTATCTTCATGAACGATGCAACCCGC
CTGTGATTCATAGAGATCTCAAGTCATCGAACATTTTGCTAGATTCCAATTTCAATGCTAAAATTTCGA
ATTTTGCACTTGCTACCACTGAGCTCCATGCGAAGAACAAAGTTAAGCTTTCGGGTACTTCTGGTTATT
TGGCTCCGGAATACCTATCCGAAGGTAAACTTACCGATAAAAGTGATGTATATGCATTCGGAGTAGTA
CTTCTTGAGCTTTTAATCGGTAGAAAACCAGTGGAGAAAATGTCACCATCTTTATTTCAATCTATTGTC
ACATGGGCAATGCCTCAGCTAACAGACCGGTCAAAGCTTCCAAACATTGTTGACCCTGTGATTAGAGA
TACAATGGACCTGAAGCACTTGTATCAAGTTGCTGCTGTAGCCGTACTTTGCGTGCAACCCGAACCAA
GTTACAGACCGTTGATTACAGACGTACTACACTCATTCATTCCACTCGTACCCGTTGATCTTGGAGGGT
CATTAAGAGCTTAA
>SEQIDNO：48
MMHQDSLDSQLHGPTHGTALTWHRRMKVALDIARGLEYLHERCNPPVIHRDLKSSNILLDSNFNAKISNFA
LATTELHAKNKVKLSGTSGYLAPEYLSEGKLTDKSDVYAFGVVLLELLIGRKPVEKMSPSLFQSIVTWAMP
QLTDRSKLPNIVDPVIRDTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSFIPLVPVDLGGSLRA
>SEQIDNO：49
AATTTGAGAGGTGAGCTGGATTTGCTTCAGAGGATTCAGCATTCGAATATAGTGTCCCTTGTGGGCTTC
TGCATTCATGAGGAGAACCGCTTCATTGTTTATGAGCTGATGGTGAATGGATCACTTGAAACACAGCT
TCATGGGCCATCACATGGATCAGCTCTGAGTTGGCACATTCGGATGAAGATTGCTCTTGATACAGCAA
GGGGATTGGAGTATCTTCACGAGCACTGCAATCCACCAATCATCCATAGGGATCTGAAGTCGTCTAAC
ATACTTTTGAATTCAGACTTTAATGCAAAGATTTCAGATTTTGGCCTTGCAGTGACAAGTGGAAATCGC
AGCAAAGGGAATCTGAAGCTTTCCGGTACTTTGGGTTATGTTGCCCCTGAGTACTTACTAGATGGGAA
GTTGACTGAGAAGAGCGATGTATATGCATTTGGAGTAGTACTTCTTGAGCTTCTTTTGGGAAGGAGGC
CAGTTGAGAAGATGGCACCATCTCAGTGTCAATCAATTGTTACATGGGCCATGCCCCAGCTAATTGAC
AGATCCAAGCTCCCTACCATAATCGACCCCGTGATCAGGGACACGATGGATCGGAAGCACTTGTACCA
AGTTGCTGCAGTGGCTGTGCTCTGCGTGCAGCCAGAACCAAGCTACAGGCCACTGATCACAGATGTCC
TCCACTCTCTGATTCCCCTGGTGCCCATGGACCTTGGAGGGACGCTGAGGATCAACCCGGAATCGCCTT
GCACGACACGAAATCAATCTCCCTGCTGA
>SEQIDNO：50
NLRGELDLLQRIQHSNIVSLVGFCIHEENRFIVYELMVNGSLETQLHGPSHGSALSWHIRMKIALDTARGLE
YLHEHCNPPIIHRDLKSSNILLNSDFNAKISDFGLAVTSGNRSKGNLKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTEKSDV
YAFGVVLLELLLGRRPVEKMAPSQCQSIVTWAMPQLIDRSKLPTIIDPVIRDTMDRKHLYQVAAVAVLCVQ
PEPSYRPLITDVLHSLIPLVPMDLGGTLRINPESPCTTRNQSPC
>SEQIDNO：51
CGGGGGCTCTTATCACTCATTGCTGCTGCTACTGCACTGGGTACAAGCTTATTGCTCATGGGTTGCTTC
TGGATTTATCATAGAAAGAAAATCCACAAATCTCATGACATTATTCATAGCCCAGATGTAGTTAAAGG
TCTTGCATTATCCTCATATATTAGCAAATACAACTCCTTCAAGTCGAATTGTGTGAAACGACATGTCTC
GTTGTGGGAGTACAATACACTCGAGTCGGCCACAAATAGTTTTCAAGAAAGCGAGATCTTGGGTGGAG
GGGGGTTCGGGCTTGTGTACAAGGGAAAACTAGAAGACAACTTGTATGTAGCTGTGAAGAGGCTGGA
AGTTGGAAGACAAAACGCAATTAAAGAATTCGAGGCTGAAATAGAGGTATTGGGCACGATTCAGCAC
CCGAATATAATTTCGTTGTTGGGATATAGCATTCATGCTGACACGAGGCTGCTAGTTTATGAACTGATG
CAGAATGGATCTCTGGAGTATCAACTACATGGACCTTCCCATGGATCAGCATTAGCGTGGCATAATAG
ATTGAAAATCGCACTTGATACAGCAAGGGGATTAGAATATTTACATGAACATTGCAAACCACCAGTTA
TCCATAGAGATCTGAAATCCTCCAATATTCTTCTAGATGCCAACTTCAATGCCAAGATCTCAGATTTTG
GTCTTGCTGTGCGCGATGGGGCTCAAAACAAAAATAACATTAAGCTCTCGGGAACCGTTGGCTATGTA
GCTCCAGAATACCTATTAGATGGAATACTAACAGATAAAAGTGATGTTTATGGCTTCCGAGTTGTA
>SEQIDNO：52
RGLLSLIAAATALGTSLLLMGCFWIYHRKKIHKSHDIIHSPDVVKGLALSSYISKYNSFKSNCVKRHVSLWE
YNTLESATNSFQESEILGGGGFGLVYKGKLEDNLYVAVKRLEVGRQNAIKEFEAEIEVLGTIQHPNIISLLGY
SIHADTRLLVYELMQNGSLEYQLHGPSHGSALAWHNRLKIALDTARGLEYLHEHCKPPVIHRDLKSSNILL
DANFNAKISDFGLAVRDGAQNKNNIKLSGTVGYVAPEYLLDGILTDKSDVYGFRVV
>SEQIDNO：53
GGGGATATACGTGTAGAATCAGCAACAAATAACTTCGGTGAAAGCGAGATATTAGGCGTAGGTGGAT
TTGGATGCGTGTATAAAGCTCGACTCGATGATAATTTGCATGTAGCTGTTAAAAGATTAGATGGTATTA
GTCAAGACGCCATTAAAGAATTCCAGACGGAGGTGGATCTATTGAGTAAAATTCATCATCCGAATATC
ATCACCTTATTGGGATATTGTGTTAATGATGAAACCAAGCTTCTTGTTTATGAACTGATGCATAATGGA
TCTTTAGAAACTCAATTACATGGGCCTTCCAGTGGATCCAATTTAACATGGCATTGCAGGATGAAGATT
GCTCTAGATACAGCAAGAGGATTAGAATATTTGCATGAGAACTGCAAACCATCGGTGATTCATAGAGA
TCTGAAATCATCTAATATCCTTCTGGATTCCAGCTTCAATGCTAAGCTTTCAGATTTTGGTCTTGCTATA
ATGGATGGGGCCCAGAACAAAAACAACATTAAGCTTTCAGGGACATTGGGTTATGTAGCTCCCGAGTA
TCTTTTAGATGGAAAATTGACGGATAAAAGTGACGTGTATGCGTTTGGAGTTGTGCTTTTAGAGCTTTT
ACTTGGAAGGCGACCTGTAGAAAAATTAGCAGAGTCGCAATGCCAATCTATTGTCACTTGGGCTATGC
CACAATTAACAGACAGATCAAAGCTTCCGAATATTGTAGATCCCGTGATCAGATACACAATGGATCTC
AAGCACCTGTACCAAGTTGCTGCGGTGGCTGTGTTATGTGTACAACCCGGACCAAGCTACCGGCCATT
TATAAACCGACGTCTTGCATTCTCTGATCCCTCTTGTTCCCCGTGA
>SEQIDNO：54
GDIRVESATNNFGESEILGVGGFGCVYKARLDDNLHVAVKRLDGISQDAIKEFQTEVDLLSKIHHPNIITLLG
YCVNDETKLLVYELMHNGSLETQLHGPSSGSNLTWHCRMKIALDTARGLEYLHENCKPSVIHRDLKSSNIL
LDSSFNAKLSDFGLAIMDGAQNKNNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLGRRPVEKL
AESQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIVDPVIRYTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPGPSYRPFINRRLAFSDPSCS
P
>SEQIDNO：55
AAGTTGAACTGTGAATGTCAATATGCTGAGAGAGAATTTGAGAATGAGGTGGATTTGTTAAGTAAAAT
TCAACATCCAAATGTAATTTCTCTACTGGGCTGTAGCAGTAATGAGGATTCAAGGTTTATTGTCTATGA
GTTGATGCAAAATGGATCATTGGAAACTCAATTACATGGACCATCTCATGGCTCAGCATTGACTTGGC
ATATGAGGATGAAGATTGCTCTTGACACAGCTAGAGGTTTAAAATATCTGCATGAGCACTGCTACCCT
GCAGTGATCCATAGAGATCTGAAATCTTCTAATATTCTTTTAGATGCAAACTTCAATGCCAAGCTTTCT
GATTTTGGTCTTGCAATAACTGATGGGTCCCAAAACAAGAATAACATCAAGCTTTCAGGCACATTGGG
GTATGTTGCCCCGGAGTATCTTTTAGATGGTAAATTGACAGATAAAAGTGATGTGTATGCTTTTGGAGT
TGTGCTTCTTGAGCTTCTATTAGGAAGAAAGCCTGTGGAAAAACTTACACCATCTCAATGCCAGTCTAT
TGTCACATGGGCCATGCCACAGCTCACAGACAGATCCAAGCTTCCAAACATTGTGGATAATGTGATTA
AGAATACAATGGATCCTAAGCACTTATACCAGGTTGCTGCTGTGGCTGTATTATGTGTGCAACCAGAG
CCGTGCTACCGCCCTTTGATTGCAGATGTTCTACACTCCCTCATCCCTCTTGTACCTGTTGAGCTTGGAG
GAACACTCAGAGTTGCACAAGTGACGCAGCAACCTAAGAATTCTAGTTAA
>SEQIDNO：56
KLNCECQYAEREFENEVDLLSKIQHPNVISLLGCSSNEDSRFIVYELMQNGSLETQLHGPSHGSALTWHMR
MKIALDTARGLKYLHEHCYPAVIHRDLKSSNILLDANFNAKLSDFGLAITDGSQNKNNIKLSGTLGYVAPE
YLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLGRKPVEKLTPSQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIVDNVIKNTMDPK
HLYQVAAVAVLCVQPEPCYRPLIADVLHSLIPLVPVELGGTLRVAQVTQQPKNSS
>SEQIDNO：57
CAGTTGCATGGACCTCCTCGTGGATCAGCTTTGAATTGGCATCTTCGCATGGAAATTGCATTGGATGTG
GCTAGGGGACTAGAATACCTCCATGAGCGCTGTAACCCCCCTGTAATCCATAGAGATCTCAAATCGTC
TAATGTTCTATTGGATTCCTACTTCAATGCAAAGCTTTCTGACTTTTGGCCTAGCTATAGCTGGATGGA
ACTTAAACAAGAGCACCGTAAAGTCTTTCGGGAACTCTGGGATATGTGGCTCCAGAGTTACCTCTTAG
ATGGGAAATTAACTGATAAGAGTGATGTCTATGCTTTCGGCATTATACTTCTGGAGCTTCTAATGGGGA
GAAGACCATTGGAGAAACTAGCAGGAGCTCAGTGCCAATCTATCGTCACATGGGCAATGCCACAGCTT
ACTGACAGGTCAAAGCTCCCAAATATTGTTGATCCTGTCATCAGAAACGGAATGGGCCTCAAGCACTT
GTATCAAGTTGCTGCTGTAGCCGTGCTATGTGTACAACCAGAACCAAGTTACCGACCACTGATAACAG
ATGTCCTGCACTCCTTCATTCCCCTTGTACCAATTGAGCTTGGTGGGTCCTTGAGAGTTGTGGATTCTGC
ATTATCTGTTAACGCATAA
>SEQIDNO：58
QLHGPPRGSALNWHLRMEIALDVARGLEYLHERCNPPVIHRDLKSSNVLLDSYFNAKLSDFWPSYSWMEL
KQEHRKVFRELWDMWLQSYLLDGKLTDKSDVYAFGIILLELLMGRRPLEKLAGAQCQSIVTWAMPQLTD
RSKLPNIVDPVIRNGMGLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSFIPLVPIELGGSLRVVDSALSVNA
>SEQIDNO：59
ATGGAGATGGCGCTAACTCCATTGCCGCTCCTGTGTTCGTCCGTCTTGTTCTTGGTGCTATCTTCGTGCT
CGTTGGCCAATGGGAGGGATACGCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT
TCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCCGGCGACGTCTACTGTGGCCACCGGCATTTCCGCCGCCGCCGCCGCCG
CCGCCAATGGGACGGCCGCCTTGTCTTCGGCAGTTCCGGCGCCTCCGCCTGTTGTGATCGTAGTGCACC
ACCATTTCCACCGCGAGCTGGTCATCGCCGCCGTCCTCGCCTGCATCGCCACCGTCACGATCTTCCTTT
CCACGCTCTACGCTTGGACACTATGGCGGCGATCTCGCCGGAGCACCGGCGGCAAGGTCACCAGGAGC
TCAGACGCAGCGAAGGGGATCAAGCTGGTGCCGATCTTGAGCAGGTTCAACTCGGTGAAGATGAGCA
GGAAGAGGCTGGTTGGGATGTTCGAGTACCCGTCGCTGGAGGCAGCGACAGAGAAGTTCAGCGAGAG
CAACATGCTCGGTGTCGGCGGGTTTGGCCGCGTCTACAAGGCGGCGTTCGACGCCGGAGTTACCGCGG
CGGTGAAGCGGCTCGACGGCGGCGGGCCCGACTGCGAGAAGGAATTCGAGAATGAGCTGGATTTGCT
TGGCAGGATCAGGCACCCCAACATTGTGTCCCTCTTGGGCTTCTGTATCCATGAGGGGAATCACTACAT
TGTTTATGAGCTGATGGAGAAGGGATCACTGGAAACACAGCTTCATGGGTCTTCACATGGATCAACTC
TGAGCTGGCACATCCGGATGAAGATCGCCCTTGACACGGCCAGGGGATTAGAGTACCTTCATGAGCAC
TGCAGTCCACCAGTGATCCATAGGGATCTGAAATCGTCTAACATACTTTTGGATTCAGACTTCAATGCT
AAGATTGCAGATTTTGGTCTTGCTGTGTCTAGTGGGAGTGTCAACAAAGGGAGTGTGAAGCTCTCCGG
GACCTTGGGTTATGTAGCTCCTGAGTACTTGTTGGATGGGAAGTTGACTGAAAAGAGCGATGTATACG
CGTTCGGAGTAGTGCTTCTAGAGCTCCTTATGGGGAGGAAGCCTGTTGAGAAGATGTCACCATCTCAG
TGCCAATCAATTGTGACATGGGCAATGCCACAGTTGACCGACAGATCGAAGCTCCCCAGCATAGTTGA
CCCAGTGATCAAGGACACCATGGATCCAAAACACCTGTACCAAGTTGCAGCAGTGGCTGTTCTATGCG
TGCAGGCTGAACCAAGCTACAGGCCACTGATCACAGATGTGCTCCACTCTCTTGTTCCTCTAGTGCCGA
CGGAGCTCGGAGGAACACTAAGAGCTGGAGAGCCACCTTCCCCGAACCTGAGGAATTCTCCATGCTGA
>SEQIDNO：60
MEMALTPLPLLCSSVLFLVLSSCSLANGRDTPSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSPATSTVATGISAAAAAAANGT
AALSSAVPAPPPVVIVVHHHFHRELVIAAVLACIATVTIFLSTLYAWTLWRRSRRSTGGKVTRSSDAAKGIK
LVPILSRFNSVKMSRKRLVGMFEYPSLEAATEKFSESNMLGVGGFGRVYKAAFDAGVTAAVKRLDGGGPD
CEKEFENELDLLGRIRHPNIVSLLGFCIHEGNHYIVYELMEKGSLETQLHGSSHGSTLSWHIRMKIALDTARG
LEYLHEHCSPPVIHRDLKSSNILLDSDFNAKIADFGLAVSSGSVNKGSVKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTEKS
DVYAFGVVLLELLMGRKPVEKMSPSQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPSIVDPVIKDTMDPKHLYQVAAVAVL
CVQAEPSYRPLITDVLHSLVPLVPTELGGTLRAGEPPSPNLRNSPC
>SEQIDNO：61
TACTCTCTTTTACAAACTGCTACGAACAACTTCAGCTCCTCCAATTTGCTGGGCGAGGGAAGTTTCGGG
CATGTGTATAAAGCGAGACTCGATTATGATGTCTATGCCGCTGTAAAGAGACTTACCAGCGTAGGAAA
ACAGCCCCAAAAAGAACTCCAGGGAGAGGTGGATCTGATGTGCAAGATAAGACATCCCAACTTGGTG
GCTCTCCTGGGCTATTCAAATGACGGCCCAGAGCCCTTGGTTGTGTACGAGCTCATGCAGAATGGTTC
ACTTCATGATCAGCTTCATGGCCCCTCATGCGGGAGTGCACTCACCTGGTACCTACGACTAAAGATTGC
TCTTGAAGCTGCCAGCAGAGGACTGGAGCACCTGCATGAAAGCTGCAAGCCTGCAATAATCCACAGA
GACTTCAAGGCATCCAACATCCTCTTGGACGCCAGCTTCAATGCGAAGGTGTCCGACTTTGGTATAGC
GGTAGCTCTGGAGGAAGGTGGCGTGGTGAAAGACGACGTACAAGTGCAAGGCACCTTCGGGTACATT
GCTCCTGAGTACCTGATGGACGGGACATTGACAGAGAAGAGTGATGTTTACGGATTTGGAGTAGTATT
GCTTGAGCTGCTGACAGGCAGACTGCCCATTGATACGTCCTTACCACTCGGATCGCAATCTCTAGTGAC
ATGGGTAACACCCATACTAACTAACCGAGCAAAGCTGATGGAAGTTATCGACCCCACCCTTCAAGATA
CGCTGAACGTGAAGCAACTTCACCAGGTGGCCGCAGTGGCAGTCCTTTGCGTCCAAGCGGAACCCAGC
TACCGCCCTCTCATCGCCGACGTGGTTCAGTCACTGGCTCCGCTGGTGCCTCAAGAGCTCGGCGGCGC
ATTGCGA
>SEQIDNO：62
YSLLQTATNNFSSSNLLGEGSFGHVYKARLDYDVYAAVKRLTSVGKQPQKELQGEVDLMCKIRHPNLVAL
LGYSNDGPEPLVVYELMQNGSLHDQLHGPSCGSALTWYLRLKIALEAASRGLEHLHESCKPAIIHRDFKAS
NILLDASFNAKVSDFGIAVALEEGGVVKDDVQVQGTFGYIAPEYLMDGTLTEKSDVYGFGVVLLELLTGRL
PIDTSLPLGSQSLVTWVTPILTNRAKLMEVIDPTLQDTLNVKQLHQVAAVAVLCVQAEPSYRPLIADVVQSL
APLVPQELGGALR
>SEQIDNO：63
ACCTCAGATGCCTATAGGGGTATTCCACTCATGCCTCTCCTGAATCGTTTGAACTCCCGTATTTCCAAG
AAGAAGGGATGTGCAACTGCAATTGAATATTCTAAGCTGCAAGCAGCTACAAATAACTTCAGCAGCA
ATAACATTCTTGGAGAGGGTGGATTTGCGTGTGTATACAAGGCCATGTTTGATGATGATTCCTTTGCTG
CTGTGAAGAAGCTAGATGAGGGTAGCAGACAGGCTGAGCATGAATTTCAGAATGAAGTGGAGCTGAT
GAGCAAAATCCGACATCCAAACCTTGTTTCTTTGCTTGGGTTCTGCTCTCATGAAAATACACGGTTCTT
AGTATATGATCTGATGCAGAATGGCTCTTTGGAAGACCAATTACATGGGCCATCTCACGGATCTGCAC
TTACATGGTTTTTGCGCATAAAGATAGCACTTGATTCAGCAAGGGGTCTAGAACACTTGCATGAGCAC
TGCAACCCTGCAGTGATTCATCGAGATTTCAAATCATCAAATATTCTTCTTGATGCAAGCTTCAACGCC
AAGCTTTCAGATTTTGGTCTTGCAGTAACAAGTGCAGGATGTGCTGGCAATACAAATATTGATCTAGT
AGGGACATTGGGATATGTAGCTCCAGAATACCTACTTGATGGTAAATTGACAGAGAAAAGTGATGTCT
ATGCATATGGAGTTGTTTTGTTGGAGCTACTTTTTGGAAGAAAGCCAATTGATAAATCTCTACCAAGTG
AATGCCAATCTCTCATTTCTTGGGCAATGCCACAGCTAACAGATAGAGAAAAGCTCCCAACTATAGTA
GACCCCATGATCAAAGGCACAATGAACTTGAAACACCTATATCAAGTAGCAGCTGTTGCAATGCTATG
TGTGCAGCCAGAACCCAGTTACAGGCCATTAATAGCTGACGTTGTGCACTCTCTCATTCCTCTCGTACC
AATAGAACTCGGGGGAACTTTAAAGCTCTCTAATGCACGACCCACTGAGATGAAGTTATTTACTTCTTC
CCAATGCAGTGTTGAGATTGCTTCCAACCCAAAATTGTGA
>SEQIDNO：64
TSDAYRGIPLMPLLNRLNSRISKKKGCATAIEYSKLQAATNNFSSNNILGEGGFACVYKAMFDDDSFAAVK
KLDEGSRQAEHEFQNEVELMSKIRHPNLVSLLGFCSHENTRFLVYDLMQNGSLEDQLHGPSHGSALTWFLR
IKIALDSARGLEHLHEHCNPAVIHRDFKSSNILLDASFNAKLSDFGLAVTSAGCAGNTNIDLVGTLGYVAPE
YLLDGKLTEKSDVYAYGVVLLELLFGRKPIDKSLPSECQSLISWAMPQLTDREKLPTIVDPMIKGTMNLKH
LYQVAAVAMLCVQPEPSYRPLIADVVHSLIPLVPIELGGTLKLSNARPTEMKLFTSSQCSVEIASNPKL
>SEQIDNO：65
AATTCGGCACGAGGAGAACACTTGCACGAGCACTGCAACCCTGCAGTGATTCACCGAGATTTCAAATC
ATCAAATATTCTTCTTGATGCAAGCTTCAACGCCAAGCTTTCAGATTTTGGTCTTGCAGTAAAAAGTGC
AGGATGTGCTGGTAACACAAATATTGATCTAGTAGGGACATTGGGATATGTAGCTCCAGAATACATGC
TTGATGGTAAATTGACAGAGAAAAGTGATGTCTATGCATATGGAGTTGTTTTGTTAGAGCTACTTTTTG
GAAGAAAGCCAATTGATAAATCTCTACCAAGTGAATGCCAATCTCTCATTTCTTGGGCAATGCCACAG
CTAACAGATAGAGAAAAGCTCCCGACTATAATAGATCCCATGATCAAAGGCGCAATGAACTTGAAAC
ACCTATATCAAGTGGCAGCTGTTGCAGTGCTATGTGTGCAGCCAGAACCCAGTTACAGGCCATTAATA
GCTGACGTTGTGCACTCTCTCATTCCTCTCGTACCAGTAGAACTTGGGGGAACATTAAAGTCATCACCC
ACTGAGATGAAGTCATTTGCTTCTTCCCAATGCAGTGCCCACGTTGCTTC
>SEQIDNO：66
NSARGEHLHEHCNPAVIHRDFKSSNILLDASFNAKLSDFGLAVKSAGCAGNTNIDLVGTLGYVAPEYMLDG
KLTEKSDVYAYGVVLLELLFGRKPIDKSLPSECQSLISWAMPQLTDREKLPTIIDPMIKGAMNLKHLYQVAA
VAVLCVQPEPSYRPLIADVVHSLIPLVPVELGGTLKSSPTEMKSFASSQCSAHVAS
>SEQIDNO：67
ATGTTCTTGTTTCCTAAAACAGTTCCTATTTGGTTTTTTCATCTGTGTCTAGTAGCAGTTCATGCCATAC
AAGAAGACCCACCTGTCCCTTCACCATCTCCCTCTCTCATTTCTCCTATTTCAACTTCAATGGCTGCCTT
CTCTCCAGGGGTTGAATCGGAAATGGGAATCAAAGACCACCCCCAGCATGATGACCTCCACAGGAAA
ATAATCTTGTTGCTCACTGTTGCTTGTTGCATACTTGTTATCATCCTTCTTTCTTTGTGTTCTTGTTTCAT
TTACTATAAGAAGTCCTCACAAAAGAAAAAAGCTACTCGGTGTTCAGATGTGGAGAAAGGGCTTTCAT
TGGCACCATTTTTGGGCAAATTCAGTTCCTTGAAAATGGTTAGTAATAGGGGATCTGTTTCATTAATTG
AGTATAAGATACTAGAGAAAGGAACAAACAATTTTGGCGATGATAAATTGTTGGGAAAGGGAGGATT
TGGACGTGTATATAAGGCTGTAATGGAAGATGACTCAAGTGCTGCAGTCAAGAAACTAGACTGCGCA
ACTGATGATGCGCAGAGAGAATTTGAGAATGAGGTGGATTTGTTAAGCAAATTTCACCATCCAAATAT
AATTTCTATTGTGGGTTTTAGTGTTCATGAGGAGATGGGGTTCATTATTTATGAGTTAATGCCAAATGG
GTGCCTTGAAGATCTACTGCATGGACCTTCTCGTGGATCTTCACTAAATTGGCATTTAAGGTTGAAAAT
TGCTCTTGATACAGCAAGAGGATTAGAATATCTGCATGAATTCTGCAAGCCAGCAGTGATCCATAGAG
ATCTGAAATCATCGAATATTCTTTTGGACGCCAACTTCAATGCCAAGCTGTCAGATTTTGGTCTTGCTG
TAGCTGATAGCTCTCATAACAAGAAAAAGCTCAAGCTTTCAGGCACTGTGGGTTATGTAGCCCCAGAG
TATATGTTAGATGGTGAATTGACGGATAAGAGTGATGTCTATGCTTTTGGAGTTGTGCTTCTAGAGCTT
CTATTAGGAAGAAGGCCTGTAGAAAAACTGACACCAGCTCATTGCCAATCTATAGTAACATGGGCCAT
GCCTCAGCTCACTAACAGAGCTGTGCTTCCAACCCTTGTGGATCCTGTGATCAGAGATTCAGTAGATG
AGAAGTACTTGTTCCAGGTTGCAGCAGTAGCCGTGTTGTGTATTCAACCAGAGCCAAGTTACCGCCCT
CTCATAACAGATGTTGTGCACTCTCTCGTCCCATTAGTTCCTCTTGAGCTTGGAGGGACACTAAGAGTT
CCACAGCCTACAACTCCCAGAGGTCAACGACAAGGCCCATCAAAGAAACTGTTTTTGGATGGTGCTGC
CTCTGCT
>SEQIDNO：68
MFLFPKTVPIWFFHLCLVAVHAIQEDPPVPSPSPSLISPISTSMAAFSPGVESEMGIKDHPQHDDLHRKIILLLT
VACCILVIILLSLCSCFIYYKKSSQKKKATRCSDVEKGLSLAPFLGKFSSLKMVSNRGSVSLIEYKILEKGTNN
FGDDKLLGKGGFGRVYKAVMEDDSSAAVKKLDCATDDAQREFENEVDLLSKFHHPNIISIVGFSVHEEMG
FIIYELMPNGCLEDLLHGPSRGSSLNWHLRLKIALDTARGLEYLHEFCKPAVIHRDLKSSNILLDANFNAKLS
DFGLAVADSSHNKKKLKLSGTVGYVAPEYMLDGELTDKSDVYAFGVVLLELLLGRRPVEKLTPAHCQSIV
TWAMPQLTNRAVLPTLVDPVIRDSVDEKYLFQVAAVAVLCIQPEPSYRPLITDVVHSLVPLVPLELGGTLR
VPQPTTPRGQRQGPSKKLFLDGAASA
>SEQIDNO：69
GCTGCTGCGGTGAAGAGATTGGATGGTGGGGCTGGGGCACATGATTGCGAGAAGGAATTCGAGAATG
AGTTAGATTTGCTTGGAAAGATTCGGCATCCGAACATTGTGTCCCTTGTGGGCTTCTGTATTCATGAGG
AGAACCGTTTCATTGTTTATGAGCTGATAGAGAATGGGTCGTTGGATTCACAACTTCATGGGCCATCAC
ATGGTTCAGCTCTGAGCTGGCATATTCGGATGAAGATTGCTCTTGACACGGCAAGGGGATTAGAGTAC
CTGCATGAGCACTGCAACCCACCAGTTATCCATAGGGATCTGAAGTCATCTAACATACTTTTAGATTCA
GACTTCAGTGCTAAGATTTCAGATTTTGGCCTTGCGGTGATTAGTGGGAATCACAGCAAAGGGAATTT
AAAGCTTTCTGGGACTATGGGCTATGTGGCCCCTGAGTACTTATTGGATGGGAAGTTGACTGAGAAGA
GCGATGTATATGCGTTTGGGGTGGTACTTCTAGAACTTCTACTGGGAAGGAAACCTGTTGAGAAGATG
GCACAATCTCAATGCCAATCAATTGTTACATGGGCCATGCCTCAGCTAACTGATAGATCCAAACTCCCT
AACATAATTGATCCCATGATCAAGAACACAATGGATCTGAAACACTTGTACCAAGTTGCTGCAATGGC
TGTGCTCTGA
>SEQIDNO：70
AAAVKRLDGGAGAHDCEKEFENELDLLGKIRHPNIVSLVGFCIHEENRFIVYELIENGSLDSQLHGPSHGSA
LSWHIRMKIALDTARGLEYLHEHCNPPVIHRDLKSSNILLDSDFSAKISDFGLAVISGNHSKGNLKLSGTMG
YVAPEYLLDGKLTEKSDVYAFGVVLLELLLGRKPVEKMAQSQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIIDPMIKNT
MDLKHLYQVAAMAVL
>SEQIDNO：71
ACCCTCGGTTATGTAGCTCCTGAGTATCTGTTAGATGGTAAGTTAACAGAGAAAAGCGATGTGTATGG
GTTTGGAGTAGTGTTACTCGAGCTTCTGCTTGGGAAGAAGCCTATGGAGAAAGTGGCAACAACAGCAA
CTCAGTGCCAGATGATAGTCACATGGACCATGCCTCAGCTCACTGACAGAACGAAACTTCCGAATATC
GTGGATCCGGTGATCAGAAACTCCATGGATTTAAAGCACTTGTACCAGGTTGCTGCTGTGGCAGTATT
GTGTGTGCAGCCAGAACCGAGTTATCGGCCATTGATAACTGATATTTTGCATTCTCTTGTGCCCCTTGT
CCCTGTTGAGCTTGGTGGGACGCTCAGGAACTCGATAACAATGGCTACAACAACAATATCTCCTGAAA
GCTAA
>SEQIDNO：72
TLGYVAPEYLLDGKLTEKSDVYGFGVVLLELLLGKKPMEKVATTATQCQMIVTWTMPQLTDRTKLPNIVD
PVIRNSMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDILHSLVPLVPVELGGTLRNSITMATTTISPES
>SEQIDNO：73
CGGCACGAGGGGCTGGTGGCCATGATCGAGTACCCGTCGCTGGAGGCGGCGACGGGCAAGTTCAGCG
AGAGCAACGTGCTCGGCGTCGGCGGGTTCGGCTGCGTCTACAAGGCGGCGTTCGACGGCGGCGCCACC
GCCGCCGTGAAGAGGCTCGAAGGCGGCGAGCCGGACTGCGAGAAGGAGTTCGAGAATGAGCTGGACT
TGCTTGGCAGGATCAGGCACCCAAACATAGTGTCCCTCCTGGGCTTCTGCGTCCATGGTGGCAATCACT
ACATTGTTTATGAGCTCATGGAGAAGGGATCATTGGAGACACAACTGCATGGGCCTTCACATGGATCG
GCTATGAGCTGGCACGTCCGGATGAAGATCGCGCTCGACACGGCGAGGGGATTAGAGTATCTTCATGA
GCACTGCAATCCACCAGTCATCCATAGGGATCTGAAATCGTCTAATATACTCTTGGATTCAGACTTCAA
TGCTAAGATTGCAGATTTTGGCCTTGCAGTGACAAGTGGGAATCTTGACAAAGGGAACCTGAAGATCT
CTGGGACCTTGGGATATGTAGCTCCCGAGTACTTATTAGATGGGAAGTTGACCGAGAAGAGCGACGTC
TACGCGTTTGGAGTAGTGCTTCTAGAGCTCCTGATGGGGAGGAAGCCTGTTGAGAAGATGTCACCATC
TCAGTGCCAATCAATTGTGTCATGGGCCATGCCTCAGCTAACCGACAGATCGAAGCTACCCAACATCA
TCGACCCGGTGATCAAGGACACAATGGACCCAAAGCATTTATACCAAGTTGCGGCGGTGGCCGTTCTA
TGCGTGCAGCCCGAACCGAGTTACAGACCGCTGATAACAGACGTTCTCCACTCCCTTGTTCCTCTGGTA
CCCGCGGATCTCGGGGGGAACGCTCAGAGTTACAGAGCCGCATTCTCCACACCAAATGTACCATCCCT
CTTGAGAAGTGATCCTACAAGTTTCGTCGAAGCGGGGAAAGCGAATNTATACGGTCCAGCGGTAGATG
GCTGTTATTTTGGTACTTATATCTCACCCTGTCCTGCTGCTTATCTTAGGATGAGTGANGAGCTCCNAC
CTGCTGCTTTTGCTGGTTGGGCAGAGAGAATACAGTTCTGGTTAGGATTG
>SEQIDNO：74
RHEGLVAMIEYPSLEAATGKFSESNVLGVGGFGCVYKAAFDGGATAAVKRLEGGEPDCEKEFENELDLLG
RIRHPNIVSLLGFCVHGGNHYIVYELMEKGSLETQLHGPSHGSAMSWHVRMKIALDTARGLEYLHEHCNPP
VIHRDLKSSNILLDSDFNAKIADFGLAVTSGNLDKGNLKISGTLGYVAPEYLLDGKLTEKSDVYAFGVVLLE
LLMGRKPVEKMSPSQCQSIVSWAMPQLTDRSKLPNIIDPVIKDTMDPKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLI
TDVLHSLVPLVPADLGGNAQSYRAAFSTPNVPSLLRSDPTSFVEAGKANXYGPAVDGCYFGTYISPCPAAY
LRMSXELXPAAFAGWAERIQFWLGL
>SEQIDNO：75
ATGAAAGTGATTGGGAGAAAGGGTTATGTCTCTTTTATTGATTATAAGGTACTAGAAACTGCAACAAA
CAATTTTCAGGAAAGTAATATCCTGGGTGAGGGCGGGTTTGGTTGCGTCTACAAGGCGCGGTTGGATG
ATAACTCCCATGTGGCTGTGAAGAAGATAGATGGTAGAGGCCAGGATGCTGAGAGAGAATTTGAGAA
TGAGGTGGATTTGTTGACTAAAATTCAGCACCCAAATATAATTTCTCTCCTGGGTTACAGCAGTCATGA
GGAGTCAAAGTTTCTTGTCTATGAGCTGATGCAGAATGGATCTCTGGAAACTGAATTGCACGGACCTT
CTCATGGATCATCTCTAACTTGGCATATTCGAATGAAAATCGCTCTGGATGCAGCAAGAGGATTAGAG
TATCTACATGAGCACTGCAACCCACCAGTCATCCATAGAGATCTTAAATCATCTAATATTCTTCTGGAT
TCAAACTTCAATGCCAAGCTTTCGGATTTTGGTCTAGCTGTAATTGATGGGCCTCAAAACAAGAACAA
CTTGAAGCTTTCAGGCACCCTGGGTTATCTAGCTCCTGAGTATCTTTTAGATGGTAAACTGACTGATAA
GAGTGATGTGTATGCATTTGGAGTGGTGCTTCTAGAGCTACTACTGGGAAGAAAGCCTGTGGAAAAAC
TGGCACCAGCTCAATGCCAGTCCATTGTCACATGGGCCATGCCACAGCTGACTGACAGATCAAAGCTC
CCAGGCATCGTTGACCCTGTGGTCAGAGACACGATGGATCTAAAGCATTTATACCAAGTTGCTGCTGT
AGCTGTGCTATGTGTGCAACCAGAACCAAGTTACCGGCCATTGATAACAGATGTTCTGCACTCCCTCAT
CCCACTCGTTCCAGTTGAGTTGGGAGGGATGCTAAAAGTTACCCAGCAAGCGCCGCCTATCAACACCA
CTGCACCTTCTGCTGGAGGTTGA
>SEQIDNO：76
MKVIGRKGYVSFIDYKVLETATNNFQESNILGEGGFGCVYKARLDDNSHVAVKKIDGRGQDAEREFENEV
DLLTKIQHPNIISLLGYSSHEESKFLVYELMQNGSLETELHGPSHGSSLTWHIRMKIALDAARGLEYLHEHC
NPPVIHRDLKSSNILLDSNFNAKLSDFGLAVIDGPQNKNNLKLSGTLGYLAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGV
VLLELLLGRKPVEKLAPAQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPGIVDPVVRDTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPS
YRPLITDVLHSLIPLVPVELGGMLKVTQQAPPINTTAPSAGG
>SEQIDNO：77
ATGCCGCCGCCATCGCCGCTCCTCCGTTCCTCCGCCTTCGTCGTCTTGCTGCTCCTGGTGTGTCGCCCGT
TGTTGGTCGCCAATGGGAGGGCCACGCCGCCTTCTCCGGGATGGCCACCGGCGGCTCAGCCCGCGCTG
CAGCCTGCACCCACCGCCAGCGGCGGCGTGGCCTCCGTGCTTCCTTCGGCCGTGGCGCCTCCTCCCTTA
GGTGTGGTTGTGGCGGAGAGGCACCACCACCTCAGCAGGGAGCTCGTCGCTGCCATTATCCTCTCATC
CGTCGCCAGCGTCGTGATCCCCATTGCCGCGCTGTATGCCTTCTTGCTGTGGCGACGATCACGGCGAGC
CCTGGTGGATTCCAAGGACACCCAGAGCATAGATACCGCAAGGATTGCTTTTGCGCCGATGTTGAACA
GCTTTGGCTCGTACAAGACTACCAAGAAGAGTGCCGCGGCGATGATGGATTACACATCTTTGGAGGCA
GCGACAGAAAACTTCAGTGAGAGCAATGTCCTTGGATTTGGTGGGTTTGGGTCTGTGTACAAAGCCAA
TTTTGATGGGAGGTTTGCTGCTGCGGTGAAGAGACTGGATGGTGGGGCACATGATTGCAAGAAGGAAT
TCGAGAATGAGCTAGACTTGCTTGGGAAGATTCGACATCCGAACATCGTGTCCCTTGTGGGCTTCTGC
ATTCATGAGGAGAACCGTTTCGTTGTTTATGAGCTGATGGAGAGTGGGTCGTTGGATTCGCAACTTCAT
GGGCCATCACATGGTTCAGCTCTGAGCTGGCATATTCGGATGAAGATTGCTCTCGACACAGCAAGGGG
ATTAGAGTACCTGCATGAGCACTGCAACCCACCGGTTATCCATAGGGATCTTAAGTCATCTAACATAC
TTTTAGATTCAGACTTCAGCGCTAAGATTTCAGACTTTGGCCTGGCAGTGACTAGTGGGAATCACAGC
AAAGGGAATTTAAAGCTTTCTGGGACTATGGGCTATGTGGCTCCTGAGTACTTATTAGATGGGAAGCT
GACTGAGAAGAGCGATGTATACGCGTTTGGGGTAGTACTTCTAGAACTCCTGCTGGGAAGGAAACCTG
TCGAGAAGATGGCACAATCTCAGTGCCGATCAATCGTTACATGGGCCATGCCTCAGCTAACTGATAGA
TCCAAGCTCCCGAACATAATTGATCCCATGATCAAGAACACAATGGATCTGAAACACTTGTACCAAGT
TGCTGCAGTGGCCGTGCTCTGCGTGCAGCCAGAGCCGAGTTACAGGCCACTGATCACCGACGTGCTTC
ACTCACTGGTACCTCTAGTGCCCACGGAGCTTGGAGGAACGCTGAGGATCGGCCCGGAATCGCCCTAC
CTACGCTACTAA
>SEQIDNO：78
MPPPSPLLRSSAFVVLLLLVCRPLLVANGRATPPSPGWPPAAQPALQPAPTASGGVASVLPSAVAPPPLGVV
VAERHHHLSRELVAAIILSSVASVVIPIAALYAFLLWRRSRRALVDSKDTQSIDTARIAFAPMLNSFGSYKTT
KKSAAAMMDYTSLEAATENFSESNVLGFGGFGSVYKANFDGRFAAAVKRLDGGAHDCKKEFENELDLLG
KIRHPNIVSLVGFCIHEENRFVVYELMESGSLDSQLHGPSHGSALSWHIRMKIALDTARGLEYLHEHCNPPVI
HRDLKSSNILLDSDFSAKISDFGLAVTSGNHSKGNLKLSGTMGYVAPEYLLDGKLTEKSDVYAFGVVLLEL
LLGRKPVEKMAQSQCRSIVTWAMPQLTDRSKLPNIIDPMIKNTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLIT
DVLHSLVPLVPTELGGTLRIGPESPYLRY
>SEQIDNO：79
ATGTTGCTCGCGTGTCCTGCAGTGATCATCGTGGAGCGCCACCGTCATTTCCACCGTGAGCTAGTCATC
GCCTCCATCCTCGCCTCAATCGCCATGGTCGCGATTATCCTCTCCACGCTGTACGCGTGGATCCCGCGC
AGGCGGTCCCGCCGGCTGCCCCGCGGCATGAGCGCAGACACCGCGAGGGGGATCATGCTGGCGCCGA
TCCTGAGCAAGTTCAACTCGCTCAAGACGAGCAGGAAGGGGCTCGTGGCGATGATCGAGTACCCGTCG
CTGGAGGCAGCGACAGGGGGGTTCAGTGAGAGCAACGTGCTCGGCGTAGGCGGCTTCGGTTGCGTCT
ACAAGGCAGTCTTCGATGGCGGCGTTACCGCGGCGGTCAAGAGGCTGGAGGGAGGTGGCCCTGAGTG
CGAGAAGGAATTCGAGAATGAGCTGGATCTGCTTGGCAGGATTCGGCACCCCAACATCGTGTCCCTGC
TGGGCTTTTGTGTTCACGAGGGGAATCACTACATTGTTTATGAGCTCATGGAGAAGGGATCCCTGGAC
ACACAGCTGCATGGGGCCTCACATGGATCAGCGCTGACCTGGCATATCCGGATGAAGATCGCACTCGA
CATGGCCAGGGGATTAGAATACCTCCATGAGCACTGCAGTCCACCAGTGATCCATAGGGATCTGAAGT
CATCTAACATACTTTTAGATTCTGACTTCAATGCTAAGATTTCAGATTTTGGTCTTGCAGTGACCAGTG
GGAACATTGACAAGGGAAGCATGAAGCTTTCTGGGACCTTGGGTTATGTGGCCCCTGAGTACCTATTA
GATGGGAAGCTGACTGAAAAGAGTGACGTATATGCATTTGGAGTGGTGCTTCTTGAGCTACTAATGGG
AAGGAAGCCTGTCGAGAAGATGAGTCAAACTCAGTGCCAATCAATTGTGACGTGGGCCATGCCGCAG
CTGACTGACAGAACAAAACTTCCCAACATAGTTGACCCAGTGATCAGGGACACCATGGATCCAAAGC
ATTTGTACCAAGTGGCAGCAGTGGCAGTTCTATGTGTGCAACCAGAACCAAGTTACAGACCGCTGATT
ACTGATGTTCTCCACTCTCTTGTCCCTCTAGTCCCTGTGGAGCTCGGAGGGACACTGAGGGTTGTAGAG
CCACCTTCCCCAAACCTAAAACATTCTCCTTGT
>SEQIDNO：80
MLLACPAVIIVERHRHFHRELVIASILASIAMVAIILSTLYAWIPRRRSRRLPRGMSADTARGIMLAPILSKFN
SLKTSRKGLVAMIEYPSLEAATGGFSESNVLGVGGFGCVYKAVFDGGVTAAVKRLEGGGPECEKEFENEL
DLLGRIRHPNIVSLLGFCVHEGNHYIVYELMEKGSLDTQLHGASHGSALTWHIRMKIALDMARGLEYLHEH
CSPPVIHRDLKSSNILLDSDFNAKISDFGLAVTSGNIDKGSMKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTEKSDVYAFGV
VLLELLMGRKPVEKMSQTQCQSIVTWAMPQLTDRTKLPNIVDPVIRDTMDPKHLYQVAAVAVLCVQPEPS
YRPLITDVLHSLVPLVPVELGGTLRVVEPPSPNLKHSPC
>SEQIDNO：81
ATGAAGAAGAAGCTTGTGCTGCATCTGCTTCTTTTCCTTGTTTGTGCTCTTGAAAACATTGTTTTGGCCG
TACAAGGCCCTGCTTCATCACCCATTTCTACTCCCATCTCTGCTTCAATGGCTGCCTTCTCTCCAGCTGG
GATTCAACTTGGAGGTGAGGAGCACAAGAAAATGGATCCAACCAAGAAAATGTTATTAGCTCTCATTC
TTGCTTGCTCTTCATTGGGTGCAATTATCTCTTCCTTGTTCTGTTTATGGATTTATTACAGGAAGAATTC
AAGCAAATCCTCTAAAAATGGCGCTAAGAGCTCAGATGGTGAAAAAGGGAATGGTTTGGCACCATAT
TTGGGTAAATTCAAGTCTATGAGGACGGTTTCCAAAGAGGGTTATGCTTCGTTTATGGACTATAAGAT
ACTTGAAAAAGCTACAAACAAGTTCCATCATGGTAACATTCTGGGTGAGGGTGGATTTGGATGTGTTT
ACAAGGCTCAATTCAATGATGGTTCTTATGCTGCTGTTAAGAAGTTGGACTGTGCAAGCCAAGATGCT
GAAAAAGAATATGAGAATGAGGTGGGTTTGCTATGTAGATTTAAGCATTCCAATATAATTTCACTGTT
GGGTTATAGCAGTGATAACGATACAAGGTTTATTGTTTATGAGTTGATGGAAAATGGTTCTTTGGAAA
CTCAATTACATGGACCTTCTCATGGTTCATCATTAACTTGGCATAGGAGGATGAAAATTGCTTTGGATA
CAGCAAGAGGATTAGAATATCTACATGAGCATTGCAATCCACCAGTCATCCATAGAGATCTGAAATCA
TCTAATATACTTTTGGATTTGGACTTCAATGCAAAGCTTTCAGATTTTGGTCTTGCAGTAACTGATGCG
GCAACAAACAAGAATAACTTGAAGCTTTCGGGTACTTTAGGTTATCTAGCTCCAGAATACCTTTTAGAT
GGTAAATTAACAGATAAGAGTGATGTTTATGCATTCGGTGTTGTGCTGCTCGAACTTCTATTGGGACGA
AAGGCTGTTGAAAAATTATCACAACTCAGTGCCAATCTTAGGTCCATTTGGGCATAG
>SEQIDNO：82
MKKKLVLHLLLFLVCALENIVLAVQGPASSPISTPISASMAAFSPAGIQLGGEEHKKMDPTKKMLLALILAC
SSLGAIISSLFCLWIYYRKNSSKSSKNGAKSSDGEKGNGLAPYLGKFKSMRTVSKEGYASFMDYKILEKATN
KFHHGNILGEGGFGCVYKAQFNDGSYAAVKKLDCASQDAEKEYENEVGLLCRFKHSNIISLLGYSSDNDT
RFIVYELMENGSLETQLHGPSHGSSLTWHRRMKIALDTARGLEYLHEHCNPPVIHRDLKSSNILLDLDFNAK
LSDFGLAVTDAATNKNNLKLSGTLGYLAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLGRKAVEKLSQLSANL
RSIWA
>SEQIDNO：83
GGAGTGGGAATTGAGAAGCAGCCACCCACCCACCCACCCTATGGATAAAAATAGAAGGCTGTTGATA
GCACTCATTGTAGCTTCTACTGCATTAGGACTAATCTTTATCTTCATCATTTTATTCTGGATTTTTCACA
AAAGATTTCACACCTCAGATGTTGTGAAGGGAATGAGTAGGAAAACATTGGTTTCTTTAATGGACTAC
AACATACTTGAATCAGCCACCAACAAATTTAAAGAAACTGAGATTTTAGGTGAGGGGGGTTTTGGATG
TGTGTACAAAGCTAAATTGGAAGACAATTTTTATGTAGCTGTCAAGAAACTAACCCAAAATTCCATTA
AAGAATTTGAGACTGAGTTAGAGTTGTTGAGTCAAATGCAACATCCCAATATTATTTCATTGTTGGGAT
ATTGCATCCACAGTGAAACAAGATTGCTTGTCTATGAACTCATGCAAAATGGATCACTAGAAACTCAA
TTACATGGGCCTTCCCGTGGATCAGCATTAACTTGGCATCGCAGGATAAAAATTGCCCTTGATGCAGC
AAGAGGAATAGAATATTTACATGAGCAGCGCCATCCCCCTGTAATTCATAGAGATCTGAAATCATCTA
ATATTCTTTTAGATTCCAACTTCAATGCAAAGGTAAAACTTTTTATGTAGAAATTATACTAGGACTAGT
TTTCCCTCTATTAATCTTGTGTTGTGATTAATTTTAGCTGTCAGATTTTGGTCTTGCTGTGTTGAGTGGG
GCTCAAAACAAAAACAATATCAAGCTTTCTGGAACTATAGGTTATGTAGCGCCTGAATACATGTTAGA
TGGAAAATTAAGTGATAAAAGTGATGTTTATGGTTTTGGAGTAGTACTTTTGGAGCTGTTATTGGGAA
GGCGGCCTGTAGAAAAGGAGGCAGCCACTGAATGTCAGTCTATAGTGACATGGGCCATGCCTCAGCTG
ACAGATAGATCAAAGCTTCCAAACATTGTTGATCCTGTCATACAAAACACAATGGATTTAAAGCATNT
GTATCAGGTTGCTGCAGGTGCTCTATTATGTGTTCAGCCAGAGCCAAGCTATCGTCCCGTATAA
>SEQIDNO：84
GAGTATCAGTTATTGGAAGCTGCAACTGACAATTTTAGTGAGAGTAATATTTTGGGAGAAGGTGGATT
TGGATGTGTTTACAAAGCATGTTTTGATAACAACTTTCTCGCTGCTGTCAAGAGAATGGATGTTGGTGG
GCAAGATGCAGAAAGAGAATTTGAGAAAGAAGTAGATTTGTTGAATAGAATTCAGCATCCGGATATA
ATTTCCCTGTTGGGTTATTGTATTCATGATGAGACAAGGTTCATCATTTATGAACTAATGCAGAACGGA
TCTTTGGAAAGACAATTACATGGACCTTCTCATGGATCGGCTTTAACTTGGCATATCCGGATGAAAATT
GCACTTGATACAGCAAGAGCATTAGAATATCTCCATGAGAATTGCAACCCTCCTGTGATCCACAGAGA
TCTGAAATCATCCAATATACTTTTGGATTCTAATTTCAAGGCCAAGATTTCAGATTTTGGTCTTGCTGTA
ATTTCTGGGAGTCAAAACAAGAACAACATTAAGCTTTCAGGCACTCTTGGTTATGTTGCTCCAGAATAT
CTGTTAGATGGTAAATTGACTGACAAAAGTGATGTCTATGCTTTTGGGGTTATCCTTCTAGAACTCCTA
ATGGGAAGAAAACCTGTAGAGAAAATGACACGAACTCAGTGTCAATCTATCGTTACATGGGCCATGCC
TCAACTCACTGATAGATCAAAGCTACCAAACATTGTTGATCCTGTGATTAAAAACACAATGGATTTGA
AGCATTTGTTCCAAGTTGCTGCTGTAGCTGTACTGTGTGTACAACCAGAACCAAGTTACCGGCCATTAA
TCACAGATGTCCTTCACTCCCTCGTACCCCTTGTTCCTGTCGATCTTGGAGG
>SEQIDNO：85
EYQLLEAATDNFSESNILGEGGFGCVYKACFDNNFLAAVKRMDVGGQDAEREFEKEVDLLNRIQHPDIISL
LGYCIHDETRFIIYELMQNGSLERQLHGPSHGSALTWHIRMKIALDTARALEYLHENCNPPVIHRDLKSSNIL
LDSNFKAKISDFGLAVISGSQNKNNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVILLELLMGRKPVEKM
TRTQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIVDPVIKNTMDLKHLFQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSLVPLVP
VDLGG
>SEQIDNO：86
TGTGCTCATGATGAGACCAAACTACTTGTTTACGAACTTATGCACAATGGTTCGTTAGAAACTCAATTA
CACGGTCCTTCTTGTGGATCCAATTTAACATGGCATTGTCGGATGAAAATTGCGCTAGATATAGCGAG
AGGATTGGAATATTTACATGAACACTGCAAACCATCTGTGATTCATAGAGATTTGAAGTCATCTAACA
TCCTTTTGGATTCAAAATTCAATGCCAAGCTTTCGGATTTCGGTCTTGCTGTGATGAACGGTGCCAATA
CCAAAAACATTAAGCTTTCGGGGACGTTGGGTTACGTAGCTCCCGAGTATCTTTTAAATGGGAAATTG
ACCGATAAAAGTGACGTCTACGCATTCGGAGTTGTACTTTTAGAGCTTCTACTCAAAAGGCGGCCTGT
CGAAAAACTAGCACCATCCGAGTGCCAGTCCATCGTCACTTGGGCTATGCCGCAACTAACAGACAGAA
CAAAGCTTCCGAGTGTTATAGATCCCGTGATCAGGGACACGATGGATCTTAAACACTTGTATCAAGTG
GCGGCTGTGGCTGTGTTGTGTGTTCAACCGGAACCGGGATACCGGCCGTTGATAACCGACGTCTTGCA
TTCTCTGGTTCCTCTCGTGCCGGTTGAACTCGGAGGGACTCTACGAGTTGCGGAAACAGGTTGCGGCA
CAGTTGACTTATGA
>SEQIDNO：87
CAHDETKLLVYELMHNGSLETQLHGPSCGSNLTWHCRMKIALDIARGLEYLHEHCKPSVIHRDLKSSNILL
DSKFNAKLSDFGLAVMNGANTKNIKLSGTLGYVAPEYLLNGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLKRRPVEKLA
PSECQSIVTWAMPQLTDRTKLPSVIDPVIRDTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPGYRPLITDVLHSLVPLVPV
ELGGTLRVAETGCGTVDL
>SEQIDNO：88
TGGATTTGGATGCGTTTAAAAGCTCAACTCAATGATAACTTATTAGTTGCGGTCAAACGACTAGACAA
TAAAAGTCAAAATTCCATCAAAGAATTCCAGACGGAAGTGAATATTTTGAGTAAAATTCAACATCCAA
ATATAATTAGTTTGTTGGGATATTGCGATCATGATGAAAGCAAGCTACTTGTTTACGAATTGATGCAAA
ATGGTTCTTTAGAAACTCAGTTACATGGGCCTTCTTGTGGATCCAATTTAACATGGTATTGCCGGATGA
AAATTGCCCTAGATATAGCAAGAGGATTGGAATATTTACATGAACACTCCAAACCATCTGTGATTCAT
AGAGATCTCAAATCATCTAATATACTTCTTGATTCAAATTTCAATGCAAAGCTTTCGGATTTTGGTCTT
GCGGTGATGGAAGGTGCAAATAGCAAAAACATTAAACTTTCGGGGACATTGGGATACGTAGCACCCG
AATATCTTTTAGATGGGAAATTAACCGATAAAAGTGACGTGTATGCATTTGGAGTCGTACTTTTTGAGC
TTTTACTCAGAAGACGACACGTTGAAAAACTAGAATCATCACAATCCCGCCAATCTATTGTCACTTGG
GCGATGCCACTACTAATGGACAGATCGAAGCTTCCGAGTGTGATAGATCCTGTGATTAGGGATACAAT
GGATCTTAAACATCTTTATCAAGTGGCTGCGGTGGCGGTGTTGTGTGTTCAATCGGAACCGAGTTACCG
TCCGTTGATAACCGATGTTTTACATTCTCTTGTTCCTCTTGTCCCGGTTGAACTTGGAGGGACACTTAGA
GTTGTAGAAAAGAGTGTTGT
>SEQIDNO：89
WIWMRLKAQLNDNLLVAVKRLDNKSQNSIKEFQTEVNILSKIQHPNIISLLGYCDHDESKLLVYELMQNGS
LETQLHGPSCGSNLTWYCRMKIALDIARGLEYLHEHSKPSVIHRDLKSSNILLDSNFNAKLSDFGLAVMEG
ANSKNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLFELLLRRRHVEKLESSQSRQSIVTWAMPLLMD
RSKLPSVIDPVIRDTMDLKHLYQVAAVAVLCVQSEPSYRPLITDVLHSLVPLVPVELGGTLRVVEKSVV
>SEQIDNO：90
ATTCTTTTAGATGCAAACTTCAATGCCAAGCTTTCTGATTTTGGCTTGTCTGTCATTGTTGGAGCACAA
AACAAGAATGATATAAAGCTTTCCGGAACGATGGGTTATGTTGCTCCTGAATATCTTTTAGATGGTAA
ATTGACTGATAAAAGTGATGTCTATGCTTTTGGAGTTGTGCTTTTGGAGCTTCTTTTAGGAAGAAGGCC
TGTTGAAAAACTGGCACCATCTCAATGTCAATCCATTGTCACATGGGCTATGCCTCAACTCACTGATAG
ATCAAAGTTACCCGATATCGTTGATCCGGTGATCAGACACACAATGGACCCTAAACATTTATTTCAGG
TTGCTGCTGTCGCCGTGCTGTGTGTGCAACCAGAACCGAGCTATCGTCCCCTAATAACAGATCTTTTGC
ACTCTCTTATTCCTCTTGTTCCTGTTGAGCTAGGAGGTACTCACAGATCATCAACATCACAAGCTCCTG
TGGCTCCAGCTTAG
>SEQIDNO：91
ILLDANFNAKLSDFGLSVIVGAQNKNDIKLSGTMGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLGRRPVE
KLAPSQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPDIVDPVIRHTMDPKHLFQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDLLHSLIPL
VPVELGGTHRSSTSQAPVAPA
>SEQIDNO：92
GATGGGAAGCTCACCGAGAAAAGCGACGTGTACGCGTTTGGCATAGTGCTTCTTGAGCTGCTAATGGG
AAGGAAGCCTGTTGAGAAGTTGAGTCAATCTCAGTGCCAATCAATTGTGACTTGGGCCATGCCCCAAC
TGACAGACAGATCAAAACTTCCCAACATAATTGACCCAGTGATCAGGGACACAATGGATCCAAAGCA
CTTGTATCAGGTTGCAGCAGTGGCTGTTCTATGCGTGCAACCAGAACCGAGTTACAGACCACTGATAA
CGGATGTTCTCCACTCTTTAGTTCCTCTAGTGCCTGTGGAGCTTGGTGGGACACTAAGGGTTGCAGAGC
CACCGTCCCCAAACCAAAATCATTCTCCTCGTTGA
>SEQIDNO：93
DGKLTEKSDVYAFGIVLLELLMGRKPVEKLSQSQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIIDPVIRDTMDPKHLYQ
VAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSLVPLVPVELGGTLRVAEPPSPNQNHSPR
>SEQIDNO：94
GGGGTTCATGGCAAGAACAATATAAAACTTTCAGGAACTTTAGGATATGTCGCGCCGGAATACCTTTT
AGATGGTAAACTTACTGATAAAAGTGACGTTTATGCGTTTGGAGTTGTGCTTCTCGAGCTTTTGATAGG
ACGAAAACCCGTGGAGAAAATGTCACCATTTCAATGCCAATTTATCGTTACATGGGCAATGCCTCAGC
TAACGGACAGATCGAAGCTTCCTAATCTTGTGGATCCTGTGATTAGAGATACTATGGACTTGAAGCCC
TTATATCAAGTTGCGGCTGTAACTGTGTTATGTGTACAACCCGAACCAAGTTACCGCCCATTAATAACG
GATGTTTTGCATTCGTTCATCCCACTTGTACCTGCTGATCTTGGAGGGTCGTTAAAAGTTGTCGACTTTT
AA
>SEQIDNO：95
GVHGKNNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLIGRKPVEKMSPFQCQFIVTWAMPQLT
DRSKLPNLVDPVIRDTMDLKPLYQVAAVTVLCVQPEPSYRPLITDVLHSFIPLVPADLGGSLKVVDF
>SEQIDNO：96
ATCGTGTTCCATTTTGGTTGTTGTCTAAAGCTTTCAGATTTTGGTCTTGCTGTAATGGATGGAGCCCAG
AACAAAAACAACATCAAGCTTTCAGGGACATTGGGTTATGTAGCTCCAGAGTATCTTTTAGATGGAAA
ACTGACCGACAAAAGTGATGTATATGCATTTGGAGTTGTACTTTTAGAGCTTCTACTTGGAAGACGGC
CTGTAGAAAAACTGGCCGCATCTCAATGCCAATCTATCGTCACTTGGGCCATGCCACAGCTAACAGAC
AGATCAAAGCTCCCAAATATTGTCGATCCTGTAATCAGATATACGATGGATCTCAAACACTTGTACCA
AGTTGCTGCCGTGGCAGTGCTGTGTGTGCAACCAGAGCCAAGTTACCGGCCATTAATAACCGATGTTT
TGCATTCTCTTATCCCTCTTGTTCCGGTGGAGCTCGGGGGAACTCTAAAAGCTCCACAAACAAGGTCTT
CGGTAACAAATGACCCGTGA
>SEQIDNO：97
IVFHFGCCLKLSDFGLAVMDGAQNKNNIKLSGTLGYVAPEYLLDGKLTDKSDVYAFGVVLLELLLGRRPV
EKLAASQCQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIVDPVIRYTMDLKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSLIP
LVPVELGGTLKAPQTRSSVTNDP
>SEQIDNO：98
CGTGGATCAACTTTAAGTTGGCCTCTCCGAATGAAAATTGCTTTGGATATTGCAAGAGGATTAGAATA
CCTTCACGAGCGTTGCAACCCCCCTGTGATCCATAGGCATCTCAAATCGTCTAATATTCTTCTTGATTC
CAGCTTCAACGCAAAGATTTCTGATTTTGGCCTTTCTGTAACTGGCGGAAACCTAAGCAAGAACATAA
CCAAGATTTCGGGATCACTGGGTTATCTTGCTCCAGAGTATCTCTTAGACGGTAAACTAACTGATAAG
AGTGATGTGTATGGTTTTGGCATTATTCTTCTAGAGCTTTTGATGGGTAAAAGGCCAGTGGAGAAAGT
GGGAGAAACTAAGTGCCAATCAATAGTTACATGGGCTATGCCCCAGCTTACGGACCGATCAAAGCTTC
CGAATATTGTTGACCCTACGATCAGGAACACAATGGATGTTAAGCATTTATATCAGGTTGCGGCTGTA
GCTGTGTTATGTGTGCAACCGGAGCCAAGCTATAGGCCATTGATAACTGATGTACTACACTCCTTCATT
CCACTTGTACCAAATGAACTCGGGGGGTCGCTTAGGGTAGTGGATTCTACTCCCCATTGCTCATAG
>SEQIDNO：99
RGSTLSWPLRMKIALDIARGLEYLHERCNPPVIHRHLKSSNILLDSSFNAKISDFGLSVTGGNLSKNITKISGS
LGYLAPEYLLDGKLTDKSDVYGFGIILLELLMGKRPVEKVGETKCQSIVTWAMPQLTDRSKLPNIVDPTIRN
TMDVKHLYQVAAVAVLCVQPEPSYRPLITDVLHSFIPLVPNELGGSLRVVDSTPHCS
>SEQIDNO：100
TTAGATAATGGCGGACCCGATTGTCAACGAGAATTCGAGAATGAGGTTGATTTGATGAGTAGAATTAG
GCATCCAAATGTGGTTTCTTTATTGGGTTATTGCATTCATGGAGAAACCAGGCTTCTTGTCTATGAAAT
GATGCAAAACGGGACGTTGGAATCGCTATTGCATGGACCATCACATGGATCCTCACTAACTTGGCACA
TTCGTATGAAGATCGCCCTCGACACAGCAAGAGGCCTCGAGTATCTGCATGAACACTGCGACCCCTCT
GTGATCCACCGTGACCTGAAGCCTTCTAACATTCTTTTGGATTCCAACTACAATTCCAAGCTCTCAGAC
TTTGGTCTTGCAGTCACTGTTGGAAGCCAGAATCAAACCAACATTAAGATTCTAGGGACACTGGGTTA
CCTTGCACCAGAGTACGTTTTGAATGGCAAATTGACAGAGAAAAGTGATGTGTTTGCTTTTGGAGTTGT
CCTGTTGGAGCTTCTCATGGGCAAGAAACCAGTGGAGAAGATGGCATCCCCTCCATGCCAATCCATTG
TCACATGGGCGATGCCTCATCTTACTGACAGAATTAAGCTTCCAAATATCATTGATCCTGTTATTAGAA
ACACCATGGATCTGAAACACTTGTACCAGGTTGCAGCTGTTGCTGTTCTCTGCGTACAACCAGAGCCCC
AGTTATCGTCCTCTGATAACTGA
>SEQIDNO：101
LDNGGPDCQREFENEVDLMSRIRHPNVVSLLGYCIHGETRLLVYEMMQNGTLESLLHGPSHGSSLTWHIR
MKIALDTARGLEYLHEHCDPSVIHRDLKPSNILLDSNYNSKLSDFGLAVTVGSQNQTNIKILGTLGYLAPEY
VLNGKLTEKSDVFAFGVVLLELLMGKKPVEKMASPPCQSIVTWAMPHLTDRIKLPNIIDPVIRNTMDLKHL
YQVAAVAVLCVQPEPQLSSSDN
>SEQIDNO：102
TCGGCTCGGCCCAGAACAAGATCGCAAGAC
>SEQIDNO：103
CTACATTCTCTCCTCGTATTATTCCTCGTTGACT
>SEQIDNO：104
ACTTTCAGATGAGTGGATCATAACCCTATACA
>SEQIDNO：105
AGATACAATGGATCTCAAACACTTATACCAG
>SEQIDNO：106
AAAGGATCCATGGGAAGTGGTGAAGAAGATAGATTTGATGCT
>SEQIDNO：107
TTTCTGCAGTCTGTGAATCATCTTGTTAACCGGAGAGTCC
>SEQIDNO：108
TCTGAGTTTTAATCGAGCCAAGTCGTCTCA
>SEQIDNO：109
TATCCCGGGAAAATGAGAGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCATTTTCAGTC
>SEQIDNO：110
TTTGGATCCTGTGAATCATCTTGTTAACCGGAGAGTCC
>SEQIDNO：111
ATACCCGGGTCTGTGTCAGGAATCCAAATGGGAAGTGGTGA
>SEQIDNO：112
AAAGGATCCTCTGTGTCAGGAATCCAAATGGGAAGTGGTGA
>SEQIDNO：113
AAATCTAGACTGTGAATCATCTTGTTAACCGGAGAGTCC
>SEQIDNO：114
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GAATCCAAATGGGAAGTGGTGAAGAAGATAGATTTGATGCTCATAAGAAACTTCTGATTGGTCTCATA
ATCAGTTTCTCTTCTCTTGGCCTTATAATCTTGTTCTGTTTTGGCTTTTGGGTTTATCGCAAGAACCAAT
CTCCAAAATCCATCAACAACTCAGATTCTGAGAGTGGGAATTCATTTTCCTTGTTAATGAGACGACTTG
GCTCGATTAAAACTCAGAGAAGAACTTCTATCCAAAAGGGTTACGTGCAATTTTTCGATATCAAGACC
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GGGCTCTGCAAGCGAAATCAACTCGAGTTTCATCGTTTATGAGCTTATGGAGAAAGGATCATTAGATG
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AACATGGCAAGAACAACATTAAACTCTCTGGGACACTTGGTTATGTTGCCCCGGAATACCTCCTTGAC
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TACCAGGTAGCAGCCATGGCTGTGTTGTGCGTGCAGCCAGAACCAAGTTACCGGCCGTTGATAACCGA
TGTTCTTCACTCACTTGTTCCACTGGTTCCGGTAGAGCTAGGAGGGACTCTCCGGTTAACAAGATGATT
CACAG
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TGTTCATACACTTAATACTCGCTGTTTTGAATTGATGTTTTAGGAATATATATGTAGAGAGAGCTTCCT
TGAGTCCATTCACAGGTCGTGATATGATTCAATTAGCTTCCGACTCATTCATCCAAATACCGAGTCGCC
AAAATTCAAACTAGACTCGTTAAATGAATGAATGATGCGGTAGACAAATTGGATCATTGATTCTCTTT
GATTGGACTGAAGGGAGCTCCCTCTCTCTTTTGTATTCCAATTTTCTTGATTAATCTTTCCTGCACAAAA
ACATGCTTGATCCACTAAGTGACATATATGCTGCCTTCGTATATATAGTTCTGGT
>SEQIDNO：149
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TGTTCATACACTTAATACTCGCTGTTTTGAATTGATGTTTTAGGAATATATATGTAGGACGACTTGGCT
CGATTAAAATCACAGGTCGTGATATGATTCAATTAGCTTCCGACTCATTCATCCAAATACCGAGTCGCC
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GATTTTAATCGAGCCAAGTCGTCCTCTCTTTTGTATTCCAATTTTCTTGATTAATCTTTCCTGCACAAAA
ACATGCTTGATCCACTAAGTGACATATATGCTGCCTTCGTATATATAGTTCTGGT
>SEQIDNO：150
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CTTTAGAAGTCCTCTCTAAATTCTTTCTTCCGATCTCCTAAATATGTTTTGTTTTGGTCAAATAAATTGA
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CATCTGTACCCATCTTTGATCATTGACAAAATATATATTAGAATGGCCTTAGAACGTGTTAGGCATCTT
CCTACTATTATCATATTACCTAATCCCCAATTTTATTACATTTTTTAATTTCTAAAAGAGCTTGAATATA
ATGTCATTTCGAATATCTCTGTTCATCTTTTTTTTTTTCTGTGCGACTTCTGACCCAAAGCCTTCGACGA
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GTTCCATTGATACAATAATGAGATTTTTGTACATTAACGCTTTCATATAGTTTTTGCGATTCAACAGAT
AATCTTAAAATTAAGGAGTCCTATTGATAAAGTCTTGTTCAAACGTACAAACTCAATCCACACAAAAC
CTTCATAAAATACGATATAGGAAATAAAGATTGTTTTTGCGTGAGAAAATACTATATGAACTCAAAAG
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TTTTTTCTGAAATTCTTCAAGGAAACTTATAGCTTAAAATCTACACTTCAAATACTCTGTTTTAAAGGC
ATTAAAAATAACTGCGTTTCAGAAAAATATTGAAATTTTAGCTGATCTTTTGCTACAAATTTAAGGAAT
CTTGGCACCTGCAGAATCTATAACATGTTCATTAAGTAATGCAATAGTTATACAATTATACATTATTTG
CATCATACTTATATTATAGTGATATTAACAAACCCATGTTCTCAGCACACTTTTACGTAGAAAAACATA
AAAACCCAAATAGGAAGAAGCCACTCATAAGGATAATGGGTTTATATAATTCACAGCAAAGAAAGCC
ATCGAACTATTCGATTAATTATCCATTCTTTTTTTTTTTAGTTTGAATGTATAAGAACAAAGAGTTGTTA
CGCATCATGACAATGTCTTAGAAAACAAAAGAAATGAATAAAAAAGTAAAACGAAAAATAAAAAGTG
AGGATGAAGTTGTTGAATGAGTTGGCGAGGCGGCGACTTTTTCATACATTCCATTTACTTAATTCCTAA
AGTCCTTCTCACATCTCTTTGTTATATAATGACACCATAACCATTTCTTCTCTTCACAATCTTTACAAGA
ATATCTCTCTTCTACAGTAAACAAAAA
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CATCAAGATTCCGGATGCTGAGAGTGGGACTTCATCATTTTCAATGTTTGTGAGGCGGCTAAGCTCAAT
CAAAACTCAGAGAACATCTAGCAATCAGGGTTATGTGCAGCGTTTCGATTCCAAGACGCTAG
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CGCCGGACCCCCCACGGCGGCAAGGGCCGCGGCCGGAGATCAGGGATCACACTGGTGCCAATCCTGA
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CCCTTGTTTTAGCTTTAATCATTGTTATTTGTTGTCTGAGGGGCTACACTGTTTCTTTATATTGGTGAAG
GAGTTACCAGGCAAAAATTCCCACCTCCTGATATTAGCAGAGACCCCCTTTTTTGTGCCTGTATGCATA
CTAACAAATAATACAGATGGAAATATGTATATTTGTTATATCATGGATTGATGCTTTATGTTTAGCAAG
TCCATGCAATGGTAGTCAAAAGATGTAAACTTTTGAATGATATATTGGGGCTTTAGATTAGCCATTTTT
ACCCTCACTTGAAAATGACAATTTTGCCCTTCCGATCTACTTTCTCTTGTCACCTCAGGCAGGCTCTTGA
AAGTTCTTATCCCTGAATTCCGTGGAAGTTTATTATTCTAATGTTATAGTTTACTTAAAGTGTCGCATAA
TCTACTAGAGCCTAATGGAAGTACTGATGGACTTTGTTTTGCTACAATCACTGCTTGCAAGAATGACTA
CTTTGGGGCATTTCTAATATATTATTGATATTTCTATGATGTATTGTTGTCCATGTACTTCAGTCCTTAC
AGCGACTAGTCCTATTTCTGCATTGATAAATTGTTCACTGTCAGACCATCTTGAGTGGCAAGAATGAGT
ATAACATGTCTTGTTTTTCTGTGATTTCAAGGTAAGCGCACATGCGCACAGTGTACACCGTCACCACAT
GTGAGTACACCCCCTAGTACACATGTAAAAAAAGCACAGTCCAGTTATTAAATGGACCATTGGCATTG
ATTGTCGTGTTTATAGGAGTAAAGATACATGTAAACACTAATTCATTGGGAGATATAAATTTATACTAC
CATTGAATGTGACATAGGCTCTAAGGTTTTTAGTTCAGCATTTCGAAAGAGCTTTGTTTGGTTGGCTTG
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CCCGCGGCTCCAGATCACGGCAAGCGCGCCCGCCGCCCGCTGCTGCGCTGCGCTGCACGTCCCGCCCT
GACGCCACGCCACGCCAAGCGCGACACGACACGACACGACACGACCCGACCCCCGCCAACGAAACGC
CGAAACGCGGCAACGCGTGACGGGCGCGCATGGTCGATGCTCTACCCGCGCGTCCGCCCCACGCCAAT
CTCCCGGCGGGTCCCTCGTGGGACGGGGAACGCGATGCGGCTGCAGGCTGCGACCGCGACCGCGACC
GCGACCGCGCCCACGTGAAGGCAGGCAGGCAGCCCCGGAGCGGGCGCGGCGGTGGGCCAACGACGC
GTTGCCGTCGCGAATCTTCTTCTGGCCACGGCCAAGGGCCAATCGCCCGCTCCGCTCCGCTCCGCACTC
CGCCTCCGCTAGGGAATATGGAACCCGATCCCACGGCCCTCTGGGTCTGGTCGACGGGTCCTCTCGCC
GTGGCAGCTGCTTCCCGGACCGGAGGATCGCTGAGCGCGGACGCCACTGCCATTGCCGTCCGACTATA
GTTGTTAATTACCATAAAATAATTTGTTAACGATAAAACCCGTGTCAGGCACCGTCGTCTGGACGCTGC
TATGGGATAACCATTCGCGTACGTCGGTTGTATGGGTGGGATCCTCTGCGGCACGCCATTCTGGTGCTG
CTAGTGGAATAGACAAAAAAAGGGCCGACGGTGTTTGCTCGTGGCAGGCCACACAGAGTGACAACCA
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TTGGAAGAATATATTTAAACATGGGCTTGTAAAACTTGGCTGTAAAGATTTGGAATTTAGGATCTTGG
AGCCCCAAAACTGTATAAACTTGCTTAGGGACCCGTGTCTTGTGTGTTGCAGACCAAAAAATTTAGAA
AGCATCTAAACACCTATTTGAATGTAAAGTTTACAGCCAAAAGTTTTAGGATGTAAAGATTTGGGATC
TAAAAGTAGTCATTAGGAAATAACACGTTAGAGAGAGAGAGTAGATCTTCTTATTGGTTTCTCATGCA
CTAATCGAACCAATCACTGGACCACTTGAACCAAACTTTATCACATTGAACTTTGTCAGTTCAGTTCGA
ACGCAGGACTGGAGCTGCCCTTAAGGCCAATTGCTCAAGATTCATTCAACAATTGAAACATCTCCCAT
GATTAAATCAGTATAAGGTTGCTATGGTCTTGCTTGACAAAGTTTTTTTTTTGAGGGAATTTCAACTAA
ATTTTTGAGTGAAACTATCAAATACTGATTTTAAAAATTTTTTATAAAAGGAAGCGCAGAGATAAAAG
GCCATCTATGCTACAAAAGTACCCAAAAATGTAATCCTAAAGTATGAATTGCATTTTTTTTGTTTGGAC
GAAAGGAAAGGAGTATTACCACAAGAATGATATCATCTTCATATTTAGATCTTTTTTGGGTAAAGCTT
GAGATTCTCTAAATATAGAGAAATCAGAAGAAAAAAAAACCGTGTTTTGGTGGTTTTGATTTCTAGCC
TCCACAATAACTTTGACGGCGTCGACAAGTCTAACGGACACCAAGCAGCGAACCACCAGCGCCGAGC
CAAGCGAAGCAGACGGCCGAGACGTTGACACCTTCGGCGCGGCATCTCTCGAGAGTTCCGCTCCGGCG
CTCCACCTCCACCGCTGGCGGTTTCTTATTCCGTTCCGTTCCGCCT
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GCACATAAGAAACTCCTGATTGGTCTTATAATCAGTTCCTCTTCTCTTGGTATCGTAATC
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CTAACATGGCATATGCGTATGAAGATTGCTCTAGATACAGCTAGAGGATTAGAGTATCTC
CATGAACATTGTCGTCCACCAGTTATCCACAGGGACCTGAAATCGTCTAATATACTTCTT
GATTCTTCCTTCAATGCCAAGATTTCAGATTTTGGTCTGGCTGTATCGGTTGGAGTGCAT
GGGAGTAACAACATTAAACTCTCTGGGACACTTGGTTATGTTGCCCCGGAATATCTCCTA
GACGGAAAGTTGACGGATAAGAGTGATGTCTATGCATTTGGGGTGGTTCTTCTTGAACTT
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TGGGCAATGCCACAACTTACCGATAGATCGAAACTCCCAAACATCGTGGATCCGGTTATA
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CGCTCCTCCCGTCGTGAT
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Claims (9)

1.一种制备转基因植物的方法，包含使用载体来转化植物、植物组织培养物、或植物细胞，载体中含有一种核酸构建物能够抑制PK220基因的表达或活性，从而获得PK220表达或活性水平降低的植物、组织培养物或植物细胞。从植物组织培养物或植物细胞中培育或再生所述的植物，其中水分利用效率提高的植物被制备。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述的核酸构建体包含一个编码PK220多肽的核酸序列的反义序列。
3.根据权利要求1的方法，其中，所述的核酸构建体包含一个组成型启动子，诱导型启动子或组织特异性启动子。
4.根据权利要求3的方法，其中，组织特异性启动子是一个根启动子。
5.根据权利要求1的方法，其中核酸构建体包含长度至少为21个核苷酸的PK220序列或其互补序列。
6.由权利要求1-5中任一方法制备的植物。
7.一种转基因种子，由权利要求6所述的转基因植物制备，其中，所述的种子产生的植物具有相对于野生型植物增加的水分利用效率。
8.一种植物，该植物在PK220基因中具有一个非天然存在的突变，其中，所述的植物具有降低的PK220表达或活性，并且所述的植物相对于野生型对照，具有提高的水分利用效率。
9.一种种子，由权利要求8所述的转基因植物制备，其中，所述的种子产生的植物具有相对于野生型植物增加的水分利用效率。
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Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20110928

Assignee: Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd.

Assignor: Performance Plants Inc.

Contract record no.: 2012990000670

Denomination of invention: Methods and means of increasing the water use efficiency of plants

License type: Exclusive License

Record date: 20120912

LICC Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model
GR01 Patent grant
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