CN102199542A - 一种具鞘微鞘藻的纯化分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具鞘微鞘藻的纯化分离方法。在荒漠中取藻结皮，用PVC管取样运回实验室进行培养；取藻结皮在已灭菌培养皿中用无菌蒸馏水浸泡后，在体式显微镜下将具鞘微鞘藻藻体剥离并挑出，取出的藻体在显微镜下观察鉴定，确定是具鞘微鞘藻后将其放入无菌培养皿中；将具鞘微鞘藻藻体经研磨、稀释后，在体式显微镜下用巴斯德吸管将所观察到的单根藻丝迅速吸出，在BG₁₁固体培养基中进行培养。培养2-3周后，在长出的具鞘微鞘藻藻落中用无菌镊子取出在显微镜下镜检后，如无污染，即可转移到已灭菌的BG₁₁液体培养基中。本发明解决了具鞘微鞘藻的纯化分离问题，对应用于沙漠生物结皮和防风固沙提供可行的生物材料，具有广阔的应用领域。

Description

一种具鞘微鞘藻的纯化分离方法

发明领域

本发明涉及荒漠苔藓培养与保存的生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种具鞘微鞘藻的纯化分离技术领域。

背景技术

近年来，我国荒漠化越来越严重，是世界上沙漠化最严重的国家之一，沙漠化土地总面积已达373万平方公里，年扩展率为2460平方公里，每年因沙漠化造成的直接经济损失高达540亿元。针对这严重的现状，寻求有效的途径防止土地资源沙化已是当务之急。

传统的防风固沙措施如植树造林、草方格沙障和粘土沙障表面上看是有效的，但不能从根本上解决沙化和沙漠化土地的治理问题。主要是高等植物生长缓慢，生长周期长，另外，每棵高等植物都相当于一个大型的抽水泵，将地下水通过蒸腾释放到大气中，从而使本已贫乏的地下水更加贫乏。特别是大于100cm较深层的土壤的含水量下降明显，深根系固沙植物对根际区域水分的利用，进一步恶化了固沙区土壤深层的水分状况，进而抑制了这些植物的生长和生存。

生物结皮作为干旱荒漠地区特殊环境的产物，是由苔藓植物、细菌、真菌、蓝绿藻、地衣与土壤形成的有机复合体。生物结皮在其发育过程中，积极参与土壤的形成，具有改变土壤理化性质、增加土壤有机质含量的功能，对土壤抗侵蚀性能的提高有着显著功效。土壤生物结皮抗逆性强，具有光合、生物固氮两大生理功能，光能利用率远高于高等植物，能够有效的利用光能资源，可以在干旱、严寒、盐碱、土壤贫瘠的恶劣的环境下发育生长，形成5-50mm厚的地表覆盖物，从而增强地表的稳定性，有效地减小荒漠地表的侵蚀，在防风、固沙、防止土壤侵蚀、改变水分分布状况等方面起着重要作用。

土壤生物结皮在干旱半干旱地区分布广泛，特别是在维管植物难以生存地区，对当地土地资源维持和生态环境保护具有重要意义。生物结皮对于荒漠干旱半干旱地区具有诸多功能：固氮作用，为荒漠植物和土壤微生态系统提供氮素；把金属螯合态转变为植物可吸收形态；提高土壤积聚能力，降低风蚀和沙土流失；构建一个粗糙表面，从而可以捕获水分或者养分含量丰富颗粒。这些功能决定了其在沙漠修复和植被管理中的重要作用。但沙漠生物结皮极易遭受破坏，一旦遭到破坏，会加速沙漠化进程。根据结皮大小，一块完整结皮自然恢复时间从几年到十几年不等，周期漫长。

具鞘微鞘藻是蓝藻门中一种丝状藻类，该物种极端耐旱，广泛存在于世界各大荒漠中，同时也是荒漠地区藻结皮的优势物种。作为荒漠植被演替过程中的先锋拓殖生物，具鞘微鞘藻能在高温、干旱、高pH、盐碱、高紫外辐射等极端环境下生长、繁殖，并利用藻丝体对沙粒的捆绑作用和分泌的多糖对沙粒的黏结作用使松散的沙面形成一个有机的整体，对生物结皮的形成和发育产生重要的生态学效应。为此，藻类学家和生态学家将具鞘微鞘藻作为一个模式物种对其开展了多方面的研究。在对生物结皮的研究中，尤其是利用具鞘微鞘藻接种人工生物结皮，连续对具鞘微鞘藻进行继代培养，将导致具鞘微鞘藻的活力降低，抵制各种恶劣环境的能力明显下降，因此，该藻种需经常从荒漠环境中纯化进行物种更新。所以，具鞘微鞘藻的纯化分离是开展以上研究的基础和关键。

经检索，已有的研究结果表明，有关具鞘微鞘藻的纯化分离生物技术在国内外还未见报道。因此，探索和研究具鞘微鞘藻的纯化分离，有利于利用具鞘微鞘藻开展各种研究，对应用于沙漠生物结皮和防风固沙有着极为重要的理论和实践意义。

发明内容

针对国内外未见有关具鞘微鞘藻纯化分离的技术现状，由于具鞘微鞘藻藻丝外面包被较厚的鞘，而且具有黏性，容易粘附一些单细胞或个体较小的藻类，分离纯化具有一定的难度。本发明的目的在于提供一种具鞘微鞘藻的纯化分离方法，本发明提供的方法简便易行，可操作性强，成功地解决了具鞘微鞘藻的纯化分离问题，对应用于沙漠生物结皮和防风固沙提供可行的生物材料。

本发明具体提供一种具鞘微鞘藻的纯化分离方法，步骤纯化分离步骤包括：

(1)取样：准备直径是20cm，高10cm的PVC管，在荒漠环境中取发育良好的藻结皮，用PVC管取样，底部用铁片和胶带封住，运回实验室。

(2)室内培养：将采集的藻结皮置于光照培养架上进行培养备用，培养条件，光照强度36-54μmol·m^-2·s^-1，光照/黑暗时间是14h/10h。

(3)灭菌：将接种所用到的镊子、解剖针、培养皿、研钵、载玻片、盖玻片、双凹载玻片、巴斯德吸管和无菌蒸馏水一并灭菌，制备无菌BG₁₁固体培养基并将其倒入5-6个固体培养皿。

(4)藻丝挑取：取藻结皮，先用无菌蒸馏水浸泡1h，然后将藻结皮放入已灭菌培养皿中，加无菌蒸馏水使藻结皮能完全浸泡，将培养皿置于体式显微镜下，用无菌尖头镊子和解剖针将一些具鞘微鞘藻藻体与藻结皮剥离并挑出，放进另一个无菌培养皿中，并加5-10ml无菌蒸馏水。

(5)藻体鉴定：将取出的藻体放在载玻片上制成临时装片，在显微镜下观察鉴定，确定是具鞘微鞘藻后将其放入无菌培养皿中。

(6)研磨：将具鞘微鞘藻藻体转移至灭菌的研钵中，加3-5ml无菌蒸馏水，轻微研磨，将藻丝和胶鞘分离开来，形成均匀的藻液。

(7)接种：取1ml藻液，用无菌蒸馏水稀释10倍，按照通常一滴为50μl计，用移液器吸取一滴至已灭菌双凹载玻片上，再加0.5ml无菌蒸馏水稀释，反复稀释几次，直至载玻片凹槽中含2-5根藻丝，然后取一滴至另一凹槽内，用巴斯德吸管在酒精灯上烧热拉成极细的针头。将另一凹槽的藻液移至体式显微镜的视野中，将显微镜调至最高倍，在视野中找到一根藻丝；然后将巴斯德吸管装上胶头，把吸管的针头移至视野中藻丝上方，将所观察到的藻丝迅速吸出，转移到盛有BG₁₁固体培养基的平板中；其余稀释的藻液可吸取0.5ml转移至其它固体培养基平板中。最后将培养皿用parafilm封口，在光照培养箱内培养，培养条件：光照强度是50μmol·m^-2·s^-1，温度为25℃，光照/黑暗时间是16h/8h。

(8)转移培养基：培养2-3周后，在长出的具鞘微鞘藻藻落中用无菌镊子取出，制成临时装片，在显微镜下进一步观察，无污染的藻类和细菌，即可转移到已灭菌的BG₁₁液体培养基中；如有污染，应重复上述步骤(6)、(7)，进一步纯化。

本发明中，每升BG₁₁培养基组分如下：NaNO₃ 1.5g，，K₂HPO₄ 0.04g，MgSO₄0.07g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，Citric acid 0.006g，Ferric ammonium citrate 0.006g，Na₂EDTA 0.001g，Na₂CO₃ 0.02g，微量元素A₅溶液1mL，琼脂粉添加量为15g·L^-1，其中，A₅溶液组分：每升重蒸水中加入H₃BO₃ 2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.86g，ZnSO₄·7H₂O 0.22g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g，CuSO₄·5H₂O 0.08g，Co(NO₃)₂·6H₂O0.05g。

通过实施本发明具体的技术内容，可以达到以下有益效果。

1、本发明提供一种具鞘微鞘藻的纯化分离方法，本发明提供的方法简便易行，可操作性强，成功地解决了具鞘微鞘藻的纯化分离问题，对应用于沙漠生物结皮和防风固沙提供可行的生物材料。

2、本发明的内容是利用荒漠沙区土壤微生物结皮的培养物人工植入荒漠土地后依靠其自然繁殖修复地表。通过模拟土壤微生物结皮形成的自然规律，使荒漠地区的高结皮覆盖率的形成时间缩短，既能大规模快速治理沙漠流沙，又能使治理区的生物与环境、生物与生物长期协调发展。此项技术对增加干旱荒漠地区地表生物结皮覆盖度，增强沙面稳定性，减小地表侵蚀具有重要的意义。

3、本发明提供的方法能适用于工业化规模生产。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

实施例：具鞘微鞘藻的纯化分离

具体培养步骤包括：

(1)取样：准备直径是20cm，高10cm的PVC管，在荒漠环境中取发育良好的藻结皮，用PVC管取样，底部用铁片和胶带封住，运回实验室。

(2)室内培养：将采集的藻结皮置于光照培养架上进行培养备用，培养条件，光照36-54μmol·m^-2·s^-1，光照/黑暗时间是14/10h，每周喷少量水分，每个PVC管为50ml。

(3)灭菌：将接种所用到的镊子、解剖针、培养皿、研钵一套、载玻片、盖玻片、双凹载玻片、巴斯德吸管和无菌蒸馏水一并灭菌，制备无菌BG₁₁固体培养基并将其倒入5-6个固体培养皿。

(4)藻丝挑取：取藻结皮，先用无菌蒸馏水浸泡1h，然后将藻结皮放入已灭菌培养皿中，加蒸馏水使藻结皮能完全浸泡，将培养皿置于体式显微镜下，用无菌尖头镊子和解剖针将一些具鞘微鞘藻藻体与藻结皮剥离并挑出，放进另一个无菌培养皿中，并加少量5-10ml蒸馏水。

(5)藻体鉴定：将取出的藻体放在载玻片上制成临时装片，在显微镜下观察鉴定，确定是具鞘微鞘藻后将其放入无菌培养皿中。

(6)研磨：将具鞘微鞘藻藻体转移至灭菌的研钵中，加3-5ml无菌蒸馏水，轻微研磨，将藻丝和胶鞘分离开来，形成均匀的藻液。

(7)接种：取1ml藻液，用无菌蒸馏水稀释10倍，按照通常一滴为50μl计，用移液器吸取一滴至已灭菌双凹载玻片上，再加0.5ml无菌蒸馏水稀释，反复稀释几次，直至载玻片凹槽中仅含2-5根藻丝为宜，然后取一滴至另一凹槽内，用巴斯德吸管在酒精灯上烧热拉成极细的针头。将另一凹槽的藻液移至体式显微镜的视野中，将显微镜调至最高倍，在视野中找到一根藻丝；然后将巴斯德吸管装上胶头，把吸管的针头移至视野中藻丝上方，将所观察到的藻丝迅速吸出，转移到盛有BG₁₁固体培养基的平板中；其余稀释的藻液可吸取0.5ml转移至其它固体培养基平板中。最后将培养皿用parafilm封口，在光照培养箱内培养，培养条件：光照强度是50μmol·m^-2·s^-1，温度为25℃，光照/黑暗时间是16h/8h。

(8)转移培养基：培养2-3周后，在长出的具鞘微鞘藻藻落中用无菌镊子取出，制成临时装片，在显微镜下进一步观察，无污染的藻类和细菌，即可转移到已灭菌的BG₁₁液体培养基中；如有污染，应重复上述步骤(6)、(7)，进一步纯化。

本发明中，每升BG₁₁培养基组分如下：NaNO₃ 1.5g，，K₂HPO₄ 0.04g，MgSO₄0.07g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，Citric acid 0.006g，Ferric ammonium citrate 0.006g，Na₂EDTA 0.001g，Na₂CO₃ 0.02g，微量元素A₅溶液1mL，琼脂粉添加量为15g·L^-1，其中，A₅溶液组分：每升重蒸水中加入H₃BO₃ 2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.86g，ZnSO₄·7H₂O 0.22g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g，CuSO₄·5H₂O 0.08g，Co(NO₃)₂·6H₂O0.05g。

本发明提供的具鞘微鞘藻的纯化分离方法，能够快速实现对具鞘微鞘藻的纯化，及时对物种进行更新，有利于利用具鞘微鞘藻开展各种研究，对应用于沙漠生物结皮和防风固沙有着极为重要的理论和实践意义。

Claims (2)

1.一种具鞘微鞘藻的纯化分离方法，其特征在于，所述的具体培养步骤包括：

(1)取样：准备直径是20cm，高10cm的PVC管，在荒漠环境中取发育良好的藻结皮，用PVC管取样，底部用铁片和胶带封住，运回实验室；

(2)室内培养：将采集的藻结皮置于光照培养架上进行培养备用，培养条件，光照强度36-54μmol·m^-2·s^-1，光照/黑暗时间是14h/10h；

(3)灭菌：将接种所用到的镊子、解剖针、培养皿、研钵、载玻片、盖玻片、双凹载玻片、巴斯德吸管和无菌蒸馏水一并灭菌，制备无菌BG₁₁固体培养基并将其倒入固体培养皿；

(4)藻丝挑取：取藻结皮，先用无菌蒸馏水浸泡1h，然后将藻结皮放入已灭菌培养皿中，加无菌蒸馏水使藻结皮能完全浸泡，将培养皿置于体式显微镜下，用无菌尖头镊子和解剖针将一些具鞘微鞘藻藻体与藻结皮剥离并挑出，放进另一个无菌培养皿中，并加5-10ml无菌蒸馏水；

(5)藻体鉴定：将取出的藻体放在载玻片上制成临时装片，在显微镜下观察鉴定，确定是具鞘微鞘藻后将其放入无菌培养皿中；

(6)研磨：将具鞘微鞘藻藻体转移至灭菌的研钵中，加3-5ml无菌蒸馏水，轻微研磨，将藻丝和胶鞘分离开来，形成均匀的藻液；

(7)接种：取1ml藻液，用无菌蒸馏水稀释10倍，按照通常一滴为50μl计，用移液器吸取一滴至已灭菌双凹载玻片上，再加0.5ml无菌蒸馏水稀释，反复稀释几次，直至载玻片凹槽中含2-5根藻丝，然后取一滴至另一凹槽内，用巴斯德吸管在酒精灯上烧热拉成极细的针头；将另一凹槽的藻液移至体式显微镜的视野中，将显微镜调至最高倍，在视野中找到一根藻丝；然后将巴斯德吸管装上胶头，把吸管的针头移至视野中藻丝上方，将所观察到的藻丝迅速吸出，转移到盛有BG₁₁固体培养基的平板中；其余稀释的藻液可吸取0.5ml转移至其它固体培养基平板中；最后将培养皿用parafilm封口，在光照培养箱内培养，培养条件：光照强度是50μmol·m^-2·s^-1，温度为25℃，光照/黑暗时间是16h/8h；

(8)转移培养基：培养2-3周后，在长出的具鞘微鞘藻藻落中用无菌镊子取出，制成临时装片，在显微镜下进一步观察，无污染的藻类和细菌，即可转移到已灭菌的BG₁₁液体培养基中；如有污染，应重复上述步骤(6)、(7)，进一步纯化。

2.一种如权利要求1所述的具鞘微鞘藻的纯化分离方法，其特征在于，所述的BG₁₁固体培养基，每升BG₁₁培养基组分含有：NaNO₃ 1.5g，，K₂HPO₄ 0.04g，MgSO₄0.07g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，Citric acid 0.006g，Ferric ammonium citrate 0.006g，Na₂EDTA 0.001g，Na₂CO₃ 0.02g，微量元素A₅溶液1mL，琼脂粉添加量为15g·L^-1，其中，A₅溶液组分：每升重蒸水中加入H₃BO₃ 2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.86g，ZnSO₄·7H₂O 0.22g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g，CuSO₄·5H₂O 0.08g，Co(NO₃)₂·6H₂O0.05g。