CN102191231B - 大豆叶酸合成关键酶adcs及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及大豆叶酸合成关键酶ADCS及其基因和应用。根据本发明的大豆叶酸合成关键酶ADCS的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。大豆叶酸合成关键酶ADCS的基因的表达能够明显提高转基因植株中叶酸合成前体对氨基苯甲酸(pABA)的含量，因此，本发明的大豆叶酸合成关键酶ADCS为提高植物本身的叶酸含量奠定了基础，使人类通过饮食直接获得天然的叶酸来满足日常所需，对人类缓解叶酸摄入缺乏具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体地，涉及大豆叶酸合成关键酶ADCS及其基因和应用。
背景技术
叶酸(folates)是四氢叶酸(THF)及其衍生物的总称，是一类水溶性B族维生素，又称为维生素B9、维生素B11、维生素M，其化学结构如下：
其中，THF由三部分组成：一个喋啶环(2-氨基-4-羟基-6-甲基喋啶)，对氨基苯甲酸pABA，和多聚谷氨酸(poly-Glu)(1-8个Gluλ连接)，又名喋酰谷氨酸。不同氧化状态的一碳单位，例如甲基，亚甲基，次亚甲基，甲酰基，连接到喋啶环的N5、pABA的N10或桥连两者从而形成四氢叶酸(THF4)、5-甲基THF4、5-甲酰THF4、5，10-亚甲基THF4多种叶酸衍生物。THF及其衍生物作为一碳单位的供体和受体，是介导一碳单位转移反应的重要因素。
植物和微生物可以从头合成叶酸从而满足自身需求，而人类及动物则不能合成叶酸，只能通过饮食来获取。食用植物中除菠菜、豆类和椰菜等其叶酸的含量相对较高外，其他食物如粮食作物、蔬菜水果等的叶酸含量都很低，远不能满足人体对叶酸的需求量。一般正常人叶酸的需要量为200～400μg/d，世界卫生组织建议成人至少为200μg/d，孕妇和乳母为400μg/d。
叶酸是维持生物体正常生命过程所必需的一类有机物质，它对人体的重要营养作用早在1948年即已得到证实。人类(或其他动物)如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，并会增加心血管疾病及癌症的发病率；叶酸对孕妇尤为重要，如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加脊柱裂，无脑畸形的发生率，在怀孕的前6周内若叶酸摄入不足，婴儿患无脑及脊柱裂畸形的可能性会增加4倍，其次，孕妇经常补充叶酸，可防止新生儿体重过轻、早产以及婴儿腭裂(兔唇)等先天性畸形；叶酸与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质；而且叶酸在体内参与DNA、氨基酸、泛酸等的合成；叶酸可提供大量游离碳离子，供给制造神经末稍和构成传递神经冲动的重要化学物质原料，来保证人体神经系统的正常发育。临床上还发现叶酸具有抗肿瘤、促进婴幼儿的神经细胞与脑细胞发育及辅助治疗精神分裂症等作用。
叶酸缺乏的现象在全球普遍存在，尤其在经济水平和生活水平较低的发展中国家和不发达国家。据调查显示，在发展中国家每年因叶酸缺乏而导致的婴儿出生缺陷至少有20万例，因叶酸缺乏而引起孕妇贫血的病例至少有1千万。目前美国和一些西方国家采取在食品中添加人工合成的叶酸制剂的政策来满足人类的需求，而这很难在食品加工业系统不健全、人口分布不平衡、经济条件有限的发展中国家实行，同时长期服用人工合成的叶酸是否会对人体带来不良副作用也很令人担忧。随着生物技术的日益发展，通过基因工程的手段改造叶酸合成代谢途径来提高食物中的叶酸含量具有很大的吸引力和极其重要的意义。
植物体内叶酸的生物合成已经研究的较为清楚，合成部位涉及到3个不同的亚细胞结构，即质体、线粒体和细胞质，分为三个分支，其分支图如下：
其中，蝶呤部分是在细胞质内以GTP为前体合成，对氨基苯甲酸的合成是以分支酸为前体在质体内合成，蝶呤和对氨基酸甲酸运输到线粒体参与合成叶酸。在此过程中，有两个关键酶，包括在蝶呤分支中，第一步反应中的GTP环化酶I(GTPcyclohydrolase I，GTPCHI)，能够催化GTP形成二氢新蝶呤三磷酸(DHNTP)，以及在pABA合成途径的第一步反应中的氨基脱氧分支酸合成酶(ADCS)。近年来的研究发现这两种叶酸关键酶在植物中的过表达都可以有效提高植物中的叶酸含量。Rocio I等在研究中发现在拟南芥GTPCHI过表达的转基因番茄中，叶酸含量提高了2倍，所以得出适当提高蝶呤的合成可增加组织中叶酸的含量，但是由于其中对氨基苯甲酸消耗殆尽，pABA的不足使得叶酸含量仅提高了2倍，因此，在GTPCHI过表达的番茄果实中特异表达拟南芥ADCS，经鉴定，成熟转基因果实中叶酸含量提高了约25倍，pABA的含量提高了19倍。这说明ADCS是叶酸合成的一个关键酶。
目前，细菌和酵母中催化pABA合成的酶ADCS已经被克隆。在植物中，拟南芥和番茄的ADCS基因也已经克隆。据美国农业部的报告(2001)显示，与谷类食物、水果、蔬菜、奶制品相比，大豆叶酸含量是最高的，这说明大豆内可能存在ADCS基因，但至今关于大豆中ADCS基因的克隆还未报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆叶酸合成关键酶GmADCS及其编码基因GmADCS。
本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供上述大豆叶酸关键酶及其基因的应用。
本发明的再一目的是提供一种提高植物叶酸含量的方法。
根据本发明的大豆叶酸合成关键酶GmADCS，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所不：
MNSSLRLFSS ELTCPASEST QNANVNFLLS RPSLRVSCFV KKGGDARVRV
SNRDGRKTKA 60
VVCCQLMHSH KEESDERKRR LQVVPVPVQK ADFVRTLLID NYDSYTYNIF
QELSIINGVP 120
PVVIQNDDWT WEELCHYLYK ENAFDNIVIS PGPGSPACPE DIGICLQLLL
KCWDIPILGV 180
CLGHQALGYV HGAQVVHASE PIHGRLSEVE HNGCQLFRDI PSGKNYGFKV
VRYHSLVIDS 240
ESLPAELIPI AWTSSTSTLP FIGSKDFGKS NTHEAQPDQS ISIDPLLAKV
GNGSSNHFDY 300
GKTRSARVLM GIRHSTRPHY GVQFHPESVA TCYGSQIFKN FREITDDYWL
RFRSSFKETH 360
AYSDACMQVS SANRLYREVC RSISTENNAV DQLKEIVHAD RHLEYNKAEM
KHLEMFNMVN 420
THHATTGYKC LKLKWRKFGH LAGQVGGAKG IFCGLFGLEA ENTFWLDSSS
TEKGRARFSF 480
MGGKGGSLWK QLVFRLSHQS DGSSKGGGYL STEDSQGSAE TIFLEEGFLD
FLNRELQSYR 540
YDKNEYEGLP FDFHGGYIGY IGYNLKVECG VKSNRHKSKT PDACFFFADN
LVAIDHKNDD 600
VYILAIHEES SSITQWLNDT EEKLLSLNGS VRMALERQKS LPLTFSSCKV
GFAAEKSKEQ 660
YIEDVKKCLN YIKDGESYEL CLTTQIRKSI EELNSLELYL HLRERNPAPY
AAWLNF SKVD 720
L SICC S SPER FLQLDRKNIL EAKPIKGTIA RGATEEEDEQ LKFKLQF SEK
DQAENLMIVD 780
LLRNDLGRVC DPGSVHVPRLMDVESYATVH TMVSTIRGKK RSDVSAVDCV
KAAFPGGSMT 840
GAPKLRSMEL LD SIESC SRG IYSGCIGFF S YNQAFDLNIV IRTVIVHEGE
ASIGAGGAIV 900
AL SNPEDEYE EMVLKTKAPT RAVMHFA 927
该酶共有927个氨基酸，其中含有保守结构域GATasel(type lglutamineamidotransferase)结构域、anthranilate synthase结构域和chorismate binding结构域，分别位于90-340、455-610位氨基酸和550-920位氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥ADCS的氨基酸序列有63％的一致性。
本发明还提供了上述大豆叶酸关键酶基因GmADCS的基因序列。具体地，该基因序列如SEQ ID No.2所示：
cagttaagaa gctttagcca ttagccatta acaaagtagc tcagtccctc tccaccacca 60
acaccacttt gcttcttctc ccgcgcgatc tgagtcatgc ctattgctat tgctaccctc 120
aatctgcatc taaaagcgat cacataaaaa tatacatcta atctttaccc attacctaag 180
cgtctgatta gagaagcagg acacttttcc ttgcgagaat gaattcgtct ctgcgtttgt 240
tttcttccga gctcacctgt cctgcgagtg aatccacgca aaacgcgaat gtgaacttcc 300
ttctgtcaag accatcatta agggtttctt gtttcgttaa gaaaggtggt gatgctcgag 360
taagagtaag taatcgcgat ggaaggaaaa cgaaggcggt ggtttgttgc caattgatgc 420
atagccacaa ggaggagtcg gatgagagaa agagaaggct acaggtggtg cctgtgcctg 480
tgcagaaggc agattttgtg aggacattgt tgattgacaa ctatgacagt tacacttata 540
atatattcca ggaactatct attattaatg gcgtgcctcc tgtggtgatc caaaatgatg 600
attggacatg ggaagaactt tgccattact tatacaaaga aaatgctttt gataatattg 660
taatatcacc tggacccggt tctccagcat gcccggaaga tataggcatt tgtcttcagc 720
tgttgcttaa gtgctgggat attcctattc tgggtgtttg cctaggacac caggcattag 780
gttatgtgca tggagctcaa gttgtccatg catctgaacc aatccatggt cgtttgagtg 840
aagttgagca caacggctgc cagctttttc gtgatatacc ttctggtaaa aattatggat 900
tcaaggtggt tcgatatcat tcactggtta tagattctga atcacttcct gcagagctca 960
ttccaatagc atggacctct tccactagca cacttccatt tattgggtcc aaagattttg 1020
gcaagtccaa tactcatgaa gctcagccag atcaaagcat ttccattgat cctcttttag 1080
ctaaagtagg aaatggaagt tcaaaccatt ttgattatgg aaaaactaga agtgcaagag 1140
ttcttatggg aatcaggcat tctacaagac cacactatgg tgtgcagttt catcctgaaa 1200
gtgttgcaac ctgctatggg agtcaaatat tcaagaattt tagggagatt acagatgatt 1260
attggctgag atttaggtca tcattcaagg aaacacatgc atattctgat gcatgcatgc 1320
aggtttcaag tgctaataga ctctacagag aggtttgcag aagtattagc acagagaata 1380
atgcagtgga tcagttaaaa gaaatagttc atgcagatag acatttggaa tataataaag 1440
ctgagatgaa gcatttagaa atgttcaaca tggtaaatac tcatcatgca accactggtt 1500
ataagtgttt gaagttgaaa tggaggaaat ttggtcactt ggctggtcaa gttggtggag 1560
caaaaggtat attttgtggg ttgtttggac ttgaagctga aaacaccttt tggttggata 1620
gttcctccac agagaaggga agagcacgct tttcatttat gggaggaaaa ggcggatcac 1680
tttggaagca gttagtgttc agattgtccc atcaaagtga tgggagttca aaaggaggtg 1740
gttatttgtc aactgaagat tctcaaggtt ctgctgaaac aatatttttg gaagaaggtt 1800
ttcttgattt tttgaacagg gagcttcaat catatcgtta tgataaaaat gaatatgaag 1860
gcttgccatt tgattttcac ggtggatata ttggttacat tgggtataac ctcaaagttg 1920
agtgtggtgt gaaatcgaac cgtcacaaat ctaaaactcc tgatgcatgc tttttctttg 1980
ctgataatct tgtagctatt gaccacaaaa atgatgatgt ttatatattg gctatacatg 2040
aagaaagttc aagtattaca cagtggttga atgacacaga ggagaaactt ctgagcttaa 2100
atggctctgt gagaatggct ttggaaagac aaaagtctct tcctttaact ttttcctcat 2160
gtaaggttgg ttttgcagct gaaaaatcta aagagcagta cattgaggat gttaagaagt 2220
gtctaaacta cattaaagat ggagaaagct atgagttatg cctcacaact cagataagga 2280
aatcgattga ggaattgaat tcccttgaac tttatctgca tttgagagaa aggaatccgg 2340
caccttatgc tgcttggctt aatttttcaa aggtggatct gagtatttgc tgttcttctc 2400
ctgagaggtt cctgcagttg gataggaaga atatactaga agctaagccc atcaagggaa 2460
cgatagctcg tggtgctact gaagaggaag atgagcaact aaaatttaaa ttacagttca 2520
gcgaaaagga tcaggctgaa aacctgatga ttgttgacct tctaaggaat gaccttggcc 2580
gtgtttgtga tcctggatct gttcatgtgc cacgtctcat ggatgtggaa tcatatgcaa 2640
ctgttcacac aatggtgagt actattcgtg ggaagaagcg gtcagatgtc agtgctgtag 2700
actgtgtcaa agctgcattt cctggtggtt caatgacagg tgcacctaag ttgagatcaa 2760
tggaacttct tgattctatt gaaagttgtt ctcgaggtat ctactcaggc tgtattggat 2820
ttttctcata taatcaagca tttgatctaa atattgtgat aagaacagtc attgtacacg 2880
agggtgaagc ttcaatagga gctggagggg caattgttgc tctgtcaaac cctgaagacg 2940
agtatgaaga gatggttttg aagacaaaag ccccaacaag ggctgtgatg cattttgctt 3000
agagctcatg agccaaacaa tagctttttt ctttcgtaga atagtaagga gtgttgtagt 3060
gtagcaaggc ttaattgttt tagggttaga agtcagttgg tttttttttt cacacaggag 3120
ggttcctttc aatttttaga agcatagatg gtttgtatta gtaatattta tgcatagatg 3180
gttttaattt aattactttt tgtattttta atcaataaaa aaaaaaaaaa aacactgtca 3240
gccgttacgt agcg 3254
该基因序列长3254bp，其中包括5’UTR序列218bp，CDS序列2784bp，3’UTR序列252bp，与已经公布的大豆基因组序列进行比对，发现其位于10号染色体上。
其中，大豆叶酸关键酶基因GmADCS的CDS序列如SEQ ID No.3所示：
atgaattcgt ctctgcgttt gttttcttcc gagctcacct gtcctgcgag tgaatccacg 60
caaaacgcga atgtgaactt ccttctgtca agaccatcat taagggtttc ttgtttcgtt 120
aagaaaggtg gtgatgctcg agtaagagta agtaatcgcg atggaaggaa aacgaaggcg 180
gtggtttgtt gccaattgat gcatagccac aaggaggagt cggatgagag aaagagaagg 240
ctacaggtgg tgcctgtgcc tgtgcagaag gcagattttg tgaggacatt gttgattgac 300
aactatgaca gttacactta taatatattc caggaactat ctattattaa tggcgtgcct 360
cctgtggtga tccaaaatga tgattggaca tgggaagaac tttgccatta cttatacaaa 420
gaaaatgctt ttgataatat tgtaatatca cctggacccg gttctccagc atgcccggaa 480
gatataggca tttgtcttca gctgttgctt aagtgctggg atattcctat tctgggtgtt 540
tgcctaggac accaggcatt aggttatgtg catggagctc aagttgtcca tgcatctgaa 600
ccaatccatg gtcgtttgag tgaagttgag cacaacggct gccagctttt tcgtgatata 660
ccttctggta aaaattatgg attcaaggtg gttcgatatc attcactggt tatagattct 720
gaatcacttc ctgcagagct cattccaata gcatggacct cttccactag cacacttcca 780
tttattgggt ccaaagattt tggcaagtcc aatactcatg aagctcagcc agatcaaagc 840
atttccattg atcctctttt agctaaagta ggaaatggaa gttcaaacca ttttgattat 900
ggaaaaacta gaagtgcaag agttcttatg ggaatcaggc attctacaag accacactat 960
ggtgtgcagt ttcatcctga aagtgttgca acctgctatg ggagtcaaat attcaagaat 1020
tttagggaga ttacagatga ttattggctg agatttaggt catcattcaa ggaaacacat 1080
gcatattctg atgcatgcat gcaggtttca agtgctaata gactctacag agaggtttgc 1140
agaagtatta gcacagagaa taatgcagtg gatcagttaa aagaaatagt tcatgcagat 1200
agacatttgg aatataataa agctgagatg aagcatttag aaatgttcaa catggtaaat 1260
actcatcatg caaccactgg ttataagtgt ttgaagttga aatggaggaa atttggtcac 1320
ttggctggtc aagttggtgg agcaaaaggt atattttgtg ggttgtttgg acttgaagct 1380
gaaaacacct tttggttgga tagttcctcc acagagaagg gaagagcacg cttttcattt 1440
atgggaggaa aaggcggatc actttggaag cagttagtgt tcagattgtc ccatcaaagt 1500
gatgggagtt caaaaggagg tggttatttg tcaactgaag attctcaagg ttctgctgaa 1560
acaatatttt tggaagaagg ttttcttgat tttttgaaca gggagcttca atcatatcgt 1620
tatgataaaa atgaatatga aggcttgcca tttgattttc acggtggata tattggttac 1680
attgggtata acctcaaagt tgagtgtggt gtgaaatcga accgtcacaa atctaaaact 1740
cctgatgcat gctttttctt tgctgataat cttgtagcta ttgaccacaa aaatgatgat 1800
gtttatatat tggctataca tgaagaaagt tcaagtatta cacagtggtt gaatgacaca 1860
gaggagaaac ttctgagctt aaatggctct gtgagaatgg ctttggaaag acaaaagtct 1920
cttcctttaa ctttttcctc atgtaaggtt ggttttgcag ctgaaaaatc taaagagcag 1980
tacattgagg atgttaagaa gtgtctaaac tacattaaag atggagaaag ctatgagtta 2040
tgcctcacaa ctcagataag gaaatcgatt gaggaattga attcccttga actttatctg 2100
catttgagag aaaggaatcc ggcaccttat gctgcttggc ttaatttttc aaaggtggat 2160
ctgagtattt gctgttcttc tcctgagagg ttcctgcagt tggataggaa gaatatacta 2220
gaagctaagc ccatcaaggg aacgatagct cgtggtgcta ctgaagagga agatgagcaa 2280
ctaaaattta aattacagtt cagcgaaaag gatcaggctg aaaacctgat gattgttgac 2340
cttctaagga atgaccttgg ccgtgtttgt gatcctggat ctgttcatgt gccacgtctc 2400
atggatgtgg aatcatatgc aactgttcac acaatggtga gtactattcg tgggaagaag 2460
cggtcagatg tcagtgctgt agactgtgtc aaagctgcat ttcctggtgg ttcaatgaca 2520
ggtgcaccta agttgagatc aatggaactt cttgattcta ttgaaagttg ttctcgaggt 2580
atctactcag gctgtattgg atttttctca tataatcaag catttgatct aaatattgtg 2640
ataagaacag tcattgtaca cgagggtgaa gcttcaatag gagctggagg ggcaattgtt 2700
gctctgtcaa accctgaaga cgagtatgaa gagatggttt tgaagacaaa agccccaaca 2760
agggctgtga tgcattttgc ttag 2784
本发明还提供了大豆ADCS基因组序列，序列如SEQ ID No.4所示。
根据本发明提供的包含上述基因的重组载体，优选为，将上述大豆叶酸合成关键酶基因GmADCS的CDS序列构建到植物过表达载体pCAMBIA1302的酶切位点Nco I和Pml I之间，得到重组表达载体pCAMBIA1302-GmADCS。
本发明还提供了上述大豆叶酸合成关键酶及其基因在提高植物叶酸合成前体pABA含量中的应用。
因此，本发明还提供了一种提高植物叶酸含量的方法，其包括将上述大豆叶酸合成关键酶基因转入植物并表达的步骤。具体地，将重组载体pCAMBIA1302-GmADCS转入拟南芥，通过RT-PCR分析及转基因植株中pABA含量的测定，表明该基因在拟南芥中得到了表达，并且转基因植株中的pABA含量得到明显提高。
本发明以叶酸含量丰富的大豆为实验材料，得到一种叶酸合成关键酶GmADCS及其编码基因GmADCS，并将该基因转入拟南芥，通过RT-PCR检测，发现转入的GmADCS基因的表达水平均得到显著提高，并且通过测定转基因植株中的叶酸合成前体pABA的含量，表明转基因植株的pABA得到显著提高。
因此，根据本发明的技术内容为进行粮食作物、蔬菜、水果等植物的转化来提高植物本身的叶酸含量奠定了基础，人类通过饮食直接获得天然的叶酸来满足日常所需，无须服用叶酸片剂，缓解叶酸摄入缺乏的现象，并克服了长期服用叶酸片剂带来的不良副作用。
附图说明
图1为GmADCS基因克隆电泳图，其中，A为以3’EST5-R2和mESTF1为引物获得基因片段的扩增结果，3’EST5-R2和mESTF1为引物PCR扩增获得1300bp左右的条带；B为GmADCS的5’RACE扩增结果GmADCS 5’RACE-PCR产物大小800bp左右；C为GmADCS的3’RACE-PCR扩增结果，3’RACE-PCR产物大小400bp。
图2为GmADCS基因在大豆中的表达模式，GmADCS在根、茎、叶中均有表达，在叶中表达最强；
图3为转基因植株基因型的鉴定，其中1-4、6、7、10-12为阳性转基因植株；
图4为GmADCS基因在转基因植株中表达水平的检测，GmADCS在转基因植株中均有表达，表达量在不同株系间存在差异，野生型拟南芥(WT)为阴性对照，没有检测到表达；
图5为转基因植株中pABA含量的测定，发现转基因植株pABA含量均比野生型有所提高。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1、GmADCS基因的克隆及序列分析
1、获得大豆ADCS基因的EST序列
将拟南芥ADCS基因的CDS序列(AtADCS)，大小为2760bp，通过NCBI与大豆的EST序列进行比对，有8条大豆EST序列，与AtADCS的2050-2714bp一致性较高，分别命名为3’EST1-8，1条EST序列，大小为281bp，与AtADCS的1345-1592bp一致性较高，命为mEST。且3’EST1-8这8条序列经比对发现它们之间仅在个别碱基及序列长短上有差异，经分析后以同源性较高的3’EST5末端序列为模板设计下游引物3’EST5-R1/R2，以mEST序列为模板设计上游引物mESTF1(引物序列见表1)。
3’EST1、3’EST2、3’EST3、3’EST4、3’EST5、3’EST6、3’EST7、3’EST8和mEST的序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.13所示。
2、PCR扩增获得GmADCS基因3’端部分序列和中间部分序列
取大豆叶片100mg，采用Trizol法提取总RNA，经DNase I处理后，检测RNA纯度和浓度，取1μg用反转录试剂盒First strand cDNA systhesis(购自Fermentas)获得cDNA。
以大豆cDNA为模板，将上述根据EST序列设计的不同的引物进行组合，及PCR反应条件的摸索。其中，以3’EST5-R2和mESTF1为引物，选用55℃为退火温度，得到1300bp左右的片段(如图1A)，片段回收后连p-EASY-T1载体，挑取8个阳性克隆进行测序，与3’EST1-8进行比对，发现其中6个克隆的测序结果一致且与3’EST2/3/5/8匹配，大小为1352bp；另2个克隆的序列与EST1差异很大，为非特异扩增的片段。
将获得的1352bp序列与已经公布的大豆基因组序列比对，发现与大豆10号染色体的一段序列一致性很高，且其预测的CDS序列2304bp，根据预测的CDS序列设计引物ADCSMF和ADCSMR(引物序列见表1)，PCR扩增得到GmADCS基因的大部分CDS序列2296bp。
3、5’RACE获得GmADCS基因的5’端序列
Trizol法提取大豆叶片提取总RNA，经DNase I处理后，取5μg，根据geneRACE试剂盒(购自invitrogen)的方法获得cDNA。根据已获得序列5’端260bp处设计引物ADCS5′RACE，180bp处设计引物ADCS5RACE nest(引物序列见表1)。之后做巢式PCR。电泳检测得到800bp左右的片段(如图1B所示)，片段回收后连p-EASY-T1载体，挑取6个阳性克隆进行测序，其中5个克隆序列一致，经分析，在已知序列的基础上获得483bp的5’端序列和218bp5’UTR序列。
4、3’RACE获得GmADCS基因的3’UTR序列
根据已获得序列3’末端300bp处设计引物ADCS 3′RACE，159bp处设计引物ADCS 3′RACE nest(引物序列见表1)。之后做巢式PCR，电泳检测得到400bp左右的片段(如图1C所示)，片段回收后连p-EASY-T1载体，挑取6个阳性克隆进行测序，其中5个克隆序列一致，获得252bp大豆的3’UTR序列。
将获得的序列进行拼接，经分析最终得到完整的GmADCS基因序列，通过克隆得到的序列设计克隆GmADCS基因CDS全长的引物ADCS10FLF1和ADCS10R1(引物序列见表1)，PCR产物测序，CDS序列2784bp。
表1GmADCS基因克隆引物序列
| 引物名称 | 序列5’-3’ |
| 3’EST5-R1 | TGCTACACTACAACACTCCTTAC |
| 3’EST5-R2 | CTATTGTTTGGCTTATGAGCTC |
| mESTF1 | GGATCACTTTGGAAGCAGTTAG |
| ADCSMF | GCATTTGTCTTCAGCTGTTG |
| ADCSMR | CTAAGCAAAATGCATCACAG |
| ADCS5′RACE | CCTCTGTGTCATTCAACCACTGTG |
| ADCS5′RACE nest | GACGGTTCGATTTCACACCACACTC |
| ADCS 3′RACE | CCTGGTGGTTCAATGACAGGTGCAC |
| ADCS 3′RACE nest | CAGTCATTGTACACGAGGGTGAAG |
| ADCS10FLF1 | ATGAATTCGTCTCTGCGTTTG |
| ADCS10R1 | CTAAGCAAAATGCATCACAGC |
实施例2、GmADCS基因在大豆中的表达模式
通过RT-PCR分析GmADCS基因在大豆不同组织器官中的转录水平。取生长8周的大豆根、茎、叶，分别用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA为模板，以大豆肌动蛋白(GmActin)为内标，设计GmActin特异性引物GmActin11F、GmActin11R(引物序列见表2)，根据GmADCS基因的CDS序列设计基因特异引物GmADCS-FSP和GmADCS-RSP(引物序列见表2)，结果表明该基因在根、茎和叶中均可检测到转录，其中，在叶中表达水平最高，根和茎中较弱(如图2所示)。
表2、GmACTIN和GmADCS的基因特异引物
| 引物名称 | 序列5’-3’ |
| GmActin11F | ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC |
| GmActin11R | GCTGGTCCTGGCTGTCTCC |
| GmADCS-FSP | GATGATTGGACATGGGAAGAAC |
| GmADCS-RSP | GATCTGGCTGAGCTTCATGAG |
实施例3、转GmADCS基因拟南芥的获得及其叶酸合成前体pABA含量的测定
将GmADCS的CDS序列构建到植物过表达载体pCAMBIA1302的酶切位点NcoI和Pml I之间，由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动得到重组表达载体pCAMBIA1302-GmADCS。
将上述重组载体电击转化农杆菌LBA4404，挑取酶切鉴定正确的克隆，利用农杆菌介导的花沾法侵染野生型拟南芥，收获的种子记为T0代。T0代种子首先在1/2MS+潮霉素B(25mg/L)的抗性培养基上筛选，获得13株阳性绿苗(记为T1代)，并移入温室中培养20天，分别取叶片提取DNA，PCR鉴定转基因植株，侵染的植株中1-4、6.、7、10-12为转基因植株(如图3所示)。进一步用RT-PCR技术检测在拟南芥转基因植株中目的基因的表达水平，发现转基因植株中均有表达，野生型拟南芥没有检测到表达(如图4所示)。利用高效液相色谱法(HPLC)检测这些植株中的叶酸合成前体pABA含量，发现比野生型提高1.2～2倍(如图5)。
Claims (7)
1.一种大豆叶酸合成关键酶GmADCS，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种大豆叶酸合成关键酶基因GmADCS，其特征在于，编码权利要求1所述的大豆叶酸合成关键酶GmADCS。
3.根据权利要求2所述的大豆叶酸合成关键酶基因GmADCS，其特征在于，所述大豆叶酸合成关键酶基因GmADCS的核苷酸序列如SEQ ID No.2、3或4所示。
4.包含权利要求2所述大豆叶酸合成关键酶基因GmADCS的重组载体。
5.权利要求1所述的大豆叶酸合成关键酶GmADCS在提高植物叶酸合成前体pABA含量中的应用，其中所述植物为大豆或拟南芥。
6.权利要求2的大豆叶酸合成关键酶基因GmADCS在提高植物叶酸合成前体pABA含量中的应用，其中所述植物为大豆或拟南芥。
7.一种提高植物叶酸合成前体pABA含量的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2所述的大豆叶酸合成关键酶基因GmADCS转入植物并表达的步骤，其中所述植物为大豆或拟南芥。
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