CN102188464A - 紫金砂中香豆素和色原酮类提取物、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫金砂提取物，所述提取物含有香豆素类和色原酮类成分。其中，香豆素类为水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、异欧前胡素、奥斯索、佛手柑内酯、欧前胡素、二氢欧山芹素、异虎耳草素、氧化前胡素乙基醚的一种或多种；色原酮类为3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、拐芹色原酮、ledebouriellol的一种或多种。本发明还涉及紫金砂提取物的制备方法、质量控制方法、药物组合物及其在制备治疗疼痛和/或炎性疾病的药物或产品中的应用。本发明提取物的药效学和急性毒性实验表明，本发明提取物具有有效成分清楚、药效作用强、毒副作用小，以及产品纯度高，服用剂量较小，质量可控等优点。

Description

紫金砂中香豆素和色原酮类提取物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于中药、化学药物领域，具体地，本发明涉及富含香豆素和色原酮类成分的紫金砂提取物、其制备方法及在治疗疼痛和/或炎性疾病的药物中的应用。

背景技术

紫金砂为为伞形科当归属植物拐芹(Angelica polymorpha Maxim)的根及根茎。主要功效为祛风、散寒、燥湿、止痛。现多用于感冒鼻塞、胃痛、腹痛、胸胁痛、风湿关节痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等症。现代药理研究发现紫金砂在抗菌、解痉、抗溃疡、免疫调节等方面具有较好疗效。

紫金砂中主要含有香豆素类、挥发油等成分。迄今为止，国内外学者从紫金砂中分离得到的化合物大多为直线呋喃型香豆素类，主要包括氧化前胡内酯、石当归素、欧前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素、佛手柑内酯、异氧化前胡内酯、独活素、3-甲基白芷属脑、异石当归素等。

有关紫金砂化学成分的药理活性、应用及制备方法，目前公开的发明专利有“紫金砂提取物及其医药用途”(申请号200610105622.6)，发明涉及紫金砂提取物，其提取方法，含有该提取物的药物组合物及其用于制备炎性疾病和/或疼痛的药物产品的用途。此发明仅通过乙醇提取制得提取物，其提取方案没有明确技术特征，有效成分不清楚。目前公开的专利还有“含有紫金砂提取物的药物制备方法及其应用”(申请号200710051331.8)，该发明涉及一种含有以挥发油为主的紫金砂提取物的药物的制备方法及其在镇痛、抗溃疡及解痉挛药物中的应用，其提取物制备方法是通过分别以水、95％乙醇加热回流提取制得提取物，再将两部分混合得到紫金砂提取物。其涉及的化学成分为没药烷吉酮和水芹烯。由于中药化学成分复杂，难以确定有效成分，因此，难以准确评价药效，同时，由于中药成分含量因产地、批次不同而不同，导致中成药质量难以控制。针对中药研究中存在的缺点，本发明人对中药紫金砂中各类化学成分进行系统分离和活性筛选研究，发现一类具有显著抗炎、镇痛活性的提取物，其化学成分与上述两个专利所披露的化学成分不同，主要为香豆素类、色原酮类成分的组合。本发明的提取物的制备方法与前述专利明显不同，在紫金砂粗提物基础上又经过溶剂萃取与大孔树脂精制，其技术方案新颖，化学成分明确，质量可控。国内外相关研究中未见有从紫金砂中获得抗炎镇痛活性良好的香豆素类、色原酮类成分复合物的相关报道。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种紫金砂提取物，其富含有香豆素类和色原酮类成分。其中，香豆素类成分为水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、异欧前胡素、奥斯索(osthol)、佛手柑内酯、欧前胡素、二氢欧山芹素、异虎耳草素(isopimpinellin)、氧化前胡素乙基醚的一种或多种；色原酮类成分为3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、拐芹色原酮、ledebouriellol的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，以提取物的总重量计算，上述香豆素类、色原酮类含量以重量百分比计合计为40-100％，50-100％，优选为60-80％。

在本发明的一个实施方案中，以提取物的总重量计算，水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、异欧前胡素、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚五种成分的含量以重量百分比计分别为：10-30％、0.6-3.0％、1.0-6.0％、0.3-1.5％、0.1-1.0％，优选为15-25％、1.0-2.0％、1.0-3.5％、0.5-1.3％、0.3-0.7％。

本发明的另一方面涉及上述的紫金砂提取物的制备方法，包括如下步骤：

1)将紫金砂以溶剂提取法或CO₂超临界萃取法进行提取，浓缩后得到粗提物；

2)取药材粗提物在水中分散均匀，用低极性溶剂进行萃取，得到萃取液；

3)萃取液蒸干，用低极性溶剂超声洗涤，静置，过滤沉淀，干燥。

4)萃取后水溶液过大孔树脂柱，乙醇洗脱，浓缩洗脱液，蒸干。

5)将3)或4)所得提取物用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(0∶100-100∶0)梯度洗脱，划分成F1-F20段；F3段用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯12∶1洗脱，再用石油醚/乙酸乙酯(1∶1)重结晶，得到单体化合物异欧前胡素；F4段用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯10∶1洗脱，再将F4-2反复用凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)，得到单体化合物奥斯索；F5段经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(10∶1-7∶1)梯度洗脱，再将F5-1段经RP-18柱，甲醇-水(20∶80-80∶20)梯度洗脱，得到欧前胡素、佛手柑内酯；F5-2段经RP-18柱，甲醇-水(20∶80-80∶20)梯度洗脱，得到二氢欧山芹素；F-7段经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(8∶1)洗脱，再将F7-3段经RP-18柱，甲醇-水(20∶80-80∶20)梯度洗脱，得到拐芹色原酮；F7-4段反复用凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)，得到氧化前胡素乙基醚。F-8段经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(6∶1)洗脱，再将F8-2段经RP-18柱，甲醇-水(30∶70-80∶20)梯度洗脱，再经过凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)得到栓翅芹烯醇、ledebouriellol；F10段经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(3∶1)洗脱，再将F10-2段经RP-18柱，甲醇-水(30∶70-80∶20)梯度洗脱，再经过凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)得到3’R-(+)-亥茅酚；F10-3段经过RP-18柱，甲醇-水(40∶60-80∶20)梯度洗脱，得到3’-O-乙酰基亥茅酚、异虎耳草素。F-14段经硅胶柱层析石油醚-乙酸乙酯(1∶2)洗脱，F14-6段重结晶得到水合氧化前胡素内酯。

采用溶剂提取法提取时，包括以下步骤：取适量紫金砂药材粉碎，加入固液比为1∶6-1∶10的水、甲醇、乙醇或丙酮或者其混合溶剂，加热回流提取，然后合并提取液，减压浓缩至干。其中优选的溶剂为含水的乙醇。提取时可以采用煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高压提取等方法。

采用CO₂超临界萃取法进行提取时，包括以下步骤：取适量紫金砂药材粉碎，过20-60数目的筛；选用超临界萃取装置，以无水乙醇作夹带剂，在萃取温度40-50℃、萃取压力25-45MPa时提取-小时，将萃取物于40-50℃减压蒸干。

采用溶剂萃取法进行萃取时，包括以下步骤：取药材粗提物在水中分散，然后用加入体积比为1∶2-1∶6的低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂萃取2-3次，以去除其中的色素及焦油物。其中优选的溶剂为石油醚、环己烷、乙酸乙酯。

将萃取得到的乙酸乙酯萃取液蒸干，浓缩成膏状，加入石油醚，超声30分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤，干燥得到提取物。

采用大孔吸附树脂法时，包括以下步骤：取萃取后的水溶液蒸干，用10-30％的乙醇溶散均匀，上大孔树脂柱，树脂柱径高比1∶6-1∶10，上样后用4-8倍BV的10-40％乙醇洗去杂质，除杂流速为1.5-6BV/h，再用3-10倍BV的60-95％乙醇洗脱，洗脱流速为3-9BV/h，收集后者洗脱部分，减压浓缩至干，得到富含有香豆素类和色原酮类成分的紫金砂提取物。

大孔吸附树脂包括非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型的树脂，如HP20、D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806、D4006、X-5、NKA-II、NKA-9等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如HP20、AB-8、I-IPD400、D101、D4006、X-5等，其中最优选AB-8型树脂。

本发明的又一方面涉及该提取物制备的药物组合物，该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等。

本发明药物组合物中含有的载体或赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂，例如填充剂、粘合剂、防腐剂、矫味剂、稀释剂、着色剂等，本发明药物组合物可按本领域已知方法制备。

本发明的又一方面涉及紫金砂提取物在制备治疗炎症和/或疼痛的产品或药物中的应用，其中的炎症包括痛风性关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎等；其中的疼痛包括痛风性关节痛、风湿性关节痛、类风湿性关节痛、头痛、腹痛、胃痛、跌打损伤痛等。

本发明的提取物可采用本领域已知的或者本文公开的途径给药。给药途径包括但不局限于下述几种：外用(包括眼、鼻)；吸入(包括气管内、口腔内、过皮或皮外的乳化剂或喷雾剂)；口服；注射或点滴(包括静脉、动脉、皮下腹腔或肌肉内)；颅内给药(包括鞘膜、脑室内)。

本发明提取物及其有效成分的用量取决于适用对象的年龄、体重和疾病的类型及严重程度等因素。

本发明质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或两种：

1.香豆素类、色原酮类成分总含量测定(紫外分光光度法)

对照品溶液的配制：精密称取水合氧化前胡素内酯对照品3.0mg，置10ml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液2.5ml至25ml容量瓶中，定容。分别吸取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.7ml，用甲醇稀释定容到10ml量瓶中，摇匀，在307nm波长处测定吸光度。以水合氧化前胡素内酯对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

供试品溶液的配置：取紫金砂提取物适量，加甲醇溶解定容至25ml量瓶中，摇匀。精密吸取1ml，加甲醇定容至10ml量瓶中，摇匀。

测定法：取供试品溶液在307nm波长处测定吸光度，按标准曲线法计算样品中香豆素、色原酮类成分总含量，即得。香豆素类、色原酮类成分含量测定(紫外分光光度法)

2.紫金砂提取物中水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚含量测定(高效液相法)

色谱条件：色谱柱：用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-水；流速：1.0ml/mim；柱温：室温。洗脱条件如表1：

表1.梯度洗脱条件

(1)水合氧化前胡素内酯标准曲线的制备

对照品溶液的配制：精密称取水合氧化前胡素内酯对照品25.1mg，置25ml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀。

标准曲线的制备：分别精密吸取对照品溶液0.2、1.5、3.0、5.0、7.0ml，用甲醇稀释定容到10ml量瓶中，摇匀。精密吸取20μl上述对照品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件，测定312nm下色谱峰峰面积。以对照品浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

(2)栓翅芹烯醇标准曲线的制备

对照品溶液的配制：精密称取栓翅芹烯醇对照品10.0mg，置25ml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀。

标准曲线的制备：分别精密吸取对照品溶液0.5、1.5、3.0、5.0、7.0ml，用甲醇稀释定容到10ml量瓶中，摇匀。精密吸取20μl上述对照品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件，测定306nm下色谱峰峰面积。以对照品浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

(3)3’R-(+)-亥茅酚标准曲线的制备

对照品溶液的配制：精密称取3’R-(+)-亥茅酚对照品5.0mg，置25ml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀。

标准曲线的制备：分别精密吸取对照品溶液0.2、1.5、3.0、5.0、7.0ml，用甲醇稀释定容到10ml量瓶中，摇匀。精密吸取20μl上述对照品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件，测定300nm下色谱峰峰面积。以对照品浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

(4)3’-O-乙酰基亥茅酚标准曲线的制备

对照品溶液的配制：精密称取3’-O-乙酰基亥茅酚对照品5.1mg，置25ml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀。

标准曲线的制备：分别精密吸取对照品溶液0.2、1.5、3.0、5.0、7.0ml，用甲醇稀释定容到10ml量瓶中，摇匀。精密吸取20μl上述对照品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件，测定294nm下色谱峰峰面积。以对照品浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

(5)异欧前胡素标准曲线的制备

对照品溶液的配制：精密称取3’-O-乙酰基亥茅酚对照品15.0mg，置25ml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀。

标准曲线的制备：分别精密吸取对照品溶液0.2、1.5、3.0、5.0、7.0ml，用甲醇稀释定容到10ml量瓶中，摇匀。精密吸取20μl上述对照品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件，测定310nm下色谱峰峰面积。以对照品浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

(6)样品含量测定

取紫金砂提取物适量，加甲醇溶解定容至25ml量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。精密吸取1ml，加甲醇定容至10ml量瓶中，摇匀。精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，分别在312、306、300、294、310nm下测定水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素的色谱峰峰面积，并根据标准曲线法计算含量，即得。

发明的有益效果

基于有关紫金砂的古代医家记述及现代药理和临床研究取得的试验结果，本发明经过长期摸索研究，确证紫金砂治疗疼痛和/或炎性疾病的的有效部位，并分离得到本发明的富含香豆素和色原酮类成分的紫金砂提取物，用以治疗疼痛和/或炎性疾病。本发明解决了长期以来存在的紫金砂提取物有效剂量高、毒性较强、质量较难控制等中药使用局限。本发明提取物的药效学和急性毒性实验表明，本发明提取物具有有效成分清楚、药效作用强、毒副作用小，以及产品纯度高，服用剂量较小，质量可控等优点。

附图说明

图1(A)为水合氧化前胡素内酯的氢谱图，(B)为水合氧化前胡素内酯的高效液相色谱图。

图2(A)为栓翅芹烯醇的氢谱图，(B)为栓翅芹烯醇的高效液相色谱图。

图3(A)为3’R-(+)-亥茅酚的氢谱图，(B)为3’R-(+)-亥茅酚的高效液相色谱图。

图4(A)为3’-O-乙酰基亥茅酚的氢谱图，(B)为3’-O-乙酰基亥茅酚的高效液相色谱图

图5(A)为异欧前胡素的氢谱图，(B)为异欧前胡素的高效液相色谱图。

具体实施方式

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：紫金砂提取物1的制备

取紫金砂药材500g粉碎后，用80％乙醇加热回流提取2次，每次提取2小时，溶剂用量为4000ml，合并提取液，减压浓缩至干，得乙醇提取物96g。称取乙醇提取物10g，加入20ml水超声分散，再加入100ml环己烷萃取3次，将水层蒸干，加入20％乙醇溶散，然后上HP20大孔树脂柱，树脂柱径高比1∶8，上样后用5倍BV的20％乙醇洗去杂质，再用10倍BV的85％乙醇洗脱，收集后者洗脱部分，减压浓缩至干，得到紫金砂提取物。测定香豆素类、色原酮类成分含量总和为61％；水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量(重量％)分别为18.9％、1.3％、1.0％、0.4％、1.5％。

实施例2：紫金砂提取物2的制备

取紫金砂药材100g粉碎后过20目筛，再选用HA121-50-01超临界萃取装置，以200ml无水乙醇作夹带剂，在萃取温度45℃、萃取压力35MPa时提取3小时。将萃取物于40℃减压蒸干，得到超临界萃取提取物5.2g。称取紫金砂粗提物5.2g，加入10ml水超声分散，再加入50ml石油醚萃取3次，将水层蒸干，加入30％乙醇溶散，然后上HP20大孔树脂柱，树脂柱径高比1∶8，上样后用5倍BV的30％乙醇洗去杂质，再用8倍BV的80％乙醇洗脱，收集后者洗脱部分，减压浓缩至干，得到紫金砂提取物。测定香豆素类、色原酮类成分含量总和为56％；水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量(重量％)分别为16.4％、1.1％、0.8％、0.6％、1.4％。

实施例3：紫金砂提取物3的制备

取紫金砂药材100g粉碎后，用50％丙酮加热回流提取2次，每次提取1小时，溶剂用量为1000ml，合并提取液，减压浓缩至干，得丙酮提取物12.5g。称取丙酮提取物5g，加入10ml水超声分散，再加入60ml乙酸乙酯萃取3次，将萃取液浓缩成膏状，加入石油醚，超声30分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤，干燥，得到紫金砂提取物。测定香豆素类、色原酮类成分含量总和为52％；水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量(重量％)分别为14.3％、0.9％、1.1％、0.8％、2.8％。

实施例4：紫金砂提取物4的制备

取实施例1的乙醇提取物25g在50ml水中分散，再用150ml石油醚萃取三次，分别合并萃取液后，减压浓缩至干。称取紫金砂粗提物10g，加15ml水超声分散，再加入50ml石油醚萃取3次，将水层蒸干，加10％乙醇溶散，然后上AB-8大孔树脂柱，树脂柱径高比1∶10，上样后用8倍BV的10％乙醇洗去杂质，再用10倍BV的85％乙醇洗脱，收集后者洗脱部分，减压浓缩至干，得到紫金砂提取物。测定香豆素类、色原酮类成分含量总和为78％；水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量(重量％)分别为23.9％、1.8％、0.8％、0.6％、2.3％。

实施例5：紫金砂提取物5的制备

取实施例1的乙醇提取物25g在50ml水中分散，再用150ml环己烷萃取三次，分别合并萃取液后，减压浓缩至干。称取紫金砂粗提物18g，加10ml水超声分散，再加50ml石油醚萃取3次，将水层蒸干，加25％醇溶散，然后上AB-8大孔树脂柱，树脂柱径高比1∶8，上样后用6倍BV的25％醇洗去杂质，再用10倍BV的85％醇洗脱，收集后者洗脱部分，减压浓缩至干，得到紫金砂提取物。测定香豆素类、色原酮类成分含量总和为67％；水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量(重量％)分别为20.9％、1.7％、0.7％、0.4％、1.8％。

实施例6：各单体化合物的制备和光谱分析

取紫金砂药材5kg，用实施例1方法制备紫金砂提取物。将制得的提取物用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(0∶100-100∶0)梯度洗脱，划分成F1-F20段。F3段用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯12∶1洗脱，再用石油醚/乙酸乙酯(1∶1)重结晶，得到单体化合物异欧前胡素(图5B)。F4段用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯10∶1洗脱，再将F4-2反复用凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)，得到单体化合物奥斯索。F5段经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(10∶1-7∶1)梯度洗脱，再将F5-1段经RP-18柱，甲醇-水(20∶80-80∶20)梯度洗脱，得到欧前胡素、佛手柑内酯；F5-2段经RP-18柱，甲醇-水(20∶80-80∶20)梯度洗脱，得到二氢欧山芹素。F-7段经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(8∶1)洗脱，再将F7-3段经RP-18柱，甲醇-水(20∶80-80∶20)梯度洗脱，得到拐芹色原酮、谷甾醇；F7-4段反复用凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)，得到氧化前胡素乙基醚。F-8段经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(6∶1)洗脱，再将F8-2段经RP-18柱，甲醇-水(30∶70-80∶20)梯度洗脱，再经过凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)得到栓翅芹烯醇(图2B)、ledebouriellol；F8-3段反复用凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)，再经过RP-18柱，甲醇-水(40∶60-80∶20)梯度洗脱，得到豆甾醇。F10段经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯(3∶1)洗脱，再将F10-2段经RP-18柱，甲醇-水(30∶70-80∶20)梯度洗脱，再经过凝胶柱层析(氯仿甲醇1∶1洗脱)得到3’R-(+)-亥茅酚(图3B)；F10-3段经过RP-18柱，甲醇-水(40∶60-80∶20)梯度洗脱，得到3’-O-乙酰基亥茅酚(图4B)、异虎耳草素。F-14段经硅胶柱层析石油醚-乙酸乙酯(1∶2)洗脱，F14-6段重结晶得到水合氧化前胡素内酯(图1B)。

以下为上述试验得到的各个单体化合物的理化性质及波谱特征：

异欧前胡素(Isoimperatorin)：淡黄色块状结晶，mp 109℃，ESI-MS m/z：271[M+H]⁺，293[M+Na]⁺。¹H-NMR(CDCl₃，400MHZ)δ：8.16(1H，d，J＝9.8Hz，H-4)，7.60(1H，d，J＝2.4Hz，H-2′)，7.14(1H，s，H-8)，6.96(1H，d，J＝2.4Hz，H-3′)，6.28(1H，d，J＝9.8Hz，H-3)，5.40(1H，t-like，J＝7.2Hz，H-2″)，4.93(2H，d，J＝7.2Hz，H-1″)，1.81(3H，s，Me-3″)，1.71(3H，s，Me-3″)(图5A)。

水合氧化前胡素内酯(aviprin)：淡黄色块状结晶，mp 131-132℃，ESI-MS m/z：305[M+H]⁺，303[M-H]^-。¹H-NMR(CD₃OD，400MHz)δ：8.27(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，7.60(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，7.12(1H，d，J＝2.0Hz，H-3′)，7.00(1H，s，H-8)，6.16(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，4.73(1H，dd，J＝9.8，2.4Hz，H-1″)，4.33(1H，dd，J＝9.6，8.4Hz，H-1″)，3.80(1H，dd，J＝8.4，2.4Hz，H-2″)，1.29(3H，s，Me-3″)，1.24(3H，s，Me-3″)(图1A)。

3’-O-乙酰基亥茅酚(3′-O-acetylhamaudol)：白色无定形粉末，mp 198-200℃，ESI-MS m/z：277[M+H]⁺。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：13.02(1H，s，OH-5)，6.37(1H，s，H-8)，6.00(1H，s，H-3)，5.12(1H，t，J＝5.4Hz，H-3′)，3.05(1H，dd，J＝17.3，5.0Hz，H-4′)，2.70(1H，dd，J＝17.2，5.6Hz，H-4′)，2.33(3H，s，Me-2)，2.05(3H，s，OAc)，1.36(3H，s，Me-2′)，1.35(3H，s，Me-2′)(图4A)。

栓翅芹烯醇(gosferol)：白色晶体，mp 137-138℃，ESI-MS m/z：287[M+H]⁺。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：8.20(1H，d，J＝9.7Hz，H-4)，8.00(1H，d，J＝2.4Hz，H-2′)，7.20(1H，s，H-8)，7.16(1H，d，J＝2.4Hz，H-3′)，6.25(1H，d，J＝9.7Hz，H-3)，5.12(1H，d，J＝9.7Hz，H-4″)，5.03(1H，d，J＝5.0Hz，H-4″)，4.56(2H，J＝8.0Hz，H-1″)，4.44(1H，m，H-2″)，1.21(3H，s，Me-3″)(图2A)。

3’R-(+)-亥茅酚(3′(R)-+-hamaudol)：白色无定形粉末，mp 198-200℃，ESI-MS m/z：277[M+H]⁺。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：12.95(1H，s，OH-5)，6.30(1H，s，H-8)，6.00(1H，s，H-3)，3.86(1H，t，J＝4.8Hz，H-3′)，2.95(1H，dd，J＝16.8，5.0Hz，H-4′)，2.74(1H，dd，J＝17.2，5.6Hz，H-4′)，2.33(3H，s，Me-2)，1.40(3H，s，Me-2′)，1.35(3H，s，Me-2′)(图3A)。

奥斯索(Osthol)：白色羽状结晶，mp 89℃，ESI-MS m/z：245[M+H]⁺，267[M+Na]⁺。¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δ：7.62(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，7.29(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，6.83(1H，d，J＝8.4Hz，H-6)，6.23(1H，d，J＝9.4Hz，H-3)，5.22(1H，t-like，J＝7.6Hz，H-2′)，3.93(3H，s，OMe)，3.53(2H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，1.84(3H，s，Me-3′)，1.67(3H，s，Me-3′)。

拐芹色原酮(angeliticin A)：白色无定形粉末，mp 177-178℃，ESI-MS m/z：341[M+Na]⁺。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：12.75(1H，s，OH-5)，6.34(1H，s，H-8)，6.24(1H，s，H-3)，6.22(1H，overlap，H-3″)，5.04(2H，s，CH₂-2)，4.78(1H，t，J＝9.0Hz，H-2′)，3.18(1H，dd，J＝15.9，9.2Hz，H-3′)，3.10(1H，dd，J＝15.7，8.1Hz，H-3′)，2.04(1H，dd，J＝7.0，1.2Hz，Me-3″)，1.96(3H，t，J＝1.2Hz，Me-2″)，1.36(3H，s，Me-4′)，1.23(3H，s，Me-4′)。

佛手柑内酯(bergapten)：白色羽状结晶，mp 188-189℃，ESI-MSm/z：217[M+H]⁺，239[M+Na]^-。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：8.16(1H，d，J＝9.8Hz，H-4)，7.59(1H，d，J＝2.2Hz，H-2′)，7.13(1H，s，H-8)，7.02(1H，d，J＝2.2Hz，H-3′)，6.27(1H，d，J＝9.8Hz，H-3)，4.28(3H，s，MeO)。

欧前胡素(imperatorin)：白色羽状结晶，mp 102℃，ESI-MS m/z：271[M+H]⁺，269[M-H]^-。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：7.77(1H，d，J＝9.4Hz，H-4)，7.69(1H，d，J＝2.4Hz，H-2′)，7.36(1H，s，H-5)，6.85(1H，d，J＝2.4Hz，H-3′)，6.36(1H，d，J＝9.4Hz，H-3)，5.61(1H，t-like，J＝7.2Hz，H-2″)，5.00(2H，d，J＝7.2Hz，H-1″)，1.74(3H，s，Me-3″)，1.72(3H，s，Me-3″)。

Ledebouriellol：白色无定形粉末，mp 98-100℃，ESI-MS m/z：375[M+H]⁺。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：12.81(1H，s，OH-5)，6.346.33(each 1H，s，H-3 and H-8)，6.09(1H，q，J＝7.0Hz，H-3″)，5.17(1H，t，J＝5.2Hz，H-3′)，4.54(2H，s，CH₂-2)，3.03(1H，dd，J＝17.2，4.8Hz，H-4′)，2.79(1H，dd，J＝17.2，5.0Hz，H-4′)，1.90(3H，d，J＝7.0Hz，Me-3″)，1.85(3H，s，Me-2″)，1.38，(6H，s，(Me-2′)₂)。

二氢欧山芹素(columbianadin)：白色无定形粉末，mp 119-120℃，ESI-MS m/z：329[M+H]⁺，327[M-H]^-。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：7.64(1H，d，J＝9.2Hz，H-4)，7.27(1H，d，J＝8.0Hz，H-5)，6.75(1H，d，J＝8.4Hz，H-6)，6.21(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，5.98(1H，dq-like，H-3″)，5.12(1H，dd，J＝9.6，8.0Hz，H-2′)，3.38(2H，m，H-1′)，1.89(3H，dd，J＝7.2，1.6Hz，Me-3″)，1.67(3H，t，J＝1.6Hz，Me-2″)，1.64(3H，s，Me-4′)，1.60(3H，s，Me-4′)。

异虎耳草素(Isopimpinellin)：白色羽状结晶，mp 151℃，ESI-MSm/z：247[M+H]⁺，269[M+Na]⁺。¹H-NMR(CDCl₃，400MH_Z)δ：8.13(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，7.63(1H，d，J＝2.4Hz，H-2′)，7.01(1H，d，J＝2.0Hz，H-3′)，6.29(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，4.18(6H，s，(MeO)₂)。

氧化前胡素乙基醚(oxypeucedanin ethanolate)：淡黄色块状结晶，mp 95℃，ESI-MS m/z：333[M+H]⁺，331[M-H]^-。¹H-NMR(CD₃Cl，400MH_Z)δ：8.24(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，7.60(1H，d，J＝2.4Hz，H-2′)，7.15(1H，s，H-8)，7.02(1H，d，J＝2.0Hz，H-3′)，6.27(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，4.59(1H，dd，J＝10.1，2.8Hz，H-1″)，4.40(1H，dd，J＝10.1，7.8Hz，H-1″)，3.94(1H，dd，J＝8.0，2.8Hz，H-2″)，3.26(2H，q，J＝7.2Hz，CH ₂ CH₃)，1.28(3H，s，Me-3″)，1.25(3H，s，Me-3″)，1.19(3H，t，J＝7.2Hz，CH₂ CH ₃ )。

证明各单体符合下述的结构。

部分单体化合物的结构

实施例7：各提取物的抗炎作用评价

1、角叉菜胶引起大鼠足跖肿胀试验

实验动物：雄性Wistar大鼠，体重140-160g；购自北京维通利华公司，饲养于本单位实验动物中心。

受试样品：实施例1-5的提取物，阳性对照萘普生(南京白敬宇制药有限公司)。

实验仪器：意大利Ugobasile公司Plethy-meter仪等。

实验用试剂：角叉菜胶购买自sigma公司，其它均为国产分析纯。

实验方法及结果：

雄性大鼠56只，随机分为7组，每组8只，受试样品混悬于生理盐水中，实验前用体积测定仪测定大鼠右后足体积作为基础体积，腹腔注射(ip)给药，空白对照给予同体积的生理盐水。给药后半小时，于大鼠右后足跖腱膜皮下注射1％角叉菜胶的生理盐水溶液0.1ml(无菌操作)。用Plethy-meter仪测定致炎前和致炎后1-6小时大鼠右后足容积。以其致炎前后的足容积差值除以致炎前足容积的百分率为肿胀度。结果见表2。

数据处理：所有数据以平均值±标准偏差表示，组间差异用t检验，以空白组为对照比较组间差异显著性。

表2 紫金砂提取物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响

注：与空白组比较，^*P＜0.05 ^**P＜0.01

2、巴豆油诱导小鼠耳肿胀实验

实验动物：雄性ICR小鼠，体重22-26g；购自北京维通利华公司，饲养于本单位实验动物中心。

受试样品：实施例1-5的提取物，阳性对照萘普生(南京白敬宇制药有限公司)。

实验仪器：角膜钻(7.5mm，苏州医疗器械厂)，万分之一天平。

实验用试剂：巴豆油致炎剂(巴豆油/乙醇/水/乙醚：2/20/5/73v/v)。

实验方法及结果：

雄性ICR小鼠70只，随机分为7组，每组10只，腹腔注射给药，空白对照给予同体积的生理盐水。给药后0.5h于右耳两侧涂抹巴豆油致炎剂(0.03ml/耳)，4h后断头处死动物。剪下双耳后以角膜钻切除两耳耳片并称重，以左右耳重量差计算肿胀度，并以空白组为对照比较组间差异显著性。结果见表3。

数据处理：所有数据以平均值±标准偏差表示，组间差异用t检验，以空白组为对照比较组间差异显著性。

表3 紫金砂提取物对巴豆油诱导小鼠耳肿胀的影响

注：与空白组比较，^*P＜0.05 ^**P＜0.01

3、尿酸盐结晶(MSU)诱导的大鼠足跖肿胀实验

实验动物：雄性Wistar大鼠，体重140-160g；购自北京维通利华公司，饲养于本单位实验动物中心。

受试样品：实施例1-5的提取物，阳性对照萘普生(南京白敬宇制药有限公司)。

实验仪器：意大利Ugobasile公司Plethy-meter仪等。

实验用试剂：尿酸盐结晶(MSU)购买自sigma公司，其它均为国产分析纯。

雄性大鼠56只，随机分为7组，每组8只，受试样品混悬于生理盐水中，实验前用体积测定仪测定大鼠右后足体积作为基础体积，腹腔注射(ip)给药，空白对照给予同体积的生理盐水。给药后半小时，于大鼠右后足跖腱膜皮下注射0.1ml MSU混悬液(100mg/ml)(无菌操作)。用Plethy-meter仪测定致炎前和致炎后1-6小时大鼠右后足容积。以其致炎前后的足容积差值除以致炎前足容积的百分率为肿胀度。结果见表4。

数据处理：所有数据以平均值±标准偏差表示，组间差异用t检验，以空白组为对照比较组间差异显著性。

表4紫金砂提取物对MSU所致大鼠足肿胀的影响

结论：研究表明，实施例1-5的提取物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀、巴豆油诱导小鼠耳肿胀、尿酸钠结晶诱导大鼠足肿胀均有显著的抑制作用，显示本发明制得的紫金砂提取物具有显著的抗炎的活性。

实施例8：各提取物镇痛作用评价

1、小鼠醋酸扭体实验

实验动物：ICR小鼠，体重18-22g，购自北京维通利华公司，饲养于本院实验动物中心。

受试样品：实施例1-5的提取物，萘普生(南京白敬宇制药有限公司)。

实验仪器：自制小鼠笼箱，摄像机等。

实验用试剂：均为国产分析纯。

实验方法及结果：

小鼠雌雄各半，随机分组，每组10只，实验前12h禁食，灌胃给予受试样品(ig)0.2ml/10g，空白对照组给予同体积的蒸馏水。一小时后，腹腔注射(ip)0.6％醋酸溶液0.2ml，立即记录20min内每只鼠的扭体次数(腹部和后肢伸长一次为一次扭体反应)。扭体抑制率计算方法为：

结果见表5。

数据处理：扭体次数以平均值±标准偏差表示，扭体次数组间差异用t检验。

表5紫金砂提取物对小鼠醋酸扭体反应的影响

注：与空白组比较，^*P＜0.05 ^**P＜0.01

2、小鼠热辐射甩尾实验

实验动物：ICR小鼠，体重18-22g，购自北京维通利华公司，饲养于本院实验动物中心。

受试样品：实施例1-5的提取物，萘普生(南京白敬宇制药有限公司)。

实验仪器：甩尾反应测试仪(model 7360，UGO BASILE S.R.L.，Italy)。

实验用试剂：均为国产分析纯。

实验方法及结果：

雄性小鼠70只，随机分成7组，每组10只。甩尾反应测试仪红外光源刺激强度调整为50V，将小鼠尾部距尾尖3cm处置于红外光源窗口，打开光源并记录甩尾反应潜伏时间；实验前测定两次反应时间并取其平均值作为基础阈值。腹腔给受试样品，空白对照组给予同体积的生理盐水。分别于给药后0.5h、1h、1.5h、2h后测定甩尾反应潜伏时间，最大反应时间设定为15s。结果见表6。

数据处理：甩尾反应潜伏时间(单位为s)以平均值±标准偏差表示，组间差异用t检验。

表6 紫金砂提取物对小鼠热辐射甩尾反应时间的影响

注：与相应时间的空白组比较，^*P＜0.05 ^**P＜0.01

结论：研究表明，实施例1-5的提取物对小鼠醋酸扭体反应、小鼠热辐射甩尾反应有不同程度的抑制作用，显示本发明制得的紫金砂提取物具有显著的镇痛活性。

实施例9紫金砂提取物急性毒性实验

取18-20克雌雄各半的ICR小鼠40，禁食12小时，不禁水，以浓度为0.30g/ml的实施例4制得的提取物灌胃给药，0.4ml/20g，连续观察7天，记录毒性反应，7天后重复测量体重，未死亡小鼠于7天后处死进行尸检。50小鼠受试当天见自发活动明显减少、俯卧、精神萎靡、摄食较少、但毛色正常，第二天稍有恢复，第三天小鼠活动、摄食量均正常，且一周内无死亡及其异常发生。实验结束时解剖未见明显病理改变。上述实验结果表明，富含香豆素和色原酮的紫金砂一次灌胃给药最大耐受量＞6g/kg，远远高于文献报道的0.45g/kg的最小致死剂量。

实施例10紫金砂提取物片的制备

实施例4所得的紫金砂提取物    100g

淀粉                         100g

上述组分混合均匀，加滑石粉适量，压制成1000片。

实施例11紫金砂提取物复方制剂的制备

实施例4所得的紫金砂提取物    100g

延胡素生物碱提取物           50g(主要含DL-四氢巴马汀，购自大兴安岭林格贝有机食品有限公司)

上述组分混合均匀，装入硬明胶胶囊中，共1000粒胶囊。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (11)

1.一种紫金砂提取物，其含有香豆素和色原酮类成分，其中，所述香豆素类成分为选自水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、异欧前胡素、奥斯索、佛手柑内酯、欧前胡素、二氢欧山芹素、异虎耳草素、氧化前胡素乙基醚中的一种或多种，所述色原酮类成分为3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚、拐芹色原酮、ledebouriellol的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的提取物，其中，以提取物总重量计算，香豆素类和色原酮类成分以重量比计算分别为40-100％，优选为60-80％。

3.根据权利要求1所述的提取物，以提取物的总重量计算，水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、异欧前胡素、3’R-(+)-亥茅酚、3’-O-乙酰基亥茅酚五种成分以重量比计算，含量分别为：10-30％、0.6-3.0％、1.0-6.0％、0.3-1.5％和0.1-1.0％；优选为15-25％、1.0-2.0％、1.0-3.5％、0.5-1.3％和0.3-0.7％。

4.权利要求1-3中任一项所述提取物的制备方法，包括如下步骤：

1)将紫金砂药材以溶剂提取法或CO₂超临界萃取法进行提取，浓缩后得到粗提物；

2)取药材粗提物在水中分散均匀，用低极性溶剂进行萃取，得到萃取液；

3)萃取液蒸干，用低极性溶剂超声洗涤，静置，过滤沉淀，干燥；或者按照4)处理萃取液，将萃取液过大孔树脂柱，乙醇洗脱，浓缩洗脱液，蒸干，得到产品。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，步骤1)中所述的溶剂提取法包括如下步骤：取适量紫金砂药材粉碎，加入固液体积比为1∶6-1∶10的溶剂，加热回流提取，然后合并提取液，减压浓缩至干，其中所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮、或者它们的混合物，优选地，所述溶剂为乙醇。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，步骤1)所述的CO₂超临界萃取法，包括如下步骤：取适量紫金砂药材粉碎，过20-60目筛；以无水乙醇作夹带剂，在萃取温度40-50℃、萃取压力25-45MPa时提取1小时，将萃取物于40-50℃减压蒸干。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述步骤2)包括以下步骤：将步骤1)中的粗提物在水中分散均匀，然后按照1∶2-1∶4的体积比加入低极性的溶剂萃取2-3次，其中所述低极性的溶剂选自烷烃类、酯类或醚类，优选为石油醚、环己烷、乙酸乙酯。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述步骤3)包括如下步骤：将步骤2)中得到的萃取液蒸干，浓缩成膏状，加入石油醚，超声30分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤，干燥得到提取物。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述步骤4)包括如下步骤：将步骤2)中萃取液蒸干，用10-30％的乙醇溶散均匀，上大孔树脂柱，树脂柱径高比1∶6-1∶10，上样后用4-8倍BV的10-40％乙醇洗去杂质，除杂流速为1.5-6BV/h，再用3-10倍BV的60-95％乙醇洗脱，洗脱液流速为3-9BV/h，收集后者洗脱部分，减压浓缩至干，得到紫金砂提取物，其中大孔树脂优选为弱极性或中等极性的树脂HP20、AB-8、I-IPD400、D101、D4006、X-5，更优选为AB-8型树脂。

10.根据含有权利要求1-3任一项所述提取物制备的药物组合物，所述提取物可以单独或与其他任何中西药按任意比例配伍，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂。

11.含有权利要求1-3任一项所述提取物用于制备治疗炎症或疼痛的药物的用途，其中，所述炎症包括痛风性关节炎、风湿性关节炎和类风湿性关节炎，所述疼痛包括痛风性关节痛、风湿性关节痛、类风湿性关节痛、头痛、腹痛、胃痛和跌打损伤痛。

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