CN102183599A - 用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法 - Google Patents

Abstract

一种用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜替代原萃取剂，在18.45℃～189℃的温度下，用中药常用的提取方法提取，滤过，为供试品溶液，采用常用毛细管电泳技术，根据中药的特点选择毛细管电泳类型，将供试品溶液瓶置于进样器中开始分析。本发明中的二甲基亚砜能够在高于18.45℃的常温下，用超声法快速一次性将中药材或中药制剂的所有成分提取出来，且二甲基亚砜是大极性溶剂，非常适合电泳分离，可以在不添加操作缓冲液的情况下直接将中药的二甲基亚砜提取液进行电泳分离分析，这样的结果就是包含了中药材或中药制剂水溶成分、油溶成分、挥发成分、微量成分和痕量成分的完整的、不失真的毛细管电泳谱图，是真正意义上的中药指纹图谱。

Description

用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法

技术领域

本发明涉及一种方法，特别是一种用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法。

背景技术

毛细管电泳技术又称高效毛细管电泳法，是以弹性石英毛细管或平板芯片为分离通道，以高压直流电场为推动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的新型液相分离技术。它包含电泳、色谱及其交叉内容，具有：仪器简单、操作简便；分析速度快，分离效率高；操作模式多，开发分析容易；实验成本低、消耗溶剂少，对环境污染小等优点。

目前使用毛细管电泳技术分析中药材或中药制剂时，通常采用水、甲醇、乙醇、丙酮等萃取剂分别提取它们的水溶成分和油溶成分。水溶成分的水提取液可以直接加入操作缓冲液中进行电泳分析，所得到的是中药材或中药制剂水溶成分的电泳谱图。由于经缓冲液稀释，其中的微量成分、痕量成分可能无法经电泳分离检出，且在水提取的过程中，热敏、易水解、易氧化等成分可能被破坏，因此得到的电泳谱图显然是失真而且不完整的。由甲醇、乙醇、丙酮等萃取剂提取的中药材或中药制剂油溶成分的提取液，因与操作缓冲液的极性不同，须挥干萃取剂后，才能将提取物溶解于缓冲液中，还需要加入有机溶剂增加油溶成分在缓冲液中的溶解率，虽然能够得到中药材或中药制剂油溶成分的电泳谱图，但由于在挥干萃取剂的过程中，中药材或中药制剂的挥发成分亦同时散失，所以最后的结果也是失真和不完整的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直接用二甲基亚砜作为萃取剂对中药材和制剂进行提取分析，能一次性将水溶、油溶、挥发等中药的所有成分完全提取的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：一种用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜替代原萃取剂，在18.45℃～189℃的温度下，用中药常用的提取方法提取，滤过，为供试品溶液，采用常用毛细管电泳技术，根据中药的特点选择毛细管电泳类型，然后按照电泳仪器系统操作手册开机，预热，输入各项参数，将供试品溶液瓶置于进样器中开始分析，根据初试的电泳谱图调整仪器系统的各项参数和操作缓冲液以获得优化结果，使用不同的检测器获取其所含成分的电泳谱图、分子质量信息和结构信息。

本发明的目的还可以通过以下措施来达到：如果用常用方法提取的提取液粘度大，可采用离心分离，取上清液为供试品溶液，替代滤过。所述的中药常用提取方法包括超声法提取，采用超声处理15～120分钟提取，滤过。所述的中药常用萃取方法还包括渗漉法、浸渍法、煎煮法、回流法、蒸馏法、升华法、旋流法、逆流法、压榨法、微波法。所述的毛细管电泳类型为常用的毛细管电泳类型，包括毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管电动色谱、多维毛细管电泳、阵列毛细管电泳、芯片式毛细管电泳、微全分析系统。所述的缓冲液可采用二甲基亚砜，如果供试品溶液中各种成分的浓度高，可用5～10倍二甲基亚砜稀释，以获得好的峰型，也可根据中药的不同特性选用常用的操作缓冲液配合，包括磷酸盐、尿素、硼砂溶液，以获得最佳的分离效果。电泳电压为3KV～25KV。所述的检测器可采用紫外-可见光分光光度检测器、激光诱导荧光检测器、质谱检测器。所述的二甲基亚砜还可与0.5％～70％水混合，作为萃取剂。二甲基亚砜与水的混合液对中药的提取温度为-20℃～100℃。

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、二甲基亚砜能够在高于18.45℃的常温下，用超声法快速一次性将中药材或中药制剂的所有成分提取出来，且二甲基亚砜是大极性溶剂，非常适合电泳分离，可以在不添加操作缓冲液的情况下直接将中药的二甲基亚砜提取液进行电泳分离分析，这样的结果就是包含了中药材或中药制剂水溶成分、油溶成分、挥发成分、微量成分和痕量成分的完整的、不失真的毛细管电泳谱图，是真正意义上的中药指纹图谱。且操作简便安全、提取时间短。由于二甲基亚砜具有诱导细胞成熟的重要功能，广泛应用于细胞生物学实验，因此在研究中药成分的细胞吸收、分配、毒性、排除、代谢作用机理方面，二甲基亚砜作为中药的萃取剂具有其他萃取剂无可比拟的优势，本方法为中药的现代研究建立一个新的平台。

2、二甲基亚砜与不同比例的水混合作为萃取剂，能降低提取的温度和平衡无机盐等水溶成分的溶解率。在实际操作时，根据不同中药的特性，将中药的二甲基亚砜提取液与常用的硼砂、尿素、磷酸盐溶液等缓冲液混合，能够在谱图中得到理想的峰形。

3、本方法用毛细管电泳技术分析中药的二甲基亚砜提取液，定性定量测定其所含成分；使用质谱检测器获取其所含成分的分子质量信息和结构信息；测定其所含成分经细胞、细菌、动物等吸收、转化、分布、排除、代谢后的变化，了解活性成分、毒性成分以及各种成分相互之间的作用机理，并为化学合成筛选先导化合物。

4、本方法首先得到的是包含了中药所有成分在内的电泳谱图，是真正意义上的中药指纹图谱，并且操作简便，重现性好。由于中药成分在二甲基亚砜中的溶解率高，且二甲基亚砜的极性大，可以直接将提取液进行电泳分析而无需加入缓冲液，避免微量、痕量成分因缓冲液稀释无法检出，加上毛细管电泳技术分离效率高的特点，因此萃取技术与分析方法的配合极具先进性。采用质谱检测器获得的各种成分的分子质量信息和结构信息，为完全明确中药成分的化学结构提供一个彻底的解决方法，为中药质量标准化工作提供彻实可行的途径。

具体实施方式

本发明下面将结合实施例作进一步详述：

实施例一

制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜替代原萃取剂，在25℃的温度下，超声处理30分钟提取，滤过，如果提取液粘度大，可采用离心分离，取上清液为供试品溶液。如果供试品含生物酶、蛋白质等易氧化、易变性、热敏成分，应采用渗漉法或浸渍法制备供试品溶液。

根据中药的特点选择毛细管区带电泳，按照仪器系统操作手册开机，预热，输入各项参数，将供试品溶液瓶置于进样器中开始分析。根据初试的电泳谱图调整仪器系统的各项参数和操作缓冲液以获得优化结果，而后用优化条件正式分析。

本例进样方法采用压力进样；电泳电压采用10KV；测试温度25℃；采用紫外-可见光分光光度检测器作为毛细管电泳的检测器。

计算的方法、公式均可参照《中国药典》高效液相色谱法的有关规定，将保留时间(t_R)改为迁移时间(t_m)即可。

如果采用质谱检测器可以得到分子离子M+、碎片离子Fi+等相对分子质量信息和结构信息，高分辨质谱检测器还能提供元素组成。

分析完成后用水冲洗毛细管，最后关机。

药理分析：将中药的二甲基亚砜提取液透过细胞层次ADME/Tox研究系统(例如Caco-2、MDCK细胞单层吸收模型)或与细胞、细菌共育和动物实验，通过它们吸收、转化、分布、排除、代谢，取样用毛细管电泳技术分析，比对中药成分前后发生的变化，将活性成分、毒性成分和各种成分之间相互作用的机理用现代技术手段加以分析，使传统中医药理论体系与现代医学模式接轨，并为化学合成筛选先导化合物。

以细胞层次上的实验为例，在ADME/Tox研究系统中，将Caco-2或MDCK细胞接种在专用于药物转运实验的Transwell池中，经细胞汇合、分化达到细胞单层完整时，将中药的二甲基亚砜提取液注入池子的顶端，然后在不同的时间从池子的底端抽取经细胞扩散吸收、代谢后的产物和池子顶端的中药二甲基亚砜提取液，用毛细管电泳技术进行分析，比对各种成分前后发生的变化，了解它们的作用机理。也可将中药的二甲基亚砜提取液加入细胞培养基(液)中进行细胞培养一段时间(如温育两天)，取样用毛细管电泳技术分析，比对各种成分前后发生的变化。特别是其中胞浆酶活性的大小直接对应死亡细胞的数量，是研究中药毒副作用的方法之一。

通过细胞、细菌和动物模型实验，从中药的活性成分中筛选出适合于化学合成的先导化合物，为新药的研发提供一条便捷的途径。

实施例二

制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜替代原萃取剂，在18.45℃的温度下，超声处理15分钟提取，滤过，为供试品溶液。

本例毛细管电泳类型选择胶束电动毛细管色谱；进样方法采用负压进样；电泳电压采用3KV；采用激光诱导荧光检测器作为毛细管电泳的检测器。其它步骤及原理与实施例一相同。

实施例三

制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜替代原萃取剂，在189℃的温度下，超声处理120分钟提取，滤过，为供试品溶液。其它步骤及原理与实施例一相同，本例适用于石决明等中药。

本例毛细管电泳类型选择毛细管电动色谱；进样方法采用虹吸进样；电泳电压采用25KV；采用质谱检测器作为毛细管电泳的检测器。其它步骤及原理与实施例一相同。

实施例四

制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜替与0.5％水混合，代替原萃取剂，在-20℃的温度下，浸渍48小时，压榨提取，滤过，为供试品溶液。

本例毛细管电泳类型选择阵列毛细管电泳；进样方法采用电动进样；电泳电压采用15KV；采用质谱检测器作为毛细管电泳的检测器。其它步骤及原理与实施例一相同。

实施例五

制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜替与70％水混合，代替原萃取剂，在100℃的温度下，煎煮2小时，提取，滤过，取上清液为供试品溶液。

本例毛细管电泳类型选择芯片式毛细管电泳，其它步骤及原理与实施例一相同。

实施例六

制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜与35％水混合，代替原萃取剂，在45℃的温度下，超声处理30分钟提取，滤过，为供试品溶液。

本例毛细管电泳类型选择微全分析系统，其它步骤及原理与实施例一相同。

二甲基亚砜可以作为操作缓冲液，如果供试品溶液中各种成分的浓度高，可用5～10倍二甲基亚砜稀释，以获得好的峰型。也可根据中药的不同特性选用磷酸盐、尿素、硼砂溶液等常用的操作缓冲液配合，以获得最佳的分离效果。

Claims (10)

1.一种用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：制备供试品溶液，按规定称取中药材或中药制剂，并进行前处理，按同一项下规定的萃取剂量用二甲基亚砜替代原萃取剂，在18.45℃～189℃的温度下，用中药常用的提取方法提取，滤过，为供试品溶液，采用常用毛细管电泳技术，根据中药的特点选择毛细管电泳类型，然后按照电泳仪器系统操作手册开机，预热，输入各项参数，将供试品溶液瓶置于进样器中开始分析，根据初试的电泳谱图调整仪器系统的各项参数和操作缓冲液以获得优化结果，使用不同的检测器获取其所含成分的电泳谱图、分子质量信息和结构信息。

2.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：如果用常用方法提取的提取液粘度大，可采用离心分离，取上清液为供试品溶液，替代滤过。

3.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：所述的中药常用提取方法包括超声法提取，采用超声处理15～120分钟提取，滤过。

4.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：所述的中药常用萃取方法还包括渗漉法、浸渍法、煎煮法、回流法、蒸馏法、升华法、旋流法、逆流法、压榨法、微波法。

5.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：所述的毛细管电泳类型为常用的毛细管电泳类型，包括毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管电动色谱、多维毛细管电泳、阵列毛细管电泳、芯片式毛细管电泳、微全分析系统。

6.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：所述的缓冲液可采用二甲基亚砜，如果供试品溶液中各种成分的浓度高，可用5～10倍二甲基亚砜稀释，以获得好的峰型，也可根据中药的不同特性选用常用的操作缓冲液配合，包括磷酸盐、尿素、硼砂溶液，以获得最佳的分离效果。

7.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：电泳电压为3KV～25KV。

8.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：所述的检测器可采用紫外-可见光分光光度检测器、激光诱导荧光检测器、质谱检测器。

9.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：所述的二甲基亚砜还可与0.5％～70％水混合，作为萃取剂。

10.根据权利要求1所述的用毛细管电泳技术分析中药二甲基亚砜提取液的方法，其特征在于：二甲基亚砜与水的混合液对中药的提取温度为-20℃～100℃。