CN102181520A - 甲基化slc19a3基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物技术领域，具体提供甲基化SLC19A3基因在制备肿瘤诊断、检测和筛查药物中的应用。SLC19A3基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，这是因为其启动子区DNA发生了肿瘤特异性的高甲基化，逆转该基因的DNA甲基化，可以恢复SLC19A3基因在肿瘤细胞中的表达。甲基化SLC19A3基因可以在肿瘤患者的外周血中检测到，而且，甲基化水平同肿瘤进展密切相关。因此在外周血中检测SLC19A3基因的DNA甲基化，是检测肿瘤进展以及人群筛查和诊断肿瘤的一种无创性新方法。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体是一种甲基化的新抑癌基因SLC19A3基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。
背景技术
肿瘤的发生发展是一个多步骤的每次过程，涉及到癌基因的活化和抑癌基因的失活。通过检测这些发生改变的癌基因和抑癌基因，可以在分子水平上早期检测到肿瘤的发生，从而为及时的干预阻挡创造机会。随着对肿瘤研究的深入，目前肿瘤的诊断和临床治疗都已经开始在分子水平展开。通过PCR和蛋白组学等技术，开发新的肿瘤相关标记物，正在日益提高肿瘤的早期诊断水平。而早期诊断和早期治疗是提高肿瘤治愈率的关键。同时，在分子诊断肿瘤的基础上，开展针对肿瘤细胞的特异性治疗，可以避免对正常细胞的毒副作用，从而可以增加治疗剂量，提高治疗效果。
随着分子生物学的进展，越来越多的抑癌基因被发现和鉴定，不仅拓展了我们对肿瘤发生的认识，也为肿瘤诊治手段的开发提供了更多的机会。人SLC19A3基因（solute carrier family 19
member 3）（Genbank No. NM_025243.3），又名Thiamine transporter 2 （ThTr-2)是一种跨膜转运蛋白。发明人在前期研究中发现该基因是一个新的抑癌基因。抑癌基因的异常失活是由先天遗传和后天渐成（也称为表观遗传）的因素造成的。启动子的高甲基化是基因的表观遗传状态发生改变的主要形式，它是导致抑癌基因转录静默的主要原因之一，从而引起肿瘤的发生和发展。因此启动子高甲基化可以用来筛选和鉴定新的抑癌基因，而抑癌基因的启动子高甲基化水平可以作为癌症诊断和预后的生物标记物。
发明内容
本发明旨在以SLC19A3基因的 DNA甲基化为基础的检测手段，提供甲基化SLC19A3基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。
为实现发明目的，发明人提供如下技术方案：
甲基化SLC19A3基因的应用，是指甲基化SLC19A3基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。
本发明从实验得知，SLC19A3基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，这是因为其启动子区DNA发生了肿瘤特异性的高甲基化。逆转该基因的DNA甲基化，可以恢复SLC19A3基因在肿瘤细胞中的表达。甲基化SLC19A3基因可以在肿瘤患者的外周血中检测到，而且，其数量同肿瘤进展密切相关。因此在外周血中检测SLC19A3基因的DNA甲基化，是一种检测肿瘤进展以及人群筛查和诊断肿瘤的无创性新方法。
发明人和其他研究者都发现在胃癌和胃增生组织中有很多肿瘤相关的基因因为启动子的超甲基化而产生转录静默，SLC19A3 基因(solute carrier family 19，member 3)是发明人研究发现的其中一个新的基因，因SLC19A3 基因启动子的超甲基化而在胃癌细胞系中低表达，而且在胃癌细胞系中表达外源SLC19A3基因后可以显著抑制细胞的增殖，同时发明人也在胃癌和胃增生组织中也证实SLC19A3基因的启动子甲基化水平明显高于正常组织。以上实验都表明SLC19A3基因是一个抑癌基因，其启动子的甲基化水平可以作为胃癌早期诊断的生物标记物。
作为优选，根据本发明所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查药物中至少包括一对特异扩增甲基化SLC19A3基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物（SLC19A3 MSP-F）具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；下游引物（SLC19A3 MSP-R）具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
作为优选，根据本发明所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查药物以SLC19A3基因的DNA甲基化为基础的检测手段，所述的检测手段包括MSP法、BGS法和MSRED-qPCR法。
通过对SLC19A3 基因mRNA的核酸序列分析，发明人发现在它的第一个外显子中存在一个经典的CpG岛（CGI）（图2 ），序列分析的标准如下：GC含量>55%，ObsCpG/ExpCpG> 0.65， 长度大于500个碱基。因此我们采用甲基化特异性PCR（MSP）和亚硫酸盐处理后的基因组测序（BGS）来进一步验证SLC19A3基因启动子的甲基化。同时，鉴于现有DNA甲基化检测方法存在复杂和通量低的不足，发明人开发了一种简单方便、灵敏度和可行性高的新方法-即MSRED-qPCR法（甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合方法）。
作为更优选，根据本发明所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查药物以SLC19A3基因的DNA甲基化为基础的检测手段，所述的检测手段为MSRED-qPCR法。
近年来的研究发现，肿瘤病人血清和血浆中甲基化的DNA水平显著高于正常人群，为了进一步验证SLC19A3基因在肿瘤病人血浆中SLC19A3基因的启动子甲基化水平，同时也为了开发一种简捷快速的检测SLC19A3基因的启动子甲基化的方法，发明人开发出一种以甲基化敏感的限制性内切酶和Real-time PCR联合的方法（MSRED-qPCR）来快速稳定的检测血浆中的SLC19A3基因的启动子甲基化水平。通过对胃癌和乳腺癌病人血浆中甲基化SLC19A3基因的检测证实，该方法能简捷且特异性的检测血浆中SLC19A3基因的启动子甲基化的异常水平。因此发明人认为SLC19A3基因的启动子甲基化水平可以作为胃癌和乳腺癌诊断的生物标记物，MSRED-qPCR法是一种操作简单稳定，灵敏度高的检测DNA甲基化的方法，可以作为开发启动子甲基化生物标记物的一个很好的平台。MSRED-qPCR法采用简单的甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应（qPCR）的方法，即简捷方便，又可以有很高的通量，同时对照的非甲基化和甲基化DNA的引入可以保证酶切能彻底的完成。亚硫酸盐处理的方法不仅复杂和通量低，而且由于需要分别使用甲基化和非甲基化的两对引物，因引物的扩增效率不同会存在一定的偏差而不能进行定量分析。
作为优选，根据本发明所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其中，所述的肿瘤诊断、检测或筛查药物以甲基化SLC19A3基因为靶点。
作为优选，根据本发明所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其中，所述的肿瘤包括但不限于胃癌肿瘤和乳腺癌肿瘤。
作为优选，根据本发明所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其中，所述的药物为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供了一种甲基化的新抑癌基因在制备肿瘤诊断、检测和筛选药物中的应用，以甲基化SLC19A3基因为基础的诊断药物可方便快捷的在分子水平上实现肿瘤的检测，同时，以甲基化SLC19A3基因为靶点和核心的药物可望成为肿瘤靶向诊断、检测和筛选的一种新手段。
附图说明
图1是SLC19A3在去甲基化药物处理前后肿瘤细胞中的表达分析（RT-PCR法）。SLC19A3在大部分肿瘤细胞中的表达在去甲基化药物处理后显著升高。
图2是SLC19A3基因的启动子CpG岛示意图。SLC19A3基因含有一个典型的CpG岛，预示该基因可能受到DNA甲基化的调控。
图3是MSP（甲基化特异PCR）方法检测肿瘤细胞中SLC19A3基因启动子DNA的甲基化情况。M表示甲基化；U表示非甲基化。
图4是BGS（亚硫酸氰盐修饰后测序）法检测SLC19A3基因启动子DNA的甲基化情况。黑圈代表甲基化；白圈代表非甲基化。
图5 MSP（甲基化特异PCR）方法检测肿瘤组织中SLC19A3基因启动子DNA的甲基化情况。M表示甲基化；U表示非甲基化。
图6是MSRED-qPCR法（甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合方法）检测外周血中甲基化SLC19A3基因与肿瘤的关系。
图7是外周血中SLC19A3基因甲基化定量分析技术用来诊断胃癌的敏感性-特异性分析曲线。
图8是外周血中SLC19A3基因甲基化定量分析技术用来诊断乳腺癌的敏感性-特异性分析曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
本发明所述的新抑癌基因SLC19A3基因的DNA甲基化在开发肿瘤诊断、检测和筛选手段中的应用，可参考常规的药物配置方法和试剂开发。药物剂型和生物制剂为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册（New York：Cold Spring Harbor
Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
试验试剂：Trizol试剂，小牛血清（FBS），磷酸盐缓冲液(PBS), RPMI-1640培养基，青霉素-链霉素(P/S)和0.25%(W/V) 胰蛋白酶/1 mM EDTA（Trypsin-EDTA）购于Invitrogen (USA)。肿瘤细胞系（AGS, Kato III, MKN28,
MKN45, NCI-N87, SNU1和SNU16）分别从日本的Riken BioResource Center细胞库和美国的ATCC购买。逆转录反应（RT）使用High Capacity cDNA Reverse
Transcription试剂盒（美国Applied Biosystem公司）。亚硫酸氰盐修饰试剂盒以及MSP和BGS所用DNA聚合酶均购自美国Zymo公司。
实施例
1 RT-PCR
实验检测
SLC19A3
基因在去甲基化药物处理前后肿瘤细胞中的表达
1.细胞培养
所有细胞均采用RPMI-1640培养基，其中含100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素和10%FBS，于37℃ 5% CO2培养箱中进行培养。去甲基化药物的使用是参照常规的Aza（5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷）应用流程：10mM的Aza处理肿瘤细胞，连续3天，每天更换培养液。同等量DMSO处理3天后的细胞用来作为对照。
2.总RNA抽提试剂盒
细胞的总RNA是用Invitrogen公司的Trizol试剂按照生产厂商提供的方法分离提取。该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶的环境。
3.总RNA的抽提
吸干细胞培养液后，直接加入1ml Trizol，室温下静置5分钟，收集细胞到1.5ml离心管中。加入氯仿后，4ºC离心分层；将上层水相转入新鲜1.5ml离心管，加入1ml异丙醇，4ºC离心沉淀RNA；用1.5ml75%乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定：紫外分光光度计测定260/280比值（确认比值均在1.7-2.0）。并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。
4.cDNA的合成
逆转录反应（RT）使用美国Applied Biosystem公司的High Capacity cDNA Reverse
Transcription试剂盒，每个反应使用2微克总RNA。加入2×RT buffer10微升和总RNA10微升，反应总体积为20微升。使用ABI PCR仪进行逆转录反应，具体运行参数如下：25ºC 10分钟；37ºC 120分钟；85ºC 5分钟；冷却至4ºC。-20ºC保存备用。
5.实时定量PCR
采用定量实时RT-PCR来比较分析组织中SLC19A3基因的mRNA水平，用GAPDH作为对照。聚合酶链反应（PCR）使用美国Applied Biosystem公司的定量RT-PCR试剂盒（Power Sybr green）。反应总体积为20微升：采用1微升cDNA模板，加入2×PCR buffer10微升，高纯去离子水9微升。反应参数如下：95ºC预热2分钟；40个循环设置如下，95ºC，30秒；60ºC，1分钟。
6.PCR所用引物
PCR使用所有引物均在Invitrogen公司合成。具体序列如下：
SLC19A3基因的RT-PCR引物：
SLC19A3-F（上游引物）: TTCTCCATGATGAGACCCTC （SEQ ID NO.3），
SLC19A3-R（下游引物）: ATGATGACTGGCTTGTAGCG. （SEQ ID NO.4）。
GAPDH的RT-PCR引物：
GAPDH-F（上游引物）: GGAGTCAACGGATTTGGT（SEQ ID NO.5），
GAPDH-R（上游引物）: GTGATGGGATTTCCATTGAT（SEQ ID NO.6）。
7.结果分析
结果如图1所示，肿瘤细胞去甲基化后，SLC19A3基因表达显著升高，表明SLC19A3基因可能受到DNA甲基化调控。
实施例
2 MSP
法检测肿瘤细胞中
SLC19A3
基因的
DNA
甲基化
1.细胞培养
参照实施例1。
2.DNA抽提
将匀浆器等在200ºC干烤4小时，去除RNA酶，冷却；将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4ºC离心分层；将中层固相转入一新鲜离心管中，加0.3ml无水乙醇（按照1ml Trizol计算），混匀后室温静置3分钟，4ºC不超过2000g离心沉淀DNA；收集上清，用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠（1ml每1ml Trizol）洗涤DNA沉淀；室温静置30分钟，4ºC不超过2000g离心沉淀DNA；收集上清重复一次；用75%乙醇洗涤DNA沉淀，每用1ml Trizol加入1.5-2ml75%乙醇，室温静置10-20分钟，4ºC不超过2000g离心沉淀DNA；风干后用8mM NaOH溶解沉淀。抽提的DNA质量鉴定：紫外分光光度计测定260/280nm比值，比值均在1.8左右。
3.亚硫酸氰盐修饰
基因组DNA的亚硫酸庆盐修饰是用ZYMO公司DNA Modification Kit按照生产商提供的操作步骤进行。重亚硫酸氢盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，从而反映出单个胞嘧啶的甲基化状态。具体步骤如下：取130μl CT 转化试剂到20μl基因组DNA溶液中，然后将混合液98℃孵育10分钟，64℃孵育2.5小时，4℃孵育20小时；将此150μl混合液及600μl M-结合缓冲液加到Zymo-Spin™ IC 柱中，全速离心30秒，弃去滤出液体，加100μl M-洗涤液至过滤柱中洗柱；洗柱后往过滤柱中加入200μl M-Desulphonation 缓冲液，室温放置15分钟，全速离心后，用M-Wash Buffer洗柱两次；最后用10μl M-洗脱液溶解吸附柱上的DNA，离心收集修饰后DNA。
4.MSP
SLC19A3基因启动子超甲基化的检测用MSP方法检测，使用美国Zymo公司的GoTaq聚合酶。反应总体积为20微升：以 1μl亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，上下游特异性引物各1μl， 2× Zymo Taq premixed 10μl，高纯去离子水7μl。反应参数如下：95ºC预变性5分钟；40个循环设置如下，95ºC变性30秒；62ºC退火30秒，72ºC延伸30秒；最后72ºC延伸10分钟。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
PCR使用所有引物均在Invitrogen公司合成。具体序列如下：
SLC19A3 MSP：
MSP-F（甲基化特异性上游引物）：5′-TTGGATTTATTCGATAGTCGC （SEQ ID NO.1），
MSP-R（甲基化特异性下游引物）： 5′-CCAACACGCGAACTACGACG（SEQ ID NO.2），
SLC19A3 USP：
USP-F（非甲基化特异性上游引物）：5′-TGTTTGGATTTATTTGATAGTTGT（SEQ ID NO.7），
USP-R（非甲基化特异性下游引物）：5′-CCCAACACACAAACTACAACA（SEQ ID NO.8）。
5.结果分析
SLC19A3基因在肿瘤细胞中因高度甲基化而表达下降（图3，M代表高甲基化；U代表低甲基化）。
如图3所示，AGS，MKN45，MKN28和SNU1等SLC19A3基因的mRNA水平下调的细胞中SLC19A3基因的启动子明显被甲基化，而在SLC19A3基因表达正常的KatoIII和N87细胞，正常胃组织以及SLC19A3基因表达缺失的细胞中没有检测到明显的启动子甲基化。
实施例
3 BGS
法检测肿瘤细胞中
SLC19A3
基因的
DNA
甲基化
1.细胞培养
参照实施例1。
2.DNA抽提
参照实施例2。
3.亚硫酸氰盐修饰
参照实施例2。
4.BGS-PCR
SLC19A3基因启动子超甲基化的检测用BGS方法验证，使用美国Zymo公司的GoTaq聚合酶。反应总体积为20微升：以 1μl亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，上下游特异性引物各1μl， 2× Zymo Taq premixed 10μl，高纯去离子水7μl。反应参数如下：95ºC预变性5分钟；40个循环设置如下，95ºC变性30秒；58ºC退火30秒，72ºC延伸30秒；最后72ºC延伸10分钟。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
PCR使用所有引物均在Invitrogen公司合成。具体序列如下：
SLC19A3 BGS：
BGS-F（上游引物）：5′-GGAAAATTTGGGTTTTTATAT（SEQ ID NO.9），
BGS-R（下游引物）：5′-GAAATATAACCATAAAAAATACTAA（SEQ ID NO.10）。
5.PCR产物的转化
运用TOPO技术，连接到TOPO PCR4载体（美国Invitrogen公司）。具体步骤如下：取新鲜PCR产物2微升，加入TOPO 载体1微升，试剂盒中氯化钠溶液1微升，高纯无离子水2微升。室温下孵育10分钟。
开始细菌转化：将TOPO反应产物加入冰浴融化的感受态细菌中，冰浴孵育半小时，42ºC热休克90秒，加入试剂盒中SOB培养液1毫升，37ºC低速培养1小时，再将细菌培养液接种在含青霉素培养LB板中继续常规培养过夜。第二天，挑取克隆培养送测序。
6.结果分析
SLC19A3基因在肿瘤细胞中高度甲基化，同实施例2的MSP法结果一致（图4，CpG用圆圈表示，黑色代表高甲基化，白色代表低甲基化；具体位置参考图2）。
结果如图4所示，SLC19A3基因表达下调并且MSP阳性的AGS和MKN28细胞中SLC19A3基因启动子被超甲基化，而在KatoIII和N87细胞中SLC19A3基因的启动子几乎没有被甲基化。
实施例
4 MSP
法检测肿瘤组织中
SLC19A3
基因的
DNA
甲基化
1.组织分离
所有标本均经病理确认。手术切除标本一经离体，迅速切取肿瘤病灶及癌旁组织，放入液氮中保存。
2.DNA抽提
参照实施例2。
3.亚硫酸氰盐修饰
参照实施例2。
4.MSP
参照实施例2。
结果分析
SLC19A3高度甲基化发生在52%（51/101）肿瘤组织中和32%（8/25）癌前病变肠化生组织中（图5）。
实施例
5 MSRED-qPCR
法检测外周血中甲基化
SLC19A3
基因
1.外周血样的收集
收集5毫升外周静脉血，2000转/分离心收集血浆，保留于-80°C备用。
2.DNA抽提
使用Invitrogen的Trizol试剂和Qiagen的QIAmp DNA Blood Mini试剂盒抽提DNA。具体步骤如下: 加入200微升缓冲液AL到200微升血浆中，震荡混匀15秒；56度孵育10分钟；加入200微升乙醇（纯度为96%以上），震荡混匀15秒；加到QIAamp spin 柱，6000转/分离心1分钟；加入500微升AW1缓冲液以及AW2缓冲液各洗涤一次；加入200微升AE缓冲液洗脱DNA，保存备用。
3.酶切
使用30单位的BstU I酶（New England Biolabs，美国）来切割1微克DNA，在60度反应条件下反应16小时。
4.PCR
使用Qiagen公司的QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒，具体过程如下：2微升DNA，0.5μM引物（序列附后）以及SYBR Green PCR Master
Mix10微升。反应条件为95ºC预变性2分钟；40个循环设置如下，95ºC变性30秒；58ºC退火30秒，72ºC延伸30秒；最后72ºC延伸10分钟。引物序列如下：
SLC19A3
MSRED-F（上游引物）：5′-CCGCGTGCTGGGATTC（SEQ ID NO.11），
SLC19A3
MSRED-R（下游引物）：5′-TCCAGAAGGCTGCAAATGG（SEQ ID NO.12）。
计算公式如下：甲基化SLC19A3水平=2-∆Ct( 酶切后 DNA- 酶切前 DNA)。
5.结果分析
在肿瘤患者外周血中可检测到甲基化SLC19A3基因，其水平显著高于正常人群外周血甲基化SLC19A3基因水平（图6）。如图7所示，诊断胃癌的曲线下面积为87%（95%可信度：78.8-94.2%），敏感性为90%（95%可信度：75.2-97.1%），特异性为62%（95%可信度：45.6-76.4%）；如图8所示，诊断乳腺癌的曲线下面积为77%（95%可信度：67.1-86.4%），敏感性为82%（95%可信度：68.0-91.2%），特异性为60%（95%可信度：43.3-74.4%）。
结论：
SLC19A3基因在肿瘤细胞以及肿瘤组织中特异性低表达，而且同启动子区DNA高甲基化相关；逆转该基因的DNA甲基化，可以恢复SLC19A3基因在肿瘤细胞中的表达；肿瘤组织以及癌前组织中也可检测到SLA19A3基因的DNA甲基化；甲基化SLC19A3基因也可以在肿瘤患者的外周血中检测到，其水平显著高于正常人群外周血甲基化SLC19A3基因水平。诊断胃癌的曲线下面积为87%（95%可信度：78.8-94.2%），敏感性为90%（95%可信度：75.2-97.1%），特异性为62%（95%可信度：45.6-76.4%）；诊断乳腺癌的曲线下面积为77%（95%可信度：67.1-86.4%），敏感性为82%（95%可信度：68.0-91.2%），特异性为60%（95%可信度：43.3-74.4%）。因此在外周血中检测SLC19A3基因的DNA甲基化，是检测肿瘤进展以及人群筛查和诊断肿瘤的一种无创性新方法，在肿瘤的诊断、预防以及治疗中均有一定的应用价值。
尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。
SEQUENCE
LISTING
<110>
杭州博谱医药科技有限公司
<120>
甲基化SLC19A3基因的应用
<130>
002
<160>
12
<170>
PatentIn version 3.3
<210>
1
<211>
21
<212>
DNA
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人工序列
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1
ttggatttat
tcgatagtcg
c
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2
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20
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DNA
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人工序列
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2
ccaacacgcg
aactacgacg
20
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3
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20
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DNA
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人工序列
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3
ttctccatga
tgagaccctc
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4
atgatgactg
gcttgtagcg
20
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18
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DNA
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人工序列
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5
ggagtcaacg
gatttggt
18
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6
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6
gtgatgggat
ttccattgat
20
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7
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24
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tgtttggatt
tatttgatag
ttgt
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21
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cccaacacac
aaactacaac
a
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9
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21
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DNA
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人工序列
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ggtttttata
t
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10
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DNA
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人工序列
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人工序列
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11
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ggattc
16
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19
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DNA
<213>
人工序列
<400>
12
tccagaaggc
tgcaaatgg
19
Claims (7)
1.甲基化SLC19A3基因的应用，其特征在于，所述的应用是指甲基化SLC19A3基因在制备肿瘤诊断、检测或筛查药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断、检测或筛查药物中至少包括一对特异扩增甲基化SLC19A3基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断、检测或筛查药物以SLC19A3基因的DNA甲基化为基础的检测手段，所述的检测手段包括MSP法、BGS法和MSRED-qPCR法。
4.根据权利要求3所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断、检测或筛查药物以SLC19A3基因的DNA甲基化为基础的检测手段，所述的检测手段为MSRED-qPCR法。
5.根据权利要求1所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断、检测或筛查药物以甲基化SLC19A3基因为靶点。
6.根据权利要求1所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括胃癌肿瘤和乳腺癌肿瘤。
7.根据权利要求1或2或4或5或6所述的甲基化SLC19A3基因的应用，其特征在于，所述的药物为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
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