CN102181498A - 酶法制备磷脂酰胆碱型ω-3不饱和脂肪酸的方法 - Google Patents

酶法制备磷脂酰胆碱型ω-3不饱和脂肪酸的方法 Download PDF

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本发明涉及一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：所述方法包括如下工艺步骤：步骤一：以海豹油甘油三酯为原料，经脂肪酶选择性酶解并分离纯化，得到高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸；步骤二：将步骤一得到的高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸作为原料，加入溶血磷脂酰胆碱，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸产品。本制备方法成本低、污染小、纯度高，富含DPA、EPA和DHA。

Description

酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法
技术领域
本发明涉及一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法。
背景技术
磷脂酰胆碱被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”，被美国国家科学院食品营养学会列为每日必需营养素。而且美国、欧洲、日本等已将磷脂酰胆碱在临床上用于动脉粥样硬化、急慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、神经衰弱等疾病治疗。Ω-3不饱和脂肪酸（简称Ω-3）具有促进婴幼儿头脑和视力发育、预防心血管疾病、降血脂、延缓衰老、预防老年性痴呆、防止癌症等生理功能。近年来，Ω-3与磷脂酰胆碱的双重作用，成为医药研究的热门课题，引起人们的极大关注。
最近的研究表明，Ω-3的生理功能因其在脂肪中的分子形式不同而不同，Ω-3在磷脂酰胆碱分子中比在甘油酯分子中更利于人体消化吸收，其氧化稳定性更好，并且磷脂酰胆碱分子形态可以原封不动地被细胞摄取，在细胞内分解，显示出增效作用。比如，磷脂酰胆碱型Ω-3与乙酯/甘油酯型Ω-3相比，前者在降低血清胆固醇的作用方面作用更明显。当Ω-3挂在磷脂酰胆碱分子上的时侯, 磷脂酰胆碱型Ω-3更加容易通过血脑屏障，进入脑中。酒精对肝的损伤特点是纤维变性及磷脂结合的薄膜变异，而磷脂酰胆碱型Ω-3对酒精肝纤维变性有极好的延缓作用。磷脂酰胆碱型Ω-3具有细胞分化诱导的作用，更是引起研究人员的高度关注。所以磷脂酰胆碱型Ω-3作为食品添加剂、保健品、药品具有极高的商业价值。
虽然从鱼和鸡蛋中富集得到含Ω-3的磷脂酰胆碱是可以实现的，如中国专利申请03807522.9从鱼内脏中提取含有多不饱和脂肪酸组成的磷脂的脂质混合物的方法和中国专利申请200810016223.1一种提取富含二十碳五烯酸（EPA）及二十二碳六烯酸（DHA）磷脂的方法，都是以鱼类海产动物为原料提取磷脂酰胆碱型Ω-3。但是提取和分离的过程比较复杂，成本高，而且需要使用的有机溶剂较多，环保压力大。与传统的提取纯化技术相比，生物酶法具有成本低、污染小、无高温加工过程等优势，所以我们利用生物酶法制备富集Ω-3的磷脂酰胆碱，有利于市场大规模的推广，前景看好。这方面，如中国专利申请200710113934.6一种制备富含多不饱和脂肪酸磷脂的工艺，就是利用酶催化鱼油Ω-3和大豆磷脂合成磷脂型Ω-3，但是该专利的起始原料大豆磷脂是一种甘油酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、丝氨酸磷脂和磷脂酸的混合物，反应后不仅磷脂酰胆碱型Ω-3含量少，而且酯转化的反应转化率很低，更为不利于产业化的是该专利所用的反应介质R134a是一种化工原料，不能用于食品的生产。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种成本低、污染小、纯度高，富含DPA、EPA和DHA的酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括如下工艺步骤：
步骤一：以海豹油甘油三酯为原料，经脂肪酶选择性酶解并分离纯化，得到高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸；
步骤二：将步骤一得到的高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸作为原料，加入溶血磷脂酰胆碱，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸产品。
步骤二中所述的酶为脂肪酶、磷脂酶A1或磷脂酶A2。
步骤一中所述的脂肪酶由圆柱形假丝酵母菌、荧光假单胞菌、黑曲霉菌 、白地霉无根菌 、巢子须霉德氏根霉菌 、毛霉菌、绵毛状腐质霉菌或圆弧青霉菌产生。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
海豹油富含DPA、EPA、DHA，和母乳中Ω-3的组成类型完全一样，DPA 的功效是DHA的十倍以上，故选择海豹油甘油三酯作为原料，制备高纯度海豹油Ω-3不饱和脂肪酸，然后以高纯度海豹油Ω-3为原料获得的磷脂酰胆碱不仅含二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)，还含有二十二碳五烯酸(DPA)，这是和以鱼油Ω-3为原料得到的产品的区别。将这种磷脂酰胆碱型Ω-3添加到婴幼儿奶粉中，不仅有利于Ω-3的高效吸收，而且更加符合母乳配方的要求。
海豹油原油中Ω-3不饱和脂肪酸的含量为15-20%，利用脂肪酶的选择性，将Ω-3不饱和脂肪酸从海豹油甘油三酯中降解下来，被降解下来的不饱和脂肪酸与剩余的甘油二酯的理化性质差别很大，通过相分离和萃取等方法将它们分离和提纯，得到高纯度的海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸，其纯度可达80%左右。
采用溶血磷脂酰胆碱为原料，酯交换的反应效率比采用大豆磷脂要高。大豆磷脂是一种磷脂酰胆碱、甘油酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、丝氨酸磷脂和磷脂酸的混合物，相当多的Ω-3会和非磷脂酰胆碱的成分发生反应。溶血磷脂酰胆碱是由磷脂酰胆碱去除部分非Ω-3脂肪酸获得的，和Ω-3酯交换反应时，由于反应体系中非Ω-3的比例低，更多的Ω-3易结合到溶血磷脂酰胆碱分子中形成磷脂酰胆碱型Ω-3。
具体实施方式
本发明的技术路线以及工艺包括如下两步：
步骤一：海豹油甘油三酯为原料，经脂肪酶选择性酶解并分离纯化，得到高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸；
步骤二：将步骤一得到的高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸作为原料，加入溶血磷脂酰胆碱，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸产品。
上述，步骤一中所述的脂肪酶由圆柱形假丝酵母菌、荧光假单胞菌、黑曲霉菌 、白地霉无根菌 、巢子须霉德氏根霉菌 、毛霉菌、绵毛状腐质霉菌或圆弧青霉菌产生。
结合上述工艺步骤，将本发明的制备方法进行进一步阐述。
实施例1：
步骤一，高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸的制备
在反应容器中加入海豹油5.5克和PH为7的磷酸盐缓冲液5-6mL，再加入1000U/ mL黑曲霉脂肪酶，在40℃条件下搅拌酶解8小时，用0.3mol/L氢氧化钠乙醇溶液开展相分离，除去甘油二酯，获得的游离脂肪酸相；取4-6 g尿素和25-35 mL乙醇加入一圆底烧瓶中，放入60-65℃水浴中，搅拌直至溶液澄清，迅速倒入盛有游离脂肪酸相的烧杯中，边搅拌边冷却至室温，置于冰箱中-35度结晶，将结晶混合物迅速抽滤，得结晶包合物和滤液两部分，其中多数饱和脂肪酸被包合在晶体中，滤液中的多不饱和脂肪酸因而得到富集。经过除杂纯化，可获得纯度达78%的高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸。
步骤二，磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的制备
取高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸0.6克、溶血磷脂酰胆碱0.12克、正己烷4 mL、1.2克磷脂酶A2，反应温度在38℃条件下，搅拌20小时，然后过滤，再将滤液在60℃减压蒸馏，回收正己烷。将3mL丙酮加入到剩下的溶液中，游离脂肪酸会溶解在丙酮中，而磷脂酰胆碱不溶解，过滤，将沉淀物在真空干燥箱中干燥得到反应产物。
实施例2
步骤一，高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸的制备
在反应容器中加入海豹油5克和PH为8的磷酸盐缓冲液5mL，再加入800U/ mL假丝酵母脂肪酶，在35℃条件下搅拌酶解10小时，用0.25mol/L氢氧化钠乙醇溶液开展相分离，除去甘油二酯，获得游离脂肪酸相；取4-6 g尿素和25-35 mL乙醇加入一圆底烧瓶中，放入60-65℃水浴中，搅拌直至溶液澄清，迅速倒入盛有游离脂肪酸相的烧杯中，边搅拌边冷却至室温，置于冰箱中-35度结晶，将结晶混合物迅速抽滤，得结晶包合物和滤液两部分，其中多数饱和脂肪酸被包合在晶体中，滤液中的多不饱和脂肪酸因而得到富集。经过除杂纯化，可获得纯度达79.4%的高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸。
步骤二，磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的制备
取高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸0.5克、溶血磷脂酰胆碱0.1克、正己烷3 mL、1.5克磷脂酶A1，反应温度在40℃条件下，搅拌15小时，然后过滤，再将滤液在60℃减压蒸馏，回收正己烷。将3mL丙酮加入到剩下的溶液中，游离脂肪酸会溶解在丙酮中，而磷脂酰胆碱不溶解，过滤，将沉淀物在真空干燥箱中干燥得到反应产物。
实施例3
步骤一，高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸的制备
在反应容器中加入海豹油5克和PH为8的磷酸盐缓冲液5mL，再加入900U/ mL圆弧青霉脂肪酶，在35℃条件下搅拌酶解9小时，用0.3mol/L氢氧化钠乙醇溶液开展相分离，除去甘油二酯，获得游离脂肪酸相；取4-6 g尿素和25-35 mL乙醇加入一圆底烧瓶中，放入60-65℃水浴中，搅拌直至溶液澄清，迅速倒入盛有游离脂肪酸相的烧杯中，边搅拌边冷却至室温，置于冰箱中-35度结晶，将结晶混合物迅速抽滤，得结晶包合物和滤液两部分，其中多数饱和脂肪酸被包合在晶体中，滤液中的多不饱和脂肪酸因而得到富集。经过除杂纯化，可获得纯度达76%的高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸。
步骤二，磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的制备
取高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸0.5克、溶血磷脂酰胆碱0.1克、正己烷3 mL、1.8克假丝酵母脂肪酶，反应温度在50℃条件下，搅拌10小时，然后过滤，再将滤液在60℃减压蒸馏，回收正己烷。将3mL丙酮加入到剩下的溶液中，游离脂肪酸会溶解在丙酮中，而磷脂酰胆碱不溶解，过滤，将沉淀物在真空干燥箱中干燥得到反应产物。

Claims (6)

1.一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：所述方法包括如下工艺步骤：
步骤一：以海豹油甘油三酯为原料，经脂肪酶选择性酶解并分离纯化，得到高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸；
步骤二：将步骤一得到的高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸作为原料，加入溶血磷脂酰胆碱，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸产品。
2.根据权利要求1所述的一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：步骤二中所述的酶为脂肪酶、磷脂酶A1或磷脂酶A2。
3. 根据权利要求1所述的一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：步骤一的具体方法为：在反应容器中加入海豹油5-6克和PH为7-8的缓冲液5-6mL，再加入800-1000U/ mL脂肪酶，在20-40℃条件下搅拌酶解8-10小时，用0.2-0.4mol/L氢氧化钠乙醇溶液开展相分离，除去甘油二酯，获得的游离脂肪酸相，取4-6 g尿素和25-35 mL乙醇加入一圆底烧瓶中，放入60-65℃水浴中，搅拌直至溶液澄清，迅速倒入盛有游离脂肪酸相的烧杯中，边搅拌边冷却至室温，置于冰箱中-35度结晶，将结晶混合物迅速抽滤，得结晶包合物和滤液两部分，滤液经过除杂纯化，可获得高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸。
4. 根据权利要求3所述的一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：步骤一中所述的脂肪酶由圆柱形假丝酵母菌、荧光假单胞菌、黑曲霉菌 、白地霉无根菌 、巢子须霉德氏根霉菌 、毛霉菌、绵毛状腐质霉菌或圆弧青霉菌产生。
5. 根据权利要求3所述的一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
6. 根据权利要求1所述的一种酶法制备磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸的方法，其特征在于：步骤二的具体方法为：在反应容器中加入步骤一制得的高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸0.5-0.7克，然后再加入溶血磷脂酰胆碱0.1-0.2克、正己烷3-5mL、1-2克酶，反应温度在30-50℃条件下，搅拌10-20小时，然后过滤，再将滤液在60℃减压蒸馏，将3-5mL丙酮加入到剩下的溶液中，过滤，将沉淀物在真空干燥箱中干燥得到反应产物。
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