CN102181448A - 绵羊fgf5基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明的绵羊FGF5基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，确定绵羊Noggin基因编码区的全序列；将目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表达载体中，获得FGF5和FGF5S基因慢病毒载体，生产重组病毒，感染293T细胞，验证重组蛋白的表达；其中扩增外显子1的引物；扩增5-RACE引物；扩增外显子3的引物；扩增3-RACE的引物；以外显子3测序结果设计3-RACE引物：其中以5-RACE和3-RACE测序结果设计扩增FGF5全长的引物：扩增FGF5的全长cDNA序列，测序确定FGF5和FGF5S的全长序列；克隆与测序：将绵羊FGF5基因的扩增产物进行回收纯化后，利用T4DNA连接酶将其与连接PMD-18T载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。
Description
技术领域
本发明涉及绵羊FGF5(成纤维细胞生长因子5)基因编码区(CDS)的全长cDNA序列克隆。
背景技术
FGF5是对毛囊生长周期具有重要调控作用的调控因子，1994年Hebert【1】利用胚胎干细胞基因敲除技术，首次在国际著名的Cell杂志上报到了FGF5基因敲除的纯合子小鼠被毛长度比杂合子长50％，其原因是由于毛囊生长VI期延长，同时证明了go基因就是FGF5突变的等位基因。FGF5主要在毛囊外根鞘表达。早期的研究证明引起安哥拉鼠被毛变长的原因是由于突变鼠的毛囊生长期延长。Zhan(1988)【2】在人的肿瘤细胞中发现了第五种成纤维细胞生长因子，并将其命名为FGF5，存在两种变位剪接体，分别编码122、267个氨基酸残基。属于FGF家族之一，FGF家族包含23个成员，其共同的特征是含有两个大的内含子，两个内含子将功能区分为三个外显子，多数FGFs的N末端具有信号肽。
Suzuki[3]用RT-PCR方法检测到大鼠的皮肤中存在FGF5两种变位剪接体，FGF5全长mRNA包含3个外显子，其变位剪接体FGF5S是由于缺失第2个外显子后，改变阅读框，提前遇到终止密码子而产生，FGF5和FGF5S均能于FGF受体1和2结合。全长的FGF5强烈的抑制生长期的毛乳头细胞刺激外根鞘细胞的增殖，引发毛囊进入休止期，而FGF5S与FGF5竞争性的结合FGF受体，拮抗FGF5的功能。国内高爱琴[4]等人利用RT-PCR检测了不同发育阶段绒山羊皮肤中的FGF5表达情况，发现仅有FGF5全长的mRNA表达，没有发现FGF5S。
2006年Housley等[5]通过狗常染色体隐性遗传分离试验，推测狗的长毛性状可能是由于FGF5基因的错义突变引起。2007年James等[6]利用全基因组扫描结合候选基因的方法，发现了FGF5基因四个突变位点与猫的被毛长度相关。同时另外一个研究小组也发现了FGF5基因与猫的被毛长度相关的突变[7]。2009年Cadieu等利用全基因组扫描的方法进一步证明了FGF5基因突变与狗的毛长相关【8】。国内高爱琴等对该基因在绵羊群体中的多态性进行了检测，但是未进行与羊毛长度的关联分析[9]。刘海英等在绒山羊群体中检测了该基因的多态性，发现该基因多态性与绒纤维的伸直长度和含绒量相关[10]。李春笑【11】等发现了该基因的两个突变位点对兔毛产量有显著影响。目前对FGF5影响毛长的研究主要集中在小鼠上，在毛和狗上也有比较深入的研究，但是在更能体现毛纤维长度价值的绵羊，绒山羊上，国外鲜有研究报道，虽然国内学者分析了绵羊FGF5的多态性，但是没有做相关性分析。如：不同发育阶段绒山羊皮肤中FGF5基因mRNA表达RT-PCR检测.高爱琴等华北农学报，2008，23(1)：36-37；不同绵羊品种FGF5基因的多态性分析.高爱琴，李宁，赵兴波，李金泉.畜牧兽医学报，2006，37(4)326-330；FGF5基因对内蒙古绒山羊绒毛性状的影响.刘海英，杨桂芹，张微，朱晓萍，贾志海.遗传2009，31(2)175-179；兔成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因SNP及其与产毛量的相关分析.李春笑等遗传，2008，30(7)893-899的报道等。
国内外目前由于缺乏绵羊FGF5的序列，还没有发现绵羊FGF5的变位剪接体。因此本发明利用RT-PCR技术结合5-RACE和3-RACE技术扩增出绵羊FGF5基因cDNA全长编码区，并且确定了其存在变位剪接体FGF5S，为进一步研究该基因影响毛囊生长发育的生物学功能研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于：确定并获取对绵羊FGF5基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建。
本发明的目的是这样实现的：绵羊FGF5基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，1)确定绵羊Noggin基因编码区的全序列；2)将目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表达载体中，获得FGF5和FGF5S基因慢病毒载体，生产重组病毒，感染293T细胞，验证重组蛋白的表达；
其中扩增外显子1的引物：上游引物TTCCCCGAGGCTATGTCCAC，下游引物ATCCATTGACTTTGCCATCCG；
其中扩增5-RACE引物：以外显子1测序结果设计5-RACE引物：上游引物(CLONTECH，SMART RACE cDNA Amplofication Kit，试剂盒自带)，下游引物GSP1：CTGCTCTGCTCCAAGCCGCTTC，NGSP1：GAAGAAGAGGAAGACACGGTGCT；
其中扩增外显子3的引物：上游引物CAGATGACTGCAAGTTCAGG，下游引物CAAAGCGAAACTTGAGTCTGT；
其中扩增3-RACE的引物，以外显子3测序结果设计3-RACE引物：上游引物(CLONTECH，SMARTRACE cDNA Amplofication Kit，试剂盒自带)GSP2：CAAGCAATCGGAGCAGCCAGAAC，NGSP2：GAAGTCCTAACACGGTGAAATAC；
其中以5-RACE和3-RACE测序结果设计扩增FGF5全长的引物：上游引物ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT，下游引物GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACCAAAGCGAAACTTGAGT；扩增FGF5的全长cDNA序列，测序确定FGF5和FGF5S的全长序列；3)克隆与测序：将绵羊FGF5基因的扩增产物进行回收纯化后，利用T4DNA连接酶将其与连接PMD-18T载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。
所述基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建，扩增外显子1，3及FGF5全长PCR反应体系(25μL)：10×buffer 2.5μL，引物(10pmol/μL)各0.5μL，dNTP(10mmol/L)2μL，DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL。RACE的反应程序参考试剂盒的说明书。
所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，PCR反应程序：预变性95℃5min；变性95℃30sec；外显子1和3的退火温度为56℃，FGF5全长的为60℃，退火时间均为30sec；72℃30sec(外显子1和3)，1min(FGF5全长)35个循环；72℃10min。
所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，构建表达载体及慢病毒的生产，感染293T细胞，验证重组FGF5/FGF5S表达：
a、以PMD-18T-FGF5，PMD-18T-FGF5S为模板，利用特异性引物F1，F2和FS1，FS2进行PCR反应，其反应体系为：1uLPMD-18T-FGF5或PMD-18T-FGF5S，2.5uL 10×PCR buffer，2uL dNTP(各2.5mM)，上下游引物(10mM)各1uL，1uLDMSO，1UTaq酶(宝生物，Pfu)，用ddH2O调整至25uL；PCR反应条件为：94℃4min，94℃30s，64℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；取反应液5uL经琼脂糖凝胶电泳检测确认；将绵羊FGF5基因的扩增产物及pLex慢病毒载体同时进行Not I/Xho I双酶切，分别回收纯化后的PCR产物和pLEX载体，利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pLEX载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素进行平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定测序，新载体命名为pLEX-FGF5和pLEX-FGF5S；
b、293T细胞培养：条件37℃，5％的CO2，培养基采用DMEM+10％的胎牛血清，每10cm面积中铺2-2.5×106个293T细胞，第2天细胞在完全培养液中汇合度达到70-80％；
c、Lipectamine 2000脂质体转染：加入1.5ml预热的Opti-MEM培养基后，按下列比例加入转染载体(pLEX-FGF5，pLEX-FGF5S)12ug、包装质粒(pSPAX2)9ug、包膜质粒(pMD2G)3.5ug、轻轻混匀，同时将50ul的脂质体加入到1.5mlopti-MEM培养基，室温放置5min后，将上述稀释好的DNA与脂质体混合，置于室温孵育20分钟；在此期间，用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次，将脂质体和DNA复合物加入细胞；将细胞培养板放回37℃培养箱中孵育；2-4小时后，移去脂质体和DNA复合物，在每个培养皿中加入10ml新鲜的培养液，重新将细胞培养板放回37℃培养箱中培养；48h后收集病毒；在6孔板中铺5-6×105个293T细胞；第2天完全培养液汇合度达到50-70％，第2天加入500ul收集病毒，500ul完全培养基，1ul polybrene(终浓度达到10ug/ml)，将细胞置于32℃孵育14-16h后，更换为完全培养基，将细胞置于37℃继续培养48h后，收集细胞进行western blot检测FGF5和FGF5S表达。
所述基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建，选用的试剂盒、药剂均为市售产品。
本发明是通过比较小鼠与人FGF5的同源性，根据保守序列设计扩增FGF5部分外显子1和3的引物，对部分外显子1和3进行测序，根据外显子1和3的测序结果设计出5-RACE和3-RACE引物，利用RACE技术扩增出绵羊FGF5基因的5‘-UTR和3’-UTR序列；并以上序列设计扩增FGF5全长编码区的引物序列，(从绵羊皮肤组织)扩增FGF5的全长cDNA序列，获得了FGF5的变位剪接体，并测序验证FGF5和FGF5S的全长序列，进一步构建FGF5，FGF5S慢病毒表达载体，为研究该基因影响毛囊生长发育的生物学功能研究奠定基础，彰显技术进步。
附图说明
本发明对照附图作进一步说明。
附图1为5-RACE的扩增结果；
如图所示：1，2为样品，M为150bp的marker。
附图2为3-RACE的扩增结果；
如图所示：1，2为样品，M为150bp的marker。
附图3为FGF5编码区的扩增结果；
如图所示：FGF5扩增产物2.5％凝胶电泳，其中1，2，3，4为扩增的样品，M为150bp的marker。
附图4为FGF5and FGF5s病毒感染293T细胞的Western Blot检测结果；
如图所示：M为蛋白marker，1为pLEX空载体，2为pLEX-FGF5，3为pLEX-FGF5S。
具体实施方式
本发明对照实施例作进一步说明。
(1)实验样品采集与总RNA提取
采集细毛羊皮肤组织，装入冻存管中并迅速置于液氮中保存备用。取100mg组织样在液氮中研碎，然后按照杭州博日RNA提取试剂盒说明书进行提取。
(2)RT-PCR
按照反转录酶M-MLV(宝生物)的说明书，对绵羊皮肤组织RNA反转录，反转录体系参照说明书的体系。
(3)引物设计
利用Oligo6.0设计扩增外显子1和3的，克隆至T载体上送交上海生物工程公司测序，测序结果见序列表1和2；通过外显子1和3的测序结果设计扩增5-RACE和3-RACE的引物，扩增结果见图1和2，克隆至T载体上送交上海生物工程公司测序，测序结果见序列表3和4；根据5-RACE和3-RACE设计扩增FGF5编码区全长的引物，扩增结果见图3，测序结果见5；根据测序结果设计克隆FGF5至慢病毒表达载体的引物，上游引物F1：ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT(Not I)下游引物为F2：
GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACCAAAGCGAAACTTGAGT(Xho I)，设计克隆FGF5S至慢病毒表达载体的引物，上游引物FS1与F1相同，下游引物FS2为：GGCCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCTGTAAATTTGGCTTAAC(XhoI)。
(4)扩增外显子1，3及FGF5全长PCR反应体系(25μL)：10×buffer 2.5μL，引物(10pmol/μL)各0.5μL，dNTP(10mmol/L)2μL，DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL；RACE的反应程序参考试剂盒的说明书。
(5)PCR反应程序：预变性95℃5min，变性95℃30sec，外显子1和3的退火温度为56℃，FGF5全长的为60℃，退火时间均为30sec，72℃30sec(外显子1和3)，1min(FGF5全长)35个循环，72℃10min。
(6)克隆和测序
将绵羊FGF5基因的扩增产物进行回收纯化后，利用T4DNA连接酶将其与连接PMD-18T载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆测序由上海生物工程公司完成；测序鉴定后的质粒命名为PMD-18T-FGF5和PMD-18T-FGF5S。
(7)构建慢病毒表达载体：分别以PMD-18T-FGF5，PMD-18T-FGF5S为模板，利用特异性引物F1，F2和FS1，FS2进行PCR反应，其反应体系为：1uLPMD-18T-FGF5或PMD-18T-FGF5S，2.5uL 10×PCR buffer，2uL dNTP(各2.5mM)，上下游引物(10mM)各1uL，1uL DMSO，1UTaq酶(宝生物，Pfu)，用ddH2O调整至25uL。PCR反应条件为：94℃4min，94℃30s，64℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；取反应液5uL经琼脂糖凝胶电泳检测确认，将绵羊FGF5基因的扩增产物及pLex慢病毒载体同时进行Not I/Xho I双酶切，分别回收纯化后的PCR产物和pLEX载体，利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pLEX载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素进行平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，经过测序验证后，新载体命名为pLEX-FGF5和pLEX-FGF5S；
其293T细胞培养：条件37℃，5％的CO2，培养基采用DMEM+10％的胎牛血清，每10cm面积中铺2-2.5×106个293T细胞，保证第2天细胞在完全培养液中汇合度达到70-80％；
其Lipectamine 2000脂质体转染：加入1.5ml预热的Opti-MEM培养基后，按下列比例加入转染载体(pLEX-FGF5，pLEX-FGF5S)12ug、包装质粒(pSPAX2)9ug、包膜质粒(pMD2G)3.5ug、轻轻混匀，同时将50ul的脂质体加入到1.5mlopti-MEM培养基，室温放置5min后，将上述稀释好的DNA与脂质体混合，混合物置于室温孵育20分钟；在此期间，用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次，将脂质体和DNA复合物加入细胞，将细胞培养板放回37℃培养箱中孵育，2-4小时后，移去脂质体和DNA复合物，在每个培养皿中加入10ml新鲜的培养液，重新将细胞培养板放回37℃培养箱中培养，48h后收集病毒；
在6孔板中铺5-6×105个293T细胞，保证第2天在完全培养液汇合度达到50-70％；第2天加入500ul收集病毒，500ul完全培养基，1ulpolybrene(终浓度达到10ug/ml)，将细胞置于32℃孵育14-16h后，更换新鲜的培养液，将细胞置于37℃继续培养48h后，收集细胞进行western blot检测FGF5和FGF5S表达。
Claims (5)
1.绵羊FGF5基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，其特征在于：
1)确定绵羊Noggin基因编码区的全序列；
2)将目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表达载体中，获得FGF5和FGF5S基因慢病毒载体，生产重组病毒，感染293T细胞，验证重组蛋白的表达；
其中扩增外显子1的引物：上游引物TTCCCCGAGGCTATGTCCAC，下游引物ATCCATTGACTTTGCCATCCG；
其中扩增5-RACE引物：以外显子1测序结果设计5-RACE引物：上游引物(CLONTECH，SMART RACE cDNA Amplofication Kit，试剂盒自带)，下游引物GSP1：CTGCTCTGCTCCAAGCCGCTTC，NGSP1：GAAGAAGAGGAAGACACGGTGCT；
其中扩增外显子3的引物：上游引物CAGATGACTGCAAGTTCAGG，下游引物CAAAGCGAAACTTGAGTCTGT；
其中扩增3-RACE的引物，以外显子3测序结果设计3-RACE引物：上游引物(CLONTECH，SMART RACE cDNA Amplofication Kit，试剂盒自带)GSP2：CAAGCAATCGGAGCAGCCAGAAC，NGSP2：GAAGTCCTAACACGGTGAAATAC；
其中以5-RACE和3-RACE测序结果设计扩增FGF5全长的引物：上游引物ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT，下游引物GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACCAAAGCGAAACTTGAGT；扩增FGF5的全长cDNA序列，测序确定FGF5和FGF5S的全长序列；
3)克隆与测序：将绵羊FGF5基因的扩增产物进行回收纯化后，利用T4 DNA连接酶将其与连接PMD-18T载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。
2.依据权利要求1所述基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建，其特征在于：扩增外显子1，3及FGF5全长PCR反应体系(25μL)：10×buffer 2.5μL，引物(10pmol/μL)各0.5μL，dNTP(10mmol/L)2μL，DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL。RACE的反应程序参考试剂盒的说明书。
3.依据权利要求1所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，其特征在于：PCR反应程序：预变性95℃5min；变性95℃30sec；外显子1和3的退火温度为56℃，FGF5全长的为60℃，退火时间均为30sec；72℃30sec(外显子1和3)，1min(FGF5全长)35个循环；72℃10min。
4.依据权利要求1所述基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，其特征在于：构建表达载体及慢病毒的生产，感染293T细胞，验证重组FGF5/FGF5S表达：
a、以PMD-18T-FGF5，PMD-18T-FGF5S为模板，利用特异性引物F1，F2和FS1，FS2进行PCR反应，其反应体系为：1uLPMD-18T-FGF5或PMD-18T-FGF5S，2.5uL 10×PCR buffer，2uL dNTP(各2.5mM)，上下游引物(10mM)各1uL，1uLDMSO，1UTaq酶(宝生物，Pfu)，用ddH2O调整至25uL；PCR反应条件为：94℃4min，94℃30s，64℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；取反应液5uL经琼脂糖凝胶电泳检测确认；将绵羊FGF5基因的扩增产物及pLex慢病毒载体同时进行Not I/Xho I双酶切，分别回收纯化后的PCR产物和pLEX载体，利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pLEX载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素进行平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定测序，新载体命名为pLEX-FGF5和pLEX-FGF5S；
b、293T细胞培养：条件37℃，5％的CO2，培养基采用DMEM+10％的胎牛血清，每10cm面积中铺2-2.5×106个293T细胞，第2天细胞在完全培养液中汇合度达到70-80％；
c、Lipectamine 2000脂质体转染：加入1.5ml预热的Opti-MEM培养基后，按下列比例加入转染载体(pLEX-FGF5，pLEX-FGF5S)12ug、包装质粒(pSPAX2)9ug、包膜质粒(pMD2G)3.5ug、轻轻混匀，同时将50ul的脂质体加入到1.5mlopti-MEM培养基，室温放置5min后，将上述稀释好的DNA与脂质体混合，置于室温孵育20分钟；在此期间，用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次，将脂质体和DNA复合物加入细胞；将细胞培养板放回37℃培养箱中孵育；2-4小时后，移去脂质体和DNA复合物，在每个培养皿中加入10ml新鲜的培养液，重新将细胞培养板放回37℃培养箱中培养；48h后收集病毒；在6孔板中铺5-6×105个293T细胞；第2天完全培养液汇合度达到50-70％，第2天加入500ul收集病毒，500ul完全培养基，1ul polybrene(终浓度达到10ug/ml)，将细胞置于32℃孵育14-16h后，更换为完全培养基，将细胞置于37℃继续培养48h后，收集细胞进行western blot检测FGF5和FGF5S表达。
5.依据权利要求1所述基因的克隆及其慢病表达毒载体的构建，其特征在于：选用的试剂盒、药剂均为市售产品。
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