CN102180932B - 一种甾体皂苷dt-13的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药提取分离工艺技术领域，具体涉及从短葶山麦冬地下部位中提取分离一种甾体皂苷DT-13的方法。本发明革除了现有技术中通过Sephadex LH-20和ODS反复纯化过程，通过用短葶山麦冬地下部位乙醇提取，提取液先用大孔树脂柱层析，层析柱用乙醇洗脱，洗脱液浓缩后再进行萃取除杂，除杂后剩下的水层部分经硅胶柱层析色谱分离，重结晶等分离过程，改进后的提取方法，工艺简单、易行，成本大大降低，得率高，约1.1-1.4‰。
Description
技术领域：
本发明涉及中药提取分离工艺技术领域，具体涉及从短葶山麦冬地下部位中提取分离一种甾体皂苷DT-13的方法。
背景技术：
短葶山麦冬Liriope muscari(Decne)Bailey为百合科山麦冬属植物，主要分布于广西、福建泉州等地，生于林下、灌丛中。短葶山麦冬块根作为常用中药收载于《中国药典》(一部)“山麦冬”项下，具有养阴润肺，益胃生津的功效，用于肺燥干咳，津伤口渴，肠燥便秘等。药理研究表明，短葶山麦冬药材可以显著延长小鼠存活时间、极显著增加小鼠的脾脏重量、显著增强小鼠的碳粒廓清作用。短葶山麦冬中主要含有甾体皂苷类、萜类、酰胺生物碱类、脂肪酸类等化合物，其中皂苷类化合物为该植物主要活性成分。药理作用表明，甾体皂苷DT-13为短葶山麦冬总皂苷中的主要活性成分，能明显的增强小鼠耐缺氧能力、增加小鼠免疫器官重量、促进碳粒廓清速率的作用，其作用强度与人参总皂苷近似；并且可对抗由环磷酞胺和60Coγ射线引起的小鼠白细胞数下降；对肉瘤180和艾氏腹水癌均等均有较强的抑瘤活性；此外，甾体皂苷DT-13具有较强的抗炎免疫药理活性，对实验性肝损伤有保护作用等(余伯阳，殷霞等.短葶山麦冬皂苷C的药理活性研究[J].中国药科大学学报，1994，25(5)：286-288；徐强，王蓉等.DT-13对迟发型变态反应及炎症反应的影响[J].中国药科大学学报，1993，24(2)：98-101；Feihua Wu，Jingsong Cao，et al.Ruscogenin glycoside(Lm-3)isolated from Liriopemuscari improves liver injhury by dysfunctioning liver-infiltration lymphocytes[J].Journal ofPharmacy and pharmacology，2001，53：681-688；Jin Tao，Hongyi Wang，et al.The saponinmonomer of dwarf lilyturf tuber，DT-13，reduces L-type calcium currents during hypoxia in adultrat ventricular myocytes[J].Life Sciences，2005，77：3021-3030)。甾体皂苷DT-13的结构如下：
发明人课题组在前期的研究中试图从短葶山麦冬中分离DT-13，采用90％乙醇渗漉提取，正丁醇萃取，硅胶柱层析色谱分离，再经Sephadex LH-20和ODS反复纯化，重结晶得到(程志红，吴弢等.短葶山麦冬化学成分的研究[J].中草药，1995，36(6)：823-826)。该方法成本高，周期长，DT-13的得率也极低，约0.078‰，因此无法进行工业化生产，这限制了该药物的进一步开发。
发明内容
本发明在前期研究的基础上，对提取方法进行了改进，革除了Sephadex LH-20和ODS反复纯化过程，改进后的提取方法，工艺简单、易行，成本大大降低，得率高，约1.1-1.4‰。
本发明的制备方法包括：短葶山麦冬地下部位用乙醇提取，提取液先用大孔树脂柱层析，层析柱用乙醇洗脱，洗脱液浓缩后再进行萃取除杂，除杂后剩下的水层部分经硅胶柱层析色谱分离，重结晶，即得。
其中大孔树脂柱层析用乙醇洗脱前，优选先用水和20％-30％乙醇淋洗除杂，本发明中的百分比均为体积百分比。
用于提取的乙醇浓度优选50％-70％，大孔树脂柱层析洗脱时优选收集60％-70％乙醇的流分。
提取用乙醇的量优选：药材∶乙醇水溶液1∶10-1∶12w/v。
萃取除杂用溶剂优选乙酸乙酯。
硅胶柱层析色谱分离时，优选以氯仿-甲醇-水混合溶剂进行洗脱。
洗脱时优选先用氯仿-甲醇-水体积比9∶1∶0.05的混合溶剂8-10BV除杂，再用氯仿-甲醇-水体积比为8.8∶1.2∶0.12的混合溶剂洗脱，收集10-15BV的洗脱液。
大孔树脂柱层析优选D101型或D4020型。
重结晶溶剂优选甲醇、乙醇或正丁醇，或甲醇、乙醇或正丁醇的水溶液。最优选为甲醇的水溶液。优选甲醇∶水为1∶1-10∶1v/v。
短葶山麦冬地下部位优选粉碎后果10-30目筛。
下面是对提取方法的部分研究：
1.药材粒径
选取过10目，过30目，过60目筛3种不同药材粒径进行单因素考察，比较DT-13的提取转移率，采用HPLC-ELSD方法测定样品中DT-13的含量。结果如下：
依据上表可以看出，药材需要粉碎，粉碎与不粉碎药材结果差异较大，过60目筛效果最好，但与过30目筛结果差异不大，考虑到工业化生产的实际状况和节省成本的考虑，过10-30目筛为最佳条件。
2.提取用乙醇浓度
热回流提取药材时，溶剂选用30％，50％，70％，90％，100％五个不同乙醇浓度进行单因素考察，结果如下：
由上表可以看出，40-90％提取浓度范围内提取转移率均大于75％，而其中又以50％-70％乙醇提取范围内效果最佳。
3.料液比
热回流提取药材时，料液比选用1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14五个不同料液比进行考察，结果如下：
由上表可以看出，在料液比1∶8之前，提取转移率受溶剂倍数影响较大，之后提取转移率受溶剂倍数影响逐渐变小，考虑到工业上提取溶液量为影响成本的最关键因素之一，故此选择料液比范围为1∶8-1∶14，而又以料液比范围在1∶10-1∶12内为最佳。
4.洗脱浓度
取样品液240ml(DT-13含量为0.1mg/ml)，进行动态吸附。吸附后静置半小时，分别用不同浓度的乙醇梯度洗脱。先用水洗脱10BV至α-萘酚反应为阴性，然后依次用水，10％，30％，50％，60％，70％，95％乙醇溶液进行梯度洗脱。计算固形物重量，并根据固形物重量计算其中DT-13量，结果如下：
由上可知，用乙醇浓度低于30％洗脱时能除去大量的DT-13以外的杂质，当乙醇浓度提高到50％后，DT-13被逐渐洗脱下来，在固形物中的含量也较高，当乙醇浓度上升到70％时DT-13几乎被洗脱完全。所以我们最终选择水去除糖，20％-30％的乙醇除杂，60％-70％的乙醇洗脱有效部位。
5.大孔树脂吸附容量考察
分别取药材1、3、4.8、6、7.2、8.5、10g提取后制成相同浓度药液上5ml的大孔树脂进行饱和吸附，结果每毫升湿树脂饱和吸附的药材量如下：
由上表结果显示，采用的5ml大孔树脂在药材量大于7g时，随上样量增加树脂的饱和吸附量趋于稳定，即每毫升大孔树脂理论饱和吸附药材量为1.4g。在实际操作中最佳树脂吸附量选择在1-1.4g/ml范围之间。
6.硅胶柱层析洗脱剂
硅胶柱层析洗脱收集DT-13的溶剂系统分别选择氯仿-甲醇-水8∶2∶0.2、8.5∶1.5∶0.15、8.5∶1.5∶0.15、9∶1∶0.1四个溶剂系统比例来考察。上样量为40g，收集四个溶剂系统的洗脱液，挥干溶剂计算固形物重量，并计算其中DT-13的量，结果见下：
由上表结果显示，溶剂系统8∶2∶0.2和8.5∶1.5∶0.15洗脱下来的固形物比较多，其中DT-13的含量均低于50％；8.8∶1.2∶0.12和9∶1∶0.1洗脱下来的固形物虽较少，但DT-13含量可达70％左右。溶剂系统8.8∶1.2∶0.12与9∶1∶0.1相比较，两者得到的DT-13纯度相当，但8.8∶1.2∶0.12系统洗脱下来的DT-13量多于9∶1∶0.1溶剂系统。所以，综合考虑，溶剂系统最佳选择为氯仿-甲醇-水为8.8∶1.2∶0.12。
7.重结晶溶剂选择
甲醇、乙醇、正丁醇，或者其水溶液为重结晶溶剂，重结晶得到的DT-13的纯度和得率如下：
由上表可知，用甲醇-水结晶纯化DT-13粗品，DT-13的得率和纯度都最高，故选择甲醇-水作为最佳结晶溶剂。
8.重结晶溶剂比例
以甲醇-水为结晶溶剂，甲醇-水(V/V)分别选用1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1六个比例进行考察，结晶得到的DT-13纯度和得率如下：
结果显示，当甲醇-水的比例为2∶1-4∶1时，结晶得到的DT-13的量和纯度均比其它比例高，所以选用甲醇-水的比例为2∶1-4∶1。
9.结晶时间
结晶步骤中，静置养晶时间分别选择4、6、8、10、12、14小时进行考察，结果见下表：
结果显示，结晶时间为4-8小时范围内DT-13的纯度最高，但结晶时间小于6小时时DT-13得率较低，结晶时间为6-14小时范围内DT-13得率较高，但8小时以后纯度下降，结合生产实际综合考虑，结晶时间在6-8小时范围内DT-13的得率和纯度均较高。
传统上一般以短葶山麦冬的块根入药，而将短葶山麦冬药材其余部位作为废物被废弃。本发明采用了短葶山麦冬整个地下部位作为原料，实现了药用资源的节约与合理利用，适合规模生产。
本发明中最后一步采用结晶技术对甾体皂苷DT-13粗品进行纯化，通过考察最佳结晶条件，只需一次结晶，使得产品纯度均达98％以上，无需多次重结晶或采用反相柱层析等昂贵分离材料进行纯化，从而大大降低了生产成本和作业时间。
本发明通过对热回流提取各影响因素、大孔树脂静态动态各参数、硅胶柱层析分离各条件进行了考察，并经中试放大实验验证，优选了最合理的整套从短葶山麦冬地下部位中提取分离甾体皂苷DT-13的方法。整套工艺流程简单科学，操作过程稳定可控，作业周期较短，生产成本较低，得到的DT-13收率高，纯度高，为目前提取分离DT-13的最佳工艺，适合工业化生产。
目前尚未见有关从药用植物中大量分离制备甾体皂苷单体的工艺报道，本发明对甾体皂苷DT-13分离制备方法的研究开发具有较高的经济价值和学术价值。
具体实施方式
实施例1
取短葶山麦冬地下部位100g，粉碎至30目，一次加入60％的乙醇溶液1200mL，回流提取2次，每次2小时，保持微沸。过滤药渣，合并提取液，计算药材中DT-13的提取转移率为90.2％。浓缩至800mL后上D101型大孔树脂进行分离。先后用水、30％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用70％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，薄层层析展开剂为氯仿∶甲醇∶水(65∶35∶10)的下层液，收集含有DT-13的部分，减压浓缩，待残留液体为150mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取后的水部分浓缩后用硅胶拌样，采用硅胶柱进行分离。氯仿∶甲醇∶水系统洗脱10个柱体积后开始收集，收集15个柱体积，减压旋干该部分得DT-13粗品。将DT-13粗品用70％的甲醇结晶，养晶6小时，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后，真空干燥，得DT-13白色固体。最后DT-13收率为60.3％，纯度达98.0％。
实施例2
取短葶山麦冬地下部位100g，粉碎至20目，一次加入50％的乙醇溶液1000mL，回流提取2次，每次2小时，保持微沸。过滤药渣，合并提取液，计算药材中DT-13的提取转移率为84.6％。浓缩至500mL后上D101型大孔树脂进行分离。先后用水、25％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用60％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，薄层层析展开剂为氯仿∶甲醇∶水(65∶35∶10)的下层液，收集含有DT-13的部分，减压浓缩，待残留液体为150mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取后的水部分浓缩后用硅胶拌样，采用硅胶柱进行分离。氯仿∶甲醇∶水系统洗脱10个柱体积后开始收集，收集10个柱体积，减压旋干该部分得DT-13粗品。将DT-13粗品用75％的甲醇结晶，养晶7小时，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后，真空干燥，得DT-13白色固体。最后DT-13收率为57.2％，纯度达98.3％。
实施例3
取短葶山麦冬地下部位100g，粉碎至10目，一次加入70％的乙醇溶液1100mL，回流提取2次，每次3小时，保持微沸。过滤药渣，合并提取液，计算药材中DT-13的提取转移率为82.5％。浓缩至440mL后上D4020大孔树脂进行分离。先后用水、20％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用65％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，展开剂为氯仿∶甲醇∶水(65∶35∶10)的下层液，收集含有DT-13的部分，减压浓缩，待残留液体为150mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取后的水部分浓缩后用硅胶拌样，采用硅胶柱进行分离。氯仿∶甲醇∶水系统洗脱10个柱体积后开始收集，收集12个柱体积，减压旋干该部分得DT-13粗品。将DT-13粗品用80％的甲醇结晶，养晶8小时，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后，真空干燥，得DT-13白色固体。最后DT-13收率为54.4％，纯度达99.6％。
实施例4
取短葶山麦冬地下部位300kg，粉碎至10目，一次加入60％的乙醇溶液2400L，回流提取2次，每次2小时，保持微沸。过滤药渣，合并提取液，计算药材中DT-13的提取转移率为75.4％。浓缩至900L后上D4020大孔树脂进行分离。先后用水、20％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用70％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，展开剂为氯仿∶甲醇∶水(65∶35∶10)的下层液，收集含有DT-13的部分，减压浓缩，待残留液体为300L左右时加入300L的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取后的水部分浓缩后用硅胶拌样，采用硅胶柱进行分离。氯仿∶甲醇∶水系统洗脱8个柱体积后开始收集，收集12个柱体积，减压旋干该部分得DT-13粗品。将DT-13粗品用70％的甲醇结晶，养晶8小时，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后，真空干燥，得DT-13白色固体。最后DT-13收率为51.6％，纯度达98.2％。
Claims (4)
1.一种从短葶山麦冬中提取甾体皂苷DT-13的方法，其特征在于：
取短葶山麦冬地下部位100g，粉碎至30目，一次加入60％的乙醇溶液1200mL，回流提取2次，每次2小时，保持微沸，过滤药渣，合并提取液，计算药材中DT-13的提取转移率为90.2％，浓缩至800mL后上D101型大孔树脂进行分离；先后用水、30％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用70％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，薄层层析展开剂为氯仿∶甲醇∶水-65∶35∶10的下层液，收集含有DT-13的部分，减压浓缩，待残留液体为150mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取后的水部分浓缩后用硅胶拌样，采用硅胶柱进行分离，氯仿∶甲醇∶水系统洗脱10个柱体积后开始收集，收集15个柱体积，减压旋干该部分得DT-13粗品，将DT-13粗品用70％的甲醇结晶，养晶6小时，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后，真空干燥，得DT-13白色固体。
2.一种从短葶山麦冬中提取甾体皂苷DT-13的方法，其特征在于：
取短葶山麦冬地下部位100g，粉碎至20目，一次加入50％的乙醇溶液1000mL，回流提取2次，每次2小时，保持微沸，过滤药渣，合并提取液，计算药材中DT-13的提取转移率为84.6％，浓缩至500mL后上D101型大孔树脂进行分离，先后用水、25％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用60％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，薄层层析展开剂为氯仿∶甲醇∶水-65∶35∶10的下层液，收集含有DT-13的部分，减压浓缩，待残留液体为150mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取后的水部分浓缩后用硅胶拌样，采用硅胶柱进行分离，氯仿∶甲醇∶水系统洗脱10个柱体积后开始收集，收集10个柱体积，减压旋干该部分得DT-13粗品，将DT-13粗品用75％的甲醇结晶，养晶7小时，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后，真空干燥，得DT-13白色固体。
3.一种从短葶山麦冬中提取甾体皂苷DT-13的方法，其特征在于：
取短葶山麦冬地下部位100g，粉碎至10目，一次加入70％的乙醇溶液1100mL，回流提取2次，每次3小时，保持微沸，过滤药渣，合并提取液，计算药材中DT-13的提取转移率为82.5％，浓缩至440mL后上D4020大孔树脂进行分离，先后用水、20％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用65％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，展开剂为氯仿∶甲醇∶水-65∶35∶10的下层液，收集含有DT-13的部分，减压浓缩，待残留液体为150mL左右时加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取后的水部分浓缩后用硅胶拌样，采用硅胶柱进行分离，氯仿∶甲醇∶水系统洗脱10个柱体积后开始收集，收集12个柱体积，减压旋干该部分得DT-13粗品，将DT-13粗品用80％的甲醇结晶，养晶8小时，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后，真空干燥，得DT-13白色固体。
4.一种从短葶山麦冬中提取甾体皂苷DT-13的方法，其特征在于：
取短葶山麦冬地下部位300kg，粉碎至10目，一次加入60％的乙醇溶液2400L，回流提取2次，每次2小时，保持微沸，过滤药渣，合并提取液，计算药材中DT-13的提取转移率为75.4％，浓缩至900L后上D4020大孔树脂进行分离，先后用水、20％乙醇除杂，淋洗至流出液变清后，改用70％乙醇洗脱，薄层层析检测流出液，展开剂为氯仿∶甲醇∶水-65∶35∶10的下层液，收集含有DT-13的部分，减压浓缩，待残留液体为300L左右时加入300L的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取后的水部分浓缩后用硅胶拌样，采用硅胶柱进行分离，氯仿∶甲醇∶水系统洗脱8个柱体积后开始收集，收集12个柱体积，减压旋干该部分得DT-13粗品，将DT-13粗品用70％的甲醇结晶，养晶8小时，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后，真空干燥，得DT-13白色固体。
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