CN102178979A

CN102178979A - 人工韧带

Info

Publication number: CN102178979A
Application number: CN2011101052993A
Authority: CN
Inventors: 蔡长傧; 王富友
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2011-04-26
Filing date: 2011-04-26
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明公开了一种人工韧带，该人工韧带由I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成；I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维力学性能优良，且细胞相容性好，无细胞毒性，细胞在其上生长良好，并附着生长，I型胶原蛋白和聚乙烯醇在体内都可以完全生物降解；本发明的人工韧带采用I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成，其力学性能与人体韧带相近，能提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要，且生物相容性好，植入人体后允许再生新韧带长入，移植物可降解，其降解产物对人体无害并能排除体外，有利于韧带的重建。

Description

人工韧带

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种植入人体的人工韧带。

背景技术

交叉韧带损伤后愈合能力极差，目前临床重建交叉韧带使用的材料包括自体移植物、异体移植物和人工合成材料。自体和异体移植物重建交叉韧带依然是目前的主流选择，常见的自体骨-髌腱-骨移植具有较高的强度，在附丽位点能够获得骨骨或腱骨愈合。但对自体供区会继发膝前疼痛、髌腱炎、髌下脂肪垫挛缩、相应部位髌骨骨折、绳肌缺失等并发症。异体移植材料存在来源少、免疫排斥反应、生物长入延迟甚至传播疾病的危险。因此，长期以来，组织工程人工韧带的研究从未停止。理想的人工韧带必须满足以下要求：

（1）良好的生物相容性，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥反应；

（2）可控的生物降解与吸收性，降解与吸收速率应与细胞或组织生长速率相适应；

（3）一定的机械强度，在植入人体后即可发挥人工韧带的即时抗张功能，提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要。

目前，已通过欧洲CE认证和中国SFDA认证，并应用于临床的比较成熟的人工韧带只有LARS人工韧带，其于1994年开始应用于临床。通常临床应用的LARS人工韧带是由聚酯纤维编织而成，但聚酯纤维不可降解，不是理想的组织工程材料。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种人工韧带，该人工韧带具有优良的生物相容性和力学性能，植入人体后有利于韧带的重建，能提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要。

本发明的人工韧带，该人工韧带由I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成。

进一步，所述I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维中含有10%~50%（重量）的I型胶原蛋白和50%~80%（重量）的聚乙烯醇；

进一步，所述I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维由原液制备、湿法纺丝、凝固和热拉伸定型的工艺步骤制备得到；

进一步，所述I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维的纤度为1~15dtex，断裂强度为1~10cN/dtex，断裂伸长率为10%~40%，初始模量为30~100 cN/dtex；

进一步，所述人工韧带包括股骨部分、关节内部分和胫骨部分，所述关节内部分由纵向排列的I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维组成，所述股骨部分和胫骨部分由I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维3D经纬编织而成。

本发明的有益效果在于：I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维力学性能优良，且细胞相容性好，无细胞毒性，细胞在其上生长良好，并附着生长，I型胶原蛋白和聚乙烯醇在体内都可以完全生物降解；本发明的人工韧带采用I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成，其力学性能与人体韧带相近，能提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要，且生物相容性好，植入人体后允许再生新韧带长入，移植物可降解，其降解产物对人体无害并能排除体外，有利于韧带的重建。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1 为倒置显微镜下50%I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维组细胞生长情况；

图2为倒置显微镜下100%I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维组细胞生长情况；

图3为倒置显微镜下空白对照组细胞生长情况；

图4为倒置显微镜下阳性对照组细胞生长情况；

图5为倒置显微镜下6板孔内细胞生长情况；

图6为倒置显微镜下细胞在I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维上生长情况；

图7为SEM观察细胞在I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维上生长情况。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明的人工韧带，由I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成，其包括股骨部分、关节内部分和胫骨部分，所述关节内部分由纵向排列的I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维组成，所述股骨部分和胫骨部分由I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维3D经纬编织而成。

本实施例中，所述I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维的制备方法为：

将一定比例的聚乙烯醇和水，98℃下搅拌溶解3h，溶液呈无色透明状；同时，将一定比例的I型胶原蛋白和水于68~70℃下搅拌溶解。将分别溶解好的I型胶原蛋白水溶液和聚乙烯醇水溶液按一定比例混合，并加入一定量的连接剂四硼酸钠于78~82℃下进行处理，随后在75℃下脱泡，最终得到纺丝原液。脱泡后的纺丝原液，在70~80℃下保温，并经调压罐调压，即送入纺丝机经喷丝孔成丝，丝束进入凝固浴凝固并牵伸，然后经过220℃热拉伸，2.5min热定型后制得I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维。控制纺丝原液中I型胶原蛋白水溶液和聚乙烯醇水溶液的比例，使最终得到的I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维中含有10%~50%（重量）的I型胶原蛋白和50%~80%（重量）的聚乙烯醇。上述方法所得到的I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维的纤度为1~15dtex，断裂强度为1~10cN/dtex，断裂伸长率为10%~40%，初始模量为30~100 cN/dtex。

当然，I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维的制备并不局限于上述方法，其它化学纤维的制备方法均可适用。

一．用MTT法和直接接触法检测所述I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维的细胞相容性

MTT比色法和直接接触法是细胞相容性实验中最常用的方法，目前广泛的应用于生物医学的多个领域。 MTT法的生物学终点是线粒体，由线粒体琥珀酸脱氢酶将MTT分子还原，生成不溶于水的蓝紫色结晶物（Formazan）,而死细胞则不能进行还原，通过化学发光仪检测其吸光度OD值，即可反映出存活细胞的数量，因此可以准确的反映出实验材料对细胞造成的毒性损害程度，并能对材料的细胞毒性做出定量评价。MTT法对试验材料的毒性有较高的敏感性，且比较符合动物体内的毒性实验结果，因此成为一种较好且常用的体外评价材料细胞毒性的方法。直接接触法能直观的观察细胞与实验材料接触后的生长情况，并可观察细胞能否在试验的支架材料上生长、增殖,弥补了MTT法对细胞形态观察效果不佳。这两种方法的联合使用可以较准确的反映试验材料对细胞造成的毒性反应。

1. 用MTT法测定小鼠成纤维细胞（L-929）在I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维浸提液中培养1、2、3、4、5、6、7d的吸光度OD值，计算细胞相对增殖率（Relative Growth Rate,RGR），判定细胞毒性的级别。具体步骤如下：

将实验分为空白对照组、阳性对照组、实验组（I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维组）

1） I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维浸提液的制备

按细胞培养液（浸提介质）与I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维表面积之比为1ml/cm²的标准在37℃，5%CO₂，湿度95%的无菌条件下浸提48h作为浸提液，加样前加入10%FBS，并配制成50%和100%浓度的I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维浸提液；

2）接种

将对数生长期的L-929细胞经0.25%胰蛋白酶消化、吹打成悬液后计数，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制成浓度5×104个/ml的细胞悬液，用移液器吸100μl接种于96孔板（即5000个细胞/孔），四周边缘孔不接种细胞，只加入150μl的DMEM培养液，做封闭；

3）加样

细胞接种24h观察见细胞贴壁后，取出96孔细胞培养板，弃原培养液；实验组加入含10%FBS的50%和100%I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维浸提液，200μl/孔；空白对照组加入含10%FBS的DMEM，200μl/孔；阳性对照组加入0.5%苯酚溶液（10μl8ml/L），200μl/孔；四周边缘孔加入DMEM，200μl/孔；将96孔细胞培养板放入37℃，5%CO₂培养箱继续培养每天用倒置显微镜观察各组细胞的生长情况。于加样后的1、2、3、4、5、6、7d分别取出96孔细胞培养板，弃旧培养液，更换新鲜培养液100μl/孔，在加入MTT液20μl/孔后，置于37℃，5%CO₂培养箱4h，弃旧液，加入DMSO150μl/孔，用移液器吹打得悬液后用酶标仪测定吸光度OD值，测定波长为490nm，并计算相对增殖率（relative growth rare，RGR），公式：实验组OD值/空白对照组OD值×100%；

4）评价标准

根据RGR值，按下表评分标准评定材料毒性程度级别：

结果评价标准：实验结果为0级或1级反应为合格；实验结果为2级反应的，结合细胞形态分析，综合评价；实验结果为3~5级反应的，为不合格；

细胞形态学变化观察法评价标准：

无毒：细胞形态正常，呈梭形或不规则三角形，贴壁生长良好；

轻度毒性：细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮细胞；

中度毒性：细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩较多，达1／3以上，见悬浮死细胞；

重度毒性：细胞基本不贴壁，90%以上为死细胞；

5）结果

在细胞培养1、2、3、4、5、6、7d用倒置显微镜观察见：50%和100%I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维组细胞形态正常，随着培养时间的延长，细胞大量增殖，细胞形态正常，呈梭形，细胞突充分伸展，内部结构清晰，局部有小面积的细胞溶解(见图1和图2)；空白对照组细胞形态正常，生长良好（见图3）；阳性对照组细胞大量崩解，呈空泡样（见图4）；

MTT比色法的OD值、相对增殖率（RGR）及细胞毒性分级如下表所示：

从上述结果可以看出，细胞在不同时间点的相对增殖率均在89%-106%之间，I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维的细胞毒性评级为0~1级，显示无明显的细胞毒性，不会对人体组织器官产生明显影响。

2. 用直接接触法，直接接触培养L-929细胞，用扫描电镜观察细胞在I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维上的生长情况

1）实验步骤

将对数生长期的L-929细胞经0.25%胰蛋白酶消化、吹打成悬液并适当稀释后，加入6孔细胞培养板中，加入事先经手工编织成网格状的I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维，加入适量培养液后，置于37℃，5%CO₂培养箱培养，每日用倒置显微镜观察细胞在6孔细胞培养板中和样本材料上的生长情况。4d后将样本取出经2.5%戊二醛固定、常规脱水、CO₂ 临界点干燥、喷金、扫描电子显微镜(100～1000倍)观察；

2）结果

在细胞培养1、2、3、4d用倒置显微镜观察，6孔细胞培养板内细胞形态正常，呈梭形，生长良好，细胞大量增殖（见图5），并有多量细胞在I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维上附着生长，且形态正常，呈梭形(见图6)。4d用扫描电镜(SEM)观察，细胞在I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维上生长良好，形态正常，呈梭形（见图7）；

从上述结果可以看出，I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维细胞相容性好，无细胞毒性，细胞在其上生长良好，并附着生长。

聚乙烯醇是一种高分子化合物，其具有良好的组织相容性，良好的力学性能，无毒，目前广泛应用于医学领域，其分子链中的侧链羟基可以结合黏附蛋白而对细胞具有较强的粘附作用，有利于细胞在聚乙烯醇材料上黏附生长和增殖，而且聚乙烯醇体内可以完全降解；胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物性高分子，它是由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，其中I 型胶原蛋白占生物体总胶原量的90%，胶原蛋白可以促进组织的修复，对细胞的黏附、迁徙、增殖有重要的作用；本发明的人工韧带采用I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成，上述实验已经证明I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维具有良好的生物相容性，因此，本发明的人工韧带生物相容性好，植入人体后允许再生新韧带长入，移植物可降解，其降解产物对人体无害并能排除体外，有利于韧带的重建。

二．本发明的人工韧带的力学性能测试：

将本发明的人工韧带取三个样品，再取一条猪交叉韧带，分别按常规方法进行拉伸测试，结果如下表所示：

Figure 2011101052993100002DEST_PATH_IMAGE005

由上表可以看出，本发明的人工韧带力学性能远高于猪交叉韧带，可以预见，本发明植入人体后能提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1. 一种人工韧带，其特征在于：该人工韧带由I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成。

2. 根据权利要求1所述的人工韧带，其特征在于：所述I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维中含有10%~50%（重量）的I型胶原蛋白和50%~80%（重量）的聚乙烯醇。

3.根据权利要求2所述的人工韧带，其特征在于：所述I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维由原液制备、湿法纺丝、凝固和热拉伸定型的工艺步骤制备得到。

4. 根据权利要求3所述的人工韧带，其特征在于：所述I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维的纤度为1~15dtex，断裂强度为1~10cN/dtex，断裂伸长率为10%~40%，初始模量为30~100 cN/dtex。

5. 根据权利要求1至4任意一项所述的人工韧带，其特征在于：所述人工韧带包括股骨部分、关节内部分和胫骨部分，所述关节内部分由纵向排列的I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维组成，所述股骨部分和胫骨部分由I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维3D经纬编织而成。