CN110152063A - 一种人工韧带用再生纤维素丝及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人工韧带用再生纤维素丝，所述再生纤维素丝的原材料包括I型胶原蛋白、丝素蛋白、聚乙烯醇和硫酸软骨素；按质量比计，再生纤维素丝的原材料中I型胶原蛋白：丝素蛋白：聚乙烯醇：硫酸软骨素为15～20:20～25:40～50:0.02～0.03；进一步可以制备成人工韧带。本发明所制备的再生纤维丝由胶原蛋白和丝素蛋白组成，极大的提高了纤维丝的组织相容性，对细胞而言，不仅无毒性，还有利于其附着生长；更有利于于制备的人工韧带移植后，在体内更容易利于自体ACL韧带样新生组织长成，且新生组织与韧带融合得比较紧密。

Description

一种人工韧带用再生纤维素丝及其应用
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，涉及一种人工韧带用再生纤维素丝及其应用。
背景技术
随着我国国力日益增长和生活水平提高，韧带损伤的发生率逐年增加。以最常见的前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)损伤为例，我国每年的韧带损伤人数保守估计在1千万以上。前交叉韧带是膝关节内韧带，将胫骨和股骨联接起来，控制膝关节旋转和防止胫骨平台过度前移或股骨后移，其功能的重要性在于维持和协调膝关节的稳定性维持膝关节的性能稳定，帮助人体完成多种难度较大的动作，具有重要的生理功能。长期剧烈的下肢运动或多种其它因素可以导致前交叉韧带断裂。前交叉韧带断裂后可导致膝关节不稳，若不及时治疗，则会因反复扭伤而引起关节软骨、半月板损伤和骨关节炎。韧带损伤保守治疗效果不佳，且完全断裂的ACL自愈能力低下，绝大多数不能恢复。所以临床上大多以重建ACL作为治疗方向，重建ACL所采用的移植物主要包括自体肌腱、异体肌腱和人工韧带。
自体组织移植的好处是没有排异，但常常会导致供区部位的并发症，且需要二次手术；还有取材有限、取材部位创伤康复期较长等问题；异体组织移植可避免自体创伤，但其来源十分有限，存在乙肝、艾滋病等传染疾病的风险，还存在免疫排斥问题，后逐渐被人工韧带所取代。目前临床上使用最多的人工韧带就是LARS韧带(ligament advancedreinforcement system)，由聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)纤维制成。但是PET分子的结构高度对称，低表面能量导致了细胞很难依附和进入PET纤维内部，骨诱导性差，存在移植物与宿主骨愈合不佳的问题，且其生物活性仍然不能令人满意。其力学性能欠佳导致韧带编织过密，纤维间隙小，同样不利于周围组织长入。远期这会引起骨道扩大、移植物磨损、内固定松动等一系列问题，导致手术失败，因此加强人工韧带的组织样诱导性，促进移植物-宿主成为自体样愈合是关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人工韧带用再生纤维素丝，还提供其应用及所制备的人工韧带。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种人工韧带用再生纤维素丝，所述再生纤维素丝的原材料包括I型胶原蛋白、丝素蛋白、聚乙烯醇和硫酸软骨素。
进一步，按质量比计，再生纤维素丝的原材料中I型胶原蛋白：丝素蛋白：聚乙烯醇：硫酸软骨素为15～20:20～25:40～50:0.02～0.03。
进一步，按质量比计，I型胶原蛋白：丝素蛋白为1:1～1.5。
进一步，按质量比计，I型胶原蛋白：丝素蛋白为1:1。
更进一步地，丝素蛋白的制备方法为：将蚕丝在温度100℃下，料液比1:20～30的Na2CO3溶液中脱胶3次，每次30-40min，除去丝胶蛋白，得到脱胶的丝素蛋白，再将获取的丝素蛋白用去离子水洗净、于50-60℃下烘干至恒重备用。
更进一步地，所述再生纤维素丝的制备方法为：将丝素蛋白溶于氯化钙-乙醇-水溶液，加入聚乙烯醇，硫酸软骨素均匀搅拌至完全溶解后，再加入I型胶原蛋白缓慢搅拌至溶解形成纺丝溶液，采用湿法纺丝技术制备成再生纤维丝。
更进一步地，氯化钙-乙醇-水溶液中按物质的量计，氯化钙：乙醇：水为1:2:8。
更进一步地，湿法纺丝技术为：室温20-25℃下纺丝溶液通过压力泵挤入喷丝头；从喷丝头出来的纺丝溶液进入凝固浴，凝固浴为10％酒精，凝固槽长度1m；纺丝压力0.1MPa；纺丝速率5-7mL/h；卷绕速率8-10r/min。
2.以上任一项所述的再生纤维素丝在制备人工韧带中的应用也在本发明所保护的范围内。
3.还提供一种以上任一项所述的再生纤维素丝制备的人工韧带。
更进一步，所述人工韧带为ACL韧带。
本发明的有益效果在于：本发明所制备的再生纤维丝由胶原蛋白和丝素蛋白组成，极大的提高了纤维丝的组织相容性，对细胞而言，不仅无毒性，还有利于其附着生长；更有利于于制备的人工韧带移植后，在体内更容易利于自体ACL韧带样新生组织长成，且新生组织与韧带融合得比较紧密。制备的人工韧带组织相容性良好，12周后外层滑膜组织无增厚且滑膜中间有新生血管长入，充分说明本发明所提供的再生纤维丝制备人工韧带能良好的形成自体韧带。进一步对再生纤维丝的编织工艺进行深入研究，结合力学测试结果，筛选出最佳的编制工艺；通过本发明所提供的编织方法制备得到人工韧带的力学性能比较接近自体的ACL，且个韧带的拉伸长度优于自体的ACL，这和麻花辫的编织方法有一定关系，而另2股直接捻成绳状的则很好的限制了其刚度。通过实验证明，再生纤维丝通过先麻花辫编织再结合直接捻成绳子后编织成的人工韧带，具备一定的内部空间结构，其内部孔径达40-60nm，有利于细胞迁移及基质形成；而且四股编织的圆形麻花辫提高了最大载荷，二者编织的配合达到分散其拉力的作用，降低了人工韧带的平均直径，能够满足前交叉重建的力学需求。本发明再生纤维丝制备的人工韧带具有良好的机械性能和缓慢的降解性，降解的同时不引起组织工程韧带力学性质的下降。本发明的人工韧带编织结构可以保证韧带分别满足维持膝关节的前后和复杂的旋转稳定作用。本发明所提供的人工韧带，与组织工程ACL和LARS(Ligament Advanced Reinforcement System)相比具有明显的优势，无需接种细胞、单纯人工材料植入即可实现ACL再生修复，简单方便。
说明书附图
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为圆形麻花辫编织步骤示范1；
图2为圆形麻花辫编织步骤示范2；
图3为圆形麻花辫编织步骤示范3；
图4为圆形麻花辫编织步骤示范4。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
实施例1
丝素蛋白溶液的制备：
将200g蚕丝在温度为100℃，在4-6L质量浓度为1g/L的Na2CO3溶液中脱胶3次，每次30-40min，除去丝胶蛋白，得到脱胶的丝素蛋白，再将获取的丝素蛋白用去离子水洗净、于50-60℃下烘干至恒重备用。
按照物质的量比1:2:8配制氯化钙-乙醇-水(CaCl2-EtoH-H2O)溶液，将丝素蛋白溶于氯化钙-乙醇-水(CaCl2-EtoH-H2O)溶液，在60℃恒温水浴锅中对脱胶后的丝素蛋白溶解4-5h，溶解后，待丝素蛋白溶液冷却至室温后用离心机8 000-10000r/min，离心5-10min，得到丝素蛋白溶液。
实施例2
室温下，取100ml 20％(质量体积分数)丝素蛋白溶液加入50g聚乙烯醇，30mg硫酸软骨素均匀搅拌至完全溶解后，再加入20g I型胶原蛋白缓慢搅拌至溶解形成纺丝溶液，采用湿法纺丝技术进行再生纤维丝的制备。纺丝工艺为：室温20-25℃下纺丝溶液通过压力泵挤入喷丝头；从喷丝头出来的纺丝溶液进入凝固浴，凝固浴为10％酒精，凝固槽长度1m；纺丝压力0.1MPa；纺丝速率5mL/h；卷绕速率8r/min。通过对纺丝工艺参数的比较，凝固浴影响因素最大，其次是纺丝速度，压力影响因素最小。通过水和不同浓度的酒精凝固浴实验测试，凝固浴为10％酒精时，对再生纤维丝的成型效果及性能最好。大于50％酒精的凝固浴，成型效果差或不能成型。将此实施例制备再生纤维丝命名为NF1。
实施例3
室温下，取100ml 25％(质量体积分数)丝素蛋白溶液加入50g聚乙烯醇，30mg硫酸软骨素均匀搅拌至完全溶解后，再加入15g I型胶原蛋白缓慢搅拌至溶解形成纺丝溶液，采用湿法纺丝技术进行再生纤维丝的制备。纺丝工艺为：室温20-25℃下纺丝溶液通过压力泵挤入喷丝头；从喷丝头出来的纺丝溶液进入凝固浴，凝固浴为10％酒精，凝固槽长度1m；纺丝压力0.1MPa；纺丝速率5mL/h；卷绕速率8r/min。将此实施例制备再生纤维丝命名为NF2。
实施例4
室温下，取100ml 25％(质量体积分数)丝素蛋白溶液加入40g聚乙烯醇，20mg硫酸软骨素均匀搅拌至完全溶解后，再加入15g I型胶原蛋白缓慢搅拌至溶解形成纺丝溶液，采用湿法纺丝技术进行再生纤维丝的制备。纺丝工艺为：室温20-25℃下纺丝溶液通过压力泵挤入喷丝头；从喷丝头出来的纺丝溶液进入凝固浴，凝固浴为10％酒精，凝固槽长度1m；纺丝压力0.1MPa；纺丝速率5mL/h；卷绕速率8r/min。将此实施例制备再生纤维丝命名为NF3。
实施例5
将实施例2-4制备的人工韧带材料再生纤维丝灭菌后放入24孔板中，并设置PET纤维组(材料加同样重量的PET纤维丝)，空白对照组(不加任何材料)，每组设置3个重复板；将指数生长期的L-929小鼠成纤维细胞经0.25％胰蛋白酶消化、吹打重悬后4倍稀释，接种于每个样本孔中，放入37℃、5％CO2培养箱中进行共培养，培养基为10％FBS的DMEM。分别在培养2、4和7d后取出24孔板，每孔加入100ul CCK-8试剂，继续培养4h后，将每孔中的溶液转移到96孔酶标板中，每孔加入100ul，使用酶标仪于波长450nm处测定吸光度值，测试结果如表1所示。并使用倒置显微镜观察L-929细胞在细胞培养板中及各材料上的增殖情况。
细胞培养的第1～7d分别用显微镜观察小鼠成纤维细胞(L-929)增殖情况。细胞培养第4天，显微镜下见空白对照组细胞形态呈梭形、生长状态良好，增殖至板底约80％以上面积；材料NF1、NF2和NF3组细胞形态呈梭形，细胞也有大量增殖，且形态正常，各材料上有少量呈梭形细胞附着生长；PET纤维组细胞形态大部分呈梭形，有少量增殖，材料上无细胞附着生长。
细胞增殖率(RGR)％＝(实验组OD平均值/空白对照组OD平均值)×100％
细胞毒性分级：0级，RGR≥100％；1级，99％＞RGR≥75％；2级，74％＞RGR≥50％；3级，49％＞RGR≥25％；4级，24％＞RGR≥1％；5级，RGR等于0％。
表1各组2d、4d和7d细胞增殖结果及细胞毒性分级评级
由表1可得知，与空白对照相比较，和PET材料共培养的细胞增殖较少，且随着时间的增加更明显。和各再生纤维丝组共培养的细胞明显增殖较多，RGR为101％～113％，细胞毒性分级均为0，说明可进一步制备成人工韧带无细胞毒性，可以用于临床。
实施例6
a.将制备好的再生纤维丝20根为1束，3束捻成一股，再取4股以编织成圆形麻花辫；
b.将制备好的再生纤维丝20根为1束，3束捻成一股，3股捻成1条绳子；
c.取a步骤制备的圆形麻花辫1根和b步骤制备的绳子2根再捻成1条，制备为人工韧带。
其中，圆形麻花辫的编织方法如附图图1至图4所示，依次A、B、C、D四股，图1所示，分为左右2组，先用左侧外面的线，去挑右侧里面的线，即用A股去挑C股，A股从上面压住C股，图2所示；再用右侧外面的线，去挑左侧里面的线，即D股从上面往左去挑A股，图3所示；再用右侧外面的线，去挑左侧里面的线，图4所示；不断重复上述步骤，编到合适的长度为止。
将此方法标记为编织方法A。
实施例7
a.将制备好的再生纤维丝15根为1束，3束捻成一股，再取4股以编织成圆形麻花辫；
b.将制备好的再生纤维丝15根为1束，3束捻成一股，3股捻成1条绳子；
c.取a步骤制备的圆形麻花辫1根和b步骤制备的绳子2根再捻成1条，制备为人工韧带。
将此方法标记为编织方法B。
实施例8
a.将制备好的再生纤维丝25根为1束，3束捻成一股，再取4股以编织成圆形麻花辫；
b.将制备好的再生纤维丝25根为1束，3束捻成一股，3股捻成1条绳子；
c.取a步骤制备的圆形麻花辫1根和b步骤制备的绳子2根再捻成1条，制备为人工韧带。
将此方法标记为编织方法C。
实施例9
a.将制备好的再生纤维丝20根为1束，3束捻成一股，再取4股以编织成圆形麻花辫；
b.将制备好的再生纤维丝15根为1束，3束捻成一股，3股捻成1条绳子；
c.取a步骤制备的圆形麻花辫1根和b步骤制备的绳子2根再捻成1条，制备为人工韧带。
将此方法标记为编织方法D。
实施例10
a.将制备好的再生纤维丝15根为1束，3束捻成一股，再取4股以编织成圆形麻花辫；
b.将制备好的再生纤维丝20根为1束，3束捻成一股，3股捻成1条绳子；
c.取a步骤制备的圆形麻花辫1根和b步骤制备的绳子2根再捻成1条，制备为人工韧带。
将此方法标记为编织方法E。
实施例11
将制备好的再生纤维丝20根为1束，3束捻成一股，3股捻成1条绳子，再3条绳子捻成1条人工韧带。
将此方法标记为编织方法F。
以上编织方法也同样适用于其他丝状的人工材料，所述人工材料为可医用的各种材料。如CN 106048765 B一种人工韧带材料的制备方法得到的人工韧带材料。还比如CN108728931 A中提到的一种可用于人工韧带的复合纤维。
实施例12
将实施例2-4制备的再生纤维丝NF1、NF2和NF3分别按照实施例6-11编织方法A-F的编织方法制备成人工韧带进行生物相容性实验，使用15只兔子进行异位移植。
健康的成年新西兰兔32只，体重均控制为(3±0.50)kg，雌16只雄16只，随机分配，但保证每种人工韧带雌雄各一。3％戊巴比妥按1.5ml/Kg剂量麻醉，手术台上固定后将背部进行小范围剃毛，无菌下操作，剃毛部位用碘伏消毒后切口3-4cm，用镊子及血管钳向两侧钝性分离皮下组织，形成囊袋样结构；植入各人工韧带再用可吸收缝线缝合，各兔子做好对应标记，再次消毒，缝合好皮肤，并包扎好敷料；连续5天给予青霉素肌肉注射预防切口感染，注射次数为1次/d，密切观察切口局部有无炎症反应。术后12周处死兔子进行观察。通过HE染色可以清楚地观察到各植入的韧带上外层滑膜组织无增厚，有成纤维细胞及滑膜中间有新生血管长入。有部分新生成的组织长成，类似自体ACL韧带样组织，且新生组织与韧带融合得比较紧密。在整个实验测试过程中未见到有明显炎症反应及组织坏死，各实验动物也无其他不适反应。说明本发明的人工韧带的生物相容性良好。
实施例13
将实施例2-4制备的再生纤维丝NF1、NF2和NF3分别按照实施例6-11编织方法A-F的编织方法制备成人工韧带进行动物实验。并以自体ACL为阳性对照。将编织好的人工韧带用万能力学测试机进行拉伸力学测试。
健康的成年新西兰兔54只，体重均控制为(3±0.50)kg，雌雄各30只，分笼饲养。将兔子随机分成组，每组3只，保证每个实验组至少雌雄各一。分组时对每只兔子行膝关节前抽屉试验及Lachman试验均阴性以确保实验兔子术前膝关节功能正常。对实验兔子每只均行双膝ACL重建，术前3％戊巴比妥按1.5ml/Kg剂量麻醉，双膝关节备皮，消毒。严格无菌条件下行髌骨内缘膝关节切开术，依次切开皮肤、关节腔，切除部分膑下脂肪垫，暴露前交叉初带，在韧带中部完全切断自体前交叉韧带，用装有2.0mm的克氏针钻头的骨科电钻分别钻取股骨及胫骨骨隧道，股骨及胫骨隧道钻取角度均为45°，用钢丝通过牵引线将制备消毒好的人工韧带拉入骨隧道。移植物末端通过松质骨螺钉栓桩固定，屈曲位拉紧人工韧带，拧紧两端螺钉。术后兔子分开单独兔笼喂养，让其自由活动。膝关节切口隔日换药并观察切口愈合情况，连续5天给予青霉素肌肉注射预防切口感染，注射次数为1次/d。每日对兔子精神状态、四肢活动、饮食及髌骨有无脱位等情况做细致观察，出现问题及时处理。
生物力学测试：于术后20周以空气栓塞法处死每组的3只兔，处死前仔细观察实验兔子的双膝关节活动情况，并仔细对双膝关节行前抽屉试验及Lachman试验检查。于胫骨端及股骨端距离膝关节4cm处截断，去除膝关节周围肌肉、筋膜等所有的软组织，仅保留人工韧带，使用骨水泥分别包埋股骨端及胫骨端，制备成股骨-人工韧带-胫骨复合体标本，将股骨端及胫骨端分别放置于电子万能力学试验机的夹具上固定牢靠，调整骨隧道与拉力方向一致，进行极限拉伸力学测试。首先，施加0-5N拉力，速度为2mm/min，循环5次，目的是将人工韧带肌腱纤维全部拉开，防止肌腱纤维的迂曲而影响生物力学测试的结果。再以10mm/min的拉伸速度施加拉伸力直至标本毁损，以电子万能力学试验机绘制的负荷-位移曲线确定人工韧带的最大载荷、刚度、拉伸长度。测试结果如表2所示。
表2各韧带力学测试结果
由表2可知，采用编织方法E的人工韧带的力学性能比较接近自体的ACL，且个韧带的拉伸长度优于自体的ACL，这和麻花辫的编织方法有一定关系，而另2股直接捻成绳状的则很好的限制了其刚度。通过实验证明，再生纤维丝通过先麻花辫编织再结合直接捻成绳子后编织成的人工韧带，具备一定的内部空间结构，其内部孔径达40-60nm，有利于细胞迁移及基质形成；而且四股编织的圆形麻花辫提高了最大载荷，二者编织的配合达到分散其拉力的作用，降低了人工韧带的平均直径，能够满足前交叉重建的力学需求。本发明再生纤维丝制备的人工韧带具有良好的机械性能和缓慢的降解性，降解的同时不引起组织工程韧带力学性质的下降。本发明的人工韧带编织结构可以保证韧带分别满足维持膝关节的前后和复杂的旋转稳定作用。
大体观察
各实验组ACL重建后未见明显的关节腔内积液及滑膜组织增生，固定用螺钉在位牢靠，在原ACL部位形成新生韧带组织，形态、色泽基本同正常ACL。所制备的人工韧带中含有蚕丝通过去除基质胶原得到蚕丝丝素纤维结构，进一步增加了人工韧带的生物相容性，且有利于细胞的粘附，迁移和增值。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种人工韧带用再生纤维素丝，其特征在于，所述再生纤维素丝的原材料包括I型胶原蛋白、丝素蛋白、聚乙烯醇和硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述的人工韧带用再生纤维素丝，其特征在于，按质量比计，再生纤维素丝的原材料中I型胶原蛋白：丝素蛋白：聚乙烯醇：硫酸软骨素为15～20:20～25:40～50:0.02～0.03。
3.根据权利要求2所述的人工韧带用再生纤维素丝，其特征在于，按质量比计，I型胶原蛋白：丝素蛋白为1:1～1.5。
4.根据权利要求2所述的人工韧带用再生纤维素丝，其特征在于，按质量比计，I型胶原蛋白：丝素蛋白为1:1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的人工韧带用再生纤维素丝，其特征在于，丝素蛋白的制备方法为：将蚕丝在温度100℃下，料液比1:20～30的Na2CO3溶液中脱胶3次，每次30-40min，除去丝胶蛋白，得到脱胶的丝素蛋白，再将获取的丝素蛋白用去离子水洗净、于50-60℃下烘干至恒重备用。
6.根据权利要求5所述的人工韧带用再生纤维素丝，其特征在于，所述再生纤维素丝的制备方法为：将丝素蛋白溶于氯化钙-乙醇-水溶液，加入聚乙烯醇，硫酸软骨素均匀搅拌至完全溶解后，再加入I型胶原蛋白缓慢搅拌至溶解形成纺丝溶液，采用湿法纺丝技术制备成再生纤维丝。
7.根据权利要求6所述的人工韧带用再生纤维素丝，其特征在于，氯化钙-乙醇-水溶液中按物质的量计，氯化钙：乙醇：水为1:2:8。
8.根据权利要求6所述的人工韧带用再生纤维素丝，其特征在于，湿法纺丝技术为：室温20-25℃下纺丝溶液通过压力泵挤入喷丝头；从喷丝头出来的纺丝溶液进入凝固浴，凝固浴为10％酒精，凝固槽长度1m；纺丝压力0.1MPa；纺丝速率5-7mL/h；卷绕速率8-10r/min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的再生纤维素丝在制备人工韧带中的应用。
10.由权利要求1-8任一项所述的再生纤维素丝制备的人工韧带。
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