CN102176929A - 包含浆膜下筋膜的分离的细胞外基质材料 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了自动物腹壁分离并包含腹壁的浆膜下筋膜层的纯化的细胞外基质材料。这种医学材料可在治疗受损组织中以及在提供修复疝的组织支撑的某些方面发现用途。本发明也描述了相关的制造方法和用途。

Description

包含浆膜下筋膜的分离的细胞外基质材料
技术领域
本发明通常属于医学材料领域，特别地属于可用于组织移植的医学材料方面。
背景技术
作为进一步的背景，已提出将多种细胞外基质(ECM)材料用于医学移植、细胞培养和其他相关应用。例如，已提出含有源自小肠、胃或膀胱组织的粘膜下层的医学移植物和细胞培养材料。参见，例如，美国专利Nos.4,902,508、4,956,178、5,281,422、5,554,389、6,099,567和6,206,931。此外，Cook Biotech Incorporated，West Lafayette，Indiana最近制造了多种商品名为SURGISIS
Figure BPA00001281285300011
、STRATASIS
Figure BPA00001281285300012
和OASIS
Figure BPA00001281285300013
的基于小肠粘膜下层的医学材料。
也提出源自肝基底膜的医学材料，例如在美国专利No.6,379,710中。同样地，已提出将源自羊膜(参见例如美国专利Nos.4,361,552和6,576,618)和源自肾小囊膜(参见2003年1月9日公布的国际PCT专利申请No.WO 03/002165)的ECM材料用于医学和/或细胞培养应用。然而，许多这些材料受限于它们的尺寸和强度。在某些应用中，必须将这些材料的多个带或片耦合或者结合在一起以获得移植物，该移植物足够大以覆盖所需区域，而同时仍然保持足够的强度以避免再植入的需要。
对于以上所述，显而易见的是仍然需要可用于各种医学应用，特别是需要较大尺寸和/或相对伸展的移植物的那些应用中的可选择的医学材料。本发明提供了这种医学材料，以及其制备和使用方法。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种适用于提供组织移植物的材料。所述材料包含细胞外基质材料的分离片，该细胞外基质材料得自动物，尤其是猪类动物的腹壁，并包含来自动物腹壁的浆膜下筋膜。所述细胞外基质材料包含胶原和弹性蛋白，并基本上不含天然细胞。该细胞外基质材料所需地为生物吸收性的，并能在某些具体实施方案中保留来自动物的天然硫酸糖胺聚糖。该细胞外基质材料可具有至少1磅的断裂拉伸强度和/或至少约50％的断裂伸长。
在另一方面，本发明提供了一种细胞外基质移植材料的制备方法，该方法包括提供自动物，尤其是猪类动物的腹壁分离的组织片段，所述组织片段包含浆膜下筋膜和粘附的浆膜下脂肪。例如机械去除至少一些浆膜下脂肪以制得包含浆膜下筋膜的组织胶原层。将胶原层去细胞化，也可处理胶原层以降低其脂质含量。在某些有利的形式中，在加工之后，组织胶原层保留天然硫酸糖胺聚糖，具有至少1磅的断裂拉伸强度，和/或至少约50％的断裂伸长。
在另一方面，本发明提供了一种治疗患者的方法。所述方法包括将本文所述的细胞外基质材料移植至患者。在优选的形式中，例如在疝修复程序的实施中，进行移植以提供患者软组织的支撑。
通过本文进一步的描述，本发明的另外的具体实施方案以及特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1显示了猪类腹壁的层，其用于从中得到片段以制备移植材料。
具体实施方式
为了促进本发明原理的理解的目的，现在将参照显示于附图中的具体实施方案，并使用特定的语言描述该具体实施方案。尽管如此，应该理解不旨在由此限制本发明的范围，在本文认为本发明所属领域技术人员通常可想到所示医学材料的变化和修改，以及其中所示的本发明原理的进一步应用。
如上所公开的，本发明提供了可用于提供医学程序的组织移植物的分离的去细胞化的细胞外基质(ECM)材料。现在转向附图，图1显示了猪的腹壁10的层的图示。图1也为包括例如牛类、羊类和马类动物的其他动物的腹壁的代表，自其可获得ECM材料。所述层包含壁层腹膜11、浆膜下筋膜12、浆膜下脂肪13、后筋膜14、腹肌15、前筋膜16、皮下脂肪17，和真皮18。本文所述的细胞外基质移植材料包含浆膜下筋膜12，以及任选的自腹壁的剩余结构层分层的壁层腹膜11。因此，优选的本发明的细胞外基质移植材料不含或者基本上不含后筋膜14、腹肌15、前筋膜16、皮下脂肪17，和真皮18。本文所用的“基本上不含”意指排除的组分不存在，除了可能作为痕量残留检测，例如组成移植材料的不多于0.5重量％。
移植材料的浆膜下筋膜源自动物，优选温血脊椎动物，更优选非人类温血脊椎动物(如猪类、羊类、牛类或马类动物)的腹壁。特别优选猪类动物源。在一个优选的具体实施方案中，可用于本发明的腹膜和筋膜可如下获得：收集腹壁，自壁分层组织片段，所述壁包括壁层腹膜、浆膜下筋膜和来自相邻组织(包括存在于组织源中的肌肉层和/或其他层)的其他组织(例如脂肪组织)的至少部分。然后所需地进一步加工包含壁层腹膜和浆膜下筋膜的组织片段以制备适合用作移植材料的含胶原(“胶原的”)且含弹性蛋白(“弹性蛋白的”)片。进一步加工可以去除壁层腹膜或保留壁层腹膜的那些的方式进行。因此，在某些具体实施方案中，制得的移植材料不含或者基本上不含壁层腹膜，在某些其他具体实施方案中，制得的移植材料包含壁层腹膜。
可使用任何合适的方式加工包含壁层腹膜11、浆膜下筋膜12和浆膜下脂肪13的每一个的至少部分的收集的组织片段，从而去除浆膜下脂肪13。合适的去除方式可包括，例如，例如用钝刀片机械研磨脂肪组织。如需要，可通过将多层材料浸入异丙醇或适于去除脂肪组织的任何其他液体介质中一段去除另外的脂肪所需的时间而去除另外的浆膜下脂肪13或任何其他脂肪组织。在一个优选具体实施方案中，首先刮擦分离的材料以去除浆膜下脂肪13的部分。在刮擦之后，用有机溶剂处理材料，例如通过浸入异丙醇(IPA)(1重量份材料相对10体积份IPA)30分钟，从而去除脂质。该去除脂质的处理步骤通常进行至少一次，但可进行多次(例如2、3、4或甚至5或更多次)。优选的本发明的经处理的ECM移植材料具有15重量％以下，更优选10重量％以下，在某些具体实施方案中为5重量％以下的天然脂质含量。
本文所述的细胞外基质材料的一个优点是它们可以较大尺寸自单独收集的腹壁组织片制得，而同时保持用于医药目的的充足的强度性质。自组织源分离的许多其他材料(例如其他ECM材料)需要连接多个材料片以制得比任何单独片更大的片状移植物，由此得到用于某些医药用途(如疝移植物)的具有充足尺寸和强度的整个片。本文所述的细胞外基质移植材料可自足够成熟和大的动物收集以免于需要使用多个侧面连接的片，尽管如需要可形成这种连接的构造。在某些具体实施方案中，包括单独的或连接至壁层腹膜的浆膜下筋膜的经加工的细胞外基质移植物具有至少20厘米的宽度和至少20厘米的长度。
本发明的细胞外基质材料可通过将材料移植至患者而用于处理多种医学症状，包括涉及患者的组织损坏的那些。在这方面，本发明的医学材料可用于治疗受损组织，并可施用至患者的外部结构(例如皮肤)，或可植入患者内，例如从而在疝修复或骨盆底重建的情况中提供组织支撑。因此，本发明的医学材料可以多种形式设置以适应其所需的使用位置。本发明的医学材料可掺入一种或多种药物或其他医药试剂，并可在施用至患者之后洗脱那些物质，由此消除或减少物质的全身用药的需要，并最小化了全身毒性和不良反应的风险。
通常，当医学材料设置为施用至组织时，将医学材料切割至或设置为其最终用途所需的尺寸。在某些具体实施方案中，材料的尺寸可大于其施用的组织缺损。以此方式调节材料的尺寸提供了容易的对周围组织的粘附。例如，一旦将调节尺寸的医学材料置于需要治疗的区域之上、之内或周围时，可使用任何几种已知的合适粘附方法将医学材料更牢固地粘附至周围组织或其他结构。合适的粘附方法包括，例如装订(stapling)、缝合、粘合等。优选地，医学材料通过缝合更牢固地粘附至周围组织或其他材料。目前本领域中可得到多种合成材料用作缝合线。例如，包括ProleneTM、VicrylTM、MersileneTM、PanacrylTM和MonocrylTM的缝合线可考虑用于本发明中。本领域技术人员公知其他缝合材料。本领域公知的医学粘合剂也可与本发明的医学材料结合使用以更牢固地将材料粘附至组织或其他结构。
在优选的具体实施方案中，包含腹膜和下浆膜下筋膜的细胞外基质材料可为生物吸收性材料，当将其植入患者中时，其所需地支撑组织重塑，从而随时间而由患者组织代替。在许多情况中，医学材料显示可重塑性质，使得重塑过程在数天或数星期的过程中发生。在优选的具体实施方案中，重塑过程在约5天至约12星期的时间内发生，在此期间过程中植入材料被再吸收并由患者组织代替。在如此进行时，优选的本发明的ECM材料可支撑或引起血管生成至材料内，从而促进新的患者组织的发育。为了这些目的，某些优选的本发明的ECM材料不使用如戊二醛的化学交联剂进行处理以避免在植入时导致材料永久(permanent)。
然而，如果在给定情况下需要，在其他具体实施方案中本发明的ECM材料可含有引入的非天然交联。例如，可在将ECM材料自其来源分离之后的任何时候用交联剂对ECM材料进行处理。增加在医学材料内和/或在两个或两个以上医学材料的层压层(laminated layers)之间的交联含量(或数目)可用于提高其强度。然而，在医学材料内引入的交联也会影响医学材料被吸收和重塑至患者组织的能力。因此，在引入交联的某些具体实施方案中，可明智地控制在ECM材料中加入的交联水平以保持ECM材料的可重塑特性。
当使用时，ECM材料的引入的交联可通过光交联技术，或通过应用交联剂(如通过化学交联剂)，或通过由脱水或其他方式引起的蛋白质交联而获得。可使用的化学交联剂包括，例如，如戊二醛的醛，如碳二亚胺的二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物，核糖或其他糖，酰基叠氮化物，磺酸基-N-羟基琥珀酰胺，或聚环氧化合物(包括例如聚缩水甘油醚，如可以商品名DENACOL EX810购自Nagese Chemical Co.，Osaka，Japan的乙二醇二缩水甘油醚，和以商品名DENACOL EX 313也购自Nagese Chemical Co.的甘油聚甘油醚)。通常，当使用时，聚甘油醚或其他聚环氧化合物每分子具有2至约10个环氧基团。
当考虑含有两个或多个ECM材料层的分层构造时，可另外交联层压板的层以将ECM材料的多个层彼此结合。ECM材料的交联也可通过将基体暴露于UV辐射，通过用如转谷氨酰酶和赖氨酰化氧的酶处理胶原基基体，以及通过光交联进行催化。因此，可在彼此耦合之前、在彼此耦合过程中和/或在彼此耦合之后将另外的交联加入单独的层。
可选择地，可滚动或堆叠两个或两个以上多层医学材料部分，或者一个材料部分在自身上折叠至少一次，然后使用不同于化学交联的结合技术(如真空压制、冻干或其他脱水加热结合条件和/或粘合剂、胶或其他结合剂的使用)将材料融合或结合在一起。合适的粘合剂可包括例如胶原凝胶或糊、明胶、纤维蛋白胶或其他包含反应活性单体或聚合物的试剂(例如氰基丙烯酸盐粘合剂)。同样地，可使用化学交联剂，如戊二醛、甲醛、环氧化物、京尼平或其衍生物、碳化二亚胺化合物、聚环氧化合物或其他类似试剂(包括在如上讨论中确定的其他那些)获得或促进结合。也可使用这些的一种或多种与脱水引发的结合的组合。
可使用多种脱水引发的结合方法以将本发明的ECM材料的部分融合在一起。在一个优选具体实施方案中，在脱水条件下压缩ECM材料的多个层。术语“脱水条件”可包括促进或引发水从多层医学材料去除的任何机械或环境条件。为了促进压缩材料的脱水，压缩基体结构的两个表面的至少一个为透水的。可任选地通过在压缩表面的外部应用吸墨(blotting)材料，加热基体结构或吹扫空气或其他惰性气体而进一步提高材料的脱水。将ECM层彼此脱水结合的特别有用的方法包括冻干，例如冷冻干燥或蒸发冷却条件。
脱水结合的另一方法为真空压制。在真空压制过程中，彼此强制接触的多层医学材料的脱水有效地将材料彼此粘结，甚至是在不存在用于获得结合的其他试剂下，尽管可使用这种试剂并同时也至少部分利用脱水引起的结合。在充足的压缩和脱水下，可使得多层医学材料形成通常单一的层压结构。
在本发明的一些方面中，有利的是在相对温和的温度暴露条件下进行干燥操作，所述条件将对本发明的ECM材料(例如天然胶原结构和存在的潜在的生物活性物质)的潜在有害影响最小化。因此，在本发明的一些形式中优选使用如下干燥操作，该干燥操作不或基本上不持续暴露于人体温度以上或略微更高，即不高于约38℃的温度下而进行。这些包括，例如，在约38℃以下的真空压制操作，在约38℃以下的鼓风干燥，或者不使用主动加热-在约室温(约25℃)下或使用冷却的这些过程的任一种。当然，相对较低的温度条件也包括冻干条件。
当制得时，ECM材料可任选地保留原生自源组织的生物活性组分。例如，腹膜和/或筋膜可包括一种或多种天然生长因子，如纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)或其组合。同样地，本发明的ECM材料可包含如一种或多种硫酸糖胺聚糖(sGAGs)(如硫酸肝素)、一种或多种非硫酸糖胺聚糖(如透明质酸)，和/或一种或多种糖蛋白(如纤连蛋白)的其他生物材料。因此，一般而言，可任选地加工本发明的ECM以保留一种或多种直接或间接引发细胞响应的天然生物活性组分，所述细胞响应如细胞形貌、增殖、生长、蛋白质或基因表达的变化。
经加工的本发明的ECM材料通常包含丰富的胶原。这种天然源ECM材料将大部分包含非无规取向的胶原纤维。经加工的ECM材料也通常包含弹性蛋白。当加工ECM材料以保留如上所述的天然生物活性组分时，该ECM材料可将这些组分作为分散于胶原纤维之间、之上和/或之内的固体而保留。用于本发明的特别合意的材料包含显著量的这种分散的非胶原和非弹性蛋白固体，所述非胶原和非弹性蛋白固体在合适的染色下在光学显微镜观察下易于确定。在某些本发明的具体实施方案中，这种非胶原和非弹性蛋白固体可构成材料干重的显著百分比，例如在本发明的各种具体实施方案中至少约1重量％，至少约3重量％，和至少约5重量％。
本发明的ECM材料也可显示血管生成特性，并因此可有效引起移植该材料的主体中的血管生成。关于此点，血管生成为身体制造新的血管以产生增加的对组织的血液供给的过程。因此，当血管生成材料与主体组织接触时，其促进或激励新血管的形成。最近开发了体内血管生成对生物材料植入的响应的测量方法。例如，一个这种方法使用皮下植入模型测定材料的血管生成特性。参见C.Heeschen等人的Nature Medicine 7(2001)，No.7，833-839。当与荧光微血管造影技术结合时，该模型可提供生物材料内血管生成的定量和定性测量。C.Johnson等人的Circulation Research 94(2004)，No.2，262-268。
此外，除了包含天然生物活性组分之外或者作为天然生物活性组分的替代物，可将非天然生物活性组分(如通过重组技术或其他方法合成制得的那些)掺入本发明的ECM材料中。这些非天然生物活性组分可为对应于在组织中天然存在的那些但可能具有不同种类的源自天然或重组制得的蛋白质(例如施用于来自如猪的其他动物的组织的人类蛋白质)。在某些形式中，可将如FGF-2、血小板衍生生长因子(PDGF)和/或VEGF的一种或多种非天然生长因子加入ECM材料。所述非天然生物活性组分也可为药品。可掺入本发明所用的材料之内和/或之上的说明性的药品包括，例如，抗生素、如血液凝固因子的血栓促进物质，例如凝血酶、纤维蛋白原、抗炎剂、抗增生剂、止痛剂和其他。可在预制造步骤、就在程序(例如通过将材料浸入含有如头孢唑啉的合适抗生素的溶液中)之前或者在将材料移植入患者的过程中或之后将这些物质施用至多层医学材料。
可通过任何合适的方式将非天然生物活性组分施用至本发明的ECM材料。合适的方式可包括，例如，喷雾、浸渍、沉浸等。若其他化学或生物组分包含于ECM材料中，非天然生物活性组分可在这些其他组分之前、与这些其他组分一起或者这些其他组分之后进行施用。在一个具体实施方案中，非天然生物活性组分的涂层可在ECM材料的任一侧或两侧形成。“涂层”意指施用非天然生物活性组分以覆盖ECM材料表面的指定部分。在某些具体实施方案中，可施用非天然生物活性组分以形成基本上覆盖本发明的ECM材料的至少一侧的整个表面区域的涂层。在其他具体实施方案中，可将如本文所述的那些的非天然生物活性组分基本上均匀地掺入整个本发明的ECM材料中。
本发明的ECM材料优选为高度纯化的，例如Cook等人的美国专利No.6,206,931中所述。因此，优选的ECM材料显示约12内毒素单位(EU)/克以下，更优选约5EU/克，且最优选约1EU/克以下的内毒素水平。作为另外的优选，本发明的ECM材料可具有约1集落形成单位(CFU)/克以下，更优选约0.5CFU/克以下的生物负载。真菌水平合意地同样较低，例如约1CFU/克以下，更优选约0.5CFU/克以下。核酸水平优选为约5微克/毫克以下，更优选为约2微克/毫克以下，且病毒水平优选为约50噬斑形成单位(PFU)/克以下，更优选约5PFU/克以下。美国专利No.6,206,931中所教导的ECM组织的这些和另外的性质可为本发明的ECM材料的特性。
在另外的具体实施方案中，本发明的ECM材料可经受扩展材料的工艺。在某些形式中，这种扩展的材料可通过使ECM材料与一种或多种碱性物质接触直至材料扩展而形成。说明性地，所述接触足以将ECM材料扩展至其原总体积的至少120％(即1.2倍)，或者在一些形式中扩展至其原体积的至少约2倍。之后，任选地例如通过中和和/或润洗而将扩展的材料自碱性介质分离。收集的扩展的材料可以任何合适的方式使用。说明性地，可在具有所需形状或构造的移植结构的形成中将扩展的材料用生物活性组分富集、干燥和/或模制等。在某些具体实施方案中，扩展的ECM材料结构可为高度压缩性和扩展性的，使得该材料被压缩以例如自管状传递器件的内腔(lumen)内传递，之后在自器件调配(deployment)时扩展而固定在患者内，引起患者内的神经束(tract)关闭，和/或引起止血。
扩展的材料可通过本发明的ECM材料与含有氢氧化钠的水性溶液或其他介质的受控接触而形成。材料的碱处理可导致材料的物理结构的变化，从而导致其扩展。这种变化可包括材料中的胶原的变性。在某些具体实施方案中，优选的是将材料扩展至其原总体积的至少约3倍，至少约4倍，至少约5倍，或至少约6倍或甚至更大倍数。扩展的量级与数种因素相关，包括例如在待扩展的材料的处理中所用的碱性介质的浓度或pH、暴露时间和温度。
ECM材料通常包含胶原纤维的网络，其具有天然存在的分子内交联和天然存在的分子间交联。当进行本文所述的扩展加工时，天然存在的分子内交联和天然存在的分子间交联可保留于加工的胶原基体材料而足以保持胶原基体材料为完整的胶原片材；然而，胶原片材中的胶原纤维会变性，且胶原片材可具有比起始材料的厚度更大的碱加工厚度，例如为原厚度的至少120％，或为原厚度的至少2倍。
说明性地，用于处理ECM材料的碱性物质的浓度在约0.5至约2M的范围内，更优选约1M的浓度。此外，在某些具体实施方案中，碱性物质的pH为约8至约14。在优选的方面中，碱性物质具有约10至约14，最优选约12至约14的pH。
除了浓度和pH之外，如温度和暴露时间的其他因素将有助于扩展的程度，如上所述。在此方面，在某些变体中，将ECM材料暴露于碱性物质在约4至约45℃的温度下进行。在优选的具体实施方案中，所述暴露在约25至约40℃的温度下进行，最优选37℃。此外，暴露时间为至少约1分钟直至约5小时或更多。在一些具体实施方案中，暴露时间为约1至约2小时。在一个特别优选的具体实施方案中，在约37℃的温度下将ECM材料暴露于pH为14的NaOH的1M溶液约1.5至2小时。这种处理导致胶原变性和材料的相当大的扩展。材料的胶原基体的变性可作为材料的胶原填充(packing)特性的变化(例如起始材料的紧密束缚胶原网络的显著破坏)而得以观察。非扩展的材料可具有紧密束缚胶原网络，当通过肉眼或在适度放大(例如100x放大)下观察时，该紧密束缚胶原网络呈现基本上均匀连续的表面。相反地，当在相同放大(例如约100x)下观察时，扩展的胶原材料可具有完全不同的表面，其表面不是连续的，而是在许多区域中呈现胶原股或束，所述胶原股或束由在股或束之间的材料中的大量间隙所分隔。因此，扩展的ECM材料通常比对应的非扩展的ECM材料更显得多孔的。此外，在许多情况中，相比于未处理的起始材料，扩展的ECM材料经证实(例如通过测量增加的透水性或其他液体通道)具有增加的孔隙率。扩展的ECM材料的更多泡和多孔的结构可使得材料可被铸塑或制备成用于制备医学材料和器件的多种海绵或泡沫形状。
在这种碱处理之后，可将ECM材料自碱性介质分离并加工以进一步使用。说明性地，可在ECM材料的进一步加工以形成本发明的结构或其他组合物之前，中和和/或用水润洗收集的材料以自材料去除碱性。
起始材料(即在用碱性物质处理之前)可任选地包含除了胶原和弹性蛋白之外的天然组分。用碱性物质处理材料可降低一种、一些或全部的这种天然组分的量。在某些具体实施方案中，材料用碱性物质进行受控处理足以产生基本上不含核酸和脂质，并潜在地也不含生长因子、糖蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖的材料。
在某些具体实施方案中，可将一种或多种外源的或内源的生物活性组分，例如类似于在扩展加工过程中自ECM材料去除的那些，返回至材料。例如，可将生长因子、糖蛋白、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖再补充至扩展的ECM材料。这些生物活性组分可通过任何合适的方法返回至材料。例如，在某些形式中，含有这些组分的组织提取物(如美国专利No.6,375,989中所述)可以制得并施用至ECM材料(所述组织提取物自该ECM材料去除)。在一个具体实施方案中，ECM材料可在组织提取物中培养充足的时间以使得包含于其中的生物活性组分与材料缔合。所述组织提取物可例如由非扩展的ECM组织获得，所述非扩展的ECM组织与用于制备被再补充的扩展的ECM材料的非扩展的ECM组织具有相同类型。用于将生物活性组分返回或引入至多层医学材料的其他方式包括本领域公知的喷雾、浸渍、沉浸等。
本文所述的ECM材料可用于制造任何合适形式的组合物或器件。合适的形式包括，例如片、多孔固体泡沫、粉末、栓塞、管、固体圆柱体、在液体介质中的悬浮体、凝胶或包括溶剂化的ECM组分的溶液。
本发明的单个分离的去细胞化的ECM层的厚度随着动物(该ECM层自所述动物分离)的不同而不同，包括基于动物的物种、年龄或尺寸等的变化。优选的这种单个层具有在约500至约1000微米，更优选约600至900微米，且最优选约750至约850微米范围内的厚度(水合)。单个ECM层在水合时合意地具有至少约1磅的断裂拉伸强度，和在某些形式中在约1至5磅范围内的断裂拉伸强度。单个ECM层合意地为高伸展性的，当其水合时具有至少约50％，通常在约50％至约80％范围内的断裂伸长。关于此点，本文所指的断裂拉伸强度和断裂伸长可根据ASTM D882(2002)或等同方法确定。单个ECM层在水合时合意地显示在约0.5至约2磅范围内的基于5-0Prolene缝合尺寸和2毫米的咬合深度的缝合保留强度。类似地，单个ECM层在水合时合意地显示在约200至约1000千帕范围内的爆破强度。特别优选具有这种厚度、断裂拉伸强度、断裂伸长、缝合保留强度和/或爆破强度的本发明的猪源ECM层。
若需要获得提高的机械或其他物理性质，可以任何合适的方式将多个ECM材料层结合在一起，所述合适的方式包括在加热、非加热或冻干条件下的脱水加热结合，使用本文所述的粘合剂、胶或其他结合剂，用化学试剂或辐射(包括UV辐射)交联，或这些彼此的任意结合或这些与如上所述的其他合适的方法的任意结合。例如，可制得具有彼此结合的2、3、4、5、6或更多个ECM层的结构。在这种结构中，ECM层可直接彼此叠加以完全重叠，或者可排布为仅部分重叠，由此产生具有比任何单独考虑的ECM层更大表面积的总片。完全重叠和仅部分重叠的ECM层的组合也可用于形成本发明的结构。本发明的腹膜/浆膜下筋膜ECM层的一个优点是它们可以相对较大的表面积尺寸得以分离，由此消除或减少了部分重叠分别的ECM层以获得相对较大的片结构的需要。一贯地，在本发明的某些优选具体实施方案中，多层压片结构包含至少两个彼此结合并形成重叠区域的腹膜/浆膜下筋膜ECM层，其中所述重叠区域具有至少400平方厘米的表面积。在这种结构中，所述至少两个ECM层可完全重叠以提供具有400平方厘米或更大的表面积的结构，或者可仅部分重叠但具有足够重叠的材料以形成至少400平方厘米的重叠表面积。在每种情况中，400平方厘米的重叠区域可包括至少20厘米的长度和至少20厘米的宽度(垂直于长度测得)。这种结构可提供给ECM片器件大的增强且稳定的材料区域，例如以在如疝修复或骨盆底重建中用于提供软组织支撑。
用本文所述的ECM材料制得的无菌医学产品可不含如合成聚合物材料的合成材料，或者可例如在多层层压结构中包含与一种或多种合成(例如合成聚合物)材料结合的ECM材料。例如，多层医学材料可包含例如通过缝合、粘合剂等粘附至细胞外基质组织的合成制得的层。这种合成制得的材料可包括非生物吸收性或生物吸收性合成聚合物材料，如聚四氟乙烯(PTFE，例如GORE-TEX材料)、尼龙、聚丙烯、聚氨酯、硅酮、DACRON聚合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乙醇酸和乳酸的共聚物(PLGA共聚物)、聚己酸内酯或本领域公知的其他。
包含本发明的ECM材料的医学产品可在医学包装中以无菌形式提供。包装产品的最终杀菌可例如通过辐射、环氧乙烷气体或任何其他合适的杀菌技术实现，可相应地选择医学包装的材料和其他性质。
本发明的ECM材料可以脱水或水合态进行包装。ECM材料的脱水可通过本领域公知的任何方式，包括上文所述的任何那些而得以实现。优选地，包装的ECM材料为冻干的或真空压制的材料。如需要，可在用于治疗患者之前使用合适的液体，如无菌水或无菌水性缓冲液将脱水ECM材料再水合。可选择地，ECM材料可以其脱水形式施用至患者。
为了提高本发明的方面及它们的特征和优点的进一步理解的目的，提供了如下特定实施例。应理解这些实施例为说明性的，且不限定本发明的方面。
实施例1
细胞外基质移植材料的制备
在食品加工厂，在加工线上的位点收集组织片段，在所述加工线处用中线切口打开完整猪类体腔，并去除前肋和所有器官。在身体每一侧的体壁皮瓣的后边缘上形成切口，在体壁的每一侧取下组织片段以制得具有大约相等尺寸(1英尺x1.5英尺)的两个组织片段。这些片段包含腹膜、浆膜下筋膜和浆膜下脂肪。经确定后筋膜不是该组织片段的一部分。取决于沿着所述片段的位置，所述浆膜下脂肪为约0.5至约1厘米厚。放置包含内脏腹膜和壁层腹膜两者的腹膜。丢弃内脏腹膜，该内脏腹膜经确定为带有血管的白色厚网络的透明薄膜。
用手使用Teflon片(1/8”厚)在两侧刮擦组织片段以去除脂肪。在该操作过程中观察到组织片段为抗撕裂的。在刮擦之后每个组织片段称重为大约143克。
一旦称重，在含有100毫升乙醇(200标准酒精度(proof))、12毫升过乙酸(PPA)和1990毫升高纯水的溶液中将每个组织片段消毒。所述片段在该溶液中摇动大约2小时，随后在高纯水中润洗5次，每次5分钟。然后将片段在高纯水中储存。观察说明在所述加工过程中使得片段不含或基本上不含壁层腹膜。
将如上所述所得组织片段施用至钉住的聚甲醛树脂(delrin)板并冷冻干燥。这生成具有不同的光滑侧和粗糙侧的白色厚冻干片。这些片在纯异丙醇(IPA)中(1重量份片对10重量份IPA)润洗两次，每次润洗30分钟，从而去除脂质。在IPA处理之后，所述片在高纯水中润洗两次，每次5分钟。然后将片在高纯水中储存。测试一片水合片的厚度和探针爆破(probe burst)。厚度值为0.734毫米、0.755毫米、0.811毫米、0.804毫米、0.796毫米，和0.818毫米，平均厚度为0.786毫米且标准偏差为0.034毫米。观察到的探针爆破力为125牛顿、89.2牛顿和98牛顿，平均为104.1牛顿，标准偏差为18.6牛顿。
实施例2
测试天然脂质含量
通常如实施例1所述获得2批材料。通过机械刮擦、用100％异丙醇(IPA)(1∶10重量∶体积)三次处理进行化学脱脂，用过乙酸(PAA)溶液消毒，用高纯水洗涤四次而加工腹壁组织片段。每一批由2片组成，总共测试四片。从每一片上切割四个4x7厘米的样品，得到每批8个样品，总共16个样品。将每个样品称重(初始重量)，滚动并置于具有10毫升100％乙醇的1.5毫升离心管中。将管置于管架(tube holder)中，并将该架置于旋转摇动器的一侧上，在室温下大约24小时。在24小时之后，排掉乙醇，将10毫升100％丙酮置入每个管中。然后将该架放置回摇动器上，在室温下大约24小时。在24小时之后，排掉丙酮，在通风橱中使样品空气干燥大约24小时。随后将样品干燥大约48小时并称重(最终重量)。由初始重量减去最终重量并除以初始重量而计算得到脂质含量。
在材料中的平均测得脂质含量测定为8.4％±6.4％。
实施例3
测试天然透明质酸含量
通常如实施例1所述获得2批材料。通过机械刮擦、用100％异丙醇(IPA)(1∶10重量∶体积)三次处理进行化学脱脂，用过乙酸(PAA)溶液消毒，用高纯水洗涤四次而加工腹壁组织片段。每一批由2片组成，总共测试四片。从每一片上切割四个12毫米的盘状样品，得到每批8个样品，总共16个样品。将每个样品称重(初始重量)，滚动并置于具有450微升无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)和50微升蛋白酶K的1.5毫升离心管中，在56℃下45分钟。然后用组织研磨器粉碎样品，每个样品90秒。将具有样品的管在4℃下在12000g下离心5分钟以使得任何未消化的材料成粒。通过将10微升消化的样品加入390微升PBS，接着通过涡流而得到上清液的1∶40的稀释。通过Corgenix HAELISA试剂盒(kits)根据制造商的指示测量透明质酸含量。由样品透明质酸含量除以样品初始重量而计算得到透明质酸重量含量。
在材料中的平均测得透明质酸含量测定为13±24.5微克/克。
实施例4
测试天然硫酸糖胺聚糖(sGAG)含量
通常如实施例1所述获得2批材料。通过机械刮擦、用100％异丙醇(IPA)(1∶10重量∶体积)三次处理进行化学脱脂，用过乙酸(PAA)溶液消毒，用高纯水洗涤四次而加工腹壁组织片段。每一批由2片组成，总共测试四片。从每一片上切割8个12毫米的盘状样品，得到每批16个样品，总共32个样品。将每个样品称重(初始重量)，滚动并置于具有450微升无菌PBS和50微升蛋白酶K的1.5毫升离心管中，在56℃下45分钟。然后用组织研磨器粉碎样品，每个样品90秒。然后将具有样品的管在15000rpm下离心10分钟以使得任何未消化的材料成粒。
使用Blyscan sGAG试验分析32个样品中的16个的sGAG含量。每个测试样品由90微升高纯水和10微升样品消化液组成。所有管进行涡流5秒，然后加入1.0毫升Blyscan染料试剂。所述管在室温下培养30分钟，并进行涡流4次，每个样品5秒。然后在15000rpm下旋转每个样品10分钟，去除所得上清液。将每个颗粒再悬浮于1.0毫升的来自Blyscan Assay试剂盒的解离试剂。所有样品在搅拌下在37℃下培养1小时，进行涡流3次，每个管进行5秒涡流。将所得溶液的100微升小份(aliquots)制成一式三份并移液至96孔板的两个孔中。取在656纳米处的吸光度读数。生成用于Blyscan sGAG试验的GAG标样的标准曲线。
使用DMMB法分析剩余16个样品的sGAG含量。将单独的样品置于1.5毫升eppendorf离心管中，将180微升无菌PBS和20微升蛋白酶K溶液加入每个管中。样品在间歇涡流下在56℃下消化15分钟。使用20微克/毫升、50微克/毫升和100微克/毫升的在高纯水中的提纯肝素生成肝素标准曲线。
将100微升小份的DMMB样品制成一式三份并置于15毫升离心管中。将100微升小份的空白(高纯水)和肝素标准一式三份，也置于15毫升离心管中。将2.5毫升DMMB溶液加入每个管中。溶液进行涡流，将每个管的100微升小份等分至96孔板的孔中。取在600纳米处的吸光度读数。生成肝素标准浓度的标准曲线。
自肝素标准曲线或GAG标准曲线计算sGAG浓度。由sGAG含量除以样品重量确定sGAG的重量含量。使用Blyscan试验的平均测得sGAG含量为1656微克/克±3164微克/克。使用DMMB法的平均测得sGAG含量为1070微克/克±460微克/克。
实施例5
在通过各种方法加工的材料中测试天然可见核和天然脂质含量
通常如实施例1所述获得4批材料。腹壁组织片段通过机械刮擦进行加工以去除致密脂肪组织层。每一批由2片组成，总共测试8片。将每个片切割为9个7x10厘米的样品。来自每一批的一个样品在搅拌下在5体积％水性乙醇溶液中的0.2体积％过乙酸中进行化学加工2小时的时间(“PAA组”)，来自每一批的一个样品通常如2008年6月5日的国际公开No.WO2008067085(Cook Biotech Incorporated)，公布的在2007年10月23日提交的国际申请No.PCT/US2007/082238的实施例13中所述进行化学加工(“‘085组”)。剩余28个样品随机分为两组。如表1所示，第一组在异丙醇(IPA)和丙酮溶液中进行处理，而第二组在氯仿和甲醇溶液中进行处理，从而导致天然脂质水平的降低。
表1
Figure BPA00001281285300161
在此处理之后，使来自每个醇处理组的2个样品经受七个处理组之一，所述七个处理组设计用于除去大多数非胶原组分的筋膜。六个处理组总结于表2中。
表2
Figure BPA00001281285300171
Figure BPA00001281285300181
一旦所有处理完成，将样品置入在定轨摇动器上的0.2％PAA中2小时。移出湿组织的2x 2厘米样品用于核评估。将剩余样品冻干，切割2x7厘米样品用于脂质分析。总共32个样品用于每个测试。
对于脂质分析，将每个样品称重，并记录起始重量。然后滚动每个样品，并将其置入具有10毫升100％乙醇的15毫升离心管中。将管置于管架中，并在室温下将该架置于旋转摇动器的一侧上达大约24小时。在24小时之后，排掉乙醇，将10毫升100％丙酮置入每个管中，并将该架放置回摇动器上，在室温下大约24小时。在24小时之后，然后排掉丙酮，在通风橱中使样品空气干燥大约48小时。在干燥时间结束时，称重每个样品，并记录最终重量。由起始重量减去最终重量而计算得到提取的脂质含量。然后该含量除以起始重量，从而计算材料含有的重量百分比脂质。
各个组的平均总脂质含量(以重量％计)为：PAA组-16％；‘085组-9％；IPA/丙酮组-3％；氯仿/甲醇组-7％。
对于可见核评估，制得Hoechst 33528染色剂的溶液用于将样品染色。通过将1毫克/毫升的在甲醇中的Hoechst原液稀释至在磷酸盐缓冲盐水中1微克/毫升(250微升Hoechst原液至250毫升PBS)，从而制得总共250毫升的染色溶液。每个样品在摇动下在5毫升的Hoechst染色溶液中在室温下培养15分钟。在染色之后，在摇动下在室温下用PBS将每个样品润洗3次5分钟。将每个染色的样品置于玻璃显微镜载玻片上，并将22毫米x22毫米的玻璃盖玻片置于样品顶部并略微按压以除去任何空气泡。然后将所述玻片置于显微镜载物台上。调节载物台以将样品置于物镜之下的随机的样品位置。调节焦距以提供具有在该位置处的尽可能最多数目的焦点对准核的图像。然后使用SpotRT软件拍摄图像。然后通过选择灰度和底片(negative)来调节图像，从而在浅背景上提供作为暗点染色的核。有时调节亮度、对比度和灰度系数(gamma)以确保最容易的核测定。在将图像打印至纸上之后进行在每个图像上的可见核的单计数。计数以每个区域的核的数目显示。
计数每个样品的0.263平方毫米代表性区域的核的数目。具有在可见区域中多于大约300个核的样品被认为是过多而无法计数，因为该程序是用作处理方案的效力的筛选工具，而不是用作核的确定定量。
在用IPA和丙酮处理之后，大多数处理对于去除核而言是更有效的。这表明IPA/丙酮处理使得细胞更易于解体，或者氯仿/甲醇处理使得细胞更不易于解体。总的来说，用NaOH处理的组织具有最低的剩余核数目，但该组织为些许凝胶状，溶胀的后处理(swollen post treatment)。该效应对于在碱性溶液中处理的胶原而言是典型的，并由于其对胶原纤维的组织的影响而有可能影响材料的强度。胰蛋白酶处理的组织也在核去除方面表现良好，但该组织易于破损，并由于其液体状性质而难以处理。这些特性对于潜在的疝修复材料是不合意的，因此排除该处理。用SDS和TBE处理的组织具有极少的可见核，且似乎不发生任何材料强度的变化。
实施例6
移植材料的机械表征
获得了六批，每批由腹壁筋膜的两个组织厚片组成。通过机械去除致密脂肪组织层而加工12个组织厚片。将六个片(每批一个)置入在定轨摇动器上的0.2％过乙酸(PAA)溶液中2小时。剩余六个片在被分为两个处理组之前，在异丙醇(IPA)和丙酮的溶液中进行处理。第一组在1M NaOH中处理1小时。将第二组置于在37℃下的0.1％SDS中1小时以及在37℃下的1x TBE中1小时。在处理完成之后将两组在高纯水中润洗四次，并在0.2％PAA中消毒2小时。在高纯水中四次润洗之后，将所有组织样品储存于4℃下的高纯水中。在冷藏储存最少24小时之后，将所有片冻干。所有处理和洗涤以1∶10重量∶体积比完成。
对于拉伸强度测试，自总共48个样品的每个冻干片切割四个狗骨头形的样品。样品为65毫米长，并具有5毫米宽的中央部分和12毫米宽的末端部分。每个测试样品的断裂拉伸强度计算为在该测试样品的数据文件中找到的最大载荷。使用Instron Table-Top Servohydraulic Testing System(8840系列)。功率驱动柄(power-actuated grip)的移动速率为均匀的100毫米/分钟。载荷传感器(load cell)分辨率为0.0025牛顿。校正(张力：1-100牛顿)中记录的最大误差为0.44％。每个测试样品的断裂拉伸强度计算为该样品的最大载荷除以该测试样品的宽度和厚度。PAA处理的材料样品的平均断裂张力为2.32牛顿。NaOH处理的材料样品的平均断裂张力为3.41牛顿。SDS处理的材料样品的平均断裂张力为3.03牛顿。在任何测试组之间不存在统计差异，这表明处理对材料的拉伸强度具有很小影响。
对于缝合保留强度测试，自总共48个样品的每个冻干片切割四个制品。每个测试制品为2厘米长，1厘米宽。具有相同直径的钢丝作为5-0聚丙烯纺织纤维(prolene)缝合线以2毫米的咬合深度穿过制品。测试样品的缝合保留强度记录为在单独测试过程中在Instron拉伸测试装置上测得的峰值载荷(peak load)。由于不锈钢丝通过材料拔出，所有测试的样品均失败。在任何测试组之间不存在统计差异，这支持了处理对材料的结构和强度具有很小影响的证据。
对于爆破强度测试，自总共48个样品的每个冻干片切割四个测试制品。使用“CA”型Mullen爆破测试器。每个样品为3英寸x 3英寸的正方形。测试样品的爆破压力记录为单独测试的在Digiburst显示单元上的皮压力(tare pressure)。记录每个测试样品的爆破压力和皮压力。在任何测试组之间不存在统计差异，这进一步支持了处理对材料的结构和强度具有很小影响的证据。
用NaOH或SDS/TBE处理材料对材料的任何机械性质不具有显著影响。总的来说，材料具有2.77±0.77磅的最终载荷，1.28±0.46磅的平均缝合保留强度，和520±193千帕的平均爆破压力。
实施例7
移植材料的生物化学表征
类似于实施例1所述获得六批(每一批由两个组织厚片组成)腹壁筋膜。简单地，通过机械去除致密脂肪组织层而初始加工12个组织厚片。随后，将六个片(每批一个)置入在定轨摇动器上的0.2％过乙酸(PAA)中2小时。剩余六个片在被进一步分为两个处理组之前，在异丙醇(IPA)和丙酮的溶液中进行处理。第一组在室温下在1MNaOH中处理1小时。将第二组置于0.1％SDS(37℃)中1小时，然后在1x TBE(37℃)中另外1小时。在处理完成之后将两组在高纯水中润洗四次，并在0.2％PAA中消毒2小时。在高纯水中四次润洗之后，将所有组织样品储存于4℃下的高纯水中。在冷藏储存最少24小时之后，将所有片冻干。所有处理和洗涤以1∶10的比例完成。
对于脂质分析，自每个冻干片上切割四个测试制品。每个样品大小为2厘米x7厘米。对于所有其他测试，每个测试组由自每个冻干片上切割的四个12毫米盘组成。测试总共288个样品(每个测试48个，6个测试)。
对于脂质分析，评估总共48个2厘米x7厘米的测试样品。由初始重量减去最终重量而计算得到提取的脂质含量。然后该含量除以初始重量，从而计算材料含有的重量百分比脂质。在ECM产品中的脂质含量通过阻碍细胞组分和脂多糖自基础材料提取，从而具有有助于体内的炎症或免疫反应的潜力。因此，有利的是具有降低ECM产品中的脂质含量的方法。仅通过机械刮擦完成的脂质降低得到具有19.8％±2.8％的平均脂质含量的材料。分析经类似处理的材料的脂质含量的在前研究显示平均为8.4％±6.4％(参见实施例3)。当该材料另外经受在异丙醇和丙酮中的处理时，脂质含量有效降低至平均2％(参见实施例6)。通过在1M NaOH中的第三次处理，潜在发生甚至进一步的脂质降低，这得到具有0.6％的平均脂质含量的组织，当进行批对比(lot-matched)比较时其表示95％的脂质降低。
对于FGF-2含量，评估总共48个12毫米盘状测试样品。称重样品，并记录重量。将单独的样品置于1.5毫升eppendorf离心管中，并将500微升无菌10x PBS加入每个管中。用组织研磨器粉碎样品，每个样品90秒。每克的FGF-2含量如实施例2所述进行计算。发现用NaOH将FGF-2完全自基础材料中消除。SDS和TBE处理对材料的FGF-2含量不具有影响。
对于sGAG含量测试，评估总共48个12毫米盘状测试样品。称重每个样品，记录起始重量。将单独的样品置于1.5毫升eppendorf离心管中，将450微升无菌1x PBS和50微升蛋白酶K溶液加入每个管中。样品在56℃下消化45分钟，然后在15000rpm离心10分钟以使任何未消化的材料成粒。每个测试样品由置于1.5毫升离心管中的80微升高纯水和20微升样品消化液组成。所有管进行涡流5秒，然后加入1.0毫升Blyscan染料试剂。所述管在室温下培养30分钟，每个样品进行4次5秒的涡流循环。然后在15000rpm下旋转每个样品10分钟，去除所得上清液。然后将每个颗粒再悬浮于1.0毫升的来自Blyscan Assay试剂盒的解离试剂。将一式两份的100微升小份的所得溶液移液至96孔板的两个孔中，在656纳米的吸光度处读数。如实施例5所述，通过将样品吸光度与标准曲线比较而计算得到样品浓度。每克的sGAG含量由样品sGAG含量除以样品总重量而计算得到。在基础材料中sGAG含量没有显著差异。此外，利用NaOH或SDS/TBE没有sGAG的显著降低。这表明SDS/TBE或NaOH对GAGs均无影响。
对于纤连蛋白含量，评估总共48个12毫米盘状测试样品。称重样品，并记录重量。将单独的样品置于1.5毫升eppendorf离心管中，并将500微升无菌10x PBS加入每个管中。用组织研磨器粉碎样品，每个样品90秒。样品一式两份通过Bender mEDsYSTEMS Humen Fibronectin ELISA试剂盒根据制造商的指示进行测试。每克的纤连蛋白含量由样品纤连蛋白含量除以样品总重量而计算得到。最初包含于基础材料中的纤连蛋白的量可通过使用SDS/TBE以及NaOH消除。
对于透明质酸测试，如实施例4所述，评估总共48个12毫米盘状测试样品。透明质酸的含量由样品透明质酸含量除以样品总重量而计算得到。在测试的任何组之间不存在统计差异。这与sGAGs的结果一致。
实施例8
移植材料的可见核含量
类似于实施例1所述获得并制得六批(每一批由两个组织厚片组成)腹壁筋膜。简单地，通过机械去除致密脂肪组织层而初始加工12个组织厚片。随后，将六个片(每批一个)置入在定轨摇动器上的0.2％过乙酸(PAA)中2小时。剩余六个片在被进一步分为两个处理组之前，在异丙醇(IPA)和丙酮的溶液中进行处理。第一组在室温下在1MNaOH中处理1小时。将第二组置于0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)(37℃)中1小时，然后置于1x TBE(37℃)另外1小时(TBE＝89mM三硼酸盐，乙二胺四乙酸溶液)。在处理完成之后将两组在高纯水中润洗四次，并在0.2％PAA中消毒2小时。在高纯水中四次润洗之后，将所有组织样品在4℃下储存。
一个2厘米x2厘米样品在材料上切割以用于测试程序。制得Hoechst 33528溶液已用于染色样品。通过将1毫克/毫升的在甲醇中的Hoechst原液稀释至在磷酸盐缓冲盐水中1微克/毫升(90微升Hoechst原液至90毫升PBS)，从而制得总共90毫升的染色溶液。每个样品在摇动下在5毫升的Hoechst染色溶液中在室温下培养15分钟。在染色之后，在摇动下在室温下用PBS将每个样品润洗3次5分钟。将染色的样品置于玻璃显微镜载玻片上。将22毫米x22毫米玻璃盖玻片置于样品顶部并轻微按压以去除任何空气泡。然后将带有染色样品的所述玻片置于显微镜载物台上。调节载物台以将样品置于物镜之下的随机的样品位置。调节焦距以提供具有在该位置处的尽可能最多数目的焦点对准核的图像。然后使用SpotRT软件拍摄图像。通过选择灰度和底片来调节图像，从而在浅背景上提供作为暗点染色的核。调节亮度、对比度和灰度系数以确保最容易的核测定。在每个样品上在随机位置拍摄四个图像。将图像打印在片上，计数存在的核数目。若图像含有多于200个核，则认为该图像过多而无法计数。一旦所有计数结束时，确定每一批的平均值和标准偏差。计数以每个区域的核数目显示。
对于在该实施例中的SDS/TBE加工，认为在20x区域(尺寸为0.263平方毫米)的基础材料上的平均核计数过多而无法计数。使用NaOH的加工有效消除了所有可见核。
实施例9
另外的生物机械测试
通常如上述实施例7所述，测试已经化学处理以去除脂质、消毒，然后冻干的另外的浆膜下筋膜ECM材料的机械性质。结果列于如下表3中，并与可得自Cook Biotech Incorporated(West Lafayette，IN)的单层猪类小肠粘膜下层(SIS)的那些结果进行比较。
表3 经加工的猪类腹壁筋膜和SIS的机械特性
Figure BPA00001281285300241
可以看出，通过断裂伸长值证实，腹壁筋膜ECM具有良好的强度性质，并比SIS显著更具伸展性。
实施例10
大鼠(Rat)腹壁测试
根据如下表4，由猪类腹壁组织片段制备另外的浆膜下筋膜ECM材料。这些材料在大鼠腹部模型中进行测试。
表4
  步骤   重量/体积比   化学品/溶液   时间
  1   1∶10   IPA(99％)   15分钟
  2   1∶10   IPA   1/2小时
  3   1∶10   丙酮(纯)   1/2小时
  4   1∶10   IPA   15分钟
  5   1∶10   HPW(高纯水)   5分钟
  6   1∶10   HPW   5分钟
  7   1∶10   1M NaOH   1小时
  8   1∶10   HPW   5分钟
  9   1∶10   HPW   5分钟
  10   1∶10   PAA溶液   2小时
  11   1∶10   HPW   5分钟
  12   1∶10   HPW   5分钟
  13   1∶10   HPW   5分钟
  14   1∶10   HPW   5分钟
除了如上筋膜材料之外，使用可得自Cook Biotech Incorporated(West Lafayette，Indiana)的4层猪类小肠粘膜下层(SIS)材料制备对照样品。
使用筋膜和SIS材料制备2厘米x2厘米样品以用于修复在大鼠腹壁生成的2厘米x2厘米缺损。使用总共60个大鼠。在每个大鼠中制得腹部皮肤和皮下切口以暴露腹壁。在每个大鼠腹部造成尺寸为大约2厘米x2厘米的全层(full-thickness)腹部/筋膜壁缺损。使用筋膜样品或SIS样品修复该缺损。在三个不同时间点评估植入样品：在2周时的具有SIS植入物的10个大鼠，在2周时的具有筋膜植入物的8个大鼠(由于盲肠粘连，两个大鼠死亡)，在4周时的具有SIS植入物的10个大鼠，在4周的具有筋膜植入物的10个大鼠，在8周时的具有SIS的10个大鼠，和在8周时的具有筋膜植入物的10个大鼠。在外植(explant)之时，从每个植入样品的中央切割下狗骨头形的测试制品。将测试制品机械测试至破坏，破坏力测量为样品的最终张力。
通常，两个材料的修复强度随时间而增加。此外，在任何时间点时筋膜和SIS之间不存在统计差异。最终张力数据总结于如下表5中。该数据表明在这两个材料之间随时间的修复强度没有差异，两个样品的材料强度随时间而增加。
表5
Figure BPA00001281285300251
在样品测试最终张力之后，收集每个剩余植入样品的片段并固定在福尔马林中。然后将固定的样品包埋、切片，并用H&E染色。组织学支持机械结果在于：在每个时间点时两个材料的细胞浸润和重塑之间存在很小差异。在2周时两个样品中均显示一些细胞向内生长。在4周时两个材料均显示更多的细胞浸润和重塑。在8周时，两个样品均显示正常的维管组织，剩余极少材料。
该实施例显示本文所述的自猪类动物的腹壁分离的移植材料相比于SIS材料具有类似的随时间的强度。组织学支持这些发现在于：本文所述的腹壁筋膜ECM材料显示与SIS类似的重塑特性。
在描述本发明的上下文(特别是在权利要求书的上下文)中术语“一”和“所述”及类似用语的使用应解释为既涵盖单数也涵盖复数，除非本文另外指出或上下文明确矛盾(clearly contradicted)。本文数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个独立的值的速记方法，除非本文另外指出，且每个独立的值引入说明书中，就像其在本文单独列举一样。本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或上下文明确矛盾。除非另外声明，本文提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围进行限制。在说明书中的语言不应解释为表示对于本发明的实施为必要的任何非声称的元素。
本发明的优选具体实施方案在本文中描述，包括发明人已知的对于进行本发明最好的方式。当然，在阅读前述说明书时，那些优选具体实施方案的变化对于本领域普通技术人员是显而易见的。发明人预期本领域技术人员在适当时采用这种变化，且发明人希望以不同于本文所特别描述而实施本发明。因此，该发明包括由适用的法律所允许的权利要求列举的主题的所有改变和等同。此外，除非本文另外指出或上下文明确矛盾，本发明涵盖在其所有可能的变化中的上述元素的任何组合。此外，本文所述的所有公布表明本领域普通技术人员的能力，因此以全文引用方式并入本文，就像以引用方式单独并入且完全列出一样。

Claims (25)

1.一种具有高弹性和强度的生物吸收性胶原和弹性细胞外基质移植材料，其包含自猪类动物的腹壁分离的高伸展性细胞外基质材料的分离的生物吸收性层，所述细胞外基质材料包含胶原和弹性蛋白，并具有包括来自腹壁的浆膜下筋膜的天然层状结构，其中所述细胞外基质材料基本上不含天然细胞，且进一步地，其中所述细胞外基质材料具有至少一磅的断裂拉伸强度和至少约50％的断裂伸长。
2.根据权利要求1所述的移植材料，其中所述细胞外基质材料具有15重量％以下的脂质含量。
3.根据权利要求1所述的移植材料，其中所述天然层状结构也包含来自腹壁的壁层腹膜。
4.根据权利要求1所述的移植材料，其中所述材料用氧化消毒剂进行消毒。
5.根据权利要求4所述的移植材料，其中所述氧化消毒剂包含过氧化合物。
6.根据权利要求5所述的移植材料，其中所述过氧化合物为过酸。
7.根据权利要求6所述的移植材料，其中所述过氧化合物为过乙酸。
8.根据权利要求1所述的移植材料，其中所述层具有至少20厘米的长度和至少20厘米的宽度。
9.根据权利要求1所述的移植材料，其中所述细胞外基质材料不含FGF-2。
10.根据权利要求9所述的移植材料，其中所述细胞外基质材料包含透明质酸。
11.根据权利要求1所述的移植材料，其包含至少两个彼此结合的所述层。
12.根据权利要求11所述的移植材料，其还包含允许液体通过移植材料的穿孔。
13.根据权利要求11所述的移植材料，其中所述片彼此脱水加热结合。
14.根据任意前述权利要求所述的移植材料，其为脱水形式并在无菌条件下密封在包装内。
15.一种治疗患者的方法，其包括将如权利要求1-13任一项所述的移植材料植入患者。
16.根据权利要求15所述的方法，其中进行所述植入以支撑患者的软组织。
17.根据权利要求15所述的方法，其中进行所述植入以修复疝。
18.一种具有高弹性的细胞外基质移植材料的制备方法，该方法包括：
提供自猪类动物的腹壁分离的组织片段，所述组织片段包含天然层结构和粘附的浆膜下脂肪，所述天然层结构至少包含来自腹壁的浆膜下筋膜；
自组织片段机械去除浆膜下脂肪以制得包含浆膜下筋膜的组织胶原层；
用液体介质处理组织胶原层以去除天然脂质；以及
将组织胶原层去细胞化；以及
其中在所述处理和去细胞化之后，所述组织层具有至少1磅的断裂拉伸强度和至少约50％的断裂伸长。
19.根据权利要求18所述的方法，其还包括将组织胶原片浸入包含氧化消毒剂的溶液中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述消毒剂包括过乙酸。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述溶液还包含乙醇。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法还包括将组织胶原片杀菌。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述液体介质包括有机溶剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述有机溶剂为异丙醇。
25.根据权利要求18-24中任意项所述的方法，其还包括在所述处理和去细胞化之后干燥组织胶原片。
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