CN102175851A

CN102175851A - 非分离式测定方法

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Publication number: CN102175851A
Application number: CN2010106168991A
Authority: CN
Inventors: H·阿哈万-塔夫狄
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2007-05-07
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2027-05-07
Also published as: US20110318747A1; IL194892A; AU2007249527B2; US20110183361A1; AU2007249527A1; US8124362B2; US20070264664A1; EP2027453B1; IL194892A0; US7732153B2; KR20090042203A; KR20150006895A; EP2027453A4; MX2008014293A; US20100317008A1; CN102175851B; WO2007133988A1; EP2027453A1; US8012705B2; US7923213B2

Abstract

公开了与特异性结合反应有关的测定方法，其与已知方法相比更简单化。能够产生化学发光的化合物被固定在固体支持物上，作为用于捕获样品中分析物的特异性结合配对成员。可以激活所述化学发光化合物并且被结合于特异结合性配对成员的活化剂化合物被过量地与样品一起添加至所述固体支持物。在活化剂结合物已经特异性地结合的位点，引发剂溶液的添加引起化学发光反应。该测定方法被称为非分离式测定法，因为在检测步骤之前，不需要除去或者分离过量的检测标签(活化剂结合物)。该方法适用于多种类型的测定，包括免疫测定、受体-配体测定和核酸杂交测定。

Description

非分离式测定方法

本申请是申请日为2007年05月07日、申请号为200780022839.3(国际申请号为PCT/US2007/068327)、名称为非分离式测定方法的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求申请人在2006年5月9日提交的另案待审的临时申请系列号No.60/798,839的优先权。

技术领域

本发明涉及新颖的与特异性结合反应有关的测定方法，其与已知方法相比更简单化。该测定方法被称为非分离式测定法，因为在检测步骤之前，它们不需要除去或者分离过量的检测标签。该方法适用于多种类型的测定，包括免疫测定、受体-配体测定和核酸杂交测定。

背景技术

人们在测定方法开发、尤其是免疫测定开发的领域已经付出了巨大的努力，以简化测定设计方案，同时保留它们在灵敏度、动态范围、耐用性、较宽的应用性和自动化适用性方面的主要优点。已经有一种方法用于设计所谓的同质测定形式，无需对添加的可检测地标记的特异性结合伴侣进行分离。该类型的方法依赖于设计出检测原则，即结合反应的结果或是开启、或是关闭。相反，异质测定形式依靠结合物的物理分离，并且在定量之前不含可检测地标记的特异性结合伴侣。

在同质酶免疫测定领域，已经公开了许多美国专利。许多专利开发了抗体-抗原结合反应来激活或抑制标记酶：美国专利Nos.3,817,837；3,852,157；3,875,011；3,966,556；3,905,871；4,065,354；4,043,872；4,040,907；4,039,385；4,046,636；4,067,774；4,191,613；以及4,171,244、4,785,080。其他的同质免疫测定涉及多种通过抗体或者其他的荧光猝灭剂的猝灭荧光方法：美国专利Nos.3,998,943；3,996,345；4,174,384；4,161,515；4,208,479和4,160,016。在归为免疫测定类型的领域还有其他的美国专利，包括：美国专利Nos.3,935,074；4,130,462；以及4,193,983。美国专利No.4,160,645公开了一种使用电子传递催化剂作为标签的测定方法。该催化剂(标签)通过粘结至抗体而失活。

Campbell等(Biochem.J.，216，185-194(1983))公开了一种检测方法，其以竞争性测定形式采用在偶联于抗原(Ag-L)的化学发光供体与荧光受体偶联于抗体(Ab-F)之间的能量传递。复合抗原最终发射荧光剂的波长，同时游离抗原发射化学发光标签的特征波长。接着，测量两种波长的光强度，并且将两种信号的比率与样品中分析物的含量相联系。

已知还有多种其他的同质免疫测定法：Rubenstein等，美国专利No.3,817,837(同质酶免疫测定)；Ullman，美国专利No.3,996,345(荧光猝灭同质免疫测定)；Maggio，美国专利No.4,233,402(酶通道同质酶免疫测定)；以及Boguslaski等，加拿大专利1,082,577(半抗原-辅助因子同质酶免疫测定)。

Ullman的美国专利6,406,913公开的测定方法包括在一定条件下处理一种疑似含有分析物的介质，使得该分析物可以引起光敏剂和化学发光的化合物获得接近的近似性。该光敏剂产生单线态氧，当其处于接近的近似性时，其通过溶液扩散并且激活化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光量与介质中的分析物含量有关。在一个实施方式中，至少一种光敏剂和化学发光化合物与悬浮的颗粒有关，并且与特异结合性配对成员相结合。

McCapra的美国专利5,516,636公开的测定方法包括特异性结合测定，其利用敏化剂作为标签。当通过辐射、电子传递、电解、电致发光或者能量传递而被激化时，该敏化剂达到激发态，其(a)刚一与分子氧相互作用就产生单线态氧，或者(b)刚一与无色染料相互作用就被氧还原，产生过氧化氢。两种与激发的敏化剂，连同外加的其他试剂一起，进行相互作用中的任何一种，可以产生可检测信号。

尽管人们在设计同质的、或者非分离式的测定形式方面作了相当大的努力，但这些测定法仍然未受到广泛的商业应用。异质测定法预料作为更简单的测定法而被开发并大量生产，虽然操作上更复杂。特别地，在高容量的临床免疫诊断的领域和较小的临床核酸诊断领域，异质测定形式占统治地位。在该应用领域内，测试形式将有利于方案可以简单化、复杂度可以降低、并且兼容性可以提高、同时可以通过除去多余步骤而自动化的领域。

发明内容

在一个方面，本发明提供新颖的与特异性结合反应有关的测定方法，尤其是免疫测定，其与已知方法相比更简单化。通过在检测步骤之前省去分离和洗涤步骤而使测定方法简单化，并且因此被认为是非分离式测定法。该方法的特征在于，使用被固定的化学发光化合物和结合(conjugated)于特异性结合伴侣的活化剂化合物，用于诱导化学发光反应。分析物介导的共定位的化学发光标签化合物和活化剂结合物引起随后的化学发光反应仅在被结合的分析物分子的位点处发生。未结合的过量活化剂结合物的存在不参与或者不妨碍化学发光反应。其结果是，发射的化学发光强度与分析物的数量成正比。

附图说明

图1是根据本发明使用标记的捕获抗体进行免疫测定的检测步骤的示意图。

图2是根据本发明使用标记的封闭性蛋白质和未标记的捕获抗体进行的另一种免疫测定法的检测步骤的示意图。

图3是根据本发明使用标记的固体表面和未标记的捕获抗体进行的另一种免疫测定法的检测步骤的示意图。

图4是一图表，显示了在使用固定在微孔板的孔中的标记的捕获抗体和过量的用于检测的抗IgG-HRP结合物的非分离式免疫测定法中的IgG抗原检测。

图5是一图表，显示了在使用标记的封闭性蛋白质和固定在微孔板的孔中的未标记的捕获抗体以及过量的用于检测的抗IgG-HRP结合物的非分离式免疫测定法中的IgG抗原检测。

图6是根据本发明使用标记的捕获核酸进行的核酸杂交测定法的检测步骤的示意图。

图7是根据本发明使用标记的固相、被固定的捕获抗体和标记的分析物类似物进行的竞争性免疫测定的检测步骤示意图。

具体实施方式

定义

烷基--含有1-20个碳的支链、直链或者环烃基团，其可以用1个以上除H之外的低级烷基取代基取代，在此使用的低级烷基指的是那些含有直至8个碳的烷基。

分析物--测定中在待检测样品中的物质。一种以上具有对分析物的特异性结合亲合力的物质将被用于检测分析物。该分析物可以是蛋白质、抗体、或半抗原，与该半抗原结合的抗体可以被制备。该分析物可以是核酸，该核酸可以被互补的核酸结合。该分析物可以是任何其他的形成特异性结合配对中的成员的物质。

芳烷基--用芳基取代的烷基。

芳基--含有芳香环的基团，该基团含有1至5个碳环的芳香环，其可以用1个以上除H之外的取代基取代。

生物材料--包括全血、防止凝血的、血浆、血清、组织、细胞、细胞内容物、以及病毒。

化学发光化合物--经过导致其被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物的反应的化合物。该激发态可以是单线激态或三重激态。该激发态可以刚一衰减成基态就直接发光，或者可以将激发能传递至发射能受体，借此返回到基态。在该过程中，能量受体被跃迁至激发态并发光。

样品--含有或者疑似含有核酸的液体。可以在本发明方法中使用的典型的样品包括：身体的液体，比如血液，其可以是当收集血液标本时通常发现的抗凝血的血液、血浆、血清、尿液、精液、唾液、细胞培养物、组织提取液等等。其他类型的样品包括：溶剂、海水、工业用水样品、食用样品和环境样品比如土壤或水、植物材料、真核生物、细菌、质粒和病毒、真菌、以及源于原核生物的细胞。

固相材料--具有测定成分被固定在其上的表面的材料。原料可以为如下形式：颗粒、微粒、纳米颗粒、纤维、珠子、膜片、滤纸及其他支持物比如试管和微孔板。

特异性结合配对、特异性结合伴侣--一种分子，其包括对另一种物质具有特异性结合亲合力的生物分子，所述另一种物质包括：DNA、RNA、低聚核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。特异性结合伴侣可以结合于活化剂或化学发光化合物的一种以上分子。

取代--是指基团上至少一个被非氢基团置换。应该注意，关于取代基团，本文中指的是可以存在多个置换位点，除非另有明确说明。

本发明涉及用于利用特异性结合配对反应来检测物质的快速而简单的测定方法。该方法需要使用被固定的化学发光化合物、用于诱导化学发光反应的结合于特异性结合伴侣的活化剂化合物、以及引发剂溶液。该方法涉及一种以上用于检测分析物的特异性结合配对反应。标记的特异性结合伴侣结合于分析物的结果是，使活化剂成为近似于被固定的化学发光化合物，以使得其可以有效激活刚一添加引发剂溶液就产生化学发光的反应。将被活化剂标记的特异性结合伴侣以过量于结合所有的分析物所需要的量，提供至系统。在添加引发剂溶液和检测之前，不用除去过量的未结合的活化剂结合物，因为其不能参与反应。

本发明的方法因此不同于常规试验方法，不需要除去存在的大大过量于与分析物特异性联接的量的未结合的活化剂结合物。可以将含有分析物、活化剂结合物、和引发剂溶液的样品依序添加至试验容器，无需洗涤或者分离、以及发光读取。另一方面，在导入引发剂溶液之前，可以将样品和活化剂结合物预混合并添加至试验容器，所述试验容器含有用于俘获分析物的特异性结合伴侣并含有被固定的化学发光标签。不需要洗涤或分离过量的未结合的活化剂结合物。另一个与本技术领域已知的常规化学发光测定法差别化的关键点在于该事实：参与光产生的化学发光化合物和活化剂(例如过氧化物酶)都不能自由地扩散进入溶液。两者都受空间制约。部分由于该结果，信号产生趋于短暂。

使用化学发光底物和酶标记的结合物的常规测定法要提供大大过量于标签酶的量的底物。通常，底物/酶的摩尔比率可以超过十的九次幂、即，过量十亿倍。据认为有必要供应这样极大过量的化学发光化合物，以便确保充分的底物供应，用于连续的酶法转化，并且该过程确保在测定中足够的检测灵敏度。申请人发现，有可能设计出高灵敏度的测定方法，其将该比率减小了几个数量级。就这点来说，这些方法基本上不同于已知的方法。

省去如上所述和如下所述示例性测定法显示的洗涤和分离步骤，从而提供了使测定方案设计简单化的机会。操作步骤数量的减少可以降低测定时间、由不完全的洗涤带来的内测定变化性、以及成本。同时，增强了实施自动化和小型化测定的能力，并具有自动化和小型化伴随的所有固有优点。

根据本发明的方法进行的测定包含四个步骤。在第一步，将固相提供于试验设备中，用于特异性捕获所研究的分析物。该固相上设有被固定的用于待检测的分析物的特异性结合伴侣。该固相上进一步设有固定于其上的化学发光标签化合物。可以以如下详述的许多不同方式提供化学发光标签。在各个变体中，化学发光标签都不可逆以使其固定不动的方式附着于物质或材料上。在第二步，将含有分析物的样品和活化剂结合物导入具有固相被固定的用于分析物的特异性结合伴侣的试验设备，并且允许形成特异性结合复合物。样品和活化剂结合物可以被分别地依序或同时添加，或者可以被预混合并作为组合添加。在此刻可以插入允许结合反应发生的任选滞后时间。在第三步，添加引发剂溶液以产生化学发光，用于检测分析物。最后，检测化学发光。优选测量峰值光强度水平或总的累积光强度。该光量可以通过绘制校准曲线根据通常已知的方法而与分析物含量有关。当在添加引发剂溶液后紧跟着发生光发射时，优选用如下任何一种机械方式定时测量的开始：通过合适的注射器的添加，或者通过已处于检测器作用下的试验设备进行添加。

测定形式和固体支持物

在本发明的方法中，将化学发光标签化合物固定至测试体系的成分。这可以以数种方式中的任一方式完成。在一个实施方式中，化学发光标签共价联接至被固定的用于分析物的特异性结合伴侣。一个实施例是一种固定在微孔板的孔上的捕获抗体。特异性结合伴侣的固定可以通过共价连接或者通过吸附工艺进行。在这种图1中描绘的方式中，借助于以“夹心”形式结合分析物的两种特异性结合伴侣，化学发光标签变得与活化剂有关。在图2中描绘的另一个实施方式中，化学发光标签被共价连接于以任意方式固定在固体支持物上的辅助物质。辅助物质的固定可以通过共价连接或者通过吸附工艺进行。因此该标签被近乎均匀地分配在固体支持物表面的周围。提供一种方法用于将分析物吸引至表面，例如通过没有标记的用于分析物的特异性结合伴侣来进行。借助于可使活化剂接近附着于辅助物质的化学发光标签的特异性结合反应，该化学发光标签变得与活化剂有关，从而该辅助物质被动地被涂布到支持物表面上。在另一个实施方式中，化学发光标签被共价连接至固体支持物的表面。如图3所示，标签因此被近乎均匀地分配在固体支持物表面的周围。提供一种方法用于将分析物吸引至表面，例如通过没有标记的用于分析物的特异性结合伴侣来进行。借助于可使活化剂接近直接附着于支持物表面的化学发光标签的特异性结合反应，该化学发光标签变得与活化剂有关。然后，无需洗涤或分离，添加引发剂溶液并且测量化学发光。

另一个实施方式包括一种变化，其中，使用分析物的类似物，包括活化剂-分析物结合物。该分析物类似物和分析物将竞争性地与用于分析物的特异性结合伴侣结合。显而易见，在这类测定方法中，在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈负相关性(图7)。

除通过用于结合抗原或其他蛋白质或其他抗体的抗体经由免疫测定法进行化学发光标签的附着之外，本发明的方法可以使用化学发光标记的核酸，用于通过互补核酸的结合来检测核酸。在这点上，该使用就核酸的大小而言没有特别限定，仅有的标准是，互补伴侣有足够的长度以允许稳定的杂交。在此使用的核酸包括基因长度的核酸、核酸的较短碎片、多聚核苷酸和低聚核苷酸，其中任何一种可以是单链的或者是双链的。在本发明的使用核酸作为特异性结合伴侣的实施方式中，核酸被共价附接或者物理地固定在固体支持物的表面上，以捕获分析物核酸。可以将化学发光标签附接于俘获核酸，大略如图6所示，或者可以按如上所述将标签与固相直接地相联接。该俘获核酸将具有与分析物核酸的序列区域完全的或者基本上完全的序列互补性。当基本上互补时，俘获核酸可能具有不与分析物互补的末端突出部分、末端环状部分或内部环状部分，只要其不会妨碍或者抑制与分析物的杂交。反向位置也可以出现在其中突出或环位于分析物核酸内部的位置。俘获核酸、分析物核酸、以及活化剂和第三核酸的结合物允许杂交。该第三核酸与分析物核酸的序列区域基本上互补，所述序列区域不同于与俘获核酸互补的区域。俘获核酸和活化剂结合物核酸与分析物的杂交可以依序或者是同时地连续进行。该工艺过程的结果是，借助于可使活化剂接近直接附着于支持物表面的化学发光标签的特异性杂交反应，该化学发光标签变得与活化剂有关。按如上所述提供引发剂溶液并且检测化学发光。

另一个实施方式包括一种变化，其中，使用分析物与活化剂的结合物。该分析物核酸-活化剂结合物和分析物核酸将竞争性地与用于分析物的特异性结合伴侣核酸结合。显而易见，在这类测定方法中，在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈负相关性。

除基于抗体和基于核酸的体系之外，其他特异性结合配对，如通常为本领域的普通技术人员所熟知的结合测定法，可以用作根据本发明的试验方法的基础。该例子有荧光素/抗荧光素配对、地高辛配基/抗地高辛配基配对、以及硝基苯基/抗硝基苯基配对。作为另一个例子，可以使用众所周知的(链霉)抗生物素蛋白/生物素结合配对。为显示其中可以使用该结合配对的一种方式，可以将链霉抗生物素蛋白-化学发光标签结合物共价连接或者吸附到固体支持物上。然后添加用生物素标记的分析物和活化剂结合物，其中结合物被附接于抗生物素抗体或者抗分析物抗体。在使复合物被形成后，添加引发剂溶液并且按上述方法进行检测。对于本领域的技术人员而言，这些例子及其他例子皆被认为在本发明方法的范围之内。

在本发明的实施方式中有用的固体支持物可以是各种材料、各种形状、和各种尺寸。已经在结合测定法中使用的材料皆可提供对于化学发光标签附着和固定特异性结合伴侣有用的固体支持物，包括：96孔、384孔以上的多种微孔板，试管，样品杯，塑料微球，纤维素，纸质或塑料试验条，胶乳粒子，聚合物颗粒，二氧化硅粒子，磁性粒子，尤其是那些平均直径为0.1-10μm以及纳米颗粒的各种材料。本发明的公开教导了对用于本发明测定方法的这些材料功能化的方法，。具体说，公开了一些方法，用于将化学发光标签化合物和特异性结合伴侣例如抗体这两者都附接至相同的表面、尤其是微粒。

化学发光标签化合物

在本发明的实施方式中用作化学发光标签的化合物具有通式：CL-L-RG，其中，CL表示化学发光的部分，L表示连接化学发光部分和活性基团的连接部分，并且RG表示用于偶联于另一种材料的活性基团部分。化学发光部分CL被包括其内。优选，但并非必需，CL基团、活化剂和引发剂溶液的化学发光反应快速发生在非常短暂的时间间隔的整个期间。

优选的化学发光化合物是能够被氧化从而当存在活化剂和引发剂溶液时产生化学发光。通过连接物和活性基团的结合可以作化学发光标签的示例性化合物种类包括氨基苯二酰一肼(鲁米诺)，以及在结构上相关的环状酰肼，包括：异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼(AHEI)、7-二甲基氨基萘-1，2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2，3-二羧酸酰肼、菲-1，2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼，以及在Masuya等的美国专利No.5,420,275和Yamaguchi的美国专利No.5,324,835中公开的其他2，3-二氮杂萘二酮类似物。

另一类化学发光部分包括在美国专利No.5,491,072、5,523,212、5,593、845和6.030、803中公开的9，10-二氢化吖啶酯、硫酯和氨磺酰。

另一类化学发光部分包括在美国专利No.5,922,558；6,696,569和6,891,057中公开的杂环化合物。这些化合物优选包括：优选包含氮、氧或者含硫的五元环或六元环或多元环基团的杂环，该杂环键合环外的双键，该杂环的末端碳原子可用选自氧和硫原子的两种原子取代。

据认为，任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物将具有本发明中使用的化学发光标签化合物的化学发光部分的功能。本技术领域已知有许多各种结构分类的这样的化合物在这些条件下可以产生化学发光，这样的化合物包括占辛染料、芳香胺和杂环胺。

在本发明的方法中有用的化学发光标签化合物的优选基团包括具有式I的9，10-二氢化吖啶类化合物：

其中，基团R¹-R¹¹中的至少一种是下式的标记性取代基：

-L-RG

其中，L是连接基团，其可以是化学键或另一种二价或多价的基团；RG是反应基团，其使化学发光标签化合物能够被结合于另一种化合物；R¹、R²和R³是含有1到50个非氢原子的有机基团，并且R⁴-R¹¹中的每一个是氢或无干扰性的取代基。标记性取代基-L-RG优选存在于R¹或R²的一个上，虽然其还可以作为取代基存在于R³上或者R⁴-R¹¹之一上。

在化学式I的化合物中的基团R¹和R²可以是含有1到约50个选自于C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子的任何有机基团，其使光产生。所述使光产生是指，当式I的化合物经受本发明的反应时，激发态产物化合物被产生并且其可以涉及一种以上化学发光中间体的产生。激发态产物可以直接地发射光，或者可以通过能量传递而将激发能传递至荧光受体，引起光从荧光受体发出。R¹和R²优选选自于1-20个碳原子的取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基。当R¹或R²是取代基时，其用1-3个原子或基团取代，所述基团选自于羰基、羧基、三(C1-C8烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基、季铵基团、季鏻基团。在一种优选实施方式中，R¹或R²优选用式-L-RG的标记性取代基取代，此处L是连接基团，而RG是反应基团。

基团R³是含有1到50个除满足基团中原子的原子价所需要的必需数量的H原子之外的非氢原子的有机基团，所述非氢原子选自于C、N、O、S、P、Si和卤素原子。更优选R³含有1到20个非氢原子。该有机基团优选选自由含1-20个碳原子的烷基、取代烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基所构成的组。更优选的R³基团包括取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、取代或未取代的苄基、烷氧基烷基、羧基烷基和烷基磺酸基团。基团R³可以被结合于R⁷或R⁸以构成5元环或6元环。在一个实施方式中，R³用式-L-RG的标记性取代基取代。

在式I的化合物中，基团R⁴-R¹¹各自独立地是H或取代基团，其允许产生激发态产物，并且通常含有1到50个选自于C、N、O、S、P、Si和卤素的原子。有代表性的取代基团可以包括，但不限于：烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、卤素、氨基、取代氨基、羧基、烷氧羰基、氨甲酰、氰基、以及磺酸酯基团。相邻基团的配对，例如R⁴-R⁵或者R⁵-R⁶，可以被结合一起，从而形成包括至少一种融合于环中的附接有两个基团的5元环或6元环的碳环或杂环体系。这样融合的杂环可以含有N、O或S原子，并且可以如上所述那些含有除H之外的环取代基。一种以上的基团R⁴-R¹¹可以是式-L-RG的标记性取代基。优选R⁴-R¹¹选自于氢、卤素和烷氧基比如甲氧基、乙氧基、叔丁氧基等等。优选所述化合物中的R⁵、R⁶、R⁹或R¹⁰基团之一为卤素，而R⁴-R¹¹中的其他基团皆为氢原子。

取代基团可以以各种量并入、并且选择在9，10-二氢化吖啶环上的环或者链位置，以便改变化合物的特性或者便于合成。这些特性包括，例如，化学发光量子产率、酶反应速度、最大光强度、光发射持续时间、光的发射波长以及在反应介质中的溶解度。具体的取代基和它们的效果被显示在下述具体的实施例中，然而，无论如何不应将其视为对本发明保护范围的限制。为便于合成式I的化合物，优选R⁴至R¹¹中的每一个基团皆为氢原子。

连接基团(L)。连接基团可以是键、原子、二价基团和多价基团、或者是原子上的直链或支链，其中一些可以是环状结构的一部分。该取代基通常含有1至约50个非氢原子、更通常1至约30个非氢原子。包含链的原子选自于C、O、N、S、P、Si、B、以及Se原子，优选选自于C、O、N、P和S原子。卤素原子可以作为链或环上的取代基存在。典型的包含连接的取代基的官能团包括：亚烷基，亚芳基，亚链烯基，醚，过氧化物，羰基例如酮、酯、碳酸酯、硫酯，或者酰胺基，胺，脒，氨基甲酸酯，脲，亚胺，酰亚胺，酰亚胺盐，碳二亚胺，肼，重氮，磷酸二酯，磷酸三酯，磷酸酯，硫醚，二硫化物，亚砜，砜，磺酸酯，硫酸酯，以及硫脲基团。

反应基团。反应基团RG是原子或基团，其存在可以促进通过共价连接或者物理力而键合于另一种分子。在一些实施方式中，例如，当反应基团是离去基团比如卤素原子或甲苯磺酸盐基团、并且化学发光标签化合物被通过亲核置换反应而共价附接于另一种化合物上时，本发明的化学发光标签化合物连接至另一种化合物将涉及从反应基团上丧失一种以上原子。在其他实施方式中，当发生加成反应例如Michael加成时、或者当反应基团是异氰酸盐或者异硫氰酸盐基团时，化学发光标签化合物通过形成共价键而连接至另一种化合物将涉及反应基团内部键的重组。在另一些其他的实施方式中，连接不会涉及共价键形成，但涉及物理力，而在这样情况下反应基团保持不变。而物理力是指吸引力，比如氢键吸引力、静电吸引力或者离子吸引力；疏水性吸引力比如碱基堆积；以及特异性亲合力相互作用比如生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用、抗原-抗体相互作用、以及核苷酸-核苷酸相互作用。

表1.用于将标签化学结合至有机分子和生物分子的反应基团

a)胺反应基团。

b)硫醇反应基团。

3)羧酸反应基团。

4)羟基反应基团。

5)醛/酮反应基团。

-NH₂ -ONH₂ -NHNH₂

6)其他反应基团配对。

优选的反应基团包括OH、NH₂、ONH₂、NHNH₂、COOH、SO₂CH₂CF₃、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺醚和顺丁烯二酰亚胺基团。

双功能偶联剂还可以用于将标签偶联到具有合适的反应性基团的有机分子和生物分子上(参见L.J.Kricka，配体-结合物测定法。Marcel Dekker公司出版，纽约，1985年，第18-20页、表2.2；和T.H.Ji，“双功能试剂”，Methods in Enzymology.91，580-609(1983))。有两种类型的双功能试剂：并入最终结构的双功能试剂，以及不并入最终结构、并且仅起偶联两种反应物作用的双功能试剂。

优选的化合物组具有式II，其中，R⁴至R¹¹中的每一个都是氢。基团R¹、R²和R³如以上所定义的。

优选的具有式I的标签化合物具有作为基团R¹或R²上取代基的基团-L-RG。优选的标签化合物具有式III。

有代表性的优选的标签化合物以及它们在连接于其他分子和固体表面的用途在下述具体的实施例中有描述。

活化剂结合物

活化剂化合物成为活化剂-特异性结合伴侣结合物的一部分。结合物具有双重作用；1)在测定中，通过特异性结合伴侣部分直接地或者通过中间的特异性结合伴侣而特异性地结合至分析物上，和2)通过活化剂部分激活化学发光化合物。结合物的活化剂部分是具有活化化学发光化合物的效果的化合物，使得当存在引发剂溶液时产生化学发光。能够用作活化剂的化合物包括过渡金属盐和络合物以及酶，尤其是含有过渡金属的酶，更尤其是过氧化物酶。在活化剂化合物中有用的过渡金属包括周期表3-12族中的那些过渡金属，尤其是铁、铜、钴、锌、锰和铬。应该注意，决定着信号产生的活化剂分子可以在物理上限制的半径内起作用，并且仅与有限供应的化学发光化合物相接触。如果活化剂具有这种潜力，这似乎阻止了较大的催化转化。

可以经受化学发光反应的过氧化物酶包括：乳过氧化物酶、微小过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤素过氧化物酶例如钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、真菌的过氧化物酶比如木质素过氧化物酶和来源于Arthromyces ramosus的过氧化物酶以及在白腐真菌中产生的依赖Mn的过氧化物酶、以及大豆过氧化物酶。其他氧化物酶的模拟化合物并不是酶，而是具有类似过氧化物酶的活性，其包括铁络合物比如亚铁原卟啉和Mn-TPPS4(Y.X.Ci等，Mikrochem.J.，52，257-62(1995))，已知该化合物可以催化底物的化学发光氧化，这种化合物明确地被考虑包含本发明所使用的过氧化物酶含义的范围内。

过氧化物酶和生物分子的结合物或者复合物还可以被使用于产生化学发光的方法中，仅有的附带条件是结合物显示出过氧化物酶活性。可以结合于一个以上过氧化物酶分子的生物分子包括：DNA、RNA、低聚核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。还可以在本发明的方法中使用包含或者结合过氧化物酶的复合物，比如脂质体、胶束、囊泡和为连接生物分子而被功能化的聚合物。

引发剂溶液

引发剂溶液提供了为产生对于化学发光所需激发态化合物所需要的反应物。该反应物可以是一种对于通过直接与化学发光标签反应而进行化学发光反应所必需的反应物。其可以具有代替该功能或者除该功能之外的促进活化剂化合物功能的作用。例如，当活化剂是过氧化物酶时，将会发生这种情况。在一种优选实施方式中，引发剂溶液包含过氧化物化合物。该过氧化物成分是任何能够与过氧化物酶反应的过氧化物或者烷基氢过氧化物。优选的过氧化物包括过氧化氢、过氧化脲和过硼酸盐。有代表性的实施方式使用作为活化剂的过氧化物酶结合物、被9，10-二氢化吖啶标记的分析物(其中，通过特异性结合伴侣与上述式III的化合物反应而提供9，10-二氢化吖啶标签)、以及包含过氧化氢的引发剂溶液。该过氧化物与过氧化物酶反应，估计可能是在酶的活性部位将铁的氧化态变成了不同的氧化态。这种改变了状态的酶与保持与酶近似性的9，10-二氢化吖啶标签反应。化学发光反应包含由化学发光化合物与过氧化物形成的中间体的进一步反应，以产生最终的反应产物和光。

某些增强化合物的并入引发剂溶液会促进酶的反应性。这些增强剂中包括已知可增强其他的过氧化物酶反应的酚类化合物和芳香胺，如美国专利No.5,171,668和5,206,149所述，现将其引入本文作为参考。在美国专利5,512,451中公开了取代的和未被取代的芳基硼酸化合物和它们的酯和酐衍生物，将其引入本文作为参考，在此也考虑将其归入在本发明中有用的增强剂范围内。优选的增强剂包括，但不限于：对苯基苯酚、对碘苯酚、对溴苯酚、对羟基桂皮酸、对咪唑基苯酚、醋氨酚、2，4-二氯苯酚、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。还可以使用选自如上所述这些种类的一种以上增强剂的混合物。

被发现有效增强由本发明的化合物产生化学发光的辅助增强剂是吩恶嗪和吩噻嗪的衍生物，它们具有下式。

在吩恶嗪和吩噻嗪增强剂的氮原子上被取代的R基包括：1-8个碳原子的烷基，以及用磺酸酯盐或羧酸酯盐基团取代的1-8个碳原子的烷基。优选的增强剂包括：3-(N-吩噻嗪基)-丙烷磺酸盐、3-(N-吩恶嗪基)丙烷磺酸盐、4-(N-吩恶嗪基)丁烷磺酸盐、5-(N-吩恶嗪基(phenoxazinyl))-戊酸盐、以及N-甲基吩恶嗪(N-methylphenoxazine)和相关同系物。

检测本发明的反应是用引发剂溶液进行的，该引发剂溶液是典型的缓冲水溶液。合适的缓冲液包括任何常用的能够保持环境允许的化学发光反应进行的缓冲液。典型地，引发剂溶液将具有约5至约10.5的pH值。示例性的缓冲液包括：磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐、碳酸盐、三(羟基-甲基氨基)甲烷[tris]、甘氨酸、麦黄酮(Tricine)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、二乙醇胺、MOPS、HEPES、MES等等。

引发剂溶液还可以含有一种以上清洁剂或者聚合物表面活性剂，以增强产光反应的发光效率或者提高测定的信/噪比。在本发明的实施方式中有用的非离子表面活性剂包括，例如：聚氧乙烯化烷基酚类、聚氧乙烯化醇类、聚氧乙烯化醚类和聚氧乙烯化山梨糖醇酯类。可以使用包括季铵盐化合物比如CTAB和季鏻盐化合物在内的单体阳离子表面活性剂。为此目的，还可以使用包括那些含有季铵和季鏻盐基团的阳离子表面活性剂的聚合型阳离子表面活性剂。

通过任何合适的已知手段比如光度计、X射线胶片、高速感光胶片、CCD摄像机、闪烁计数器、化学光度计或目测，可以检测通过本发明的方法发射的光。每种检测手段具有不同的光谱灵敏度。人眼是优选地对绿光灵敏，CCD摄像机显示出对红光的最高灵敏度，X射线胶片具有对紫外线、蓝光或绿光的最大应答，这些都是可利用的。检测装置的选择将取决于应用和成本、方便性考虑、以及是否需要产生经常记录。在那些光发射时程较快的实施方式中，优选进行引发剂反应以便在使用检测装置时产生化学发光。作为例子，可以在适合于接受试管或微孔板的壳体内，在放置于光度计中或者被置于CCD摄像机前的试管或微孔板中进行检测反应。

应用

本发明的测定方法发现了在许多类型的特异性结合配对测定法中的应用性。在这些应用中，首要的应用是化学发光酶联免疫测定法，比如ELISA。进行免疫化学步骤的各种测定形式和方案已为本领域技术人员所熟知，并且包括竞争性测定法和夹心测定法。可以通过根据本发明的免疫测定法测试的物质种类包括：蛋白质、抗体、半抗原、药物、类固醇及其他通常在免疫测定技术领域已知的物质。

本发明的方法还可用于通过利用酶标记核酸探针的核酸检测。例举的方法包括：溶液杂交测定法、Southern blotting中的DNA检测、通过Northern blotting的RNA检测、DNA测序、DNA指纹图谱法、集落杂交(colony hybridization)以及噬菌斑杂交法(plaque lift)，其进行过程对本领域的技术人员而言是众所周知的。

除上述的抗原-抗体、半抗原-抗体或者抗体-抗体配对之外，特异性结合配对还可以包括互补的低聚核苷酸或多聚核苷酸、抗生物素蛋白-生物素、链霉抗生物素蛋白-生物素、激素-受体、凝集素-碳水化合物、IgG蛋白质A、核酸-核酸结合蛋白以及核酸-抗核酸抗体。在筛选药物候选对象中使用的受体测定法是本发明方法的另一应用领域。这些结合配对的任何一种皆可以适合于在本发明方法的三组分夹心技术或者如上所述的二组分竞争性技术中使用。

本发明的目的还在于提供根据本发明的方法进行测定的试剂盒。试剂盒在包装产品组合中可以包括：化学发光标签，其或者是游离的标签化合物、化学发光标记的特异性结合伴侣、化学发光衍生的固体支持物比如颗粒或者微孔板，或者是化学发光标记的辅助物质比如封闭性蛋白质；同时还有引发剂溶液和使用说明书。如果化学发光标记是由使用者进行的话，试剂盒还可以任选地含有活化剂结合物、分析物定标器、稀释剂和反应缓冲液。

实施例

实施例1.化合物1的合成。

使用DCC作为偶联剂，通过碘化羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺反应，合成了碘化羧酸酯NHS酯。

在氩气保护下，向二硫酯B(1.808g，5.00mmol)在无水DMF(50mL)中的溶液中添加NaH(在矿物油中60％，0.200g，5.00mmol)。在室温下反应后4h后，添加NHS 3-碘化丙酸酯A(1.485g，5.00mmol)，并且将得到的混合物搅拌过夜。在真空下除去NMF。用CH₂Cl₂/EtOAc(40∶1)进行柱层析，得到1.770g的黄色固体化合物1(产率67％)。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ2.30(s，3H)，2.74(t，2H)，2.83(s，4H)，3.01(t，2H)，5.31(s，2H)，6.88(t，2H)，7.07(m，2H)，7.11-7.18(m，3H)，7.27(m，4H)，7.82(dd，1H)，7.89(dd，1H)ppm。

实施例2.化合物2的合成。

在氩气保护下，将二硫酯C(0.692g，1.50mmol)和NaH(在矿物油中60％，0.060g，1.50mmol)在无水DMF(20mL)中的混合物在室温下搅拌4小时，得到稍混浊的溶液。然后将NHS 6碘化己酸酯A(0.661g，1.95mmol)添加在DMF(5mL)中。在16h后，在真空下除去DMF。向残余物添加10mL的丙酮，接着添加20mL的乙醚。倾析上清液。以相同的工序洗涤沉淀物三次。在真空干燥后，得到了1.200g的黄色固体化合物2。¹H NMR(300MHz，CD3OD)：δ1.15(m，2H)，1.33-1.47(m，4H)，2.01(p，2H)，2.38(t，2H)，2.67(t，2H)，2.75(t，2H)，2.82(s，4H)，2.88(t，2H)，5.32(s，2H)，6.88-6.93(m，2H)，7.00(t，2H)，7.08-7.28(m，7H)，7.83(d，1H)，7.92(d，1H)ppm。

实施例3.化合物3和4的合成。

在氩气保护下，将二硫酯C(1.00g，2.10mmol)和NaH(在矿物油中60％，0.087g，2.16mmol)在无水DMF(20mL)中的混合物在室温下搅拌4小时，得到稍混浊的溶液。然后将N-6碘化己氧基琥珀酰亚胺D(0.82g，2.52mmol)添加在DMF(5mL)中。将混合物搅拌过夜，此后在真空下除去DMF。用30mL乙醚洗涤残余物四次，得到1.35g的化合物3。

将化合物3(0.25g)溶于5mL甲醇中，向其内添加5.0mL的50％的NH₂OH水溶液。溶液搅拌2天后，在真空下蒸去溶剂。用6x20mL的乙醚洗涤残余物，得到0.21g的化合物4。¹H NMR(300MHz，CD3OD)：δ1.14(m，4H)，1.40(m，4H)，1.94(p，2H)，2.65-2.71(m，4H)，2.84(t，2H)，3.55(t，2H)，5.31(s，2H)，6.88(d，2H)，6.98(q，2H)，7.10(m，4H)，7.12-7.27(m，3H)，7.85(t，2H)ppm。

实施例4.化合物5和6的合成。

在氩气保护下，将二硫酯C(1.32g，2.78mmol)和NaH(在矿物油中60％，0.114g，2.86mmol)在30mL无水DMF中的混合物在室温下搅拌4小时。然后将化合物E(1.014g，3.61mmol)添加于10mL的DMF中。将混合物搅拌过夜，此后在真空下除去DMF。用20mL乙醚洗涤残余物三次，得到2.10g的化合物F。

将化合物F(2.25g)溶于15mL的在甲醇中7N NH₃和10mL的28％氨水溶液的混合物中。搅拌3天后，在真空下除去溶剂。用乙醚(3x50mL)洗涤残余物，并且用H₂O/2-丙醇重结晶，得到1.20g的化合物5。

向化合物5(0.300g的话，0.563mmol)在9.0mL干燥DMF中的悬浮液中添加1.20mL的三乙胺。将混合物搅拌5min，得到稍混浊的溶液。向该溶液中添加6-马来酰亚胺己酸NHS酯(化合物G0.260g，0.843mmol)。在5min内得到透明溶液。在16hrs后，在真空下除去DMF。用乙醚(4x30mL)洗涤残余物，然后溶于甲醇(2mL)，并且用乙醚(50mL)沉淀。得到0.400g浅黄色泡沫状固体化合物6。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)：δ1.26(t，11H)，1.49-1.58(m，6H)，1.90(p，2H)，2.08(t，2H)，2.68(m，4H)，2.80(t，2H)，3.00(t，2H)，3.15(q，6H)，3.42(t，2H)，5.28(s，2H)，6.73(s，2H)，6.85(d，2H)，6.96(m，2H)，7.07(m，4H)，7.18-7.25(m，3H)，7.83(m，2H)ppm。

实施例5.辅助标签化合物7-12。

在美国专利6,858,733中公开了下述所列其他示例性的标签化合物的制备方法。

实施例6.9，10-二氢化吖啶标记的抗体的制备。

实施例3中的9，10-二氢化吖啶标记的化合物3被用于标记绵羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoresearch)。使0.24mg抗体在0.1M硼酸盐缓冲液、pH 8.25中的溶液与DMF中化合物3(10∶1摩尔比化合物3：抗体)以500μl的体积在室温下反应15min，然后z 4℃下过夜。使溶液穿过脱盐柱(BioRad)，用PBS缓冲液洗脱，以便除去未结合的标签。通过收集500μl组分，得到了与任何未反应的抗体混在一起的标记的抗体。

通过化学发光测定法测试组分的标记抗体的含量。将1或10μl等分组分与50μl的0.4MHCl+3.6％过氧化脲混合，接着在Turner Designs TD-20e型光度计中向试管内注射50μl的0.5M的NaOH。从注射时开始测量来自发光脉冲的总的累积强度。保留显示化学发光的那些组分。组分8在产物中占有最大含量。

实施例7.9，10-二氢化吖啶标记的BSA的制备。

实施例3中9，10-二氢化吖啶标记的化合物3被用于标记牛血清白蛋白(BSA)。使0.1g的BSA在500μl的0.1M硼酸盐缓冲液、pH 8.25中的溶液与42μl的23.4mg化合物3/100μl DMF(10∶1摩尔比化合物3：BSA)在室温下反应15min，然后在4℃下过夜。使溶液穿过脱盐柱(BioRad)，用PBS缓冲液洗脱，以便除去未结合的标签。通过收集500μl组分，得到了与任何未反应的BSA混在一起的标记的BSA。

按实施例6中的方法，通过化学发光测定法测试组分中标记的BSA的含量。保留显示化学发光的组分。组分7在产物中占有最大含量。

实施例8.被9，10-二氢化吖啶功能化的微孔的制备。

通过使用EDC作为偶联剂，使被羧酸基团(生物系统)功能化的白色聚苯乙烯96孔微孔板与化合物5偶联。制备化合物5在DMF和0.1M的MES缓冲液(70∶30(v/v))所组成的溶液、(pH 4)中的原液。将0.2mL等分原液添加至平板的各个孔，这些孔已经预先在MES缓冲液中洗涤。添加在MES缓冲液中的EDC，并且使混合物反应过夜。除去上清液，并且依序用水2x1mL和甲醇6x1mL洗涤这些孔。

实施例9.用9，10-二氢化吖啶标记的聚(甲基丙烯酸酯)微粒物的制备。

通过回流四个小时，使安伯来特树脂(Amberlite resin，IRP-64，100-400目，2.50g)与SOCl₂反应。冷却该反应，并且在真空下除去挥发物。然后将小球悬浮在50mL的CH₂Cl₂中，向其中添加17.0mL的三乙胺，接着添加15.0mL的1，2-乙二胺。在氩气保护下将混合物搅拌过夜。通过添加100mL的甲醇分散颗粒物，然后过滤。用甲醇和CH₂Cl₂洗涤滤出的颗粒物，并且风干。得到的颗粒物重2.80g，计算的NH₂含量是2.86mmol/g。

在氩气保护下，将在10mL无水DMF中的用1，2-乙二胺修饰的颗粒物(100mg)与10mg的化合物2一起在室温下搅拌过夜。将混合物过滤，并且用甲醇洗涤颗粒物。在风干后，回收的功能化颗粒物重102mg。

在可选的另一种方法中，通过按上述方法与SOCl₂反应，将2.50g的安伯来特树脂转化为酸性氯化物形式，然后与4.32g的N-羟基琥珀酰亚胺在50mL的四氢呋喃和6.8mL的三乙胺中起反应，从而制备出被NHS酯功能化的颗粒物。这些颗粒与含有游离末端NH₂基团的化合物5起反应，达到偶联效果。

实施例10.被9，10-二氢化吖啶标记的微粒物与抗体的结合。

在室温下，将20mg重量的、含有未反应的末端NH₂基团的、用9，10-二氢化吖啶标记的安伯来特颗粒物，进一步与在100mL无水DMF中的102mg二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(约5当量)反应15min。通过离心分离颗粒物，并且用10x1mL的DMF洗涤。得到的游离NHS酯在0.1M硼酸盐缓冲液、pH 8.5，2mM的EDTA中被偶联于绵羊抗小鼠IgG(0.5mL的1.8mg/ml原液)，在4℃下过夜。将反应混合物在13k rpm下离心，并且除去上清液。该颗粒物在离心柱(spin column)上用PBS+0.05％吐温-20洗涤若干次。

通过在1.0mL的封闭缓冲液(1％BSA，在1X PBS中1％蔗糖)中于37℃下孵育1小时，将得到的被抗体标记的颗粒物用BSA封闭。该颗粒用吐温-PBS洗涤缓冲液进行洗涤，并且储存于1.0mL的1Xx PBS中。

实施例11.用9，10-二氢化吖啶标记的磁性微粒物的制备。

制备4mg化合物5在0.7mL的DMF和0.3mL的0.1M MES缓冲液所组成的溶液(pH4)中的原液。将0.1mL等分原液添加至50mg的已经在MES缓冲液中洗涤过的羧基化聚苯乙烯颗粒物(Dynal Dynabeads M-270型羧酸)。混合物用0.67mL的MES缓冲液和0.23mL的DMF稀释。添加EDC(23mg)，并且将混合物摇动过夜。除去上清液，并且颗粒物依序用2x1mL的水和6x1mL的甲醇洗涤，并且再悬浮于1mL的甲醇中。

测试颗粒物的标记结合。将10μl等分的颗粒物(含有大约0.5mg)添加至0.5mL的水中，制备出1mg/ml原液。使100μl等分原液与过量的HRP反应5min。用4x1mL的水洗涤颗粒物，然后悬浮在1mL的水中。注射含有25mM tris、pH 8.0、8mM对羟基桂皮酸、1mM EDTA、0.2％吐温-20和0.1M过氧化脲的引发剂溶液(10μl)，并且在光度计中记录化学发光的闪光。观察到相比空白18RLU的6040RLU信号。

将5mg部分的颗粒物用2x200μl的0.1M MES缓冲液、pH 4洗涤，然后再悬浮于117μl的MES缓冲液。将绵羊抗小鼠IgG(0.15mg，来自1.8mg/ml原液)添加到颗粒物，并且将混合物摇动30分钟。添加5mg的EDC，并且将混合物摇动4个小时。除去上清液，并且用3x500μl的洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温-20)洗涤小球。将颗粒物再悬浮于500μ1的封闭缓冲液(PBS+1％BSA+1％蔗糖)和5mg的EDC中，在室温下搅拌15min，并且在4℃下搅拌过夜。除去上清液，颗粒物用2x500μl的洗涤缓冲液洗涤，并且再悬浮于1mL的PBS中。

实施例12.使用标记的捕获抗体进行微孔板免疫测定。

将来自实施例6中标记抗体制备的含有产物的组分以1∶100的比例在PBS缓冲液中稀释。将50μl等分稀释液分别添加至白色聚苯乙烯96孔板上的26个孔中。该平板在室温下在轨道摇床上搅动5分钟。除去溶液，并且将孔用1X PBS+0.05％吐温-20洗涤三次，在各个步骤以后除去所有的洗涤缓冲液。

将绵羊抗小鼠IgG F(ab′)₂-HRP结合物(Jackson Immunoresearch)在包含2.5％BSA和在1X PBS中1％蔗糖的结合缓冲液中以1∶1.2x10⁶的比例稀释。作为另一种选择，结合物还可以在其他的基质比如FBS中稀释。

将等分的稀释结合物分配入26个孔中。通过与在抗IgG F(ab′)₂-HRP结合溶液中0ng/ml溶液一起进行2倍稀释，从而制备出含有100ng/ml-0.048ng/ml的IgG标准试样。该标准试样和零试样是分配入孔中，达到最终容积50μl/孔。将平板在平板摇床上室温下培育1hr。

制备出含有25mM tris、pH 8.0、8mM对羟基肉桂酸、1mM EDTA、0.2％吐温-20和0.1M过氧化脲的引发剂溶液。

将平板转移至Luminoskan平板光度计。无需除去结合溶液，通过依序注射100μl的引发剂溶液产生发光，并且读取各个孔的累积强度持续5秒。绘制得到的测定结果如图1所示。该测定法允许在全程测试的整个期间用超过零信号的零+2标准偏差的最低校准进行定量。

实施例13.未标记的捕获抗体和标记BSA微孔板免疫测定法。

添加50μl等分未标记的绵羊抗小鼠IgG(H+L)40μg/ml的1X PBS，以涂敷白色聚苯乙烯96孔板的26个孔。该平板在室温下在轨道摇床上搅动5分钟。除去溶液，并且将孔用1X PBS+0.05％吐温-20洗涤三次，在各个步骤以后除去所有的洗涤缓冲液。

在PBS缓冲液+1％蔗糖中以50μl/mL稀释来自在实施例7中标记的BSA制备的含有产物的组分。将100μl等分稀释液添加至白色聚苯乙烯96孔板的26个孔的每一个中。该平板在37℃下保温1hr。除去溶液，并且将孔用PBS+0.05％吐温-20洗涤三次，在各个步骤以后除去所有的洗涤缓冲液。

将绵羊抗小鼠IgG F(ab′)₂-HRP结合物(Jackson Immunoresearch)在包含1％BSA和在1X PBS中1％蔗糖的结合缓冲液中以1∶1.2x10⁶的比例稀释。将等分的稀释结合物分配入26个孔中。通过与在抗IgG F(ab′)₂-HRP结合溶液中0ng/ml溶液一起进行2倍稀释，制备出含有100ng/ml-0.048ng/ml的IgG标准试样。将标准试样和零含量试样分配入孔中，达到最终容积50μl/孔。将平板在平板摇床上室温下培育1hr。

将平板转移至Luminoskan平板光度计。无需除去结合溶液，通过依序注射100μl的引发剂溶液产生发光，并且和读取各个孔的累积强度持续5秒。绘制得到的测定结果如图2所示。该测定法允许在全程测试的整个期间用超过零信号的零+2标准偏差的最低校准进行定量。

实施例14.通过使用标记的磁性微粒物进行微粒物免疫测定。

取50μg的9，10-二氢化吖啶反应物和实施例11中制得的抗体共标记的磁性微粒物。颗粒物用1X PBS+0.05％吐温-20洗涤三次，并且再悬浮于绵羊抗小鼠IgG F(ab′)₂-HRP结合物在含有1％BSA和1％蔗糖的1X PBS缓冲液中以1∶1.2x10⁶比例稀释的稀释液中。将该颗粒悬浮液分配入白色聚苯乙烯96孔板上26个孔中。通过在孔中进行2倍连续稀释至最后浓度100ng/ml-0.048ng/ml或0ng/ml，制备出绵羊抗小鼠IgG F(ab′)₂-HRP结合物溶液的IgG标准试样。将各个标准试样和零试样分配入孔中，使得最终的反应物体积为50μl/孔。将平板在摇床上室温下培育1hr。

将平板转移至Luminoskan平板光度计。无需除去结合物溶液，通过依序注射100μl的引发剂溶液产生发光，并且读取各个孔的累积强度持续5秒。绘制得到的测定结果，使IgG定量。

实施例15.通过使用标记的安伯来特微粒物进行微粒物免疫测定。

取100μg的9，10-二氢化吖啶反应物和实施例10的抗体共标记的安伯来特微粒物。颗粒物用1X PBS+0.05％吐温-20洗涤三次，并且再悬浮于在含有1％BSA和1％蔗糖的1XPBS缓冲液中以1∶1.2x10⁶的比例稀释的绵羊抗小鼠IgG F(ab′)₂-HRP结合物稀释液。将该颗粒悬浮液分配入白色聚苯乙烯96孔板上26个孔中。通过在孔中进行2倍连续稀释至终浓度100ng/ml-0.048ng/ml或0ng/ml，制备出绵羊抗小鼠IgG F(ab′)₂-HRP结合物溶液的IgG标准试样。将各个标准试样和零试样分配入孔中，使得最终的反应物体积为50μl/孔。将平板在摇床上室温下培育1hr。

实施例16.制备用9，10-二氢化吖啶标记的羧基修饰的微粒物。

通过根据实施例11中所述程序的EDC偶联，将具有0.0282毫当量/g的羧基载荷的羧酸修饰的聚苯乙烯1μm微粒物(Seradyn)结合于化合物5。用0.39mg的化合物5(0.74μmol)处理52.5mg部分的颗粒物(1.48μmol COOH)，以保证未反应的COOH基团被保留。通过在pH 4的MES缓冲液中的EDC偶联，将游离的COOH基偶联于绵羊抗小鼠IgG(1.48μmol)。通过使用离心柱，用吐温-PBS缓冲液洗涤除去未反应的抗体。

Claims

1.一种试剂盒，其包括：

a)固体支持物，其上固定有下述物质：

(1)可作为过氧化物酶作用底物的化学发光化合物，其包含选自下组的化学发光部分：9，10-二氢化吖啶酯、9，10-二氢化吖啶硫酯、9，10-二氢化吖啶磺酰胺、9，10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物、下述化学式所示的9，10-二氢化吖啶类化合物：

其中，R¹选自于烷基、烯基、炔基、芳基以及1-20个碳原子的芳烷基，所述碳原子可任意被1-3个选自于下面的基团取代：羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO₃ ^-2基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基团、季铵基团或季磷基团；X选自于C₁-C₈烷基、芳基、芳烷基、具有1-20个碳原子的烷基或芳基羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基基团、SO₃ ^-基团、葡糖基基团和化学式PO(OR′)(OR″)所示的磷酰基基团，其中R′和R″是独立地选自于C₁-C₈烷基、氰烷基、芳基和芳烷基、三甲硅烷基团、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵以及三烷基鏻阳离子；Z¹选自于O原子和S原子；R⁶选自于取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、苯甲基、烷氧基烷基和羧烷基基团；所述取代基R^7-14中的0个或1个或2个选自于烷基、烷氧基、羟基以及卤素，而其余的R^7-14是氢；以及

(2)用于分析物的第一特异性结合配对体，以及

b)具有活化剂化合物的活化剂结合物，所述活化剂化合物被结合于第二特异性结合配对体，其中，所述活化剂化合物是过氧化物酶。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物还包含连接部分，所述连接部分具有1-20个原子的亚烃基链，其末端为-CH2-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、或-C(＝O)NR-基团，其中，R是C1-8烷基；或者所述连接部分具有3-30个原子的聚(亚烃基-氧基)链，其末端为-CH2-、-O-、-S-、-NH-、-NR-、-SiO-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-NRC(＝O)-、或-C(＝O)NR-基团，其中，R是C_1-8烷基，其中，所述连接部分将所述化学发光化合物连接至所述固体支持物。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物被共价连接于所述固体支持物。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物被共价连接于被固定化在固体支持物上的辅助物质。

5.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，还包括引发剂溶液，所述引发剂溶液是包含过氧化物和选自下组的过氧化物酶增强子的水溶液：苯酚化合物、芳香胺、芳基硼酸化合物、芳基硼酸酯化合物、芳基硼酸酸酐化合物、下述化学式之一所示的化合物

其中R是可以用磺酸盐基团或羰酸盐基团取代的C₁-C₈烷基。

6.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述固体支持物选自微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素试验条、纸测试条、塑料试验条、胶乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子、金属胶体以及磁性粒子。

7.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，用于分析物的所述被固定化的第一特异性结合配对体选自于抗体、结合性蛋白以及核酸。

8.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述第二特异性结合配对体选自于分析物类似物、抗体、结合性蛋白以及核酸。

9.如权利要求5-8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引发剂溶液包含pH为5～10.5之间的缓冲水溶液，并进一步包含一种以上洗涤剂或聚合物表面活性剂。

10.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物是下述化学式所示的9，10-二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物

其中，基团R¹-R¹¹中的至少一个是标记性取代基，其中R¹和R²各自是含有1-50个选自C、N、O、S、P、Si、以及卤素原子的非氢原子的有机基团，并且选自于烷基、烯基、炔基、芳基、或含有1-20个碳原子的芳烷基，这些碳原子可任意用1-3个选自下组的原子或基团取代：羰基、羧基、三(C₁-C₈烷基)甲硅烷基、SO₃ ^-基团、OSO₃ ^-2基团、葡糖基基团、PO₃ ^-基团、OPO_3- ²基团、卤素原子、羟基、硫醇基、氨基、季铵基团、或季磷基团；R³是含有1-50个选自C、N、O、S、P、Si、以及卤素原子的非氢原子的有机基团，并且是选自于取代或未取代的C₁-C₄烷基、苯基、取代或未取代的苯甲基、烷氧基烷基、羧烷基、以及烷基磺酸基；以及，R⁴-R¹¹各自独立地是H或含有1-50个选自C、N、O、S、P、Si、以及卤素的原子的取代基，并且选自于烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、卤素、氨基、取代胺类、羧基、烷氧羰基、氨甲酰、氰基、以及磺酸盐基。