CN104535560B - 一种酶促化学发光底物液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶促化学发光底物液。本发明所提供的酶促化学发光底物液，其特征在于：所述酶促化学发光底物液由A液和B液两组组分构成；所述A液含氧化剂和稳定剂；所述B液含发光剂和增强剂；所述氧化剂为过氧化脲；所述稳定剂为四聚磷酸钠、氟化钠和酒石酸钠；所述发光剂为鲁米诺；所述增强剂为3‑[(3‑胆酰胺基丙基)二甲基铵]‑1‑丙磺酸、对乙酰氨基酚和2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚。本发明所提供的酶促化学发光底物液，具有稳定、灵敏度高、发光平台期长、成本低等优点，适于临床医院用于体外诊断配套试剂。

Description

一种酶促化学发光底物液

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别涉及一种酶促化学发光底物液。

背景技术

化学发光分析技术是现代微量分析方法之一，具有灵敏度高、线性范围宽、检测速度快、仪器设备简单等优点，已广泛应用于环境科学、生命科学、临床医学等领域，成为目前化学分析领域的热点之一。

鲁米诺(luminol，3-氨基邻苯二甲酰肼)，是目前应用最广泛的化学发光试剂之一，具有易合成、成本低等优点。在碱性溶液中，鲁米诺可被氧化剂(如过氧化脲、H₂O₂等)氧化，其氧化产物可以吸收反应中产生的能量，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸根离子，该离子从不稳定的高能态返回到低能态，将能量以光的形式释放，产生化学发光。鲁米诺氧化产物发光为闪光型，即具有发光强度弱、持续时间短。而鲁米诺发光增强剂，可将其发光时间、发光强度明显延长或提高。近二十多年来，已有大量关于鲁米诺发光增强剂文献报道，包括取代酚、萘酚、六羟基苯并噻唑芳香胺，取代硼酸、牛血清白蛋白(BSA)，表面活性剂如溴化十六烷基三甲基铵、SDS等。

目前上市销售化学发光体外诊断试剂中的辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)酶促化学发光底物系统，多采用鲁米诺-过氧化脲-增强剂系统，而过氧化脲本身不稳定，易随存放时间延长而释放O₂，现有的鲁米诺-增强体系其平台期亦无法满足临床检测的高灵敏度、高特异性要求，发光底物系统的稳定性尚需提高，而进口发光底物虽然灵敏度高、特异性强、平台期长，但其试剂成本较高，不便于广大基层临床医院使用。

发明内容

为了弥补以上领域的不足，本发明提供了一种高效、稳定的HRP酶促化学发光底物液。

本发明所提供的酶促化学发光底物液，其特征在于：所述酶促化学发光底物液由A液和B液两组组分构成；所述A液含氧化剂和稳定剂；所述B液含发光剂和增强剂；所述氧化剂为过氧化脲；所述稳定剂为四聚磷酸钠、氟化钠和酒石酸钠；所述发光剂为鲁米诺；所述增强剂为3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸、对乙酰氨基酚和2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚。

所述A液中氧化剂过氧化脲的浓度为1-10mM。

所述A液中稳定剂的各组分质量百分比浓度为：0.01-0.05％四聚磷酸钠、0.03-0.05％氟化钠和0.01-0.1％酒石酸钠。

所述B液中发光剂鲁米诺的浓度为1-15mM。

所述B液中增强剂的各组分质量百分比浓度为：0.01-0.05％3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸、0.05-0.2％对乙酰氨基酚和0.01-0.08％2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚。

所述A液和B液的配方如下：

A液：

过氧化脲，浓度为：1-10mM；

四聚磷酸钠，质量百分比浓度为：0.01-0.05％；

氟化钠，质量百分比浓度为：0.03-0.05％；

酒石酸钠，质量百分比浓度为：0.01-0.1％；

pH值为5.0的柠檬酸缓冲液；

B液：

鲁米诺，浓度为：1-15mM；

3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸，质量百分比浓度为：0.01-0.05％；

对乙酰氨基酚，质量百分比浓度为：0.05-0.2％；

2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚，质量百分比浓度为：0.01-0.08％；

pH值为8.4的硼酸缓冲液。

优选地，所述A液和B液的配方如下：

A液：

过氧化脲，浓度为：5mM；

四聚磷酸钠，质量百分比浓度为：0.03％；

氟化钠，质量百分比浓度为：0.04％；

酒石酸钠，质量百分比浓度为：0.06％；

10mM pH值为5.0的柠檬酸缓冲液；

B液：

鲁米诺，浓度为：10mM；

3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸，质量百分比浓度为：0.03％；

对乙酰氨基酚，质量百分比浓度为：0.1％；

2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚，质量百分比浓度为：0.05％；

20mM pH值为8.4的硼酸缓冲液。

本发明还提供了一种化学免疫检测试剂盒，其含有本发明所述的酶促化学底物液。

本发明以优选的四聚磷酸钠、氟化钠、酒石酸钠组合配方，有效解决了氧化剂(过氧化脲)在实际存放过程不稳定问题；以优选的3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸、对乙酰氨基酚、2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚组合配方，增强了鲁米诺-过氧化脲体系的发光强度、延长其发光持续时间，且其成本较低，可广泛用于临床医院体外诊断配套试剂，为临床医院提供稳定、灵敏度高、发光平台期长、成本低化学发光底物系统。

该化学发光底物液具有稳定、灵敏度高、发光平台期长、成本低等优点，适于临床医院用于体外诊断配套试剂。

附图说明

图1为本发明实施例1、2和3的酶促发光底物液与进口发光底物液平台期比较结果。

图2本发明实施例3的酶促发光底物液与进口发光底物液检测PCT校准品建立校准曲线。

图3为本发明实施例3的酶促发光底物液与进口化学发光底物液用于PCT试剂盒检测的临床样本相关性结果。

具体实施方式

实施例1、制备本发明酶促化学发光底物液1

(1)制备酶促化学发光底物液A液：

称取0.0094g过氧化脲(Sigma公司289132)、0.01g四聚磷酸钠(上海汇凯公司7727-67-5)、0.03g氟化钠(国药试剂10019608)、0.01g酒石酸钠(国药试剂30169816)、0.172g柠檬酸(C6H₈O₇·H₂O国药试剂10007108)、0.347g柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O国药试剂10019428)，调整pH至5.0，用纯化水定容至100ml。

以上方法制备得到的酶促化学发光底物液A液中各组分的浓度如下：

过氧化脲，浓度为：1mM；

四聚磷酸钠，质量百分比浓度为：0.01％；

氟化钠，质量百分比浓度为：0.03％；

酒石酸钠，质量百分比浓度为：0.01％；

10mM pH值5.0的柠檬酸缓冲液；

(2)制备酶促化学发光底物液B液：

称取0.0177g鲁米诺(Sigma公司SA851102)、0.01g CHAPS(Sigma公司SC942602)、0.05g对乙酰氨基酚(国药试剂30001224)、0.01g 2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚(北京恒业公司90-72-2)、0.0858g硼砂(国药试剂10020808)、0.0680g硼酸(国药试剂10004808)，调整pH至8.4，用纯化水定容至100ml。

以上方法制备得到的酶促化学发光底物液B液中各组分的浓度如下：

鲁米诺，浓度为：1mM；

3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸，质量百分比浓度为：0.01％；

对乙酰氨基酚，质量百分比浓度为：0.05％；

2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚，质量百分比浓度为：0.01％；

20mM pH值为8.4的硼酸缓冲液。

酶促化学发光底物液A液与酶促化学发光底物液B液按1:1(体积比)比例使用。

实施例2、制备本发明酶促化学发光底物液2

(1)制备酶促化学发光底物液A液：

称取0.094g过氧化脲(Sigma公司289132)、0.05g四聚磷酸钠(上海汇凯公司7727-67-5)、0.05g氟化钠(国药试剂10019608)、0.1g酒石酸钠(国药试剂30169816)、0.172g柠檬酸(C6H₈O₇·H₂O国药试剂10007108)、0.347g柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O国药试剂10019428)，调整pH至5.0，用纯化水定容至100ml。

以上方法制备得到的酶促化学发光底物液A液中各组分的浓度如下：

过氧化脲，浓度为：10mM；

四聚磷酸钠，质量百分比浓度为：0.05％；

氟化钠，质量百分比浓度为：0.05％；

酒石酸钠，质量百分比浓度为：0.1％；

10mM pH值5.0的柠檬酸缓冲液；

(2)制备酶促化学发光底物液B液：

称取0.2655g鲁米诺(Sigma SA851102)、0.05g CHAPS(Sigma SC942602)、0.2g对乙酰氨基酚(国药试剂30001224)、0.08g 2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚(北京恒业公司90-72-2)、0.0858g硼砂(国药试剂10020808)、0.0680g硼酸(国药试剂10004808)，调整pH至8.4，用纯化水定容至100ml。

以上方法制备得到的酶促化学发光底物液B液中各组分的浓度如下：

鲁米诺，浓度为：15mM；

3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸，质量百分比浓度为：0.05％；

对乙酰氨基酚，质量百分比浓度为：0.2％；

2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚，质量百分比浓度为：0.08％；

20mM pH值为8.4的硼酸缓冲液。

酶促化学发光底物液A液与酶促化学发光底物液B液按1:1(体积比)比例使用。

实施例3、制备本发明酶促化学发光底物液3

(1)制备酶促化学发光底物液A液：

称取0.047g过氧化脲(Sigma公司289132)、0.03g四聚磷酸钠(上海汇凯公司7727-67-5)、0.04g氟化钠(国药试剂10019608)、0.06g酒石酸钠(国药试剂30169816)、0.172g柠檬酸(C6H₈O₇·H₂O国药试剂10007108)、0.347g柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O国药试剂10019428)，调整pH至5.0，用纯化水定容至100ml。

以上方法制备得到的酶促化学发光底物液A液中各组分的浓度如下：

过氧化脲，浓度为：5mM；

四聚磷酸钠，质量百分比浓度为：0.03％；

氟化钠，质量百分比浓度为：0.04％；

酒石酸钠，质量百分比浓度为：0.06％；

10mM pH值5.0的柠檬酸缓冲液；

(2)制备酶促化学发光底物液B液：

称取0.177g鲁米诺(Sigma SA851102)、0.03g CHAPS(Sigma SC942602)、0.1g对乙酰氨基酚(国药试剂30001224)、0.05g 2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚(北京恒业公司90-72-2)、0.0858g硼砂(国药试剂10020808)、0.0680g硼酸(国药试剂10004808)，调整pH至8.4，用纯化水定容至100ml。

以上方法制备得到的酶促化学发光底物液B液中各组分的浓度如下：

鲁米诺，浓度为：10mM；

3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸，质量百分比浓度为：0.03％；

对乙酰氨基酚，质量百分比浓度为：0.1％；

2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚，质量百分比浓度为：0.05％；

20mM pH值为8.4的硼酸缓冲液。

酶促化学发光底物液A液与酶促化学发光底物液B液按1:1(体积比)比例使用。

实施例4、本发明酶促化学发光底物液1、2、3与进口发光底物液平台期比较

以降钙素原(PCT)检测试剂盒(化学发光法)(同昕生物技术(北京)有限公司，产品目录号：C-0796)分别用本发明化学发光底物液1、2、3及进口化学发光试剂(pierce公司)为底物，校准品F的发光值(RLU值)平台期见表1。

降钙素原(PCT)检测试剂盒(化学发光法)检测方法：

(1)准备：取出试剂盒，室温(18-25℃)平衡30分钟。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水做20倍稀释。

(2)加样：设校准品A-F，建议校准品复孔检测，校准品或样本每孔加样50μL。

(3)温育：用不干胶条封板后，在37℃温育30分钟。

(4)洗板：揭开不干胶条并倒掉孔内液体，每孔加入300ul洗液，静置30秒，弃去液体，拍干板子。重复洗板5次。

(5)加入酶联物：每孔加入酶联物50ul。

(6)温育：用不干胶条封板后，37℃温育30分钟。

(7)洗板：重复步骤4。

(8)加底物液：每孔分别加入酶促化学发光底物液A液、B液50ul，使用8道移液器，用微量震荡器振荡混匀5秒钟。

(9)检测：加入底物液后室温(20～27℃)避光静置反应5分钟，立刻在微孔板化学发光分析仪上依序测量各孔的相对发光单位(RLU)，测量时间为0.1秒/孔。

(10)用发光分析仪中的数据处理程序(拟合类型：双对数Log-Log)，直接给出校准曲线及样本的浓度值。

表1本发明底物液1、2、3与进口发光底物液平台期比较

由表1及图1可知，本发明的化学发光底物液与进口化学发光底物液的平台期基本相当(平台期：5-30分钟)，其中优选底物液(实施例3的酶促化学发光底物液3)与进口化学发光底物液的平台期最为接近。

实施例5、本发明酶促化学发光底物液3与进口化学发光底物液用于PCT试剂盒检测的性能指标比较

以降钙素原(PCT)检测试剂盒(化学发光法)(同昕生物技术(北京)有限公司，产品目录号：C-0796)分别用本发明酶促化学发光底物液3及进口化学发光试剂(pierce公司)为底物，采用实施例4所述的试剂盒检测方法，根据产品标准要求检测试剂盒的空白限、线性、重复性、回收率、特异性，结果如表2和图2所示。

降钙素原(PCT)检测试剂盒(化学发光法)产品标准所述性能指标检测方法：

(1)回收率

将降钙素原纯品配制成50ng/ml浓度的溶液加入到0.5ng/ml的降钙素原人源样本中，所加入降钙素原纯品溶液与样本之间的体积比例为1:9，3次重复测定，根据公式(1)计算结果均值应在85-115％范围内。

$R=\frac{C\×(V_0+V)-C_0\×V_0}{V\×\mathrm{Cs}}\×100\%...\left(1\right)$

其中：R…………………回收率；

V…………………………加入纯品溶液体积；

V0…………………………样本的体积；

C…………………………样本加入纯品溶液后的检测浓度；

C0…………………………样本的检测浓度；

Cs…………………………纯品溶液的浓度。

(2)线性

将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。按试剂盒说明书进行操作，将每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法直线拟合，并计算线性相关系数r，结果应不小于0.99。

(3)空白限

将校准品A(0ng/ml)或者0.9％生理盐水作为样本，在同一次实验中重复测定20次，计算其计数平均值(M)加上两倍标准差(S)，根据校准品A和相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2S的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白限，应不大于0.05ng/ml。

(4)重复性

同一次试验中分别重复检测浓度值为1.03±0.22ng/ml、20.83±5.23ng/ml样本10次，根据剂量反应曲线计算得到的浓度值的平均值(M)和标准差(S)。按公式(2)计算变异系数(CV)，结果不大于10％。

CV＝S/M×100％………………………………………………(2)

(5)分析特异性

在不含任何分析物的样本中分别加入20ng/ml人下钙素(Katacalcin)、60ng/mL人降钙素(Calcitonin)、10000ng/ml人降钙素基因相关肽(CGRP，Calcitonin Gene-RelatedPeptide)，重复测定3次，取均值，按公式(3)计算结果，应小于0.5％。

表2本发明底物液3与进口化学发光底物液用于PCT试剂盒检测的性能指标比较

由表2可知，本发明实施例3制备的酶促化学发光底物液3与进口发光底物液用于PCT试剂盒检测的性能指标均符合产品标准要求，检测的性能指标基本一致。

实施例6、本发明酶促化学发光底物液3与进口化学发光底物液用于PCT试剂盒检测的临床样本相关性

以降钙素原(PCT)检测试剂盒(化学发光法)(同昕生物技术(北京)有限公司，产品目录号：C-0796)分别用本发明酶促化学发光底物液3及进口化学发光试剂(pierce公司)为底物，采用实施例4所述的试剂盒检测方法，检测43例临床样本，以本发明实施例3制备的酶促化学发光底物液3检测结果为x轴，以进口化学发光底物液检测结果为y轴线性拟合曲线，并计算相关系数r，结果如图3所示。由图3可知，两种发光底物检测临床样本相关性r2为0.9947(r2大于0.95)，满足临床检测需求。

Claims (7)

1.一种酶促化学发光底物液，其特征在于：所述酶促化学发光底物液由A液和B液两组组分构成；所述A液含氧化剂和稳定剂；所述B液含发光剂和增强剂；所述氧化剂为过氧化脲；所述稳定剂为四聚磷酸钠、氟化钠和酒石酸钠；所述发光剂为鲁米诺；所述增强剂为3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸、对乙酰氨基酚和2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚。

2.根据权利要求1所述的酶促化学发光底物液，其特征在于：所述A液中氧化剂过氧化脲的浓度为1-10mM。

3.根据权利要求1或2所述的酶促化学发光底物液，其特征在于：所述A液中稳定剂的各组分质量百分比浓度为：0.01-0.05％四聚磷酸钠、0.03-0.05％氟化钠和0.01-0.1％酒石酸钠。

4.根据权利要求1所述的酶促化学发光底物液，其特征在于：所述B液中发光剂鲁米诺的浓度为1-15mM。

5.根据权利要求1或4所述的酶促化学发光底物液，其特征在于：所述B液中增强剂的各组分质量百分比浓度为：0.01-0.05％3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸、0.05-0.2％对乙酰氨基酚和0.01-0.08％2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚。

6.根据权利要求1所述的酶促化学发光底物液，其特征在于：所述A液和B液的配方如下：

A液：

过氧化脲，浓度为：1-10mM；

四聚磷酸钠，质量百分比浓度为：0.01-0.05％；

氟化钠，质量百分比浓度为：0.03-0.05％；

酒石酸钠，质量百分比浓度为：0.01-0.1％；

pH值为5.0的柠檬酸缓冲液；

B液：

鲁米诺，浓度为：1-15mM；

3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸，质量百分比浓度为：0.01-0.05％；

对乙酰氨基酚，质量百分比浓度为：0.05-0.2％；

2、4、6三(二甲氨基甲基)苯酚，质量百分比浓度为：0.01-0.08％；

pH值为8.4的硼酸缓冲液。

7.一种化学免疫检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有权利要求1-6中任一所述的酶促化学发光底物液。