CN102174564B - 一种获得转基因海岛棉的方法 - Google Patents

一种获得转基因海岛棉的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102174564B
CN102174564B CN 201110037241 CN201110037241A CN102174564B CN 102174564 B CN102174564 B CN 102174564B CN 201110037241 CN201110037241 CN 201110037241 CN 201110037241 A CN201110037241 A CN 201110037241A CN 102174564 B CN102174564 B CN 102174564B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sea island
island cotton
plant
agrobacterium
flower
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN 201110037241
Other languages
English (en)
Other versions
CN102174564A (zh
Inventor
陈勋基
郝晓燕
李建平
危晓薇
邵琳
足木热木
黄全生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Of Nuclear Technology And Biotechnology Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute Of Nuclear Technology And Biotechnology Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Of Nuclear Technology And Biotechnology Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences filed Critical Institute Of Nuclear Technology And Biotechnology Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Priority to CN 201110037241 priority Critical patent/CN102174564B/zh
Publication of CN102174564A publication Critical patent/CN102174564A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102174564B publication Critical patent/CN102174564B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Abstract

本发明公开了一种获得转基因海岛棉的方法。只需要制备相应的农杆菌菌液，离心回收，加入1/2MS培养基、20％蔗糖、0.1‰(v/v)Selwet和0.1‰(v/v)DMSO，使之OD值达到0.6左右，装小喷壶，选取早晨刚展开的海岛棉花朵，对准柱头进行喷施，喷完后套纸管，做标记，待种子成熟后，种植转化T0代进行标记基因检测及PCR检测。该方法操作简单，不受基因型限制，转化效率较高，减轻了工作量，将会促进海岛棉基因转化研究，加快分子育种进程。目前，还未见有关海岛棉农杆菌侵染法转化的报道。

Description

一种获得转基因海岛棉的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的喷花法转化海岛棉的方法。
背景技术
目前海岛棉基因转化工作主要集中在建立高频率、稳定、简便可重复的植株再生体系及花粉管通道法两种，但是海岛棉愈伤诱导及转化相对比较困难，对基因型要求很高，再生频率较其他植物而言相对较低，很难突破。而花粉管通道转化方法落铃率较高育种影响转化频率，建立一种简单易行，操作方便的海岛棉转基因方法势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的海岛棉花粉管转化新方法，本发明简单易行，操作方便，无需复杂的实验仪器，工作量较小，转化频率较高，可加快海岛棉的基因工程育种进度。
本发明的技术方法如下：
一种获得转基因海岛棉的方法，包括以下步骤：构建植物表达载体，将构建好的表达载体转化农杆菌，挑取阳性克隆，在YEB培养基上摇菌，待菌液浓度达到1.2-1.6时，收集菌体，在收集的菌体中加入渗透培养基，混匀得到农杆菌悬浮液；将所述农杆菌悬浮液对刚展开的海岛棉花朵进行喷雾，喷雾后用套管套住该花朵，并做好标记，生育期结束收获转化种子，进入下一代种植，种植的F1代幼苗在3叶期时进行卡那霉素或除草剂检测；筛选不变色的植株进行PCR检测，获得转化阳性的F1代植株，进行Southern检测，所有阳性苗留种，种植并获得纯化转基因株系。
所述的获得转基因海岛棉的方法，所述渗透培养基：1/2MS+20％蔗糖+0.1‰(v/v)Selwet+0.1‰(v/v)DMSO。
所述的获得转基因海岛棉的方法，所述收集菌体的方法为：室温下5000rpm离心5min，弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于10mlYEB液体中，置于冰盒保存。
所述的获得转基因海岛棉的方法，将构建好的表达载体转化农杆菌GV3101或EHA105。
所述的获得转基因海岛棉的方法，所述植物表达载体具有较好的选择标记或抗性标记，使后代植株容易进行实验室及田间筛选。
所述的获得转基因海岛棉的方法，将转化的菌株在液体YEB培养基250rpm摇菌，带到OD值达到1.2时，收集菌体，并放置于4℃，保证菌液活力。
所述的获得转基因海岛棉的方法，将所述农杆菌悬浮液注入400ml喷壶中，选取刚展开的花朵喷雾，到花上有水珠滴下时为止，喷雾后用套管盖住花，用色彩鲜艳的毛线做好标记。
该方法操作简单，不受基因型限制，转化效率较高，减轻了工作量，将会促进海岛棉基因转化研究，加快分子育种进程。目前，还未见有关海岛棉农杆菌侵染法转化的报道。
附图说明
图1、转EPSPS基因后代PCR检测；M表示Marker，+表示阳性对照，1-32表示不同转基因后代单株，-表示非转基因阴性对照
图2、转基因后代Southern检测；+：表示质粒，1-7：表示不同转基因后代株系，-：表示非转基因对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1、取保藏的除草剂基因EPSPS的农杆菌菌液划线，再次PCR检测，挑取阳性单菌落，接种于5ml相应抗性的YEB中，28℃，230rpm过夜。
2、次日，将4ml菌液转入400ml相应抗性的YEB培养基，继续培养，使菌液的0D值达到1.2到1.6之间。
3、室温下5000rpm离心5min，弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于10mlYEB液体中，置于冰盒保存。
4、将上述菌液加入1/2MS+20％蔗糖+40μl Selwet+40μlDMSO的渗透培养基中，渗透培养基总量为400ml，使OD值大约在0.6左右。
5、将混合好的农杆菌悬浮液注入400ml喷壶中，以海岛棉新海21、新海25、新海32为受体，选取刚展开的花朵进行喷雾，到植株上有水珠滴下时为止，喷雾后用纸帽盖住花，用色彩鲜艳的毛线做好标记。统计喷花数量及坐铃率，如表1所示。
表1 不同海岛棉品种喷雾侵染花数及坐铃率
Figure BSA00000433593100031
6、种子成熟后收获T1代种子，加代筛选，播种密度可以大一些，但每穴播种量不要超过两粒。
7、待达到两叶一心，用1％的卡那霉素涂抹叶片，5天一次，共三次，筛选不变色的植株，将叶片不变色的植株做标记，拔去两边棉苗，确保通风。
8、叶片不变色的植株取样进行PCR检测(图1)，如能扩增出目的基因的条带即为转化成功单株。
9、统计转化频率及PCR阳性植株，如下表2所示，不同海岛棉品种均获得了转EPSPS基因的植株。
表2 海岛棉转EPSPS基因的转化频率
  受体品种名称   T1代种子量   卡检阳性苗  PCR阳性苗
  新海21   3500   120   38
  新海25   3100   109   17
  新海32   3200   87   29
  合计   9800   316   84
9、取转化成功的单株叶片进行Southern检测确定基因整合情况(图2)，所有阳性苗留种，种植并获得纯化转基因株系。。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种获得转基因海岛棉的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、取保藏的除草剂基因EPSPS的农杆菌菌液划线，再次PCR检测，挑取阳性单菌落，接种于5ml相应抗性的YEB中，28℃，230rpm过夜； 
A2、次日，将4ml菌液转入400ml相应抗性的YEB培养基，继续培养，使菌液的OD值达到1.2到1.6之间； 
A3、室温下5000rpm离心5min，弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于10ml YEB液体中，置于冰盒保存； 
A4、将上述菌液加入1/2MS+20％蔗糖+40μl Selwet+40μl DMSO的渗透培养基中，渗透培养基总量为400ml，使OD值在0.6； 
A5、将混合好的农杆菌悬浮液注入400ml喷壶中，以海岛棉新海21、新海25、新海32为受体，选取刚展开的花朵进行喷雾，到植株上有水珠滴下时为止，喷雾后用纸帽盖住花，用色彩鲜艳的毛线做好标记； 
A6、种子成熟后收获T1代种子，加代筛选； 
A7、待达到两叶一心，用1％的卡那霉素涂抹叶片，5天一次，共三次，筛选不变色的植株，将叶片不变色的植株做标记，拔去两边棉苗，确保通风； 
A8、叶片不变色的植株取样进行PCR检测，能扩增出目的基因的条带即为转化成功单株； 
A9、统计转化频率及PCR阳性植株； 
A10、取转化成功的单株叶片进行Southern检测确定基因整合情况，所有阳性苗留种，种植并获得纯化转基因株系。 
CN 201110037241 2011-02-14 2011-02-14 一种获得转基因海岛棉的方法 Expired - Fee Related CN102174564B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110037241 CN102174564B (zh) 2011-02-14 2011-02-14 一种获得转基因海岛棉的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110037241 CN102174564B (zh) 2011-02-14 2011-02-14 一种获得转基因海岛棉的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102174564A CN102174564A (zh) 2011-09-07
CN102174564B true CN102174564B (zh) 2013-10-30

Family

ID=44517806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110037241 Expired - Fee Related CN102174564B (zh) 2011-02-14 2011-02-14 一种获得转基因海岛棉的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102174564B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517396B (zh) * 2011-12-29 2013-06-19 南京农业大学 一种培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法
CN103667335A (zh) * 2012-08-31 2014-03-26 新疆农业大学 一种农杆菌菌液喷雾转基因方法
CN113632724A (zh) * 2021-07-28 2021-11-12 山西省农业科学院棉花研究所 一种提高棉花活体基因转化效率的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1141870C (zh) * 2001-03-20 2004-03-17 浙江大学 转基因三系杂交棉育种的方法
ATE506438T1 (de) * 2002-12-18 2011-05-15 Athenix Corp Herbizidresistenz verleihende gene
CN101691583A (zh) * 2009-09-25 2010-04-07 南京农业大学 一种农杆菌介导的不依赖于组织培养的棉花转基因方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN102174564A (zh) 2011-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103205459A (zh) 一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化的方法
CN112322628B (zh) 调控棉花对黄萎病和干旱抗性的转录因子GhWRKY1-like基因及应用
CN113337520B (zh) 陆地棉GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用
CN103003429B (zh) 棉花植物事件a2‑6以及用于其检测的引物和方法
CN102766650A (zh) 一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法
CN102660554A (zh) 大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST1及其应用
CN105087641A (zh) 一种新的农杆菌介导的大白菜原位转基因方法
CN101691583A (zh) 一种农杆菌介导的不依赖于组织培养的棉花转基因方法
CN102174564B (zh) 一种获得转基因海岛棉的方法
CN106399339A (zh) 一种抗除草剂抗虫融合基因、编码蛋白及应用
CN112126655A (zh) 一种亚洲棉GaNCED3基因在提高植物抗旱性中的应用
CN108085334B (zh) 一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法
CN102676541A (zh) 大豆圣豆9号NAC转录因子基因GmST2及其应用
CN102864165A (zh) 一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法
CN104004783A (zh) 一种提高棉花转基因效率的方法
CN108998472A (zh) 一种利用苎麻BnXTH1基因提高植物耐镉能力的方法
CN101736028B (zh) 一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法
CN102978235A (zh) 一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法
CN103408646B (zh) 香蕉ERF转录因子MaERF及表达载体
CN110358861B (zh) 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁分子标记R13I14
CN110468229B (zh) 水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1
Jocković et al. Helianthus species as a sources for broomrape resistance
CN102220373B (zh) 一种纵切幼苗叶基座转化小麦的方法
CN104726488A (zh) 一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法
CN112852862B (zh) 拟南芥小肽信号分子rgf7基因的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20131030

Termination date: 20160214