CN102174063A - 一种低聚唾液酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种低聚唾液酸的制备方法，属于生物工程技术领域。将α2-8连接的聚唾液酸在温和条件下进行水解并用超滤膜进行分离，收集聚合度约2-10的低聚唾液酸，经过脱盐，浓缩膜分离系统浓缩后，再冷冻干燥即得产品低聚唾液酸。低聚唾液酸可作为一种功能性营养添加剂，也可应用于化妆品、药物及其他生物医药技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种低聚唾液酸的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
唾液酸（SA），学名叫作“N-乙酰基神经氨酸”，是一种天然存在的碳水化合物。它最初由颌下腺粘蛋白中分离而得，也因此而得名。人体中，脑的唾液酸含量最高，脑灰质中的唾液酸含量是肝、肺等内脏器官的15倍。
聚唾液酸（Polysialic acid，PSA）是唾液酸（sialic acid, NeuAc, NANA）单体以α-2,8或α-2,9糖苷键连接而成的同聚物，是一些哺乳动物细胞表面糖蛋白的组成部分和少数几种细菌（奈瑟氏脑膜炎球菌，大肠杆菌K1株等）的胞外多糖组分。α-2,8连接的聚唾液酸在细菌多糖中是唯一非免疫原性的（不引起哺乳动物个体内的T细胞或抗体应答），这也是这些细菌容易侵入哺乳动物和人体而不被抗体细胞发现的原因。又如，广泛分布于体内的细胞表面神经节苷酯（GM）中有较短的寡聚唾液酸（3～9），并认为该寡聚物可有效地导致或者保持对PSA的免疫耐受性。
唾液酸在人体中具有非常重要的功能，在生长发育、细胞识别、肿瘤迁移、发炎和病毒感染中发挥很大作用。研究表明，人脑发育的黄金期是在妊娠至2岁。这个阶段是脑细胞数量调整、体积增大、功能完善、神经联结网络形成的关键时期。因此，唾液酸对于保证婴儿正常的生长发育至关重要。此外，含有唾液酸的寡糖是一类重要的糖分子，在细胞通讯、病毒侵染、毒素结合与肿瘤增殖中起到重要的作用。目前生物治疗领域对唾液酸类寡糖的需求日益增加，经济高效地大量获得唾液酸类寡糖物质已成为满足该需求的重要一步。唾液酸与唾液酸寡糖已经成为寡糖类产品开发研究的热点之一。
目前，唾液酸的提取主要从动物组织中提取，该方法价格昂贵。而唾液酸寡糖的制备方法主要有酸解法，微波法，酶合成法，这几种方法各有利弊。酸解法如用硫酸、盐酸来水解聚唾液酸这些方法污严重且不容易控制反应的终点。而微波法则不易控制反应体系温度。在这种背景下，我们提出用pH 4.7的醋酸钠超低盐缓冲液的方法来水解聚合唾液酸，不仅仅避免了以往水解方法中反应终点难以控制的缺点，从而提高目标产物的量，而且大大减低了对环境的污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种低聚唾液酸的制备方法，该方法具有反应温和，便于控制反应进程，以及能耗低，对环境友好等优点。
本发明的技术方案：一种低聚唾液酸的制备方法，其特征在于将α2-8连接的聚唾液酸在温和条件下进行水解并用超滤膜进行分离，收集聚合度约2～10的低聚唾液酸，经过脱盐，浓缩膜分离系统浓缩后，再冷冻干燥即得产品低聚唾液酸；所采用的分离技术包含使用截留分子量为8000的膜进行的膜分离技术，与包含截留分子量为400的膜浓缩技术；工艺为：
（1）聚唾液酸的水解
取一定量的纯化的聚唾液酸，按照料液比1:5-10的质量比溶解于50mM NaOAc 溶液中，该溶液的pH预先用无水乙酸调至pH 4.7，在60-65℃条件下水解2-3小时。
聚唾液酸由Escherichia coli菌株发酵获得，聚唾液酸的提取方法已经由本申请人江南大学申请了专利，专利号为ZL 200710191366.1。
（2）低聚唾液酸得率的监控分析
取1mL步骤（1）的水解混合液，用填料为Biogel-P6，长为100mm，直径为4.8cm的玻璃色谱柱分离，流动相为0.2mM NH4OAc，流速为45mL/h，检测器为紫外检测器，波长为230nm，用台式记录仪记录变化，根据记录纸图像，确定2-10聚合度的低聚唾液酸对应的色谱峰，并根据色谱峰面积计算水解靶标产物的得率。
（3）水解后低聚唾液酸产物的膜分离
选用截留分子量为8000的膜采用中空卷式膜分离方法来进行分离，操作压为0.5MPa，用5倍体积的pH4.7、50mM NaOAc 溶液推动水解混合液过膜，超滤时间为25分钟，截留液再进行水解，水解过程按照水解60℃，30分钟，超滤25分钟来操作。
（4）包含低聚唾液酸透过液的浓缩与脱盐
选用截留分子量为400的脱盐浓缩膜来进行浓缩与脱盐，操作压为0.5MPa，超滤时间为30分钟。
（5）包含低聚唾液酸浓缩液的冷冻干燥
脱盐浓缩后的浓缩液直接用冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得低聚唾液酸产品。
本发明的有益效果：其一，由于采用温和反应条件，使得水解反应便于控制，同时由于采用较低温度的水解条件，较短的水解时间使得能耗得以节约；其二，由于采用膜分离与浓缩技术不但无环境污染，节约人力、物力，而且无须加热，在低温下运行，不破坏寡唾液酸的结构，节约能耗。
附图说明
图1 低聚唾液酸的工业化制备流程示意意图。
具体实施方式
本发明通过以下的实施例进一步说明。这些实施例只是为了说明本发明，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1：聚唾液酸的水解
取100g聚合唾液酸，溶解于1L 50mM NaOAc 溶液（溶液的pH用无水乙酸调至pH 4.7），在65℃条件下水解2小时。
实施例2：聚唾液酸的水解
取100g 聚合唾液酸，溶解于0.5L 50mM NaOAc 溶液（溶液的pH用无水乙酸调至pH 4.7），在60℃条件下水解3小时。
实施例3：低聚唾液酸的提取
选用截留分子量为8000的膜采用中空卷式膜分离方法来进行分离，操作压为0.5MPa，用2.5-5L pH4.7 50mM NaOAc 溶液推动反应混合液过膜，超滤时间为25分钟。截留液继续用于水解。水解过程按照水解60℃，30分钟，超滤25分钟来操作。按照1︰5-10的体积比来进行超滤。对透过液的浓缩则采用截留分子量为400的脱盐截留膜来进行，操作压为0.5MPa，超滤时间为30分钟。截留的浓缩液经过冷冻干燥得到聚合度为2-10的低聚唾液酸产品。产品得率为80%以上。
Claims (1)
1.一种低聚唾液酸的制备方法，其特征在于将α2-8连接的聚唾液酸在温和条件下进行水解并用超滤膜进行分离，收集聚合度约2-10的低聚唾液酸，经过脱盐，浓缩膜分离系统浓缩后，再冷冻干燥即得产品低聚唾液酸；所采用的分离技术包含使用含截留分子量为8000的膜进行的膜分离技术与包含截留分子量为400的膜浓缩技术；工艺为：
（1）聚唾液酸的水解
取一定量的纯化的聚唾液酸，按照料液比1:5-10的质量比溶解于50mM NaOAc 溶液中，该溶液的pH预先用无水乙酸调至pH 4.7，在60-65℃条件下水解2-3小时；
（2）低聚唾液酸得率的监控分析
取1mL步骤（1）的水解混合液，用填料为Biogel-P6，长为100mm，直径为4.8cm的玻璃色谱柱分离，流动相为0.2mM NH4OAc，流速为45mL/h，检测器为紫外检测器，波长为230nm，用台式记录仪记录变化，根据记录纸图像，确定2-10聚合度的低聚唾液酸对应的色谱峰，并根据色谱峰面积计算水解靶标产物的得率；
（3）水解后低聚唾液酸产物的膜分离
选用截留分子量为8000的膜采用中空卷式膜分离方法来进行分离，操作压为0.5MPa，用5倍体积的pH4.7、50mM NaOAc 溶液推动水解混合液过膜，超滤时间为25分钟，截留液再进行水解，水解过程按照水解60℃，30分钟，超滤25分钟来操作；
（4）包含低聚唾液酸透过液的浓缩与脱盐
选用截留分子量为400的脱盐浓缩膜来进行浓缩与脱盐，操作压为0.5MPa，超滤时间为30分钟；
（5）包含低聚唾液酸浓缩液的冷冻干燥
脱盐浓缩后的浓缩液直接用冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得低聚唾液酸产品。
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