CN102133433A - 一种可注射性心肌组织工程产品及其制备方法 - Google Patents

一种可注射性心肌组织工程产品及其制备方法 Download PDF

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CN102133433A CN2011100564212A CN201110056421A CN102133433A CN 102133433 A CN102133433 A CN 102133433A CN 2011100564212 A CN2011100564212 A CN 2011100564212A CN 201110056421 A CN201110056421 A CN 201110056421A CN 102133433 A CN102133433 A CN 102133433A
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李俊杰
杨桂利
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刘志强
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Abstract

本发明公开了属于组织工程产品技术领域的一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品及其制备方法。本发明的心肌组织工程产品包括心肌细胞、壳聚糖-多肽和卡拉胶微球。本发明通过微乳液法分别制备壳聚糖-多肽阳离子微球和卡拉胶阴离子微球，通过静电自组装的方式形成可注射性的多孔微球支架，然后将心肌细胞种植在壳聚糖多肽微球表面，和卡拉胶微球混合形成可注射性微球支架-细胞复合体。该微球支架具有调控心梗微环境的能力，同时具有利于心肌细胞贴附和生长的空间结构，便于养分和代谢物的传递，是一种新型的心肌组织工程用支架材料。

Description

一种可注射性心肌组织工程产品及其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程产品技术领域，具体涉及一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品及其制备方法。
背景技术
以生物材料携带细胞和生长因子的心肌组织工程策略可以有效地调控心梗微环境，从而进一步提高细胞的滞留率和存活率，是一种新型的有效的治疗心肌梗死的手段。其中，生物材料起非常关键的作用，理想的心肌组织工程生物材料应该具有调控心梗微环境、抗凋亡、促进血管生长等多重功能，同时还应该具有合适的可注射行为、空间结构和力学强度。
壳聚糖是自然界唯一的阳离子多糖，具有良好的生物相容性和组织相容性，同时具有抗氧化能力可以清除心肌梗塞微环境中的活性氧自由基，其抗氧化性能随着壳聚糖分子量的增加而降低，但是壳聚糖分子量的降低使其在制备生物材料时成型困难且力学性能下降，因此对高分子量的壳聚糖进行化学修饰以提高其抗氧化能力是制备心肌组织工程生物材料的必要步骤。另一方面，传统的可注射性心肌组织工程水凝胶材料，虽然能够有效地提高细胞的滞留率和存活率，对心肌损伤的修复有明显效果。但是细胞在水凝胶中生长空间有限、养分和代谢物传递困难，限制了在心肌组织工程中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品。
本发明的目的还在于提供一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品的制备方法。
一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品，其特征在于，该产品包括心肌细胞、壳聚糖-多肽和卡拉胶微球。
其特征在于，所述卡拉胶微球的粒径为30-200μm。
一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)称取一定量壳聚糖将其溶于1％-3％的乙酸中，制备成质量浓度为1％-5％壳聚糖的乙酸，搅拌直至全部溶解。
(b)称取1-4g功能性多肽溶与20ml去离子水肿，加入2-吗啉乙磺酸水合物搅拌活化半小时，然后将其加入到50ml壳聚糖溶液中混匀。
(c)加入碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺并搅拌1-4小时，然后将其置于透析袋中透析72小时。
(d)将其放入低温冰箱中预冻12-48小时，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1-4g壳聚糖-多肽复合物溶于2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将20-50ml液体石蜡，乙酸乙酯和span-80混合均匀。
(c)在100-2000r/min转速条件下缓慢将10-40ml壳聚糖-多肽溶液滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入一定量的2.5％戊二醛，100-2000r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置2-4小时后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)准确称取1-4g卡拉胶溶于去离子水中获得浓度为0.2-4％的卡拉胶。
(b)将适量的液体石蜡，乙酸乙酯和span-80混合均匀。
(c)在100-2000r/min转速条件下缓慢将20-50ml卡拉胶溶液滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2-10ml 0.1M的氯化钙，100-2000r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置1-4小时后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(f)Co60灭菌备用。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.1-2g壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的10ml培养液中，然后利用该培养液接种心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得一定卡拉胶微球浓度的悬浊液，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照一定的比例加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。
所述功能性多肽为谷胱甘肽或谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽。
本发明的有益效果：本发明的微球支架具有调控心梗微环境的能力，同时具有利于心肌细胞贴附和生长的空间结构，便于养分和代谢物的传递，是一种新型的心肌组织工程用支架材料。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步说明本发明。
以下实施所用的主要原料：壳聚糖(脱乙酰度95％分子量20万)、多肽为固相合成产品，纯度大于99％，卡拉胶为kappa型，分子量约为20万，其余原料均为化学纯；实施例所用心肌细胞由中国人民解放军总医院医学捐赠。
实施例1
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)配制质量百分比浓度为1％的乙酸50ml，称取1g壳聚糖-多肽复合物溶入其中磁力搅拌20min使其充分溶解，配制的质量浓度为2％的壳聚糖-多肽。
(b)称取0.2g的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽)，溶于10ml去离子水中，然后再向其中加入2-吗啉乙磺酸水合物(MES)(MES的最终浓度为0.1M)，然后将其加入壳聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物0.5g，(其中EDC和NHS的比例为1∶1)，室温搅拌5小时后，将其置于透析袋中透析72小时，置入低温冰箱中预冻12小时以上，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1g的壳聚糖-多肽复合物溶于50ml的2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将30ml液体石蜡、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将2g壳聚糖-多肽滴加到液体石蜡、乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时。形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2ml的2.5％戊二醛，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水一次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)称取0.5g卡拉胶溶于49.5g去离子水中获得浓度为1％的卡拉胶50ml。
(b)将30ml液体石蜡，30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将30ml卡拉胶溶液滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时。形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入10ml的0.1M的氯化钙，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.3g的壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的培养液中，然后在其中种植1×106心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得30mg/ml卡拉胶微球浓度的悬浊液10ml，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。
实施例2
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)配制质量百分比浓度为1％的乙酸50ml，称取1g壳聚糖-多肽复合物溶入其中磁力搅拌20min使其充分溶解，配制的质量浓度为2％的壳聚糖-多肽。
(b)称取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽)，溶于10ml去离子水中，然后再向其中加入2-吗啉乙磺酸水合物(MES)(MES的最终浓度为0.1M)，然后将其加入壳聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物0.5g，(其中EDC和NHS的比例为1∶1)，室温搅拌5小时后，将其置于透析袋中透析72小时，置入低温冰箱中预冻12小时以上，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1g的壳聚糖-多肽复合物溶于50ml的2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将30ml液体石蜡、30ml乙酸乙酯和40mlspan-80混合均匀，100ml。
(c)在1000r/min转速条件下缓慢将2g壳聚糖-多肽滴加到液体石蜡、乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时。形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2ml的2.5％戊二醛，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水一次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)准确称0.5克的卡拉胶溶于49.5克去离子水中获得浓度为1％的卡拉胶50ml。
(b)将适量的液体石蜡、乙酸乙酯和span-80混合均匀，100ml。
(c)在1000r/min转速条件下缓慢将30ml卡拉胶溶胶滴加到液体石蜡、乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入10ml的0.1M的氯化钙，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(f)Co60灭菌备用。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.3g的壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的培养液中，然后在其中种植1×106心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得30mg/ml卡拉胶微球浓度的悬浊液10ml，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。
实施例3
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)配制质量百分比浓度为1％的乙酸50ml，称取1g壳聚糖-多肽复合物溶入其中磁力搅拌20min使其充分溶解，配制的质量浓度为2％的壳聚糖-多肽。
(b)称取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽)，溶于10ml去离子水中，然后再向其中加入2-吗啉乙磺酸水合物(MES)(MES的最终浓度为0.1M)，然后将其加入壳聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物0.5g，(其中EDC和NHS的比例为1∶1)，室温搅拌5小时后，将其置于透析袋中透析72小时，置入低温冰箱中预冻12小时以上，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1g的壳聚糖-多肽复合物溶于50ml的2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将30ml液体石蜡、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将2g壳聚糖-多肽滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2ml的2.5％戊二醛，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水一次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)准确称取一定量的卡拉胶溶于去离子水中获得浓度为1％的卡拉胶50ml。
(b)将30ml液体石蜡，30ml乙酸乙酯和40mlspan-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将30ml卡拉胶溶胶滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入10ml的0.1M的氯化钙，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(f)Co60灭菌备用。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.3g的壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的20ml培养液中，然后在其中种植1×106心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得30mg/ml卡拉胶微球浓度的悬浊液10ml，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。
实施例4
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)配制质量百分比浓度为1％的乙酸50ml，称取1g壳聚糖-多肽复合物溶入其中磁力搅拌20min使其充分溶解，配制的质量浓度为2％的壳聚糖-多肽。
(b)称取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽)，溶于10ml去离子水中，然后再向其中加入2-吗啉乙磺酸水合物(MES)(MES的最终浓度为0.1M)，然后将其加入壳聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物0.5g，(其中EDC和NHS的比例为1∶1)，室温搅拌5小时后，将其置于透析袋中透析72小时，置入低温冰箱中预冻12小时以上，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1g的壳聚糖-多肽复合物溶于50ml的2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将30ml液体石蜡，30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在1000r/min转速条件下缓慢将2g壳聚糖-多肽滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时。形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2ml的2.5％戊二醛，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水一次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)准确称取一定量的卡拉胶溶于去离子水中获得浓度为1％的卡拉胶50ml。
(b)将30ml液体石蜡、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在1000r/min转速条件下缓慢将30ml卡拉胶溶胶滴加到液体石蜡、乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入10ml的0.1M的氯化钙，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(f)Co60灭菌备用。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.3g的壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的培养液中，然后在其中种植1×106心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得30mg/ml卡拉胶微球浓度的悬浊液10ml，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。
实施例5
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)配制质量百分比浓度为1％的乙酸50ml，称取1g壳聚糖-多肽复合物溶入其中磁力搅拌20min使其充分溶解，配制的质量浓度为2％的壳聚糖-多肽。
(b)称取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽)，溶于10ml去离子水中，然后再向其中加入2-吗啉乙磺酸水合物(MES)(MES的最终浓度为0.1M)，然后将其加入壳聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物0.5g，(其中EDC和NHS的比例为1∶1)，室温搅拌5小时后，将其置于透析袋中透析72小时，置入低温冰箱中预冻12小时以上，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1g的壳聚糖-多肽复合物溶于50ml的2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将30ml液体石蜡，30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将2g壳聚糖-多肽滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2ml的2.5％戊二醛，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水一次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)准确称取一定量的卡拉胶溶于去离子水中获得浓度为1％的卡拉胶50ml。
(b)将30ml液体石蜡、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将30ml卡拉胶溶胶滴加到液体石蜡、乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入10ml的0.1M的氯化钙，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(f)Co60灭菌备用。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.5g的壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的培养液中，然后在其中种植1×106心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得30mg/ml卡拉胶微球浓度的悬浊液10ml，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。
实施例6
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)配制质量百分比浓度为1％的乙酸50ml，称取1g壳聚糖-多肽复合物溶入其中磁力搅拌20min使其充分溶解，配制的质量浓度为2％的壳聚糖-多肽。
(b)称取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽)，溶于10ml去离子水中，然后再向其中加入2-吗啉乙磺酸水合物(MES)(MES的最终浓度为0.1M)，然后将其加入壳聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物0.5g，(其中EDC和NHS的比例为1∶1)，室温搅拌5小时后，将其置于透析袋中透析72小时，置入低温冰箱中预冻12小时以上，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1g的壳聚糖-多肽复合物溶于50ml的2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将30ml液体石蜡，30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将2g壳聚糖-多肽滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时。形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2ml的2.5％戊二醛，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水一次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)准确称取一定量的卡拉胶溶于去离子水中获得浓度为1％的卡拉胶50ml。
(b)将30ml液体石蜡、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将30ml卡拉胶溶胶滴加到液体石蜡、乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入10ml的0.1M的氯化钙，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(f)Co60灭菌备用。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.5g的壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的培养液中，然后在其中种植1×106心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得30mg/ml卡拉胶微球浓度的悬浊液10ml，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。
实施例7
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)配制质量百分比浓度为1％的乙酸50ml，称取1g壳聚糖-多肽复合物溶入其中磁力搅拌20min使其充分溶解，配制的质量浓度为2％的壳聚糖-多肽。
(b)称取0.5的功能性多肽(谷胱甘肽、谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽)，溶于10ml去离子水中，然后再向其中加入2-吗啉乙磺酸水合物(MES)(MES的最终浓度为0.1M)，然后将其加入壳聚糖-多肽中。再向其中加入EDC和NHS的混合物0.5g，(其中EDC和NHS的比例为1∶1)，室温搅拌5小时后，将其置于透析袋中透析72小时，置入低温冰箱中预冻12小时以上，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1g的壳聚糖-多肽复合物溶于50ml的2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将30ml液体石蜡、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将一定量的壳聚糖-多肽滴加到液体石蜡、乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2ml的2.5％戊二醛，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水一次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)准确称取一定量的卡拉胶溶于去离子水中获得浓度为1％的卡拉胶50ml。
(b)将30ml液体石蜡、30ml乙酸乙酯和40ml span-80混合均匀，100ml。
(c)在500r/min转速条件下缓慢将30ml卡拉胶溶胶滴加到液体石蜡、乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入10ml的0.1M的氯化钙，500r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置一定的时间后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(f)Co60灭菌备用。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.1g的壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的培养液中，然后在其中种植1×106心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得30mg/ml卡拉胶微球浓度的悬浊液10ml，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。

Claims (4)

1.一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品，其特征在于，该产品包括心肌细胞、壳聚糖-多肽和卡拉胶微球。
2.根据权利要求1一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品，其特征在于，所述卡拉胶微球的粒径为30-200μm。
3.一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)壳聚糖-多肽复合物的制备
(a)称取一定量壳聚糖将其溶于1％-3％的乙酸中，制备成质量浓度为1％-5％壳聚糖的乙酸，搅拌直至全部溶解。
(b)称取1-4g功能性多肽溶与20ml去离子水肿，加入2-吗啉乙磺酸水合物搅拌活化半小时，然后将其加入到50ml壳聚糖溶液中混匀。
(c)加入碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺并搅拌1-4小时，然后将其置于透析袋中透析72小时。
(d)将其放入低温冰箱中预冻12-48小时，然后冷冻干燥，获得壳聚糖-多肽复合物。
(2)壳聚糖-多肽微球的制备
(a)准确称取1-4g壳聚糖-多肽复合物溶于2％的醋酸中制得壳聚糖-多肽。
(b)将20-50ml液体石蜡，乙酸乙酯和span-80混合均匀。
(c)在100-2000r/min转速条件下缓慢将10-40ml壳聚糖-多肽溶液滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入一定量的2.5％戊二醛，100-2000r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置2-4小时后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到壳聚糖-多肽微球。
(f)Co60灭菌备用。
(3)卡拉胶微球的制备
(a)准确称取1-4卡拉胶溶于去离子水中获得浓度为0.2-4％的卡拉胶。
(b)将适量的液体石蜡，乙酸乙酯和span-80混合均匀。
(c)在100-2000r/min转速条件下缓慢将20-50ml卡拉胶溶液滴加到液体石蜡，乙酸乙酯和span-80的混合液中，并持续搅拌1-2小时，形成均一的乳液。
(d)在乳液中缓慢加入2-10ml 0.1M的氯化钙，100-2000r/min转速条件下持续搅拌1-5小时。
(e)静置1-4小时后，离心，用甲醇、石油醚洗涤、去离子水依次洗涤数次，真空干燥，即可得到卡拉胶微球。
(f)Co60灭菌备用。
(4)可注射性微球支架-细胞复合体的制备
(a)将0.5-2g壳聚糖-多肽微球分散到含有血清的10ml培养液中，然后利用该培养液接种心肌细胞，待细胞在微球上粘附后，离心，弃去上清液，备用。
(b)将卡拉胶微球分散到含有血清的培养液中，搅拌，获得一定卡拉胶微球浓度的悬浊液，备用。
(c)将粘附有细胞的壳聚糖-多肽微球按照一定的比例加入到卡拉胶微球悬液中，快速搅拌，获得可注射性微球支架-细胞复合体。
4.根据权利要求3所述一种基于多糖-多肽微球支架的可注射性心肌组织工程产品的制备方法，其特征在于，所述功能性多肽为谷胱甘肽或谷氨酰胺-组氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸五肽。
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