CN102133210A - 白藜芦醇在制备预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别涉及白藜芦醇在制备预防和治疗呼吸道合胞病毒感染药物中的应用，白藜芦醇在体外可以明显降低呼吸道合胞病毒的感染滴度和呼吸道合胞病毒诱导的IL-6的分泌；在体内可以显著降低呼吸道合胞病毒感染小鼠的肺组织中呼吸道合胞病毒的滴度，并对呼吸道合胞病毒诱导的气道炎症和气道高反应有较好的治疗作用。

Description

白藜芦醇在制备预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及白藜芦醇在制备预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒 (Respiratory syncytial virus, RSV) 是世界范围内引起婴幼儿时期下呼吸道感染最常见和最重要的病毒病原，也是年幼儿童因呼吸道感染致病住院的首要原因。1岁以内婴儿有70%曾经感染呼吸道合胞病毒，到2岁时基本上所有婴幼儿均有呼吸道合胞病毒感染的病史。婴幼儿时期呼吸道合胞病毒感染与儿童反复喘息和气道高反应性密切相关，但其机制尚不完全清楚。目前，临床上仍然没有能够预防呼吸道合胞病毒感染的药物，呼吸道合胞病毒感染后也无有效药物治疗。

白藜芦醇是一种多酚类化合物，唯一来源是植物。大约70多种植物都可以产生这种物质，用以抵御真菌和细菌等病原体攻击。白藜芦醇除了具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节的作用外，还具有抗病毒作用，但迄今为止，尚未见白藜芦醇能够抗呼吸道合胞病毒的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供白藜芦醇在制备治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

为达到上述目的，在本发明的第一方面，提供了白藜芦醇在制备治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

进一步，所述治疗呼吸道合胞病毒感染的药物为抑制呼吸道合胞病毒的药物；

进一步，所述治疗呼吸道合胞病毒感染的药物为抗呼吸道合胞病毒感染引起的气道炎症的药物；

进一步，所述治疗呼吸道合胞病毒感染的药物为抗呼吸道合胞病毒感染引起的气道高反应的药物；

进一步，所述治疗呼吸道合胞病毒感染的药物的剂型为注射剂或气雾剂。

本发明的目的之二在于提供白藜芦醇在制备预防呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

为达到上述目的，在本发明的第二方面，提供了白藜芦醇在制备预防呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

本发明的有益效果为：体外实验表明，白藜芦醇对上皮样喉癌细胞（Hep-2细胞）和人气道上皮细胞（9HTEo细胞）的毒性小，能使呼吸道合胞病毒的感染滴度明显降低，还能使呼吸道合胞病毒诱导的白介素-6（IL-6）的分泌明显降低；体内实验表明，白藜芦醇作用于呼吸道合胞病毒感染小鼠后，小鼠肺组织中呼吸道合胞病毒滴度降低了62.8%；同时，白藜芦醇可抑制呼吸道合胞病毒诱导的气道炎症细胞产生，一定程度上减轻呼吸道合胞病毒感染诱导的肺部炎症；还能降低呼吸道合胞病毒诱导的气道高反应性；白藜芦醇气雾剂的效果更佳；另外，白藜芦醇对呼吸道合包病毒的预防作用效果佳，因此，白藜芦醇制备预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的药物。

附图说明

图1为作用时间与呼吸道合胞病毒在Hep-2细胞中滴度线性分析图；

图2为9HTEo细胞在显微镜放大100倍下的照片；其中A为对照组；B为呼吸道合胞病毒组；C为白藜芦醇干预组；

图3为作用时间与呼吸道合胞病毒在9HTEo细胞中滴度线性分析图；

图4为对照组、呼吸道合胞病毒组和白藜芦醇干预组对呼吸道合胞病毒诱导IL-6分泌影响的柱状分析图；

图5为呼吸道合胞病毒组和白藜芦醇干预组的肺组织病毒滴度柱状比较图；

图6为肺部病例组织切片图；其中A和B为对照组；C和D为呼吸道合胞病毒组；E和F为白藜芦醇干预组；A、C和E的显微镜放大倍数为200倍，B、D和F的显微镜放大倍数为400倍；

图7为肺组织炎症病理评分分析图；

图8为对照组、呼吸道合胞病毒组和白藜芦醇干预组在不同浓度乙酰甲胆碱的影响下气道阻力的线性比较图；

图9为白藜芦醇雾化对RSV复制滴度影响，呼吸道合胞病毒组肺组织平均病毒滴度3.845×10⁴PFU/g；白藜芦醇干预组肺组织平均病毒滴度为0.6875×10⁴PFU/g，两组间差异具有显著性；

图10为白藜芦醇雾化对RSV复制滴度影响 (n=6，p=0.0095)，呼吸道合胞病毒组肺组织平均病毒滴度3.845×10⁴PFU/g；白藜芦醇预防组肺组织平均病毒滴度为1.695×10⁴PFU/g，两组间差异具有显著性；

图11为白藜芦醇雾化对肺泡灌洗液细胞计数的影响（n=6，P<0.001），白藜芦醇雾化呼吸道合胞病毒感染的小鼠后，肺泡灌洗液细胞计数较呼吸道合胞病毒组明显减少，两组相比有统计学差异；

图12为白藜芦醇预防用药对肺泡灌洗液细胞计数的影响（n=6，P<0.001）白藜芦醇预防组肺泡灌洗液细胞计数较呼吸道合胞病毒组明显减少，两组相比有显著性差异；

图13为白藜芦醇雾化对气道高反应性影响（n=6，P<0.05），呼吸道合胞病毒感染后第5天，小鼠气道阻力明显增高；白藜芦醇雾化5天后，能降低呼吸道合胞病毒诱导的气道高反应性，气道阻力值用均数±标准差表示；

图14白藜芦醇预防用药对气道高反应性影响（n=6，P<0.05），白藜芦醇预防组较呼吸道合胞病毒组气道高反应性明显降低，气道阻力值用均数±标准差表示。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、细胞实验

1 实验方法

1.1常规培养Hep-2和9HTEo细胞株。

上述细胞的培养按现有技术的常规方法进行。

1.2 MTT法检测Hep-2细胞和9HTEo细胞的白藜芦醇耐受浓度

96孔板培养单层Hep-2细胞和9HTEo细胞，1×10⁴/孔，吸弃培养基，用PBS液洗细胞1次，用含有体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基将白藜芦醇储存液分别稀释成含有白藜芦醇0、30、50、70、100、120 umol的工作液加入孔中，置温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的孵箱中培养72小时，吸弃工作液，用PBS液洗细胞1次，每孔加入MTT工作液20μl，继续孵育4小时，吸弃孔内培养上清液，每孔再加入二甲基亚砜150μl，振荡10分钟使结晶物充分融解，用酶标仪于波长570nm处检测各孔吸光度值。

1.3 呼吸道合胞病毒感染Hep-2细胞后，检测适宜浓度白藜芦醇对呼吸道合胞病毒滴度的影响

将Hep-2细胞用含有体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基以1×10⁵/孔接种于24孔板，细胞贴壁后，用PBS液洗1次，将呼吸道合胞病毒以MOI=0.1接种细胞，置温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的孵箱中吸附2小时，每30分钟轻轻晃动一次以使吸附均匀，吸附结束后弃病毒液，另加病毒维持液0.6ml/孔，置温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的孵箱中培养4小时；分别设呼吸道合胞病毒组（不加入白藜芦醇）和白藜芦醇干预组（加入白藜芦醇100 umol），培养至24小时，收集上清液0.4ml/孔，-80℃冻存，补充新的病毒维持液0.4ml/孔，继续培养，分别于培养至48、72、96、120小时，重复上述操作，即收集上清液并补充新的病毒维持液；最后用Quantum's Adeasy TCID50法检测不同时间收集的上清液中的病毒滴度。

1.4 呼吸道合胞病毒感染9HTEo细胞后，检测适宜浓度白藜芦醇对呼吸道合胞病毒滴度的影响

将9HTEo细胞用含有体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基以1×10⁵/孔接种于24孔板，细胞贴壁后，用PBS液洗1次，将呼吸道合胞病毒以MOI=0.1接种细胞，置温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的孵箱中吸附2小时，每30分钟轻轻晃动一次以使吸附均匀，吸附结束后弃病毒液，另加病毒维持液0.6ml/孔，置温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的孵箱中培养4小时；分别设呼吸道合胞病毒组（不加入白藜芦醇）和白藜芦醇干预组（加入白藜芦醇50 umol），培养至24小时，收集上清液0.4ml/孔，-80℃冻存，补充新的病毒维持液0.4ml/孔，继续培养，分别于培养至48、72、96、120小时，重复上述操作，即收集上清液并补充新的病毒维持液；最后用Quantum's Adeasy TCID50法检测不同时间收集的上清液中的病毒滴度。

1.5 呼吸道合胞病毒感染9HTEo细胞后，检测白藜芦醇对上皮细胞炎症因子分泌的影响

将9HTEo细胞用含有体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基以1×10⁵/孔接种于24孔板，12小时细胞贴壁后改用无血清RPMI 1640培养基培养至24小时，以MOI=10接种呼吸道合胞病毒和MOCK细胞至每孔，置温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的孵箱中吸附2小时，每30分钟轻轻晃动一次以使吸附均匀，吸附结束后弃病毒液，加入无血清无抗生素的RPMI 1640培养基0.6ml/孔，置温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的孵箱中培养4小时；分别设呼吸道合胞病毒组（不加入白藜芦醇）和白藜芦醇干预组（加入白藜芦醇至浓度为50μg/ml），置温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的孵箱中培养至呼吸道合胞病毒感染48小时，收集上清液于离心管中，14,000rmp离心10分钟，收集上清液，-80℃冻存，采用ELISA法检测白介素-8（IL-8）和IL-6的水平。

实验结果

数据用                                                

±s（均数±标准差）表示，采用SPSS16.0统计软件，两组间均数比较采用t检验；多个样本均数比较采用ANOVA分析，以SNK-q检验进行均数间多重比较；多个样本率的比较采用X²检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 Hep-2细胞和9HTEo细胞对不同浓度白藜芦醇耐受情况

Hep-2细胞可耐受白藜芦醇的最大剂量是100 mmol，9HTEo细胞可耐受白藜芦醇的最大剂量是50 mmol。

2.2 呼吸道合胞病毒感染Hep-2细胞后，白藜芦醇对呼吸道合胞病毒滴度的影响

5天呼吸道合胞病毒滴度变化结果为：白藜芦醇100 mmol组在呼吸道合胞病毒感染的第2天和第3天，呼吸道合胞病毒感染滴度明显低于呼吸道合胞病毒组（P<0.05），详见图1。

2.3 呼吸道合胞病毒感染9HTEo细胞后，白藜芦醇对细胞病变和呼吸道合胞病毒滴度的影响

呼吸道合胞病毒感染9HTEo细胞后，白藜芦醇对细胞病变的影响，详见图2，白藜芦醇干预组无明显合胞病变，而呼吸道合胞病毒组可见明显病变。

5天呼吸道合胞病毒滴度变化结果为：白藜芦醇50 mmol组在呼吸道合胞病毒感染的第1、2、3天，呼吸道合胞病毒感染滴度明显低于呼吸道合胞病毒组（P<0.05），详见图3。

2.4 呼吸道合胞病毒感染9HTEo细胞后，白藜芦醇对呼吸道合胞病毒诱导IL-6和IL-8分泌的影响

呼吸道合胞病毒感染9HTEo细胞后，白藜芦醇干预组的IL-6水平明显低于呼吸道合胞病毒组（P<0.05），详见图4。白藜芦醇干预组的IL-8水平与呼吸道合胞病毒组无明显差异。

二、动物实验

1 实验方法

1.1 实验动物和处理

取6-8周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠 （购于重庆医科大学实验动物中心），给予环磷酰胺100mg/kg腹腔注射后，随机分为对照组、呼吸道合胞病毒组和白藜芦醇干预组；然后，对照组正常饲养；呼吸道合胞病毒组和白藜芦醇干预组在环磷酰胺注射后第5天，用体积分数为10%的水合氯醛麻醉，呼吸道合胞病毒 10⁵PFU/ml滴鼻；白藜芦醇干预组在呼吸道合胞病毒滴鼻1小时后，给予白藜芦醇30mg/kg腹腔注射，连续注射5天。

1.2 肺组织呼吸道合胞病毒病毒滴度测定

取三组小鼠肺组织，按10ml/g加入组织平衡液，匀浆，离心，收集上清液，-80℃冻存，空斑实验检测病毒滴度。

1.3 肺泡灌洗液白细胞计数及分类

将三组小鼠脱颈处死，将预冷至4℃的PBS液注入肺，再通过气管吸出，获得肺泡灌洗液1.5ml；将所得肺泡灌洗液离心，收集上清，-80℃冻存；同时，向细胞沉淀中加入PBS液1ml，行细胞计数，并做细胞涂片，瑞氏染色，进行细胞分类。

1.4 肺病理组织检测

取三组小鼠肺组织，用体积分数为10%的中性甲醛溶液固定24小时，脱水，石蜡包埋，切片5um，HE染色，参照Myou的方法（Myou S, et al. Blockade of inflammation and airway hyperresponsiveness in immune-sensitized mice by dominant-negative phosphoinositide 3-kinase-TAT. J Exp Med. 2003, 198: 1573- 1582）进行组织形态学评分，用组织形态学评分表示肺部炎症程度。

1.5 全身体积描述记法检测肺功能

三组小鼠于清醒状态下，用全身体积描述器（emka, France）检测气道高反应性，即小鼠暴露于不同浓度（分别为0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/ml）的乙酰甲胆碱溶液3分钟，休息2分钟，放入体描箱进行检测，用气道阻力（Penh）代表气道高反应性。

白藜芦醇雾化剂的影响

SPF级雌性BALB/c小鼠，饲养2天后，给予环磷酰胺100mg/kg腹腔注射后的小鼠随机分为对照组、呼吸道合胞病毒组和白藜芦醇干预组。呼吸道合胞病毒组在环磷酰胺注射后第5天， 10%水合氯醛麻醉，RSV10⁵PFU/ml滴鼻；白藜芦醇干预组在RSV滴鼻1小时后，给予白藜芦醇30mg/kg，雾化发生器雾化，每次30分钟，连续雾化5天，取标本检测。分别检测肺泡灌洗液细胞计数，肺组织匀浆病毒滴度及气道高反应性。

1.7 白藜芦醇注射液的预防作用

SPF级雌性BALB/c小鼠，饲养2天后，给予环磷酰胺100mg/kg腹腔注射后的小鼠随机分为对照组、呼吸道合胞病毒组和白藜芦醇预防组。白藜芦醇预防组在环磷酰胺注射2小时后，给予白藜芦醇腹腔注射30mg/kg，连续注射5天，5天后，10%水合氯醛麻醉，RSV10⁵PFU/ml滴鼻，RSV感染后第5天取标本检测。分别检测肺泡灌洗液细胞计数，肺组织匀浆病毒滴度及气道高反应性。

实验结果

数据用

±s（均数±标准差）表示，采用SPSS16.0统计软件，两组间均数比较采用t检验；多个样本均数比较采用ANOVA分析，以SNK-q检验进行均数间多重比较；多个样本率的比较采用X²检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 白藜芦醇对肺部病毒滴度的影响

白藜芦醇干预组小鼠肺组织中呼吸道合胞病毒滴度与呼吸道合胞病毒组相比降低了62.8%，差异有显著性，详见图5，提示白藜芦醇能够抑制呼吸道合胞病毒在肺组织的复制。

2.2 白藜芦醇对肺泡灌洗液白细胞计数及分类的影响

呼吸道合胞病毒感染后引起大量淋巴细胞浸润，呼吸道合胞病毒组的白细胞总数较对照组明显增多（P<0.05），淋巴细胞百分比较对照组增大（P<0.01）；白藜芦醇干预后，白细胞总数较对照组增多，但较呼吸道合胞病毒组明显减少（P<0.05），淋巴细胞百分比较呼吸道合胞病毒组降低了37.8%（P<0.05），详见表1，提示白藜芦醇可抑制呼吸道合胞病毒诱导的气道炎症细胞产生。

表1 肺泡灌洗液白细胞计数（×10⁶）及分类百分比（%）

a*表示对照组与呼吸道合胞病毒组间白细胞总数差异具有显著性（n=8，P<0.05）

b*表示呼吸道合胞病毒组与白藜芦醇干预组间白细胞总数差异具有显著性（n=8，P<0.05）

c*表示白藜芦醇干预组与对照组间白细胞总数差异具有显著性（n=8，P<0.05）

d**表示三组间白细胞分类百分比差异具有显著性（n=8，P<0.01）

2.3 白藜芦醇对肺组织炎症变化影响

呼吸道合胞病毒感染后第5天，小鼠肺泡组织出现明显充血、水肿、大量淋巴细胞浸润，毛细支气管管壁增厚，管壁及管周可见大量淋巴细胞；白藜芦醇干预5天后，小鼠肺部炎症明显减轻，肺泡壁毛细支气管壁变薄、充血减弱、炎症细胞减少，详见图6。肺部组织评分中，白藜芦醇干预组与呼吸道合胞病毒组病理评分有显著性差异，呼吸道合胞病毒组评分为2.208±0.238，白藜芦醇干预组评分为1.09±0.074，降低了50.6%，详见图7。上述结果显示，白藜芦醇一定程度上能够减轻呼吸道合胞病毒感染诱导的肺部炎症。

2.4 白藜芦醇对小鼠气道高反应性影响

呼吸道合胞病毒感染后第5天，检测小鼠气道高反应。呼吸道合胞病毒组的气道阻力在乙酰甲胆碱浓度为3.125～50mg/ml时均高于对照组（P<0.05），白藜芦醇干预5天后，白藜芦醇干预组的气道阻力与呼吸道合胞病毒组相比明显降低（P<0.05），提示白藜芦醇干预后能够降低呼吸道合胞病毒诱导的气道高反应性，详见图8。

2.5白藜芦醇雾化剂的影响

白藜芦醇雾化呼吸道合胞病毒感染小鼠后，肺组织中呼吸道合胞病毒滴度明显降低，与呼吸道合胞病毒感染组相比其差异具有显著性（图9），降低了82.1%。提示白藜芦醇雾化能够抑制呼吸道合胞病毒在肺组织的复制。

呼吸道合胞病毒感染后引起大量淋巴细胞浸润，白细胞总数3.475±0.231×10⁶较对照组0.720±0.105×10⁶明显增多；白藜芦醇雾化后，白细胞总数0.795±0.28×10⁶与呼吸道合胞病毒感染组相比明显减少（P<0.001）（图11），减少了77.1%。结果提示，白藜芦醇雾化可抑制呼吸道合胞病毒诱导的气道炎症细胞产生。

呼吸道合胞病毒感染后第5天，检测小鼠气道高反应。呼吸道合胞病毒感染组的气道阻力在乙酰甲胆碱（3.125mg/ml-50mg/ml）浓度均高于对照组（n=6，P<0.05），白藜芦醇雾化5天后，在乙酰甲胆碱（12.5mg/ml~50mg/ml）白藜芦醇雾化组气道阻力与呼吸道合胞病毒感染组相比明显降低（n=6，P<0.05）（图13）。实验结果提示白藜芦醇雾化能够降低呼吸道合胞病毒诱导的气道高反应性。

2.6白藜芦醇注射液的预防作用

呼吸道合胞病毒感染小鼠前给予白藜芦醇后，肺组织中呼吸道合胞病毒滴度明显降低，与呼吸道合胞病毒感染组相比其差异具有显著性（图10），降低了55.9%。提示白藜芦醇预防用药能够抑制呼吸道合胞病毒在肺组织的复制。

呼吸道合胞病毒感染后引起大量淋巴细胞浸润，白细胞总数3.475±0.231×10⁶较对照组0.720±0.105×10⁶明显增多；白藜芦醇预防组，白细胞总数1.96±0.0.31×10⁶与呼吸道合胞病毒感染组相比明显减少（P<0.001）（图12），减少了43.6%。结果提示，白藜芦醇预防用药可减少呼吸道合胞病毒诱导的气道炎症细胞产生。

呼吸道合胞病毒感染后第5天，检测小鼠气道高反应。呼吸道合胞病毒感染组的气道阻力在乙酰甲胆碱（3.125mg/ml~50mg/ml）浓度均高于对照组（n=6，P<0.05），白藜芦醇预防用药5天后，在乙酰甲胆碱（12.5mg/ml~50mg/ml）白藜芦醇预防组气道阻力与呼吸道合胞病毒感染组相比明显降低（n=6，P<0.05）（图14）。实验结果提示白藜芦醇预防用药能够降低呼吸道合胞病毒诱导的气道高反应性。

基于上述实验结果：白藜芦醇在体外可以明显降低呼吸道合胞病毒感染滴度和呼吸道合胞病毒诱导的IL-6的分泌；在体内可以显著降低呼吸道合胞病毒感染小鼠的肺组织中呼吸道合胞病毒的滴度即能够抑制呼吸道合胞病毒的复制，可以减轻呼吸道合胞病毒感染诱导的气道炎症和气道高反应性；得出如下结论：白藜芦醇具有抗呼吸道合胞病毒的作用，可以用于制备治疗呼吸道合胞病毒感染的药物。

上述实施例中的动物实验是以腹腔注射形式给药，提示以白藜芦醇为活性成分的治疗呼吸道合胞病毒感染的药物可以制成注射剂，通过注射途径给药。同时，根据治疗呼吸系统疾病药物的常规制药技术，本领域技术人员知晓，以白藜芦醇为活性成分的治疗呼吸道合胞病毒感染的药物也可以制成其他制剂。

上述实施例中的动物实验是以小鼠为实验对象，白藜芦醇的给药剂量为每日每公斤体重30mg，根据实验结果并结合理论分析，推测白藜芦醇的给药剂量在每日每公斤体重1~50mg内对呼吸道合胞病毒感染均有效。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (6)

1.白藜芦醇在制备治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述白藜芦醇的应用，其特征在于：所述治疗呼吸道合胞病毒感染的药物为抑制呼吸道合胞病毒的药物。

3.根据权利要求1所述白藜芦醇的应用，其特征在于：所述治疗呼吸道合胞病毒感染的药物为抗呼吸道合胞病毒感染引起的气道炎症的药物。

4.根据权利要求1所述白藜芦醇的应用，其特征在于：所述治疗呼吸道合胞病毒感染的药物为抗呼吸道合胞病毒感染引起的气道高反应的药物。

5.根据权利要求1-4任一项所述的白藜芦醇的应用，其特征在于：所述治疗呼吸道合胞病毒感染的药物的剂型为注射剂或气雾剂。

6.白藜芦醇在制备预防呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

Images