CN102133172A - 一种紫杉醇纳米胶束及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫杉醇纳米胶束及其应用。一种紫杉醇纳米胶束，为如下1)或2)或3)所示：1)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的混合物；2)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；3)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。本发明的功能化紫杉醇纳米胶束在口服给药后能使紫杉醇通过胃肠道屏障，克服耐药性乳腺癌的多药耐药性。本发明的功能化紫杉醇纳米胶束口服剂型能避免过敏反应，可用于众多的癌症病人，同时适用于多药耐药肿瘤，比当前的静脉注射剂型有更大的优越性。

Description

一种紫杉醇纳米胶束及其应用

技术领域

本发明涉及一种紫杉醇纳米胶束及其应用。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel)是从红豆杉属植物中提取和纯化得到的一种具有高效抗肿瘤活性的天然物质，对许多类型的癌症具有显著的疗效，包括卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。由于紫杉醇很小的溶解度(＜1μg/ml)和很差的胃肠道屏障透过性，导致紫杉醇不能口服生物利用。目前临床中使用的紫杉醇制剂都是静脉注射剂。紫杉醇的市售制剂泰素(Taxol)是由聚氧乙烯蓖麻油/无水乙醇(50/50)制成的无色黏稠状溶液。但制剂中的聚氧乙烯蓖麻油引起病人严重的副反应，例如过敏反应、神经毒性和肾毒性，而且还可溶解聚氯乙烯输液器中的增塑剂，也可引起制剂稀释时紫杉醇出现沉淀。

实际上，由于紫杉醇的低溶解度、胃肠道中P-糖蛋白的外排以及肠或肝上细胞色素P-450 3A4酶的代谢，使得紫杉醇很难跨过胃肠道屏障。研究者们采用了很多策略来提高紫杉醇的生物利用度，但是目前仍没有理想的紫杉醇口服剂型。

紫杉醇对多种类型的肿瘤病人复发后治疗上表现出明显的多药耐药性，主要是由于ABC转运蛋白家族的过度表达(尤其是P-糖蛋白)，使得抗肿瘤药物被耐药肿瘤细胞外排后，从而降低了肿瘤细胞内的药物浓度。

由于这些问题的存在，有必要开发一种新型紫杉醇输送系统，以提高紫杉醇的溶解度，提高紫杉醇对胃肠道屏障的透过性以及克服紫杉醇的多药耐药性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种紫杉醇纳米胶束。

本发明所提供的紫杉醇纳米胶束，为如下1)或2)或3)所示：

1)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的混合物；

2)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；

3)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

上述紫杉醇纳米胶束中，

1)中，所述紫杉醇和载体的投料质量比为1∶20至1∶40，优选为1∶28；

2)中，所述紫杉醇和载体的投料质量比为1∶20至1∶40，优选为1∶28；

3)中，所述紫杉醇和载体的投料质量比为1∶40至1∶60，优选为1∶50。

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，

1)中，所述载体中，所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的投料摩尔比为1∶(0.5-3)∶(0.2-0.5)，优选1∶1∶0.4。

2)中，所述载体中，所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1∶(0.5-3)，优选1∶1。

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述1)、2)和3)中，

所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的分子式为C₁₃₅H₂₆₈NO₅₆P，分子结构式如式II所示：

(式II)

所述聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的分子式为(C₂H₄O)₂₃C₃₃H₅₄O₅，分子结构式如式III所示：

(式III)

所述地喹氯铵的分子式为C₃₀H₄₀C₁₂N₄，分子结构式如式IV所示：

(式IV)

所述紫杉醇的分子式为C₄₇H₅₁NO₁₄，分子结构式如式I：

(式I)

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述1)、2)和3)中，所述制备的方法包括如下步骤：将所述紫杉醇和所述载体置于容器中，再向其中加入甲醇，使所述紫杉醇和所述载体溶解于所述甲醇中，再去除甲醇并使所述紫杉醇和所述载体的混合物在所述容器壁上形成薄膜，再向所述容器中加入pH7.0-7.5的缓冲液，水化处理，得到水化处理产物，即得到所述紫杉醇纳米胶束。

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述制备的方法中，所述水化处理的方法为将装有所述薄膜和所述缓冲液的容器在60℃振摇30min；

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述制备的方法中，所述缓冲液为HEPES缓冲液；

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述制备的方法中，所述HEPES缓冲液由10mMHEPES、145mM NaCl和水组成，水补足体积；所述HEPES缓冲液的pH值为7.4。

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述制备的方法中，所述水化处理后，包括将水化处理产物进行0.2μm孔径过滤的步骤。

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束的平均粒径分别为15.51±0.58nm，15.94±0.29nm和15.77±0.77nm；

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束的粒径的多分散系数分别为0.14±0.04，0.19±0.08和0.18±0.04。

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束的Zeta电位分别为-5.4mV，-3.7mV和1.6mV；

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束的载药量分别为1.57±0.15％，2.55±0.03％和2.58±0.18％；

上述任一所述紫杉醇纳米胶束中，所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束中紫杉醇的含量分别为987±21μg/ml，1456±33μg/ml，1502±17μg/ml。

上述任一所述紫杉醇纳米胶束在制备抑制肿瘤的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述抑制肿瘤为抑制肿瘤的增殖和/或抑制肿瘤细胞的存活；

上述任一所述应用中，所述抑制肿瘤的增殖为抑制肿瘤细胞的增殖和/或抑制肿瘤球体积增大和/或促进肿瘤球的瓦解；

上述任一所述应用中，所述肿瘤为乳腺癌；所述乳腺癌的细胞为人源乳腺癌MCF-7细胞或耐药人源乳腺癌MCF-7/Adr细胞。

本发明的功能化紫杉醇纳米胶束粒径大约15nm，明显提高了紫杉醇的细胞内摄取，选择性地累积进入线粒体和内质网，对MCF-7和MCF-7/Adr细胞表现出强烈的抑制效应。功能化紫杉醇纳米胶束能够穿透进入MCF-7和MCF-7/Adr肿瘤球的中心坏死区，明显降低了肿瘤球的大小。透射电镜结果表明，完整的功能化紫杉醇纳米胶束能够跨过Caco-2细胞单层和外翻小肠囊。口服给药后对耐药性乳腺癌细胞移植瘤具有明显抗肿瘤活性。功能化紫杉醇纳米胶束在口服给药后能使紫杉醇通过胃肠道屏障，克服耐药性乳腺癌的多药耐药性。本发明的功能化紫杉醇纳米胶束口服剂型能避免过敏反应，可用于众多的癌症病人，同时适用于多药耐药肿瘤，比当前的静脉注射剂型有更大的优越性。本发明功能化紫杉醇纳米胶束在肿瘤治疗领域将有广阔的应用前景。

附图说明

图1紫杉醇纳米胶束及其表征。

图2五种不同的紫杉醇制剂对MCF-7细胞(A)和MCF-7/Adr细胞(B)的抑制效应。

图3MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞的摄取。

图4纳米胶束在MCF-7细胞(A)和MCF-7/Adr细胞(B)中亚细胞器的分布。图中，6香豆素纳米胶束即指6香豆素标记的普通紫杉醇纳米胶束。

图5各种紫杉醇制剂对肿瘤球的抑制效应及穿透力研究。图5E和F中，a为游离罗丹明123，b为罗丹明123标记的普通紫杉醇纳米胶束，c为罗丹明123标记的抗耐药紫杉醇纳米胶束，d为罗丹明123标记的功能化紫杉醇纳米胶束。

图6不同的紫杉醇制剂对紫杉醇跨过Caco-2细胞单层的影响。

图7不同的紫杉醇制剂对紫杉醇跨过外翻小肠囊的影响。

图8功能化紫杉醇纳米胶束口服给药后对移植瘤模型的治疗效果(A)和给药期间荷瘤裸鼠的体重变化(B)。

图9 DiR标记的功能化纳米胶束在荷MCF-7/Adr移植瘤裸鼠体内的分布和肿瘤蓄积能力。

图1-9中的标记中，未作特别说明的，紫杉醇纳米胶束均指文中的普通紫杉醇纳米胶束。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

文中，维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS₁₀₀₀)也即聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。

泰素注射剂购自海口市制药厂，产品批号为080204。紫杉醇干粉购自南京天尊泽众化学试剂公司，产品批号为080315。

人源乳腺癌MCF-7细胞购自中国医学科学院协和医科大学药物研究所。耐药人源乳腺癌MCF-7/Adr细胞购自中国医学科学院协和医科大学血液病研究所(也叫中国医学科学院协和医科大学血液学研究所)。人结肠腺癌Caco-2购自中国医学科学院协和医科大学药物研究所。

聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DSPE)购自日本油脂株式会社，产品目录号为DSPE-020CN。

聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS₁₀₀₀)购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为57668。

地喹氯铵购自浙江洪波化工有限公司，产品批号为100402。

实施例1、紫杉醇纳米胶束的制备

一、制备中使用的原料

1、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG₂₀₀₀-DSPE)的分子式为C₁₃₅H₂₆₈NO₅₆P，分子量为2829，含有聚合度为45的聚乙二醇(PEG)，分子结构式如式II所示：

(式II)

2、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS₁₀₀₀)的分子式为(C₂H₄O)₂₃C₃₃H₅₄O₅，分子量为1513；含有聚合度为23的聚乙二醇(PEG)，结构式如式III所示：

(式III)

3、地喹氯铵的分子式为C₃₀H₄₀C₁₂N₄，分子量为527.57。结构式如式IV所示：

(式IV)

4、紫杉醇的分子式为C₄₇H₅₁NO₁₄，分子量为853.92，化学结构式如式I：

(式I)

二、制备方法

(一)功能化紫杉醇纳米胶束的制备

方法I：

将紫杉醇和载体置于茄形瓶中，再向其中加入甲醇，使紫杉醇和载体溶解于甲醇中，旋转蒸发37℃真空干燥除去甲醇，并使所述紫杉醇和所述载体的混合物在茄形瓶底部及内壁形成一层薄薄的均匀膜。再向茄形瓶中加入pH值为7.4的HEPES缓冲液，进行水化处理(即在60℃水浴中振摇30min)，得到水化处理产物(即功能化紫杉醇纳米胶束溶液)，冷却至室温，水化处理产物中过量的紫杉醇通过0.2μm的聚碳酸酯膜过滤除去，即得透明的功能化紫杉醇纳米胶束。

其中，载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的混合物；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的投料摩尔比为1∶1∶0.4；紫杉醇和载体的投料质量比为1∶28。

每1升HEPES缓冲液按照如下方法制备：将10mmol HEPES、145mmol NaCl和水混合，调节pH值至7.4，用水补足体积至1L。

方法II：

操作步骤基本与方法I相同，不同的是：载体中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的投料摩尔比为1∶0.5∶0.2；紫杉醇和载体的投料质量比为1∶20。HEPES缓冲液的pH值至7.0。

方法III：

操作步骤基本与方法I相同，不同的是：载体中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的投料摩尔比为1∶3∶0.5；紫杉醇和载体的投料质量比为1∶40。HEPES缓冲液的pH值至7.5。

(二)抗耐药紫杉醇纳米胶束的制备

方法I：

与功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法I中所述步骤基本相同，不同的是：

所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；载体中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1∶1。

方法II：

与功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法II中所述步骤基本相同，不同的是：

所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；载体中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1∶0.5。

方法III：

与功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法III中所述步骤基本相同，不同的是：

所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；载体中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1∶3。

(三)普通紫杉醇纳米胶束的制备

方法I：

与功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法I中所述步骤基本相同，不同的是：

所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；紫杉醇和载体的投料质量比为1∶50。

方法II：

与功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法II中所述步骤基本相同，不同的是：

所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；紫杉醇和载体的投料质量比为1∶40。

方法III：

与功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法III中所述步骤基本相同，不同的是：

所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；紫杉醇和载体的投料质量比为1∶60。

三、纳米胶束的表征

(一)方法：

采用Nano Series Zen 4003 Zeta Sizer测定纳米胶束的粒径和Zeta电位。采用透射电镜观察制备的三种纳米胶束的大小和形状。

紫杉醇的体外含量用高效液相色谱法测定。用十八烷硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(Phenomenex 4.6×250mm，5μm)，乙腈-水(60∶40，v/v)为流动相，温度为30℃，检测波长为227nm，流速为1ml/min测定。精密量取制备的胶束溶液，用9倍体积的甲醇破坏。取出20μL进样用HPLC法测定胶束中紫杉醇的含量。

包封率及载药量分别按下式计算：

紫杉醇从各种剂型中的释放速率用释放百分数来表示，采用透析法测定。三种紫杉醇纳米胶束和泰素注射剂(含有50μg紫杉醇)加入1ml蒸馏水混匀后放入透析袋(截留分子量为12000-14000)内。为了测试紫杉醇干粉悬浮液的释放行为，5μl紫杉醇溶液(10mg紫杉醇/ml乙腈溶液))加入1ml蒸馏水混匀后放入透析袋内，紫杉醇立即沉淀。各种紫杉醇纳米胶束、泰素或紫杉醇颗粒的透析袋两端扎紧后置于150.0ml释放介质中，在37℃、100rpm的条件下在摇床上振荡。释放介质分别为人工胃液(含1％胃蛋白酶，pH 1.2)、人工肠液(含1％胰蛋白酶，pH 6.8)和磷酸盐缓冲液(含10％胎牛血清，pH 7.4)。分别于0，0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24和48h时取出0.5ml释放介质，并每次取样后立即补入同等体积的新鲜释放介质。以释放液为空白对照，HPLC测定紫杉醇含量，并用下式计算紫杉醇的释放率∶释放率％＝(W_i/W_total)×100％，W_i为第i个时间点在释放介质中测得的紫杉醇量，W_total为释放实验前加入的紫杉醇总量。

人工胃液的配制(按中华人民共和国药典2005版配制)：取盐酸234ml，加水稀释至1000ml，即得稀盐酸。本液含盐酸应为9.5％～10.5％。取上述配制的稀盐酸16.4ml，加水约800ml及胃蛋白酶10g，搅匀后加水定容至1000ml即可。

人工肠液的配制(按中华人民共和国药典2005版配制)：取磷酸二氢钾6.8g加水500ml，用0.4％(w/w)的NaOH溶液调节pH至6.8；另取胰酶10g加水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000ml即可。

磷酸盐缓冲液的配制：将137mmol NaCl，2.7mmol KCl，8mmol Na₂HPO₄，2mmolKH₂PO₄，100ml胎牛血清和水混合，调节pH值至7.4，用水补足体积至1L。

(二)结果：

普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束的平均粒径分别为15.51±0.58nm，15.94±0.29nm和15.77±0.77nm；其粒径的多分散系数分别为0.14±0.04，0.19±0.08和0.18±0.04；载药量分别为1.57±0.15％，2.55±0.03％和2.58±0.18％；其zeta电位分别为-5.4mV，-3.7mV和1.6mV。

三种纳米胶束的包封率均大于70％。

图1中，(A)三种紫杉醇纳米胶束的的透射电镜照片；(B)载体材料的浓度对紫杉醇溶解度的影响；(C)不同的紫杉醇剂型在人工胃液中的体外释放行为；(D)不同的紫杉醇剂型在人工肠液中的体外释放行为；(E)不同的紫杉醇剂型在含10％胎牛血清的PBS溶液中的体外释放行为。

图1A为三种紫杉醇纳米胶束的透射电镜结果。从图中可以看出，三种纳米胶束均为球形，粒径均一，大约在15-20nm之间。图1B是形成胶束载体材料的浓度对紫杉醇溶解度的影响。结果表明，随着载体材料浓度的增加，紫杉醇的溶解度也在增加。当载体材料浓度为25mM时，紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束中紫杉醇的溶解度分别为987±21，1456±33，1502±17μg/ml。图1B对应的实验条件为：对于紫杉醇纳米胶束，载体材料浓度为25mM指的是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的浓度为25mM；对于抗耐药紫杉醇纳米胶束，载体材料浓度为25mM指的是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的浓度均为12.5mM；对于功能化紫杉醇纳米胶束，载体材料浓度为25mM指的是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的浓度分别为10.4mM，10.4mM和4.2mM。溶解度的测定方法为：精密量取0.2μm的聚碳酸酯膜过滤后的胶束溶液100μL，溶解于900μL甲醇中，混匀。取出20μL进样用HPLC法测定得到胶束中紫杉醇的浓度。

图1C、1D和1E分别代表不同紫杉醇剂型在人工胃液、人工肠液和含10％胎牛血清的PBS溶液中体外释放行为。结果表明，在起始2h内，三种紫杉醇纳米胶束在三种释放介质中的释放率不到20％。紫杉醇干粉悬浮液48h内在三种释放介质中的释放率不到25％。然而，泰素注射剂12h内在三种释放介质中的释放率超过80％。相对于泰素，三种紫杉醇纳米胶束均有明显的缓释行为。在12h时，普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束的释放率分别如下：在人工胃液中，46.0±0.9％，55.0±1.0％和62.3±2.4％；在人工肠液中，29.0±1.2％，43.4±0.8％和53.9±1.9％；在含10％胎牛血清的PBS中，24.3±2.0％，46.0±0.9％和46.8±1.9％。12h以后释放量变化不大。

上述结果都是实施例1中实验二的制备方法中方法I得到的普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束、功能化紫杉醇纳米胶束的结果。

实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的功能化紫杉醇纳米胶束的结果与方法I得到的功能化紫杉醇纳米胶束的结果无显著差异。

实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的抗耐药紫杉醇纳米胶束的结果与方法I得到的抗耐药紫杉醇纳米胶束的结果无显著差异。

实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的普通紫杉醇纳米胶束的结果与方法I得到的普通紫杉醇纳米胶束的结果无显著差异。

四、制备6-香豆素，罗丹明123和DiR标记的纳米胶束的制备

6-香豆素标记的功能化纳米胶束的方法：将6-香豆素(购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为442631)和载体置于茄形瓶中，再向其中加入甲醇，使6-香豆素和载体溶解于甲醇中，旋转蒸发37℃真空干燥除去甲醇，并使所述6-香豆素和所述载体的混合物在茄形瓶底部及内壁形成一层薄薄的均匀膜。再向茄形瓶中加入pH值为7.4的HEPES缓冲液，进行水化处理(即在60℃水浴中振摇30min)，得到水化处理产物(即6-香豆素标记的功能化纳米胶束溶液)，冷却至室温，水化处理产物中过量的6-香豆素通过0.2μm的聚碳酸酯膜过滤除去，即得透明的6-香豆素标记的功能化纳米胶束。其中，载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的混合物；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的投料摩尔比为1∶1∶0.4；6-香豆素和载体的投料质量比为1∶200。

6-香豆素标记的抗耐药纳米胶束的方法：与6-香豆素标记的功能化纳米胶束的制备的方法中所述步骤基本相同，不同的是：所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；载体中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1∶1。

6-香豆素标记的普通纳米胶束的方法：与6-香豆素标记的功能化纳米胶束的制备的方法中所述步骤基本相同，不同的是：所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

罗丹明123标记的功能化纳米胶束的方法：将罗丹明123(购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为R8004)和载体置于茄形瓶中，再向其中加入甲醇，使罗丹明123和载体溶解于甲醇中，旋转蒸发37℃真空干燥除去甲醇，并使所述罗丹明123和所述载体的混合物在茄形瓶底部及内壁形成一层薄薄的均匀膜。再向茄形瓶中加入pH值为7.4的HEPES缓冲液，进行水化处理(即在60℃水浴中振摇30min)，得到水化处理产物(即罗丹明123标记的功能化纳米胶束溶液)，冷却至室温，水化处理产物中过量的罗丹明123通过0.2μm的聚碳酸酯膜过滤除去，即得透明的罗丹明123标记的功能化纳米胶束。其中，载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的混合物；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的投料摩尔比为1∶1∶0.4；罗丹明123和载体的投料质量比为1∶200。

罗丹明123标记的抗耐药紫杉醇纳米胶束的方法：与罗丹明123标记的功能化纳米胶束的制备的方法中所述步骤基本相同，不同的是：所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；载体中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1∶1。

罗丹明123标记的普通紫杉醇纳米胶束的方法：与罗丹明123标记的功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法中所述步骤基本相同，不同的是：所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

DiR标记的功能化纳米胶束的方法：将DiR(购自美国Biotium公司，产品目录号为60017)和载体置于茄形瓶中，再向其中加入甲醇，使DiR和载体溶解于甲醇中，旋转蒸发37℃真空干燥除去甲醇，并使所述DiR和所述载体的混合物在茄形瓶底部及内壁形成一层薄薄的均匀膜。再向茄形瓶中加入pH值为7.4的HEPES缓冲液，进行水化处理(即在60℃水浴中振摇30min)，得到水化处理产物(即DiR标记的功能化纳米胶束溶液)，冷却至室温，水化处理产物中过量的DiR通过0.2μm的聚碳酸酯膜过滤除去，即得透明的DiR标记的功能化纳米胶束。其中，载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的混合物；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的投料摩尔比为1∶1∶0.4；DiR和载体的投料质量比为1∶50。

DiR标记的抗耐药纳米胶束的方法：与DiR标记的功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法中所述步骤基本相同，不同的是：所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；载体中聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1∶1。

DiR标记的普通纳米胶束的方法：与DiR标记的功能化紫杉醇纳米胶束的制备的方法中所述步骤基本相同，不同的是：所用的载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

实施例2、紫杉醇纳米胶束的功能

一、本实施例中所用细胞的培养方法

人源乳腺癌MCF-7细胞使用的培养基为细胞培养基I。耐药人源乳腺癌MCF-7/Adr细胞使用的培养基为细胞培养基II(1μM阿霉素保持耐药性)，在实验一周前换成细胞培养基I培养。

人结肠腺癌Caco-2细胞使用的培养基为细胞培养基III。

所有细胞的培养条件为37℃、5％CO2培养箱中培养。

细胞培养基I：由RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素组成，其配比为：RPMI-1640细胞培养基∶胎牛血清∶青霉素∶链霉素＝1ml∶0.1ml∶100U∶100μg。

细胞培养基II：由RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素和阿霉素组成，其配比为：RPMI-1640细胞培养基∶胎牛血清∶青霉素∶链霉素∶阿霉素＝1ml∶0.1ml∶100U∶100μg∶1μmol。

细胞培养基III：由MEM细胞培养基、胎牛血清、非必须氨基酸、青霉素和链霉素组成，MEM细胞培养基、胎牛血清、非必须氨基酸、青霉素和链霉素＝1ml∶0.15ml∶0.01ml∶100U∶100μg。

二、对乳腺癌细胞的抑制效应

紫杉醇干粉是原料药，紫杉醇干粉悬浮液是紫杉醇的水溶液；游离紫杉醇指的是紫杉醇溶于二甲基亚砜中，给予细胞时，用无血清培养液稀释100倍。

消化对数生长期的MCF-7和MCF-7/Adr细胞，用培养基洗涤2遍，以5000个/孔的量接种到96孔板上，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h。按下面的步骤加药。下述内容括号中的浓度都指加到96孔板中被稀释后的终浓度。

(a)取不加药等量培养基，加入到96孔培养板中，作为空白对照；

(b)加入一系列浓度的游离紫杉醇(0.0001-5μM)；

(c)加入一系列浓度的泰素(0.0001-5μM)；

(d)加入一系列浓度的普通紫杉醇纳米胶束(0.0001-5μM)；

(e)加入一系列浓度的抗耐药紫杉醇纳米胶束(0.0001-5μM)；

(f)加入一系列浓度的功能化紫杉醇纳米胶束(0.0001-5μM)；

加药后的96孔培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱中，继续孵育48h。细胞培养结束后，取出培养板，移去培养孔中的培养液，每孔加入10％预冷的三氯乙酸(TCA)200μL，在4℃冰箱中放置1h固定细胞。然后用蒸馏水洗涤5遍，以去除TCA，在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB(购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为S9012)100μL，室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，以去除未结合的染料，空气中干燥后每孔加入10mmol/L Tris base(三羟甲基胺基甲烷)200μL溶解，在平板振荡器上振荡30min，至染料全部溶解。在酶标仪于540nm波长处测定光密度值(0D)。用经过加药培养以后细胞的存活百分数(Survival rate，％)来评价各种紫杉醇纳米胶束对细胞的毒性作用。细胞存活百分数按照下式计算：

抑制率＝1-细胞存活率。

图2A和2B分别代表五种不同的紫杉醇制剂对MCF-7和MCF-7/Adr细胞的抑制效应。对于MCF-7细胞，在紫杉醇浓度为0.01μM时，游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束对MCF-7细胞增殖的抑制率分别为19.65％、33.43％、34.94％、38.17％和43.33％，五种紫杉醇制剂均具有明显的抑制效应，其中功能化紫杉醇纳米胶束具有最强的抑制效应。对于耐药的MCF-7/Adr细胞，在紫杉醇浓度为1.0μM时，游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束对MCF-7/Adr细胞增殖的抑制率分别为11.21％、42.97％、14.56％、63.89％和82.73％。游离紫杉醇和普通紫杉醇纳米胶束对MCF-7/Adr细胞的增殖几乎没有抑制作用；而功能化紫杉醇纳米胶束具有最强的抑制效应；泰素也有一定的抑制作用，但效果不如抗耐药紫杉醇纳米胶束或功能化紫杉醇纳米胶束。

三、乳腺癌细胞的摄取

消化对数生长期的MCF-7或MCF-7/Adr细胞，制成细胞悬液，以4×10⁵个cells/孔的量接种到6孔板上，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；向培养板的孔中分别加入游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束、功能化紫杉醇纳米胶束，上述制剂中紫杉醇的浓度为10.0uM，每个剂型设有三个复孔；将加入不同紫杉醇剂型的培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱中，分别孵育0.5h、1h、2h、4h、6h；孵育结束后，加入预冷(4℃)的PBS溶液终止细胞摄取，然后快速清洗3遍；每孔加入600ul 0.25％胰酶，室温消化2min，吸掉消化液；每孔加入1.5ml PBS溶液终止消化，吹打贴壁细胞，收集细胞至1.5ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；每个离心管中加入0.5ml甲醇溶液，冰水浴中探头超声(工作时间3s，间歇时间3s，全程时间1min，功率400W)破碎细胞。一部分10000rpm离心10min，上清液测定紫杉醇含量；一部分用BCA法测定蛋白含量。将每孔紫杉醇含量除以相应孔的总蛋白含量，用以消除每孔细胞数量所带来的误差。

细胞内紫杉醇的摄取量的计算公式：

采用激光共聚焦法研究乳腺癌细胞对罗丹明-123标记的纳米胶束的定性摄取。将MCF-7或MCF-7/Adr细胞接种于玻底培养皿中，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；加入游离罗丹明-123、罗丹明-123标记的普通紫杉醇纳米胶束、罗丹明-123标记的抗耐药紫杉醇纳米胶束、罗丹明-123标记的功能化紫杉醇纳米胶束(罗丹明-123浓度为10μM)，置二氧化碳培养箱中，37℃培养2小时，依次用冰冷PBS漂洗三次，然后用Hoechst333342(10μM)进行细胞核染色30min，PBS漂洗三次。用激光共聚焦显微镜进行图像分析。

图3中，(A)MCF-7细胞对五种紫杉醇制剂在不同时间的摄取；(B)MCF-7/Adr细胞对五种紫杉醇制剂在不同时间的摄取；(C)激光共聚焦显微镜观察MCF-7细胞在2h时对各种罗丹明-123制剂的摄取；(D)激光共聚焦显微镜观察MCF-7/Adr细胞在2h时对各种罗丹明-123制剂的摄取.

图3C和3D分别为MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞在2h时对游离罗丹明-123(a)、罗丹明-123标记的普通紫杉醇纳米胶束(b)、罗丹明-123标记的抗耐药紫杉醇纳米胶束(c)和罗丹明-123标记的功能化紫杉醇纳米胶束(d)摄取的激光共聚焦结果。其中，a1-d1：蓝色指的是Hoechst 33342染色的MCF-7细胞或MCF-7/Adr细胞的细胞核；a2-d2：绿色指的是分别给予MCF-7细胞或MCF-7/Adr细胞游离罗丹明-123(a2)、罗丹明-123标记的普通紫杉醇纳米胶束(b2)、罗丹明-123标记的抗耐药紫杉醇纳米胶束(c2)和罗丹明-123标记的功能化紫杉醇纳米胶束(d2)后，细胞内罗丹明-123的荧光；a3-d3：1和2的叠力和图像。

从图3A和3B中可以看出，随着孵育时间的延长，细胞内紫杉醇的量增加。在孵育时间为6h时，MCF-7细胞给予泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束后，细胞内紫杉醇的摄取量比游离紫杉醇分别提高了4.9，7.5，12.6和13.0倍，此时游离紫杉醇组细胞内紫杉醇的摄取量为0.93μg/mg蛋白。相比之下，MCF-7/Adr细胞给予泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束后，细胞内紫杉醇的摄取量比游离紫杉醇分别提高了16.9，2.9，41.2和45.1倍，此时游离紫杉醇组细胞内紫杉醇的摄取量为0.05μg/mg蛋白。MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞对功能化紫杉醇纳米胶束的摄取量最大。

图3C和3D表明，对于MCF-7细胞，亲水的游离罗丹明-123易扩散进入MCF-7细胞，导致明显的细胞内聚集；在三种罗丹明-123标记的纳米胶束中，给予罗丹明-123标记的功能化紫杉醇纳米胶束的MCF-7细胞内荧光最强。然而，对于MCF-7/Adr细胞，游离罗丹明-123的荧光强度最弱；在三种罗丹明-123标记的紫杉醇纳米胶束中，给予罗丹明-123标记的功能化紫杉醇纳米胶束的MCF-7/Adr细胞内荧光最强。这些结果与细胞摄取的定量结果一致。

四、纳米胶束在细胞器内分布

采用激光共聚焦显微镜观察6-香豆素标记的纳米胶束在MCF-7或MCF-7/Adr活细胞细胞器内的分布。将MCF-7或MCF-7/Adr细胞接种于玻底培养皿中，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；加入游离6-香豆素、6-香豆素标记的普通紫杉醇纳米胶束、6-香豆素标记的抗耐药紫杉醇纳米胶束、6-香豆素标记的功能化紫杉醇纳米胶束(6-香豆素浓度为1.0μM)，置二氧化碳培养箱中，37℃培养4小时；依次用冰冷PBS漂洗三次；然后分别用溶酶体红色荧光探针(50nM Lyso Tracker Red DND-99)染色溶酶体、线粒体体红色荧光探针(200nM Mito Tracker Deep Red FM)染色线粒体、内质网红色荧光探针(1μM ER Tracker Red)染色内质网和高尔基体红色荧光探针(5μM

TR ceramide complexed to BSA)染色高尔基体，PBS漂洗三次；用Hoechst333342(10μM)进行细胞核染色30min，PBS漂洗三次。用激光共聚焦显微镜进行图像分析。

图4为纳米胶束在MCF-7细胞(A)和MCF-7/Adr细胞(B)中亚细胞器的分布。

说明：a-d：蓝色指的是Hoechst 33342染色的MCF-7细胞或MCF-7/Adr细胞的细胞核；绿色指的是分别给予MCF-7细胞或MCF-7/Adr细胞游离6-香豆素(a1-a4)、6-香豆素纳米胶束(b1-b4)、抗耐药6-香豆素纳米胶束(c1-c4)和功能化6-香豆素纳米胶束(d1-d4)后，细胞内6-香豆素的荧光；a1-d1：红色指的是溶酶体红色荧光探针染色后的溶酶体；a2-d2：红色指的是线粒体红色荧光探针染色后的线粒体；a3-d3：红色指的是内质网红色荧光探针染色后的内质网；a4-d4：红色指的是高尔基体红色荧光探针染色后的高尔基体。

图4A和4B分别为MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞给予游离6-香豆素和6-香豆素纳米胶束后的激光共聚焦结果。溶酶体、线粒体、内质网和高尔基体经细胞器特异性性染料标记为红色，游离6-香豆素和三种6-香豆素纳米胶束呈绿色，各种细胞器和纳米胶束共定位时呈现黄色，不共定位时呈现红色。从结果可以看出，MCF-7和MCF-7/Adr细胞给予游离6-香豆素后，6-香豆素的绿色荧光和各种细胞器的红色荧光完全分离不重合，表明游离6-香豆素没有分布在溶酶体、线粒体、内质网和高尔基体(图4A，a1-a4；图4B，a1-a4)；6-香豆素标记的三种纳米胶束也没有分布在溶酶体(图4A，b1-d1；图4B，b1-d1)，但是选择性地累积进入内质网(图4A，b3-d3；图4B，b3-d3)和高尔基体图4A，b4-d4；图4B，b4-d4)；相比之下，唯有功能化的6-香豆素纳米胶束特异性地累积进入线粒体(图4A，d2；图4B，d2)。

五、对乳腺癌肿瘤球的抑制效应

(一)方法

肿瘤球的建立：配制浓度为20g/L的琼脂糖凝胶水溶液。将一定量的琼脂糖溶于一定量的无血清RPMI 1640培养液中，在80℃的水浴中静置30min；采用悬滴法(hanging-drop方法)来制备相似大小和细胞数的多细胞肿瘤球；48-well培养板每孔中加入200μl琼脂糖凝胶水溶液，冷却凝固后，加入900ul培养基(即上述细胞培养基I)；盖子上每孔滴加20ul的细胞悬液(含有500个细胞)，盖上盖子，置于37℃、5％CO₂培养箱中，继续孵育72h。转移到48-well培养板孔中，培养两天。

抑制肿瘤球生长实验：向含肿瘤球的48-well培养板的孔中分别加入无血清RPMI1640培养液、游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束、功能化紫杉醇纳米胶束，上述制剂中紫杉醇在孔中的浓度为5uM。加药后的48孔培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱中，继续孵育；观测肿瘤球在上述条件下的生长情况。记录每天肿瘤球的最长和最短球径，记录的天数为给药后的第1、2、3、4、5天；计算抑制肿瘤球生长的公式：V＝(∏×d_max×d_min)/6，其中，d_max为大直径；d_min为小直径；肿瘤球抑制率％＝[(V_dayi/V_day0)-1]×100％，其中V_dayi代表加药后孵育的第i天肿瘤球的体积；V_day0代表加药前肿瘤球的体积。

肿瘤球体积变化率的计算公式：肿瘤球体积变化率＝(V_dayi/V_day0)×100％

肿瘤球的电镜照片：向含肿瘤球的48-well培养板的孔中分别加入无血清RPMI1640培养液、游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束、功能化紫杉醇纳米胶束，上述制剂中紫杉醇在孔中的浓度为5uM。加药后的48孔培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱中，继续孵育。肿瘤球与各种紫杉醇制剂孵育后第三天，取出孵育的肿球，将其用2.5％的戊二醛溶液固定60min，再用0.1M的磷酸盐缓冲液漂洗3次，然后脱水和固定。最后，用扫描电镜观测肿球，并拍摄照片。

激光共聚焦观察胶束穿透肿瘤球的能力：向含肿瘤球的48-well培养板孔中分别加入游离罗丹明-123、罗丹明-123标记的普通紫杉醇纳米胶束、罗丹明-123标记的抗耐药紫杉醇纳米胶束、罗丹明-123标记的功能化紫杉醇纳米胶束，上述制剂中罗丹明-123的浓度为10uM。加药后的48孔培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱中，继续培养12h；将肿瘤球转移到玻底皿中，每组5个肿瘤球，用新鲜培养液洗涤三次，每皿再加入100ul新鲜培养液；对于每个肿瘤球，从肿瘤球顶部到中央以10μm的间隔进行光切，研究不同层面的罗丹明-123荧光强度。

(二)结果

结果如图5所示。

(A)五种不同的紫杉醇制剂对MCF-7肿瘤球的抑制效应；(B)五种不同的紫杉醇制剂对MCF-7/Adr肿瘤球的抑制效应；(C)给予MCF-7肿瘤球五种紫杉醇制剂后第三天的扫描电镜照片；(D)给予MCF-7/Adr肿瘤球五种紫杉醇制剂后第三天的扫描电镜照片；(E)给予MCF-7肿瘤球各种罗丹明-123制剂后12h的激光共聚焦层切照片；(F)给予MCF-7/Adr肿瘤球各种罗丹明-123制剂后12h的激光共聚焦层切照片。

图5A和5B中，给予游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束后，MCF-7肿瘤球在第5天的肿瘤球体积变化率分别为85.9±3.1％，61.9±3.0％，34.5±0.6％，25.4±2.9％和14.2±0.2％(肿瘤球体积变化率越低表明药物效果越好；在用药期间，肿瘤变小了，文中数据代表肿瘤球体积变为用药开始时的百分之多少)。对于耐药的MCF-7/Adr肿瘤球，给予游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束后，MCF-7肿瘤球在第5天的肿瘤球体积变化率分别为188.7±9.0％，74.0±5.3％，73.4±4.0％，43.7±10.7％和23.3±1.0％。在所有含紫杉醇的制剂中，功能化紫杉醇纳米胶束具有最强的抑制体外MCF-7和MCF-7/Adr肿瘤球生长作用。

图5C和5D中，给予游离紫杉醇，MCF-7肿瘤球的表面细胞死亡，出现凹孔(图5C b1，b2，图5C a1，a2)，而MCF-7/Adr肿瘤球几乎没有变化(图5D b1，b2)；给予泰素，MCF-7肿瘤球或MCF-7/Adr肿瘤球的表面出现更多凹孔(图5C c1，c2；图5D c1，c2)；给予普通紫杉醇纳米胶束，MCF-7肿瘤球和MCF-7/Adr肿瘤球严重受损，肿瘤球表面更多细胞死亡(图5C d1，d2；图5D d1，d2)；给予抗耐药紫杉醇纳米胶束，MCF-7肿瘤球和MCF-7/Adr肿瘤球部分倒塌(图5C e1，e2；图5D e1，e2)；给予功能化紫杉醇纳米胶束，MCF-7肿瘤球和MCF-7/Adr肿瘤球失去三维结构而瓦解(图5C f1，f2；图5D f1，f2)。图5C和5D中，a为给予无血清RPMI 1640培养液，b为给予游离紫杉醇，c为给予泰素，d为给予普通紫杉醇纳米胶束，e为给予抗耐药紫杉醇纳米胶束，f表示给予功能化紫杉醇纳米胶束，1表示放大×300倍，2表示放大×5000倍。

图5E和5F，对于MCF-7肿瘤球，游离罗丹明-123、罗丹明-123标记的普通紫杉醇纳米胶束、罗丹明-123标记的抗耐药罗丹明-123纳米胶束分别可以穿透到距离肿瘤球顶部30um、50um和70um的深度；罗丹明-123标记的功能化紫杉醇纳米胶束可以穿透到肿瘤球的正中心(距离肿瘤球顶部80um)。对于MCF-7/Adr肿瘤球，游离罗丹明-123和罗丹明-123标记的普通紫杉醇纳米胶束的穿透力也很弱，只是在肿瘤球边缘看到微弱的罗丹明-123荧光；罗丹明-123标记的抗耐药罗丹明-123纳米胶束和功罗丹明-123标记的功能化紫杉醇纳米胶束分别可以穿透到距离肿瘤球顶部50um和70um的深度。

六、紫杉醇纳米胶束透过Caco-2细胞单层机理

Caco-2细胞单层做为胃肠道屏障的体外模型，来评价各种紫杉醇剂型的吸收特性。消化对数生长期的Caco-2细胞，制成细胞悬液3.0×10⁵个cells/ml，向

细胞板的顶端加入0.5ml已充分混合的细胞悬液，底端加入1.5ml细胞培养液，将Transwell放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。前两周隔天换液(顶端0.5ml和底端1.5ml)，此后每天换液。经过21天培养，细胞单层用于实验。

实验前，Caco-2细胞单层用Hank’s平衡盐溶液在37℃洗涤两次。测定细胞单层的跨膜电阻值，只有电阻值大于800Ωcm²的细胞单层用于实验。实验过程中，于设定的时间点测定电阻值。

为了评估各种紫杉醇制剂对紫杉醇跨过Caco-2细胞单层的转运，向底端加入1.5ml Hank’s平衡盐溶液，向顶端分别加入0.5ml的游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束制剂，其中紫杉醇在

细胞板的顶端中的浓度为5.0uM，置于37℃培养箱中孵育。分别于15、30、60、90、120、150和180min时从底端取出0.5ml样品，并每次取样后立即补入同等体积的新鲜Hank’s平衡盐溶液。透过样品2.5ml，加入2.5ml甲醇，涡旋1min，10000rpm离心5min，取上清，50℃水浴下氮气吹干，残渣以200μl甲醇复溶，涡旋1min，10000rpm离心5min，上清液进样HPLC测定紫杉醇含量。表观透过系数按下式计算：P_app＝dQ/dt×1/(AC₀)，其中dQ/dt为透过速率，C₀为紫杉醇制剂在顶端的初始浓度，A为聚碳酯膜的表面积。

紫杉醇累积透过量的计算公式：

$Q=V_e\×\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i+V_0\×C_n$

其中，V_e为置换体积；C_i为第i次置换取样时

细胞板底端的溶液中紫杉醇的浓度；V₀为

细胞板底端加入的Hank’s平衡盐溶液体积；n为置换次数。

在各种内吞抑制剂存在下进行转运实验，研究普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束的跨膜转运机理。为了抑制能量介导的内吞，细胞单层首先在4℃孵育1h，然后分别加入各种紫杉醇纳米胶束(紫杉醇在

细胞板的顶端中的浓度为5μM)，继续在4℃孵育2h；为了抑制小窝介导的内吞，细胞单层首先与1μg/ml菲律平III(购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为F4767)在37℃孵育1h，然后分别加入各种紫杉醇纳米胶束(1μg/ml菲律平III，紫杉醇浓度为5μM)继续在37℃孵育2h；为了抑制网格蛋白介导的内吞，细胞单层首先与10μg/ml氯丙嗪(购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为C8138)在37℃孵育1h，然后分别加入各种紫杉醇纳米胶束(10μg/ml氯丙嗪，紫杉醇浓度为5μM)继续在37℃孵育2h；为了抑制胆固醇依赖的内吞，细胞单层首先与10mM甲基-β-环糊精(购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为C4555)和1μg/ml洛伐他汀在37℃孵育1h，然后分别加入各种紫杉醇纳米胶束(10mM甲基-β-环糊精，1μg/ml洛伐他汀，紫杉醇浓度为5μM)继续在37℃孵育2h。

为了直接观察是否完整的功能化纳米胶束跨过细胞单层，细胞单层分别与Hank’s平衡盐溶液(作为对照)或功能化纳米胶束在37℃孵育2h。收集底端的透过液，醋酸铀负染，透射电镜观察透过液的大小和形状。

结果如图6所示，(A)不同紫杉醇制剂跨过Caco-2细胞单层的紫杉醇累积透过量；(B)给予Caco-2细胞单层功能化紫杉醇纳米胶束或空白Hank’s平衡盐溶液2h后顶端和底端介质的透射电镜照片；(C)各种内吞抑制剂存在下三种紫杉醇纳米胶束跨Caco-2细胞单层的表观透过系数变化率。

从图6A中可以看出，三种紫杉醇纳米胶束的累积透过量明显提高，而游离紫杉醇的透过量微乎其微。120min时，泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束的表观透过系数值分别是游离紫杉醇的4.9，17.3，18.1和36.4倍；120min时，游离紫杉醇的表观透过系数值为0.37cm/s。

从图6B中可以看出，给予空白Hank’s平衡盐溶液，在Caco-2细胞单层的顶端和底端仅观察到少量蛋白碎片。在顶端给予功能化紫杉醇纳米胶束后，在底端可以观察到直径为15-20nm的球形颗粒，而且底端和顶端观察到的颗粒粒径相同。结果表明，功能化紫杉醇纳米胶束经过完整的胞吞和胞吐过程而跨过Caco-2细胞单层。

从图6C中可以看出，转运过程中，加入各种内吞抑制剂后，显示出了明显的抑制效应。不加入任何内吞抑制剂的条件下，普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束相应的表观透过系数分别为6.5±1.4、6.8±1.8和13.6±0.3。加入不同的内吞抑制剂后，普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束相应的表观透过系数变化率如下：4℃条件下，22.9±3.4％，28.5±2.6％和15.7±5.0％；在小窝介导的内吞抑制剂条件下，49.1±10.1％，66.5±5.0％和40.4±5.9％；在网格蛋白介导的内吞抑制剂条件下，73.2±10.7％，73.7±9.7％和62.4±9.6％；在消除胆固醇条件下，34.3±5.7％，61.7±2.9％和36.2±4.0％。

紫杉醇透过系数变化率的公式(即图6C的纵坐标的计算公式)：

七、紫杉醇纳米胶束透过外翻小肠囊

健康雄性SD大鼠(起始体重约230-250g)，购自于北京大学医学部实验动物中心。所有动物实验均按照国际动物实验的指导标准进行。外翻小肠囊实验用于评价各种紫杉醇制剂跨过小肠的转运情况。实验前将大鼠禁食12-16h，不禁水，用20％的乌拉坦腹腔注射麻醉。沿腹中线打开腹腔，剪下实验的肠段，去除肠系膜，在37℃的通氧气TC199培养液中冲洗干净，一端用棉线扎紧，用细玻璃棒轻柔地将肠管翻转使黏膜面朝外。8cm长的肠段一段用棉线扎紧，用注射器向肠内注满TC199培养液，另一端扎紧个取样针，然后将其放入三颈烧瓶中，取样针端液面高于体系液面，在烧瓶中通入气体(95％O₂及5％CO₂)，整个装置放入37℃恒温水浴中，10min预培养后，分别加入游离紫杉醇、泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束或功能化紫杉醇纳米胶束(紫杉醇在肠囊外液体中的终浓度为5.0μM)，振荡。分别于15、30、60、90、120、150和180min时从肠内取出0.5ml样品，并每次取样后立即补入同等体积的新鲜TC199培养液。透过样品2.5ml，加入2.5ml甲醇，涡旋1min，10000rpm离心5min，取上清，50℃水浴下氮气吹干，残渣以200ul甲醇复溶，涡旋1min，10000rpm离心5min，上清液进样HPLC测定紫杉醇含量。表观透过系数按下式计算：P_app＝dQ/dt×1/(AC₀)，其中dQ/dt为透过速率，C₀为紫杉醇制剂在黏膜侧的初始浓度，A为小肠的面积。

为了直接观察是否完整的功能化紫杉醇纳米胶束跨过外翻小肠囊，充满TC199培养液的外翻小肠囊分别与TC199培养液(作为对照)或功能化紫杉醇纳米胶束在37℃孵育2h。收集浆膜侧的液体，醋酸铀负染，透射电镜观察透过液的大小和形状。

紫杉醇累积透过量的计算公式：

$Q=V_e\×\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i+V_0\×C_n$

其中，V_e为置换体积；C_i为第i次置换取样时小肠囊内溶液中紫杉醇的浓度；V₀为小肠囊内加入的空白TC199培养液的体积；n为置换次数。

图7中，(A)不同紫杉醇制剂跨过外翻小肠囊的紫杉醇累积透过量；(B)给予外翻小肠囊功能化紫杉醇纳米胶束或空白TC199培养液2h后黏膜侧和浆膜侧介质的透射电镜照片。

从图7A中可以看出，除游离紫杉醇外，泰素和三种紫杉醇纳米胶束的累积透过量随孵育时间的延长而明显提高。120min时，泰素、普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束和功能化紫杉醇纳米胶束的紫杉醇表观透过系数值分别是游离紫杉醇的4.5，27.5，34.2和52.9倍。120min时，游离紫杉醇组的紫杉醇表观透过系数值为0.50cm/s。

从图7B中可以看出，与Caco-2细胞单层的结果相同，在黏膜侧给予功能化紫杉醇纳米胶束后，在浆膜侧可以观察到直径为15-20nm的球形颗粒，而且浆膜侧和黏膜侧观察到的颗粒粒径相同。结果表明，功能化紫杉醇纳米胶束可以完整地跨过外翻小肠囊。

八、体内抗耐药性乳腺癌移植瘤效应

雌性BALB/c裸鼠(体重16-18g)购自北京大学医学部实验动物中心，动物在无菌条件下饲养，无菌条件下操作。将1.0×10⁷个MCF-7/Adr细胞混悬于200μl无血清培养基中，皮下注射到裸鼠腋下。每天观察裸鼠的腋下肿瘤生长情况，并且记录肿瘤的体积。大概接种肿瘤细胞第19天后，肿瘤体积达到150～180mm³，可以给药治疗。将接种后的裸鼠随机分成5组，每组6只。在给裸鼠接种MCF-7/Adr细胞后的第20、22、24、26、28和30天，分别给予生理盐水、尾静脉注射泰素、口服泰素、尾静脉注射功能化紫杉醇纳米胶束或口服功能化紫杉醇纳米胶束。紫杉醇剂量为10mg/kg。每天测量肿瘤的大小和裸鼠体重。肿瘤体积(V)用下面公式计算：V＝长×宽²/2(mm³)。各处理组的荷瘤裸鼠在肿瘤接种后第35天处死，测量肿瘤的长和宽，采用下式计算给药后的肿瘤抑制率：肿瘤抑制率(％)＝100％-(给药组肿瘤体积/空白组肿瘤体积)×100％。裸鼠体重的变化来评价各个给药组的毒性。

在裸鼠体内建立MCF-7/Adr移植瘤模型，功能化紫杉醇纳米胶束口服给药后对移植瘤模型的治疗效果如图8A所示。从图中可以看出，泰素对耐药性乳腺癌具有很小的抑制效应，第35天泰素尾静脉注射组和口服组肿瘤的体积抑制率分别为25.7％和13.7％。相比之下，功能化紫杉醇纳米胶束对耐药性乳腺癌具有明显的肿瘤抑制活性，第35天功能化紫杉醇纳米胶束尾静脉注射组和口服组肿瘤的体积抑制率分别为83.7％和75.2％。

给药期间荷瘤裸鼠的体重变化如图8B所示。泰素尾静脉注射组和口服组裸鼠的体重明显低于功能化紫杉醇纳米胶束尾静脉组和口服组，说明功能化紫杉醇纳米胶束能一定程度地降低化疗药物的毒性。功能化紫杉醇纳米胶束口服组裸鼠的体重并没有显著下降，说明该胶束在裸鼠体内毒性较低。

九、荷瘤裸鼠的活体成像

采用活体成像来观察DiR标记的功能化紫杉醇纳米胶束在荷MCF-7/Adr移植瘤裸鼠体内的分布和肿瘤蓄积能力。将1.0×10⁷个MCF-7/Adr细胞混悬于200μl无血清培养基中，皮下注射到裸鼠腋下。当肿瘤体积达到500mm³，分别给予生理盐水、尾静脉注射游离DiR，尾静脉注射DiR标记的功能化紫杉醇纳米胶束，口服游离DiR，口服DiR标记的功能化紫杉醇纳米胶束。DiR剂量为2.0mg/kg。照射前2分钟腹腔注射戊巴比妥(剂量60mg/kg)以进行麻醉，分别在给药后0.5h，1h，3h，6h，12h和24h，采用Kadak多光谱活体成像系统照相。24h后，脱臼处死，立即解剖出心、肝、脾、肺、肾、肠和肿瘤，对不同组织进行成像。

图9中，(A)尾静脉注射DiR标记的功能化纳米胶束后裸鼠体内的荧光分布；(B)尾静脉注射DiR标记的功能化纳米胶束24后肿瘤和组织的体外成像；(C)口服DiR标记的功能化纳米胶束后裸鼠体内的荧光分布；(D)口服DiR标记的功能化纳米胶束24后肿瘤和组织的体外成像。

DiR标记的功能化紫杉醇纳米胶束在荷MCF-7/Adr移植瘤裸鼠体内的分布和肿瘤蓄积能力如图9所示。尾静脉注射和口服给予DiR标记的功能化紫杉醇纳米胶束(图9A和图9C)后0.5h时，可以在裸鼠体内观察到强烈的DiR荧光信号，而且在肿瘤组织的荧光信号可以持续到24h。相反，尾静脉注射和口服给予游离DiR染料(图9A和图9C)，肿瘤组织没有明显的荧光信号。给药24h后，解剖出心、肝、脾、肺、肾、肠和肿瘤组织的体外成像结果见图9B和图9D。结果表明，无论是静脉还是口服给予DiR标记的功能化纳米胶束，在肿瘤组织均观察到最强的荧光信号。

本实施例中上述各实验结果都是实施例1中实验二的制备方法中方法I得到的普通紫杉醇纳米胶束、抗耐药紫杉醇纳米胶束、功能化紫杉醇纳米胶束的结果。

用实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的功能化紫杉醇纳米胶束分别进行本实施例中上述各实验，实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的功能化紫杉醇纳米胶束的结果与方法I得到的功能化紫杉醇纳米胶束的结果无显著差异。

用实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的抗耐药紫杉醇纳米胶束分别进行本实施例中上述各实验，实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的抗耐药紫杉醇纳米胶束的结果与方法I得到的抗耐药紫杉醇纳米胶束的结果无显著差异。

用实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的普通紫杉醇纳米胶束分别进行本实施例中上述各实验，实施例1中实验二的制备方法中方法II和III制备得到的普通紫杉醇纳米胶束的结果与方法I得到的普通紫杉醇纳米胶束的结果无显著差异。

Claims (10)

1.一种紫杉醇纳米胶束，为如下1)或2)或3)所示：

1)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的混合物；

2)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的混合物；

3)由载体和紫杉醇制备而成；所述载体为聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

2.根据权利要求1所述的紫杉醇纳米胶束，其特征在于：

1)中，所述紫杉醇和载体的投料质量比为1∶20至1∶40，优选为1∶28；

2)中，所述紫杉醇和载体的投料质量比为1∶20至1∶40，优选为1∶28；

3)中，所述紫杉醇和载体的投料质量比为1∶40至1∶60，优选为1∶50。

3.根据权利要求1或2所述的紫杉醇纳米胶束，其特征在于：

1)中，所述载体中，所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯和地喹氯铵的投料摩尔比为1∶(0.5-3)∶(0.2-0.5)，优选1∶1∶0.4。

2)中，所述载体中，所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1∶(0.5-3)，优选1∶1。

4.根据权利要求1或2或3所述的紫杉醇纳米胶束，其特征在于：

所述1)、2)和3)中，

所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的分子式为C₁₃₅H₂₆₈NO₅₆P，分子结构式如式II所示：

(式II)

所述聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯的分子式为(C₂H₄O)₂₃C₃₃H₅₄O₅，分子结构式如式III所示：

(式III)

所述地喹氯铵的分子式为C₃₀H₄₀C₁₂N₄，分子结构式如式IV所示：

(式IV)

所述紫杉醇的分子式为C₄₇H₅₁NO₁₄，分子结构式如式I：

(式I)

5.根据权利要求1-4中任一所述的紫杉醇纳米胶束，其特征在于：所述1)、2)和3)中，所述制备的方法包括如下步骤：将所述紫杉醇和所述载体置于容器中，再向其中加入甲醇，使所述紫杉醇和所述载体溶解于所述甲醇中，再去除甲醇并使所述紫杉醇和所述载体的混合物在所述容器壁上形成薄膜，再向所述容器中加入pH7.0-7.5的缓冲液，水化处理，得到水化处理产物，即得到所述紫杉醇纳米胶束。

6.根据权利要求1-5中任一所述的紫杉醇纳米胶束，其特征在于：所述制备的方法中，所述水化处理的方法为将装有所述薄膜和所述缓冲液的容器在60℃振摇30min；

所述制备的方法中，所述缓冲液为HEPES缓冲液；

和/或，所述HEPES缓冲液由10mM HEPES、145mM NaCl和水组成，水补足体积；所述HEPES缓冲液的pH值为7.4。

7.根据权利要求1-6中任一所述的紫杉醇纳米胶束，其特征在于：所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束的平均粒径分别为15.51±0.58nm，15.94±0.29nm和15.77±0.77nm；

所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束的粒径的多分散系数分别为0.14±0.04，0.19±0.08和0.18±0.04。

8.根据权利要求1-7中任一所述的紫杉醇纳米胶束，其特征在于：所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束的Zeta电位分别为-5.4mV，-3.7mV和1.6mV；

和/或，所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束的载药量分别为1.57±0.15％，2.55±0.03％和2.58±0.18％；

和/或，所述3)、2)和1)所示紫杉醇纳米胶束中紫杉醇的含量分别为987±21μg/ml，1456±33μg/ml，1502±17μg/ml。

9.权利要求1-8中任一所述紫杉醇纳米胶束在制备抑制肿瘤的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抑制肿瘤为抑制肿瘤的增殖和/或抑制肿瘤细胞的存活；

和/或，所述抑制肿瘤的增殖为抑制肿瘤细胞的增殖和/或抑制肿瘤球体积增大和/或促进肿瘤球的瓦解；

和/或，所述肿瘤为乳腺癌；所述乳腺癌的细胞为人源乳腺癌MCF-7细胞或耐药人源乳腺癌MCF-7/Adr细胞。

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