CN102120989B - 一种新型谷氨酰胺转胺酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型谷氨酰胺转胺酶及其应用，属于蛋白质工程技术领域。通过对吸水链霉菌发酵液进行纯化得到了一种能够活化谷氨酰胺转胺酶酶原的新型酶，该酶可用于将谷氨酰胺转胺酶酶原直接转化成活性酶，解决了酶原向酶转化的问题，缩短了发酵时间，提高了发酵产量。
Description
技术领域：
本发明涉及一种新型谷氨酰胺转胺酶及其应用，属于蛋白质工程技术领域。
背景技术：
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，简称TGase，EC 2.3.2.13)，又称转谷氨酰胺酶，是一种催化酰基转移反应的酶。它具有多种催化功能，既可以使蛋白质分子内、分子间交联，也可以使蛋白质和氨基酸连接还可以水解蛋白质分子内的谷氨酰胺，从而改变蛋白质本身以及其所附着细胞和组织等的结构和功能，提高蛋白质的营养价值，被誉为“21世纪超级粘合剂”。成为目前食品加工领域最受关注和应用最为广泛的酶制剂。此外，在生物医药，组织工程，纺织和皮革处理等多个领域也有着潜在应用。
链霉菌产谷氨酰胺转胺酶是目前唯一可以商业化的能够交联蛋白的酶制剂。日本的天野公司已经将该酶推向了市场，获得了巨大的利润，而我国还处于研究阶段。链霉菌谷氨酰胺转胺酶是以酶原的形式分泌到细胞外部，在多种蛋白酶的作用下活化而成的。由于链霉菌产酶和活化机理较为复杂，目前靠菌种的选育和发酵条件以及过程的优化等传统手段来提高谷氨酰胺转胺酶的产量还远远达不到商业化的生产需求。
发明内容：
本发明的目的是提供一种能够活化酶原的谷氨酰胺转胺酶。
本发明的另一个目的是提供所述新型谷氨酰胺转胺酶的应用方法，是将新型酶用于谷氨酰胺转胺酶酶原的活化。
所述新型谷氨酰胺转胺酶的制备方法如下：
1)将发酵液去除菌体得到的上清液经过硫酸铵分级沉淀，收集蛋白沉淀溶解后进行透析；
2)将透析后的酶液加入到用pH 7.5的Tris-HCl平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中，用0-1mol/L氯化钠线形梯度洗脱，收集活性部分；
3)将收集的活性部分用硫酸铵浓缩，将浓缩后的酶液加入Superdex 7510/300GL层析柱中，用0.15mol/L氯化钠洗脱并收集活性部分；
4)将收集到的活性部分加入到用pH 8.5的Tris-HCl平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中，用0-0.4mol/L氯化钠进行线性梯度洗脱，收集洗脱时间20-30min的活性部分。
本发明所述发酵液是指：以吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13作为出发菌株，10％的接种量接菌至发酵培养基中，30℃，200r/min培养60h，得到含谷氨酰胺转胺酶的发酵液。吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13已在中国专利ZL03152956.9公开，授权公告号CN 1208452C，授权公告日2005年6月29日。
本发明通过对吸水链霉菌WSH03-13的发酵液的分离纯化发现了一种新型谷氨酰胺转胺酶，该酶具有能够活化酶原的特性，可用于将谷氨酰胺转胺酶的酶原直接转化成活性酶，解决了酶原向酶转化过程中的问题，缩短了发酵时间，提高了发酵产量。
附图说明：
图1.谷氨酰胺转胺酶分离纯化全过程的SDS-PAGE电泳图
1、蛋白分子量标准；2、发酵上清液；3、盐析后的酶液；4、第一次离子交换后的酶液；5、Superdex 75凝胶过滤后的酶液；6、谷氨酰胺转胺酶A；7、谷氨酰胺转胺酶B
图2.TGase B和酶原(Pro-TGase)混合物随时间的酶活变化曲线
图3.TGase B和酶原(Pro-TGase)混合物随时间的SDS-PAGE电泳分析
1：分子量标准；2-9：分别为培养0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h的混合物
具体实施方式：
材料和检测方法
吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，已在中国专利ZL03152956.9公开，授权公告号CN 1208452C，授权公告日2005年6月29日
发酵培养基：糊精20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，CaCl21g/L，MgSO42g/L，K2HPO42g/L，KH2PO42g/L(pH 7.0)。
谷氨酰胺转胺酶活力测定方法：以L-谷氨酸-γ-单羟肟酸为标准品作标准曲线。恒温水浴锅调到37℃，将底物(Z-Gln-Gly和羟胺)和待测样品(40μL)放入水浴锅预热10min，在样品中加入100μL底物，反应10min，然后加40μL终止剂(三氯乙酸和三氯化铁)终止反应。取出样品，8000×g离心5min，在562nm下用蛋白核酸定量测定仪比色测定酶活。酶活力单位定义：该酶在37℃时每分钟催化底物生成1μmol L-谷氨酸-γ-单羟肟酸所需要的酶量。
实施例1：
将吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13以10％的接种量接菌至发酵培养基中，30℃，200r/min培养60h，发酵结束后测定谷氨酰胺转胺酶活力为：2.5U/mg。
实施例2：
(1)硫酸铵沉淀
将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus发酵液离心去除菌体后，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为50％，缓慢搅拌使其完全溶解。调节pH值，使酶液的pH保持在7.5，静置半小时后10000×g低温离心10min，收集上清液继续加入硫酸铵至饱和度为80％，4℃静置数小时后，低温离心收集蛋白沉淀。将沉淀溶解在20mmol/L Tris-HCl pH 7.5的缓冲液中并且4℃透析数小时；
(2)第一次离子交换层析
将透析后的酶液加入到预先用20mmol/L Tris-HCl pH 7.5的缓冲液平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中。用含0-1mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min，检测波长为280nm，收集有活性的部分。
(3)凝胶过滤层析
将收集到的全部活性部分用硫酸铵(饱和度80％)浓缩并用少量Tris-HCl pH 7.5缓冲液溶解，将浓缩后的酶液加入到预先用20mmol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液平衡好的Superdex 7510/300GL层析柱中，用含0.15mol/L氯化钠的相同缓冲液进行洗脱，流速为0.4mL/min，检测波长为280nm，收集有活性的部分；
(4)第二次离子交换层析
将收集到的活性部分经20mmol/L Tris-HCl pH 8.5的缓冲液透析后再次加入到预先用20mmol/L Tris-HCl pH 8.5缓冲液平衡好的Hitrap Q HP离子柱中，用含0-0.4mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，收集洗脱时间22-27min的溶液，即为所制备的新型谷氨酰胺转胺酶。
谷氨酰胺转胺酶分离纯化全过程的SDS-PAGE电泳图见图1。
实施例3：TGase B对酶原的活化作用
将纯化后的酶原Zhang D X，Wang M，Do G C，et al.J.Agric.Food Chem.，2008，56(9)：3403-3408(0.40mg/mL)和TGase B(0.45mg/mL)以5∶1(v/v)的比例混合后，置于37℃水浴锅中培养，分别在不同时间点0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h取样，立即测酶活(见图2)，将各时间点的样品走SDS-PAGE电泳(见图3)。用20mmol/LpH 8.5Tris-HCl缓冲液以相同的比例分别稀释纯化后的酶原和TGase B，然后按上述相同的条件处理，作为对照。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (1)
1.一种新型谷氨酰胺转胺酶用于活化谷氨酰胺转氨酶酶原的用途，其特征是：所述谷氨酰胺转氨酶酶原是吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-01的谷氨酰胺转氨酶酶原；所述新型谷氨酰胺转氨酶是从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵液中纯化得到，其纯化步骤如下：
1）将吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13去除菌体得到的上清液经过硫酸铵分级沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后进行透析；
2）将透析后的酶液加入到用pH7.5的Tris-HCl平衡好的阴离子交换柱HitrapQ HP中，用0-1mol/L氯化钠线性梯度洗脱，收集活性部分；
3）将收集的活性部分用硫酸铵浓缩，将浓缩后的酶液加入Superdex7510/300GL层析柱中，用0.15mol/L氯化钠洗脱并收集活性部分；
4）将收集到的活性部分加入到用pH8.5的Tris-HCl平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中，用0-0.4mol/L氯化钠进行线性梯度洗脱，收集洗脱时间22-27min的活性部分。
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