CN101984052B - 一种谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法 - Google Patents

一种谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，是采用阴离子交换柱分离纯化谷氨酰胺转胺酶，属于生物制品分离纯化技术领域。本发明方法工艺简单，具有较高的得率，所得到的谷氨酰胺转胺酶纯度高。

Description

一种谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法
技术领域
一种谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，本发明涉及一种以阴离子交换层析为主要手段的谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，属于生物制品分离纯化技术领域。 
背景技术
谷氨酰胺转胺酶（Transglutaminase，简称TGase，EC 2.3.2.13），又称转谷氨酰胺酶，是一种催化酰基转移反应的酶。它具有多种催化功能，既可以使蛋白质分子内、分子间交联，也可以使蛋白质和氨基酸连接还可以水解蛋白质分子内的谷氨酰胺，从而改变蛋白质本身以及其所附着细胞和组织等的结构和功能，提高蛋白质的营养价值，被誉为“21世纪超级粘合剂”。成为目前食品加工领域最受关注和应用最为广泛的酶制剂。此外，在生物医药，组织工程，纺织和皮革处理等多个领域也有着潜在应用。
       然而，目前在国内食品、生物医药领域应用的谷氨酰胺转胺酶主要购自日本公司，其原因在于日本公司生产的谷氨酰胺转胺酶纯度较高。而本发明旨在开发出一种高纯度、高得率的电泳级谷氨酰胺转胺酶的纯化方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法。
本发明的具体步骤如下：
1）  将发酵液去除菌体得到的上清液经过硫酸铵分级沉淀，收集蛋白沉淀溶解后进行透析；
2）  将透析后的酶液加入到用pH 7.5的Tris-HCl平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中，用0-1 mol/L氯化钠线形梯度洗脱，收集活性部分；
3）  将收集的活性部分用硫酸铵浓缩，将浓缩后的酶液加入Superdex 75 10/300GL层析柱中，用0.15 mol/L氯化钠洗脱并收集活性部分；
4）  将收集到的活性部分加入到用pH 8.5的Tris-HCl平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中，用0-0.4 mol/L氯化钠进行线性梯度洗脱，收集活性部分。
    本发明所述发酵液是指：以吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13作为出发菌株，10%的接种量接菌至发酵培养基中，30℃，200 r/min培养60 h，得到含谷氨酰胺转胺酶的发酵液。吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13已在中国专利ZL03152956.9公开，授权公告号CN 1208452 C，授权公告日2005年6月29日。
  本发明的详细的步骤为：
（1）硫酸铵沉淀
将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus发酵液离心去除菌体后，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为50%，缓慢搅拌使其完全溶解。调节pH值，使酶液的pH保持在7.5，静置半小时后10000×g低温离心10 min，收集上清液继续加入硫酸铵至饱和度为80%，4℃静置数小时后，低温离心收集蛋白沉淀。将沉淀溶解在20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5的缓冲液中并且4℃透析数小时；
（2）第一次离子交换层析 
将透析后的酶液加入到预先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5的缓冲液平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中。用含0-1 mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为280 nm，收集有活性的部分；
（3）凝胶过滤层析 
将收集到的全部活性部分用硫酸铵（饱和度80%）浓缩并用少量Tris-HCl pH 7.5缓冲液溶解，将浓缩后的酶液加入到预先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液平衡好的Superdex 75 10/300GL层析柱中，用含0.15 mol/L氯化钠的相同缓冲液进行洗脱，流速为0.4 mL/min，检测波长为280 nm，收集有活性的部分；
（4）第二次离子交换层析 
    将收集到的活性部分经20 mmol/L Tris-HCl pH 8.5的缓冲液透析后再次加入到预先用20 mmol/L Tris-HCl pH 8.5缓冲液平衡好的Hitrap Q HP离子柱中，用含0-0.4 mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，收集活性部分，即为所制备的电泳纯谷氨酰胺转胺酶。 
本发明的有益效果：本发明提供了一种谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，该方法工艺简单，具有较高的得率，所得到的谷氨酰胺转胺酶纯度高。
附图说明：
图1. 第一次离子交换色谱图
图2. 凝胶过滤色谱图
图3. 第二次离子交换色谱图
图4. 谷氨酰胺转胺酶分离纯化全过程的SDS-PAGE电泳图
1、蛋白分子量标准；2、发酵上清液；3、盐析后的酶液；4、第一次离子交换后的酶液；5、Superdex 75凝胶过滤后的酶液；6、第二次离子交换后得到的TGase A；7、第二次离子交换后得到的TGase B。 
具体实施方式：
材料和检测方法
吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13，巳在中国专利ZL03152956.9公开，授权公告号CN  1208452 C，授权公告日2005年6月29日。
发酵培养基：糊精20 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母提取物 5 g/L，CaCl2 1 g/L，MgSO4 2 g/L，K2HPO4 2 g/L，KH2PO4 2 g/L（pH 7.0）。
谷氨酰胺转胺酶活力测定方法：以L-谷氨酸-g-单羟肟酸为标准品作标准曲线。恒温水浴锅调到37℃，将底物(Z-Gln-Gly和羟胺)和待测样品（40 μL）放入水浴锅预热10 min，在样品中加入100 μL底物，反应10 min，然后加40 μL终止剂（三氯乙酸和三氯化铁）终止反应。取出样品，8000×g离心5 min，在562 nm下用蛋白核酸定量测定仪比色测定酶活。酶活力单位定义：该酶在37℃时每分钟催化底物生成1 mmol L-谷氨酸-g-单羟肟酸所需要的酶量。
实施例1
将吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13以 10%的接种量接菌至发酵培养基中，30℃，200 r/min培养60 h，发酵结束后测定谷氨酰胺转胺酶活力为：2.5 U/mg。
实施例2
（1）硫酸铵沉淀
将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus发酵液离心去除菌体后，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为50%，缓慢搅拌使其完全溶解。调节pH值，使酶液的pH保持在7.5，静置半小时后10000×g低温离心10 min，收集上清液继续加入硫酸铵至饱和度为80%，4℃静置数小时后，低温离心收集蛋白沉淀。将沉淀溶解在20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5的缓冲液中并且4℃透析数小时；
（2）第一次离子交换层析 
将透析后的酶液加入到预先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5的缓冲液平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中。用含0-1 mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为280 nm，收集有活性的部分（图1）；
（3）凝胶过滤层析 
将收集到的全部活性部分用硫酸铵（饱和度80%）浓缩并用少量Tris-HCl pH 7.5缓冲液溶解，将浓缩后的酶液加入到预先用20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液平衡好的Superdex 75 10/300GL层析柱中，用含0.15 mol/L氯化钠的相同缓冲液进行洗脱，流速为0.4 mL/min，检测波长为280 nm，收集有活性的部分（图2）；
（4）第二次离子交换层析 
将收集到的活性部分经20 mmol/L Tris-HCl pH 8.5的缓冲液透析后再次加入到预先用20 mmol/L Tris-HCl pH 8.5缓冲液平衡好的Hitrap Q HP离子柱中，用含0-0.4 mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，收集活性部分，即为所制备的电泳纯谷氨酰胺转胺酶。TGase的回收率可以达到45.9%，TGase A的比酶活可以达到14.3 U/mg，TGase B的比酶活可以达到17.8 U/mg（图3）。
谷氨酰胺转胺酶分离纯化全过程的SDS-PAGE电泳图见图4所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一种谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，其特征在于，步骤如下：
1)将来源于中国专利ZL03152956.9的吸水链霉菌Streptomyceshygroscopicus WSH03-13发酵液去除菌体，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为50％，缓慢搅拌使其完全溶解；调节pH值，使酶液的pH保持在7.5，静置半小时后10000×g低温离心10min，收集上清液继续加入硫酸铵至饱和度为80％，4℃静置数小时后，低温离心收集蛋白沉淀；将沉淀溶解在20mmol/L Tris-HCl pH 7.5的缓冲液中并且4℃透析；
2)将透析后的酶液加入到预先用20mmol/L Tris-HCl pH 7.5的缓冲液平衡好的阴离子交换柱Hitrap Q HP中；用含0-1mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min，检测波长为280nm，收集有活性的部分；
3)将收集到的全部活性部分用饱和度80％的硫酸铵浓缩并用少量Tris-HCl pH 7.5缓冲液溶解，将浓缩后的酶液加入到预先用20mmol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液平衡好的Superdex 7510/300GL层析柱中，用含0.15mol/L氯化钠的相同缓冲液进行洗脱，流速为0.4mL/min，检测波长为280nm，收集有活性的部分；
4)将收集到的活性部分经20mmol/L Tris-HCl pH 8.5的缓冲液透析后再次加入到预先用20mmol/L Tris-HCl pH 8.5缓冲液平衡好的Hitrap Q HP离子柱中，用含0-0.4mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，收集活性部分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸水链霉菌Streptomyceshygroscopicus WSH03-13发酵培养基为：pH 7.0，糊精20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，CaCl21g/L，MgSO42g/L，K2HPO42g/L，KH2PO42g/L。
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