CN102083806A

CN102083806A - 用于治疗急性和慢性炎性疾病的5-(4-甲基磺酰基-苯基)-噻唑衍生物

Info

Publication number: CN102083806A
Application number: CN2009801226820A
Authority: CN
Inventors: 维克特·鲁华欧罗佑; 安东尼奥·迪拉西拉马门尼兹; 梅尔秋·奥瓦兹迪默索托; 安娜·慕诺兹慕诺兹
Original assignee: Faes Farma SA
Current assignee: Faes Farma SA
Priority date: 2008-06-16
Filing date: 2009-06-15
Publication date: 2011-06-01
Also published as: CA2728139A1; BRPI0915325A2; AU2009259451B2; IL209801A0; ZA201008877B; UY31896A; KR20110022679A; TW201010988A; MX2010013978A; TWI403506B; EP2313382A1; NZ589894A; WO2009153226A1; JP2011524352A; SA109300384B1; RU2495031C2; AU2009259451A1; RU2011101439A; MA32473B1; AR072113A1

Abstract

本发明涉及式(I)化合物：或其药物学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物在制备用于治疗急性或慢性炎性疾病的药物的应用，通过抑制至少一种选自TNF-α和IFN-γ的促炎性细胞因子，或通过免疫调节IL-8趋化因子和/或IL-10调控因子。本发明还涉及新的式(I’)化合物：

Description

用于治疗急性和慢性炎性疾病的5-(4-甲基磺酰基-苯基)-噻唑衍生物

技术领域

本发明涉及衍生自5-(4-甲基磺酰基-苯基)-噻唑的化合物在制备用于治疗急性和慢性炎性疾病或症状、如类风湿性关节炎的药物产品中的用途。

背景技术

免疫学是自我和非自我识别的科学研究。自我耐受的失衡是自身免疫疾病的起因。此外，其他情况诸如移植、动脉粥样硬化、感染性的和非感染性的急性和慢性炎性病理以及许多迄今不被认为是自身免疫的其他疾病，表现出免疫细胞介导的发病机理。大多数作者认为免疫炎性效应物应答的激活基于两个信号：

-信号1意指克隆抗原的受体(TCR-CD3T细胞受体复合物)的触发，其识别嵌入在主要组织相容性复合物(MHC)分子中的同源抗原。在B-细胞中，细胞外可溶性或膜结合抗原与免疫球蛋白CD79(Ig/CD79)克隆受体复合物交联，以将信号1传递到抗体分泌型淋巴细胞系。

-除抗原传递信号1之外，第二信号必须避免因无反应性或克隆缺失导致的耐受。信号2由共刺激物传递，例如在专职性抗原提呈细胞(APC)(如人单核细胞和它们的分化系后代)表面表达的CD86。

在天然免疫炎症应答中，触发模式识别受体(PRR)的微生物和自我修正的抗原或有丝分裂原促进了危险信号。PRR信号通路，例如TLR4(革兰氏阴性壁细菌脂多糖或LPS的受体)传递高水平的共刺激表面分子(也就是CD80或CD86)的表达。反过来，共刺激配体CD80-CD86在辅助T细胞表面交联CD28。信号1(也就是抗-CD3抗体交联)加上信号2(也就是通过特异性抗体的CD28交联)的结合实验性地模拟了有效的炎性效应免疫应答的天然条件。值得注意地，核准的免疫抑制药物在高水平共刺激物的情况下在抑制促炎细胞因子级联的激活方面存在困难。后者发生在自免疫疾病和许多其他严重的急性和慢性炎性症状中。

APC不仅对于获得的免疫系统决定免疫应答种类中很关键，因为它们深深地影响是否有由激发克隆介导的效应物(也就是T细胞辅助、Th、细胞毒性、Th、抗体产生、B-细胞)应答或是耐受应答(通过无反应性或细胞凋亡)。而且，APC本身还可以传递效应物即时免疫应答。一个很好的证明例子是在癌症病人中单核细胞产生和释放大量的肿瘤坏死因子α(TNF-α)。在这些病人中，TNF-α促进血管内皮的增强应答和激活，伴随着白细胞介素8(IL-8)和其他促炎细胞因子以及促凝血活性物质的分泌。总之，TNF-α促进伴随肿瘤坏死的血栓形成和缺血性，这是肿瘤坏死因子或TNF-α的原始定义。但是，TNF-α是一种与许多其他疾病症状有关的多效性细胞因子。长期的证据表明，在单核细胞中，LPS可能触发大量TNF-α的分泌，这强烈地促进了感染性休克的发展。最近，不适当的大量的TNF-α的产生和分泌被认为是自身免疫炎性疾病的治疗靶点，例如类风湿性关节炎、脊椎关节病、克罗恩病、葡萄膜炎和牛皮癣。因此，目前已经广泛的认为使用抗TNF-α是治疗这些疾病的技术策略，其中通过减少生物活性TNF-α的可用水平可能会改善病人的症状。

基于这点考虑，那些可能会受惠于用TNF-α拮抗剂治疗的疾病的数量快速增长，包括动脉粥样硬化、代谢综合征、脑炎、病毒性肝炎、肾小球肾炎、对肿瘤的不适当的炎症应答和感染性休克及其他。

除由某些体细胞产生之外，TNF-α的产生有两个主要来源，单核细胞和T-淋巴细胞。在获得性免疫应答的过程中，促炎症反应指导方案下，APC曝光于危险信号，这触发IL-12p70(p35和p40的异源二聚体)的分泌，后者是一个极化活化的Th-细胞指向Th-1型的细胞因子分泌特性的共刺激分子。Th1-细胞表现出独特的细胞因子特性，其中干扰素γ(IFN-γ)的分泌是一个真正的足迹。这些细胞也分泌大量的TNF-α。

Th1产生的IFN-γ促进许多与炎性疾病的认识有关的效应。一方面，它进一步激活单核细胞并通过给定刺激物增加TNF-α分泌的水平。另一方面，它促进TNF-α受体下游的更强的信号通路。总之，IFN-γ除其本身的直接效应如抗病毒活性外，还增加MHC-II中的表达，并通过增加TNF-α仍然很强的效应而导致炎症和病变。

促炎症级联由单核细胞中的TNF-α或Th1-细胞中的IFN-γ和TNF-α的产生开始，通过其他促炎细胞因子通路如IL-8而被放大。IL-8(不管其原始名称)被描述为一种由巨噬细胞和其他细胞类型例如上皮细胞产生的趋化因子，它也由内皮细胞合成，因而相应地也被命名为CXCL8。尽管中性粒细胞是IL-8的主要靶细胞，但也有比较宽范围的细胞(内皮细胞、巨噬细胞、肥大细胞、角化细胞)对该趋化因子有反应。IL-8的主要功能是在其靶细胞(例如中性粒细胞)中诱导趋化作用。还诱导中性粒细胞系中迁移所需的系列细胞生理反应和它的靶功能吞噬作用，像细胞内Ca²⁺、胞吐作用(例如组胺释放)、呼吸爆发的增加。IL-8可以由任何具有与固有免疫反应有关的TLR的细胞分泌。IL-8的主要功能是聚集中性粒细胞以吞噬触发抗原模式TLR的抗原。通过将IL-8靶细胞传送到内皮和其他靶组织，因此除了IL-8在机体防御中的作用，IL-8还与许多TNF-α的致病作用的扩增和执行有关。

白细胞迁移和回归不仅由趋化因子类和其受体调控，还由大量的粘附分子调控。其中，选择蛋白CD62L是公认的阻止白细胞迁移至淋巴结的治疗靶点，并因此被认为是非甾体抗炎药(NSAID)的体外效果分级的一个参数。

许多免疫抑制因子和抗TNF-α分子影响正常免疫防御机制，因为它们促进对免疫细胞的细胞毒性效应或抑制在成功的效应物免疫应答之前引起克隆扩增的增殖机制。

鉴于细胞外间隙分泌TNF-α的重要性(无论是细胞质膜嵌入或分泌可溶形式)，已经在设计治疗剂上花了许多努力，所述治疗剂阻断细胞外TNF-α与TNF-受体I和/或TNF-受体II的相互作用。最相关的方法是使用可溶性诱饵TNF-受体，其俘获TNF-α并由于长时间分离而阻止促炎配体与细胞受体的相互作用。

第二策略是制造常规的或双特异单链分子的人源化抗人TNF-α抗体，其还靶向特定疾病(也就是在类风湿性关节炎中抗VEGF/抗TNF-α)中的其他相关分子。鉴于上述分子是TNF-α拮抗剂，限定了它们的作用机制是阻断细胞外分泌的TNF-α。

驱使TNF-α产生和分泌的全面的但未穷尽的靶点清单可能是：a)驱使TNF-α的转录表达的分子；b)驱使从核到细胞质的TNF-α-RNA转运以及RNA剪接的分子；c)指导TNF-α翻译的分子；d)调控TNF-α-mRNA稳定性的分子；e)指导高尔基小泡至促TNF-α表面形式所锚定的细胞膜的分子；f)和TNF-α的分泌脱落有关的分子如TNF-α转化酶(TACE)；以及g)调控促-TNF-α的表面形式及其信号的内化作用的分子。所有这些涉及TNF-α产生和分泌的细胞靶点。

尽管设计阻断TNF-α产生的治疗剂的策略不同，但是非常需要找到选择性阻断TNF-α产生和其他关键的促炎细胞因子如IFN-γ产生的新药物。

发明概述

本发明的作者意外地发现式(I)化合物显示出许多非常有趣的免疫调控作用，其有可能有益于控制急性和慢性炎性疾病的发病机理，所以具有潜在的临床应用价值。特别地，本发明所用的化合物能够抑制来自患慢性炎性疾病如类风湿性关节炎的病人的外周血单核细胞(PBMC)的TNF-α的产生，以及抑制被T-细胞刺激后的那些细胞的IFN-γ的分泌。此外，式(I)化合物能够调控趋化因子(也就是IL-8)和调控细胞因子(也就是IL-10)的分泌的生物反应特性，并在健康和疾病中以不同的方式作用。式(I)化合物的整个免疫调节作用与来自外周血的单核细胞上的任何毒性作用无关，而且，促有丝分裂刺激后的活化和增殖反应不受这些化合物的调节。

在仅仅一个小分子中，由于它们在系统性和器官特异性自体免疫失调、移植、急性和慢性炎性疾病、一些代谢和退行性疾病和动脉粥样硬化的病理生理中全都至关重要，若干促炎细胞因子如TNF-α和IFN-γ的抑制作用的结合，以及调控IL-8趋化因子和/或IL-10调控细胞因子的可能性，使式(I)化合物在各种可能的临床和治疗关联的重构水平中，属于一类新的用于靶向促炎性/调控细胞因子和趋化因子的级联的免疫调节剂。

值得注意地，免疫细胞是固着的，并进入器官以侦察遭受炎症的细胞组织，其中它们聚集于根据疾病活性、靶器官和损伤扩增来分布的病灶中。由于本发明所用的化合物预期能调控病理生理进程的某些方面，所以可以使用成像研究来描述受体数量、结合效率、受体占有率和药物探针浓度。鉴于白细胞的复位特征，治疗靶点的检测集合了有关靶细胞和病灶部位的位置的信息。

因此，式(I)化合物还表现出在药物显影、临床试验和个体化用药中用作成像生物标记的潜在用途，其不仅可以提供药物动力学、分布和定量信息，还可以提供临床前和临床试验中的个体化反应模式的相关资料信息。后者可能导致给予需要该预测和个体化评价的病人有效量的式(I)化合物或其药物组合的临床终点的有效的、可靠性的、个体化的替代生物标记的确定，由此用于本领域技术人员已知的不同的生物成像技术的优化。

根据第一方面，本发明涉及式(I)化合物的应用：

(I)

其中：

R₁选自氢、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂环基；

R₂选自氢、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、和N(R’R”)，其中R’和R”分别为氢或C₁-C₆烷基；和

R₃是C₁-C₆烷基，

或其药物学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物在制备用于治疗急性或慢性炎性疾病的药物中的用途，通过抑制至少一种选自TNF-α和IFN-γ的促炎细胞因子的产生，或者通过免疫调节IL-8趋化因子和/或IL-10调控细胞因子。

在本发明的一个特别的方面，急性或慢性炎性疾病选自急性和慢性血清阳性或血清阴性的寡关节炎和多关节炎、脊椎关节炎、肾小球肾炎、胶原病、肾小管间质性肾炎、代谢综合征、动脉粥样硬化、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺病、多发性硬化症、脱髓鞘疾病、脑膜炎、脑炎、脑膜脑炎、炎症性神经根病和周围神经病、发炎性肠病、肝硬化、肝炎、心力衰竭、缺血性疾病、肾衰竭、炎症性膀胱炎、良性前列腺增生症、前列腺炎、心肌炎、心包炎、葡萄膜炎、异位性皮炎、湿疹、荨麻疹、牛皮癣、酒渣鼻、过敏性鼻炎、败血症、感染性休克、多器官衰竭，系统性自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、脉管炎、皮肌炎、淀粉样变性或肉样瘤病，器官特异性自身免疫性疾病如重症肌无力、甲状腺炎或幼年型糖尿病(insulinitis)、器官移植、感染和肿瘤引起的发炎、TNF-α依赖性细胞衰退、坏死、细胞凋亡、移植物抗宿主病、恶病质和自分泌和旁分泌性病理细胞生长。

这些治疗适应症是至少一种异常免疫应答、免疫失调、免疫紊乱、免疫致病、免疫治疗、免疫抑制或免疫调节生物反应的结果。

本发明的另一方面涉及式(I’)的化合物：

其中：

R₁选自氢、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂环基；和

R₃是C₁-C₆烷基，

或其药物学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物。

第三方面，本发明的目的是一种药物组合物，其包含上述定义的式(I’)化合物或其药物学上可接受的盐、前药或溶剂化物，以及至少一种药物学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂。

本发明的另一方面涉及如上述定义的式(I’)化合物作为药物的应用。

最后，本发明的另一方面涉及如上述定义的式(I)化合物作为成像和药物成像技术中的成像生物标记的用途，用于发现免疫病灶、靶细胞和靶分子。

附图说明

图1：用于流式微球阵列(CBA)显影的选定微粒的不同荧光特征。

图2：化合物12对来自健康志愿者(n＝10)的LPS刺激的PBMC中TNF-α的产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的中位数和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图3：化合物12对来自健康志愿者(n＝13)的LPS-或TCR/CD3+CD28-刺激的PBMC中TNF-α产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的平均误差和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图4：化合物12对来自类风湿性关节炎病人(n＝7)的PBMC中TNF-α产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的平均误差和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图5：化合物12对来自健康志愿者(n＝13)的PBMC中IFN-γ产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的平均误差和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图6：化合物12对来自类风湿性关节炎病人(n＝8)的PBMC中IFN-γ产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的平均误差和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图7：化合物12对来自健康志愿者(n＝13)的PBMC中IL-8产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的平均误差和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图8：化合物12对来自类风湿性关节炎病人(n＝8)的PBMC中IL-8产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的平均误差和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图9：化合物12对来自健康志愿者(n＝13)的PBMC中IL-10产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的平均误差和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图10：化合物12对来自类风湿性关节炎病人(n＝8)的PBMC中IL-10产生的影响。柱代表不同实验条件下各样品在成对培养中的平均误差和标准误差。星号代表各实验条件下相应数据相对于赋形剂具有统计学上的显著差异(p＜0.05)。

图11：在存在和不存在PHA、PHA+IL-2、或者单克隆抗体抗-CD3(T3)和抗-C28的结合的刺激下，化合物12(a)和赋形剂(b)对来自健康志愿者(n＝8)的PBMC增殖反应的影响。

图12：化合物12对来自健康志愿者的PBMC的淋巴细胞(a)和单核细胞(b)中的CD62L脱落的影响。

发明详述

在本发明的内容中，以下术语的具体含义描述如下：

术语“C_1-6烷基”是指直链或支链的烃链基团，由碳和氢原子组成，不包括不饱和状态，有1-6个碳原子，并由一个单键连接在该分子的其余部分上，例如甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、n-丁基、t-丁基、n-戊基等等。C_1-6烷基可以可选地被一个或多个取代基取代，如环烷基、芳基、杂环基、卤素、羟基、烷氧基、氰基、氨基、硝基或烷硫基。

术语“环烷基”是指饱和或部分饱和的稳定的3-8元环基团，并且其仅由碳和氢原子组成，例如环己基或环戊基。除非说明书中另有特殊规定，术语“环烷基”包括可选择地被至少一个取代基取代的环烷基基团，所述取代基独立地选自氢、C_1-6烷基、卤素、羟基、-N(R₃)(R₄)，其中R₃和R₄独立地选自氢和直链或支链的C_1-6烷基。

术语“芳基”是指稳定的5-8-元芳环基团，并且其仅由碳和氢原子组成，例如苯基或环辛四烯。除非说明书中另有特殊规定，术语“芳基”包括可选择地被至少一个取代基取代的芳基，该取代基独立地选自氢、C_1-6烷基、卤素、羟基、-N(R₃)(R₄)，其中R₃和R₄独立地选自氢和直链或支链的C_1-6烷基。

“杂环基”是指由碳原子和1-5个选自氮、氧和硫的杂原子组成的稳定的3-8元环基团。就本发明的目的而言，杂环基可以部分或完全的饱和或是芳香族的。杂环的例子包括，但不限于，吡咯烷、吡啶、噻吩、呋喃等等。除非说明书中另有特殊规定，术语“杂环基”包括可选择地被至少一个取代基取代的杂环基，该取代基独立地选自氢、C_1-6烷基、卤素、羟基、-N(R₃)(R₄)，其中R₃和R₄独立地选自氢和直链或支链的C_1-6烷基。

术语“卤素”是指溴、氯、碘或氟。

术语“急性或慢性血清阳性或血清阴性的寡关节炎和多关节炎”是指具有一个或多个滑动关节并伴有阳性或阴性的类风湿因子的滑膜炎疾病，包括类风湿性关节炎以及原发性和继发性舍格伦综合征。

术语“脊椎关节炎”是指涉及骶骨关节和/或脊柱和/或周边关节的免疫病原性HLA-B27相关的炎性疾病，还包括葡萄膜炎。

术语“肾小球性肾炎”是指涉及肾小球的炎性病变。

术语“肾小管间质性肾炎”是指涉及肾小管和肾间质的炎性疾病。

术语“胶原病(colagenopathies)”是指病原性免疫机制的系统性炎性疾病，包括系统系红斑狼疮(SLR)、皮肌炎和硬皮病。

术语“炎性肠病”是指有或没有全身特征的病原性免疫机制的胃肠道的炎性疾病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。

术语“阻塞性肺病”是指呼气流量(FEV)可逆或不可逆减退的支气管疾病，包括哮喘和慢性阻塞性肺病。

术语“间质性肺病”是指涉及肺间质的炎性疾病。

术语“脱髓鞘疾病”是指具有刺激髓磷脂溶解的免疫病原机制的中枢神经系统的炎性疾病，包括多发性硬化和视觉神经炎。

术语“脑膜炎、脑炎和脑膜脑炎”是指脑膜和/或中枢神经系统的其他结构的炎性疾病。

术语“炎症性神经根病和周围神经病”是指周围神经系统的炎性疾病。

术语“炎症性膀胱炎”是指膀胱的炎性疾病。

术语“良性前列腺增生症”是指前列腺的良性肥大和/或增生。

术语“异位性皮炎、湿疹和荨麻疹”是指过涉及或不涉及IgE的免疫发病机理的过敏性皮肤疾病。

术语“牛皮癣”是指免疫系统发病机理的过角质化和红斑性皮肤反应。

术语“酒渣鼻”是指以在中间的脸上并跨过面颊、鼻子或前额的红斑(潮红和发红)为特征的皮肤的普通炎性症状，通常对颈和胸部也会有较少的影响。

术语“过敏性鼻炎”是指免疫过敏性发病机理的间歇性的(也称为季节性的)或持续的(也称为常年的)炎性鼻粘膜疾病。

术语“败血症、感染性休克和多器官衰竭”是指由对微生物制剂的异常免疫反应和其他病因介导的系统炎性疾病。

术语“肉样瘤病和淀粉样变性病”是指涉及器官和/或全身性的原发性免疫疾病，但没有明确定义其中可以观察到的异常免疫反应的病因。

术语“器官特异性自体免疫疾病”是指没有定义病因的免疫系统介导的器官损伤，包括重症肌无力、甲状腺炎、垂体炎、肾上腺炎及其他。

术语“器官移植”是指移植细胞、组织和器官的排斥反应的预防和治疗。

术语“感染和肿瘤诱导的炎症”是指继发于微生物制剂或肿瘤刺激的异常免疫应答。

术语“TNF-α依赖性细胞衰退、细胞凋亡或坏死”是指TNF-α诱导的组织衰退或死亡。

术语“移植物抗宿主病”是指移植细胞诱导的炎性免疫应答。

术语“恶病质”是指由炎症或肿瘤性疾病诱导的系统性厌食症或营养不良和体重减轻。

术语“动脉粥样硬化”是指继发于粉瘤或由炎症细胞(大部分为巨噬细胞)及含油脂质的细胞碎片聚集在动脉壁上所引起的任何动脉硬化。

术语“缺血性疾病”是指继发于降低的组织氧合和/或血流量的器官病灶，包括心脏和脑血管缺血的。

术语“自分泌和旁分泌病理性细胞生长”是指以TNF-α作为一个细胞因子调控细胞的活化和增殖因子的恶性或良性疾病。

除非另有说明，本发明所用的化合物意在包括区别仅在于存在一个或多个同位素富集原子的化合物。例如，具有现有结构的但是一个氢被氘或氚取代，或者一个碳被¹³C-或¹⁴C-富集碳或¹⁵N-富集氮取代的化合物都在本发明的范围内。

术语“其药物学上可接受的盐、溶剂化物或前药”涉及盐、溶剂化物或前药，当其被给药至接受者时其提供(直接或间接)如上文所述的一个化合物药。然而，应该观察到药物学上不可接受的盐也在本发明的范围内，因为它们可以用于制备药物学上可接受的盐。盐、前药和衍生物可以根据现有技术已知的方法制备。“药物学上可接受”优选地是指当对人或动物给药时，分子实体和组合物是生理耐受的，且通常不引起过敏反应或类似的不良反应，例如胃不适、头晕等。术语“药物学上可接受”意味着其被联邦或州政府的监管机构批准，或包含在美国药典或其他可用于动物、更尤其是用于人的普遍公认的药典中。

例如，上述的化合物的药物学上可接受的盐是由包含碱或酸单元的上述化合物通过常规化学方法得到。举例来说，这些盐的制备通常是通过这些化合物的游离的酸或碱形式在水或有机溶剂或两者的混合物中与化学当量的合适的碱或酸反应。通常优选的是非水介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。举例来说，酸加成盐的例子包括无机酸加成盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐，以及有机酸加成盐例如乙酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。举例来说，碱加成盐的例子包括无机盐如钠、钾、钙、铵、镁、铝和锂盐，以及有机碱盐如乙二胺、乙醇胺、N，N-二烷基乙醇胺、葡糖胺和碱性氨基酸盐。

术语“前药”此处定义为一个化合物，其进行化学衍生如取代或添加另外的化学基团，以改变(作为药物用途)它的一些物理化学性质，如溶解度或生物活性，例如衍生自一个活性化合物的对目标给药后提供活性化合物本身的酯或醚。从特定的活性化合物制备前药的公知的方法的例子对于本领域技术人员是已知的，并可以在例如Krogsgaard-Larsen et al.，Textbook of Drug Design and Discovery，Taylor & Francis(2002年4月)中找到。根据本发明，术语“溶剂化物”应理解为本发明化合物通过非共价键结合其他分子(多数是极性溶剂)的任何形式。溶剂化物的例子包括水合物和醇化物，例如甲醇化物。

特别优选的前药是那些给药于病人后增加本发明化合物的生物利用度的(例如，使得口服给药的化合物更快的被血液吸收)，或那些与原始化合物相比增加原始化合物在生物隔室(例如脑或淋巴系统)的分布的。

本发明使用的化合物可以是结晶形式，也就是多晶型，作为游离化合物或溶剂化物(例如水合物)，应当理解两种形式都在本发明的范围内。溶剂化方法是本领域公知的。合适的溶剂化物是药物学上可接受的溶剂化物。在一个特别实施方式中，溶剂化物是水合物。

盐、溶剂化物和前药可以通过本领域已知的方法制备。可以观察到药物学上不可接受的盐、溶剂化物或前药也包括在本发明的范围内，因为它们可以用于制备药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。

式(I)化合物或它们的盐或溶剂化物优选的是药物学上可接受的形式或基本上纯净的形式。药学上可接受的形式尤其应理解为排除正常药学添加剂如稀释剂和佐剂之外具有药物学上可接受的纯度，且不包含任何在正常剂量水平时被认为是有毒的物质。药物的纯度优选为50％以上，更优选为70％以上，进一步优选在90％以上。在一个优选实施方式中，式(I)化合物或它的盐、溶剂化物或前药的纯度为95％以上。

如上述式(I)所示的本发明使用的化合物可以包括依赖于手性中心存在的对映体或依赖于多重键存在的异构体(例如Z、E)。单独的异构体、对映体、非对映异构体以及它们的混合物都在本发明的范围内。

在一个特别的实施方式中，由于在成像和药物成像技术中的用途、或它们作为药物显影、临床试验和个性化用药中的生物标记的替代的用途，式(I)化合物可以用荧光或发光的标签或标志来标记，通过本领域技术人员已知的任何方法引入标记物。

在本发明的一个特别的实施方式中，R₁是取代或未取代的C₁-C₆烷基。优选地，R₁是甲基。

在另一个特别的实施方式中，R₂是氢、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基。优选地，R₂是取代或未取代的环烷基。更优选地，R₂是环戊基。

在另一个特别的实施方式中，R₃是甲基。

在另一个更特别的实施方式中，本发明所用的式(I)化合物选自以下化合物：

或其药物学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物。

本发明所用的式(I)化合物可以通过已有的合成工艺获得。例如，它们可以通过以下线路图概括的方法制备。

该过程首先包含化合物4-R₃-苯硫基乙酸的酯化反应以得到甲基酯衍生物。进行所述反应需要使用甲基化剂，如在盐如NaHCO₃存在的情况下使用MeI，或在酸性介质存在时使用MeOH作为甲基化剂。

在以下步骤中，使用氧化剂如臭氧，对甲基酯衍生物(可选择地没有任何纯化)中的硫原子进行氧化，从而从硫醚基团中得到砜化合物。

随后，用试剂如NBS卤化，使酯基团在α-位形成卤化物。在加热条件下，用不同的硫代酰胺与该化合物进行环加成，生成高纯度的R₁-取代5-(4-R₃-磺酰基-苯基)-噻唑-4-醇。

用于环加成的硫代酰胺从酰胺获得，对应于在J.Med.Chem (34)2158-2165，1991 and J.Org.Chem.(65)，13，3973，2000中描述的Lawesson试剂。所述硫代酰胺包括如上文定义的R₁选自氢、取代或未取代的C₁-C₆烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的芳基，和取代或未取代的杂环的化合物。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法通过羟基引入R₂基团，以得到本发明所用的式(I)化合物。在一个特别的实施方式中，羟基与分子式为R₂-卤素的卤化物反应，优选R₂-Br，以得到式(I)的化合物。

在提到的反应中使用的所有反应物都是市面有售的。

在另一方面，本发明提供式(I’)化合物：

其中：

R₁选自氢、取代或未取代的C₁-C₆烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的芳基，和取代或未取代的杂环基；和

R₃是C₁-C₆烷基，

或其药物学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物。

在一个特别实施方式中，R₁是取代或未取代的C₁-C₆烷基。优选地，R₁是甲基。

在另一个特别实施方式中，R₃是甲基。

在另一特别的实施方式中，本发明的式(I’)化合物选自以下化合物：

或其药物学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物。

本发明进一步提供药物组合物，其包含本发明的式(I’)的新化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，以及至少一种药学上接受的载体、佐剂和/或赋形剂，以对病人给药。

在一个特别的实施方式中，为了用于预防和/或治疗急性或慢性炎性疾病的给药，治疗有效量的式(I)的化合物、它们的药学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物和一种或多种药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂一起制成合适的药物组合物。

术语“载体、佐剂和/或赋形剂”是指与活性成分一起给药的分子实体或物质。这些药学载体、佐剂或赋形剂可以是无菌液体(例如水和油，油包括来自石油或动物、植物或合成的油的，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等)、赋形剂、崩解剂、润湿剂或稀释剂。合适的药用载体记载在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。

药物组合物可以以任何合适的给药方式给药，例如，口服、肠胃外(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌内等等)、直肠给药等等，由于治疗的疾病具有慢性特性，所以典型地选用口服给药。

在一个特别的实施方式中，所述药物组合物可以是口服给药的固体或者液体形式的药品形式。口服给药的药品形式的说明性实施例包括片剂、胶囊、颗粒、溶液、混悬液等等，以及可以包含常规赋形剂如粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂等等，并且可以通过常规方法制备。药物组合物也可以适合肠胃外给药，例如，以合适剂型的无菌冻干产品、悬浮液或溶液的形式；这种情况下，所述药物组合物可以包括合适的赋形剂，如缓冲剂、表面活性剂等等。无论如何，赋形剂将根据所选的给药药品形式进行选择。用于给药的不同药品形式和它们的制备方法的综述可以在“Tratado de Farmacia Galénica”，by C.Faulíi Trillo，10th Edition，1993，Luzán 5，S.A.de Ediciones.中找到。

为了药物的治疗应用，式(I)化合物优选地是药物学上可接受的或基本上纯的药物形式，也就是除去药学上可接受的佐剂外，式(I)化合物具有药学上可接受的纯度，并且不包括在常规剂量水平被认为有毒的物质。式(I)化合物的纯度优选地是高于50％，更优选地高于70％，更优选地高于90％。在一个优选实施方式中，它们的纯度高于95％。

除其他因素外，用于给药的式(I)化合物的治疗有效量通常依赖于被治疗的个体、所述个体所患疾病的严重性、所选的给药方法等等。因此，本发明所述的剂量仅应被本领域技术人员作为指导使用，本领域技术人员必须根据前面提到的变量调整剂量。然而，式(I)化合物可以一天给药一次或多次，例如，一天1、2、3或4次，典型的每天的总量包含0.1-1000mg/kg体重/天，优选地10mg/kg体重/天。

式(I)化合物、其药学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物，以及包含它们的药物组合物可以和其他药物联合用于治疗急性和慢性炎性疾病。所述其他药物可以形成同一药物组合物的一部分，或可选择地，以单独组合物的形式与包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物的药物组合物同时或非同时给药。

在本发明的范围内，“急性和慢性炎性疾病”的表述是指由炎性/免疫细胞和炎性细胞因子级联导致的任何疾病、紊乱或症状，其中异常共刺激是一个发病机理。涉及的主要细胞是炎性/免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞、APC、T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞、浆细胞、粒细胞和肥大细胞，或与欲治疗疾病有关的以上细胞亚群的结合。

术语“细胞因子”是指影响其他细胞的功能的分泌性蛋白，尤其是，与调控免疫系统的细胞或涉及免疫反应的细胞之间的相互作用有关。所述细胞因子是TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IFN-γ(干扰素-γ)、IL-8(白细胞介素-8)趋化因子和调控细胞因子IL-10(白细胞介素-10)。IL-10的产生由高的TNF-α水平诱导，并促进TNF-α的产生和阻断促炎细胞因子转录时的负反馈。

在本发明的一个特别方面中，急性或慢性炎性疾病选自急性和慢性血清阳性或血清阴性的寡关节炎和多关节炎、脊椎关节炎、肾小球肾炎、胶原病、肾小管间质性肾炎、代谢综合征、动脉粥样硬化、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、间质性肺病、多发性硬化症、脱髓鞘疾病、脑膜炎、脑炎、脑膜脑炎、炎症性神经根病和周围神经病、发炎性肠病、肝硬化、肝炎、心力衰竭、缺血性疾病、肾衰竭、炎症性膀胱炎、良性前列腺增生症、前列腺炎、心肌炎、心包炎、葡萄膜炎、异位性皮炎、湿疹、荨麻疹、牛皮癣、酒渣鼻、过敏性鼻炎、败血症、感染性休克、多器官衰竭、系统性自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、脉管炎、皮肌炎、淀粉样变性或肉样瘤病)、器官特异性自身免疫性疾病(如重症肌无力、甲状腺炎或幼年型糖尿病、器官移植、感染和肿瘤诱导的炎症)、TNF-α依赖性细胞衰退、坏死、细胞凋亡、移植物抗宿主病、恶病质和自分泌及旁分泌性病理细胞生长。

在一个优选的实施方式中，急性或慢性炎性疾病是血清阳性或血清阴性的慢性多关节炎，更优选地是类风湿性关节炎。

本发明的另一方面是一种治疗急性或慢性炎性疾病的方法，包括向需要该治疗的病人给药治疗有效量的上述式(I)化合物或其药物组合物。

说明书内容中的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”意思是化合物根据本发明的一个配方给药，用于预防、减轻或消除疾病或与所述疾病有关的一个或多个症状。“治疗”还包括预防、减轻或消除疾病的生理上的后遗症。

本发明内容中的术语“减轻”应理解为被治疗病人的情况的任何改善-主观地(病人的感觉或对病人的感觉)和客观地(测量参数)。

本发明的另一方面涉及如上定义的式(I)化合物在成像和药物成像技术中的作为成像生物标记的用途，用于发现免疫病灶、靶细胞和靶分子。

药物成像技术扩展了生物标记的范围，由充分的临床前(分子、细胞、器官和整体动物示踪、以及概念和机制的证据的研究、疗效评价等等)和临床(人类医疗)体内成像技术的快速成长的结合获得生物标记的范围，扩展到了那些由此处描述的并用作药物的化合物产生的有价值的信息资料。

通过以下实施例对本发明进行额外的解释。该解释不应被理解为是对权利要求所确定的本发明的范围的限制。

实施例

合成

实施例1.(4-甲硫苯基)-乙酸甲酯的合成

将1.82g(10mmol)的4-甲硫苯基乙酸溶于30mLDMF中，随后加入1.34g(16mmol)的NaHCO₃；搅拌混合器搅拌大约15min。之后，在室温下保持搅拌24h并同时加入1.9mL的ICH₃。这段时间结束后，将混合物倒到水/冰中。当没有沉淀发生时，加入乙醚萃取。有机相经水冲洗并用无水硫酸钠干燥，之后在旋转蒸发器中浓缩所述有机相得到1.92g(9.7mmol，97％产率)无色油，其光谱数据确认了具有预期的结构。所述产品将不经过纯化而用于下一步合成过程，因为其在TLC(洗脱液为二氯甲烷/甲醇9/1)中提供单一印迹。

RMN¹H(CDCl₃)：7.2(s，4H)3.7(s，3H)3.5(s，2H)2.4(s，3H CH₃S)

RMN ¹³C(CDCl₃)：171.5136.9130.4129.4126.451.640.215.5

实施例2.(4-甲基磺酰基-苯基)-乙酸甲酯的合成

将30.7g(50mmol)过硫酸氢钾的在80mL水中的溶液逐滴加入到3.4g(17.3mmol)在实施例1中获得的化合物在100mL的甲醇中的溶液中，并保持反应在水/冰浴中进行。一旦滴加完成之后，持续搅拌5小时，并允许温度上升至室温水平。然后，溶剂的一部分在减压下浓缩，沉淀的固体过滤并用水重复洗涤。干燥后，固体称重为3g。来自过滤的水用二氯甲烷萃取，有机相经水清洗，用无水硫酸钠干燥并在旋转蒸发器中浓缩，获得超出预期1g的产物，产量为4g(17mmol，100％产率)。所述固体在57℃熔化并分解，用HPLC测定其纯度为99％。光谱数据确认了预期的结构：

RMN¹H(CDCl₃)：7.9(d，2H)，7.5(d，2H)，3.7(s，s 3+2H)，3.1(s，3H)

RMN¹³C(CDCl₃)：170.80140.13139130.33127.6352.3144.4940.82

实施例3.溴-(4-甲基磺酰基-苯基)-乙酸甲酯的合成

将20g(87.62mmol)上述酯溶于300mL四氯化碳中；分批加入19g(105mmol)N-溴代琥珀酰亚胺、2g(12.18mmol)偶氮二异丁腈和0.1mL溴。反应混合物加热至80℃并持续3小时，随后冷却，过滤并用二氯甲烷洗涤。滤出液用水洗后用盐水洗。溶液用无水硫酸钠干燥，真空浓缩获得28g油，用快速色谱法以庚烷/乙酸乙酯(1/1)作为洗脱液进行纯化。纯化部分浓缩获得19.63g(72.94％产率)的溴代衍生化合物。

熔点：81.8-83.3℃

NMR¹H(CDCl₃)，：7.9(d，2H)，7.75(d，2H)，5.4(s，1H)，3.8(s，3H)，3,1(s，3H)。

NMR¹³C(CDCl₃)，.：168.0(C)；141.6(C)；141.1(C)；129.8(CH)；127.8(CH)；53.7(CH)；44.7(CH₃)及44.2(CH₃)ppm。

实施例4.2-甲基-5-(4-甲基磺酰基-苯基)-噻唑-4-醇的合成

16.7g(54.3mmol)由实施例3获得的酯溶于400mL甲苯中，随后加入19mL吡啶和4.08g(54.34mmol)硫代酰胺。反应混合物加热至80℃(水浴温度)并搅拌2小时。之后，使混合物冷却，过滤沉淀固体，并用水清洗(2x 50mL)，之后用乙醚清洗(2x 30mL)。产物真空干燥，获得7g(26mmol，47.86％产率)的乳状固体，其在216-226℃熔化。

光谱数据确认了所期望的产品结构。

RMN¹H(d⁶DMSO)δ：11.8(s，1H)7.8(m，4H)3.1(s，3H)2.6(s，3H)ppm

RMN ¹³C(d⁶DMSO)：162.9(C)；159.4(C)；146.2(C)；143.0(C)；128.0(CH)；126.1(CH)；104.4(C)；44.2(CH₃)；19.9(CH₃)ppm.

实施例5.4-环戊基氧-5-(4-甲基磺酰基-苯基)-2-甲基-噻唑的合成

将7.0g(26mmol)由实施例4获得的羟基噻唑和8.8g(63.67mmol)碳酸钾溶于200mL的DMF中。逐滴加入14mL(130mmol)环戊基溴。反应混合物加热至80℃持续3小时，随后冷却，置于冰水混合物中并用乙酸乙酯萃取。有机相用水清洗(3X 100mL)，经无水硫酸钠干燥后浓缩得到12g的粗材料，其从庚烷/乙醚(1/1)中结晶。用快速色谱法以庚烷/乙酸乙酯(2/1)为洗脱液纯化产品，得到6.7g(19.85mmol，76.39％产率)的化合物12。熔点：124.6-125.2℃

NMR¹H(CDCl₃)，：7.9(dd，4H)，5.4，(m，1H)，3.0，(s，3H)，2.6，(s，3H)，1.7-2.0(m，8H)ppm

NMR¹³C(CDCl₃)，：162.6(C)；159.5(C)；138.3(C)；137.1(C)；128.1(CH)；126.8(CH)；109.1(C)；83.7(CH)；45.0(CH3)；33.5(CH₂)；24.1(CH₂)；20.4(CH₃)ppm

生物测定

材料与方法

1.对象

本项研究用来自健康志愿者和类风湿性关节炎病人通过静脉穿刺获得的肝素化外周血来进行。

健康志愿者是在在医院业务内常规控制下的供血者。

本研究包含的类风湿性关节炎病人遵从美国风湿病学会的诊断标准并表现临床活性疾病，并在邀请加入时已经进行过至少6个月的20mg/周的口服Methrotexate治疗。疾病活性度以下述方法定义：a)DAS28≥3，2和/或b)6个或更多肿胀关节和6个或更多疼痛关节。而排除标准按以下进行：a)邀请加入时正患有活性传染病；b)加入之前患有肿瘤疾病；c)患有其它系统性或器官特异性的自身免疫疾病，并在邀请加入的至少1年之前没有完全康复；d)患有严重的肾脏、心脏或肝脏症状，并且与由类风湿性关节炎作为主要疾病所引起的水平改变不相关；e)患有常规状态的严重衰退，并且是由于与所述主要疾病无关的症状；f)在邀请加入前的一年内接受除指示剂量的Methrotexate之外的皮质类固醇、免疫抑制剂、细胞抑制剂或其它任何对免疫系统具有已知活性的药物的治疗；g)邀请加入时怀孕或在产后期。

本研究经西班牙马德里的阿尔卡拉大学调查委员会批准。

2.材料

-组织培养板，96孔平底并具有低蒸发盖(353073 Falcon，Becton Dickinson Labware，Franlklin Lakes，07417-1886，NJ，美国)。

-未灭菌板，96孔V形底(Greiner，Soria Greiner，马德里，西班牙)。

-一次性Pasteur移液器(Brand，Alemania)。

-可调节容积的微量移液器20，200，1000和5000μl(Gilson，Francia)。

-Eppendorf多管移液器4780(汉堡，德国)。

-Eppendorf无菌吸头(汉堡，德国)。

-未使用的丙烯无菌吸头(Daslab，马德里，西班牙)。

-5和10ml的无菌塑料试管(Daslab，马德里，西班牙)。

-15和50ml的无菌离心管(BD Falcon，Franklin Lakes，美国)。

-5ml的细胞计数器聚苯乙烯试管(BD Falcon，Franklin Lakes，美国)。

-肝素采血管10ml(Venojet，Terumo Europe，比利时)

-血浆提取管10ml(BD Vacutainer，Plymouth，英国)

-移液管填装器，以及电动移液器(Flow Lab，德国)。

-无菌过滤器，22μm Millex-GS(Millipore，Molshein，法国)。

-透明盖玻片(Hirschman，德国)。

-Neubauer计数室(Saaringia，德国)。

-Herasafe HS12垂直薄层流动室(Heraeus，德国)。

-CO₂调节的细胞培养箱Heracell 150(Heraeus，德国)。

-Beckman冷冻离心机，Multifuge 3SR(Heraeus，德国)。

--70℃冷冻器(Selecta，Tarrasa，西班牙)。

-Olympus CHS-2显微镜(Olympus，东京，日本)。

-FACScalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，Mountain View，美国)，具有软件和分析器BD Cellquest Pro v.5.5.1)。

-BD FACS Arrray生物分析仪。

-酶-免疫分析阅读器(Titertek Multiscan Plus，Flow laboratories)。

-Beckman放射性β计数器。

3.用于分离和鉴定细胞亚群的试剂

-简单氯盐(SSF)Apiroserum(Ibys，马德里，西班牙)。

-淋巴细胞分离剂(Ficoll-Hypaque，Nyegaard Co，Oslo，挪威)。

-台盼蓝(Flucke AG.，Buchs SG。，德国)。

-PBS FACS FLOW(Becton Dickinson)。

-HEPES缓冲液(Reactivos de Sigma y Panreac)

-甲基-³H胸腺嘧啶(³[H]-T)。特定活性60Ci/mmol(美国放射化学药品，ITISA，马德里，西班牙)。

-用于免疫荧光和流式细胞研究中的单克隆抗体：表1

表1.本研究中使用的单克隆抗体

*在“第七届人类白血球分化抗原研讨会”中定义。

4.细胞培养中使用的试剂

-完全培养基由RPMI-1640(Cambrex BioSciences B4800Verviers，比利时)添加1％L-谷氨酸200mM和25mM Hepes(Flow Lab.，Irvine，California，美国)制备。

-胎牛血清(FCS)(Gibco，Grand Island，纽约，美国).

-培养基：使用添加10％FCS的完全培养基。通过加热至57℃保持45分钟而从所有血清中去除补体。

-植物凝集素M(PHA)(Sigma Ref#L-8902，Lot#115K4132，Sigma，马德里，西班牙)。

-LPS(E.coli 0111：B4菌株，InvivoGene，San Diego CA92121，美国)。

-抗生素混合物。向培养基加入10mg/mL氨苄青霉素钠(Britapen，Beecham A.，Toledo，西班牙)、1.6mg/mL硫酸庆大霉素(Tamadit Lab.，Dr.Esteve SA.，马德里，西班牙)和0.5μg/mL两性霉素B(Fungizona，Squibb，Esplugues，巴塞罗那，西班牙)。

-抗-CD3单克隆抗体(Orthoclone OKT3，Orthopharmaceutical Corporation，Raritan，NJ，美国)。

-抗-CD28单克隆抗体(Clon 15E8，Menarini，马德里，西班牙).

5.获取生物样品

a)静脉血：从通过肘前静脉穿刺收集的静脉血来获取单核细胞。取50ml血，储存于肝素锂试管(Venojet)，进一步用盐水1/1(体积/体积)稀释，所有操作在无菌条件下进行。

b)收集人细胞亚群。为了分离PBMC，剩余血液成分以密度梯度分散于淋巴细胞分离液(Ficoll)上。这一方法基于血液细胞密度的差异。在含有稀释和肝素化的血液的50ml离心管中，小心加入15ml Ficoll-Hipaque(密度1.077g/ml)。离心(400xg)45分钟后，获得由两个界面分隔开的三个层(红血球、Ficoll和血浆)：PBMC包含在位于稀释的血浆和Ficoll之间的位置。可以通过用巴斯德移液器将其吸出而收集。这样获得的细胞重悬于SSF中并离心(300xg持续10分钟)；弃去上清液(洗脱步骤)，而细胞球重悬于含10％的PBS的RPMI 1640培养基中。

6.计数与存活率研究

在所有细胞悬浮液中细胞浓度和存活率通过台盼蓝0.1％稀释液和纽鲍尔室(Neubauer chamber)显微镜计数来测定。通过排除染色的能力来建立活细胞的百分数。仅当细胞存活率大于95％时才继续进行实验。

7.血清细胞因子的ELISA定量

为了定量血清细胞因子浓度，抽取的血液在含有或不含抗凝血剂(分别通过肘前静脉穿刺和动脉导管来收集)的情况下储存在试管中。允许血液在实验室内室温下凝集，进一步通过离心(600xg，20分钟)来分离血清。收集上清液，过滤，等份分离后-70℃保存。使用表2中所描述的商业试剂盒来进行不同细胞因子的浓度检测。

表2.-本研究使用的商业ELISA试剂盒

上清液解冻至室温，并与其各自的抗细胞因子在平板底部混合，然后经过不同的时间培养。随后，进行洗脱，并以与上清液中展现的细胞因子的数量成比例的方式加入相应公司推荐的底物以进行比色反应。结果用酶-免疫分析阅读器Multititer Plus(Tiertek Multiscan Plus，Flow Laboratories)来评估。这些结果与由公司提供的已知浓度的每种细胞因子获得的标准曲线相对比。

标准曲线的分析和随后的插值用软件Delta Soft II 4.1版(Biometallics，Inc.)在Apple Macintosh计算机上进行。细胞因子浓度转换成摩尔浓度，以计算每种情况的分子比率和可溶分子的数量。

8.免疫表型测定

使用藻红蛋白标记(PE)的单克隆抗体的单色的直接免疫荧光技术。PE是一种被488nm激光激发和在570nm发射的荧光物质，其对流式细胞仪来说是可检测的和易于分辨的。通过使用表1所描述的抗体，进行了直接标记：

PBMC标记：该过程在96孔V形底平板中标记。在每个孔中，安置5x10⁴个细胞，之后以400xg离心5分钟。洗脱之后，重悬细胞，并加入5μl的对应单克隆抗体。再次重悬细胞，平板在黑暗中于4℃培养20分钟。随后，加入150μl PBS并进行两次洗脱。最后，细胞重悬于150μl PBS中并在细胞仪试管中收集，加入PBS至最终体积为0.3ml。

进行计数时，使用FACSCalibur流式细胞仪，装备氩激光并调谐至488nm，以诱发藻红蛋白荧光。该设备除了荧光通道之外，还提供了关于大小(FSC)和细胞复杂度(SSC)的信息。

作为阴性对照，可使用没有标记的研究细胞和用与本研究所使用的(IgG1-FITC，PE y TC，IgG2a FITC，PE，TC)同种型的单克隆抗体标记的其他不相关细胞。

9.细胞培养与功能研究

通常的培养条件：所有细胞培养在垂直薄层流动室中在无菌条件下进行，使用无菌的一次性材料或用环氧乙烷或灭菌设备灭菌。培养物在37℃，5％CO₂和95％相对湿度下的保持在培养箱中。

10. ³ [H]-胸苷的增殖研究

在促细胞分裂剂的刺激下，淋巴细胞进行胚芽生殖和细胞分化过程。用于定量化细胞增殖的方法是分析³[H]-胸苷与新合成的DNA的结合，在结束和收集之前测定来自细胞培养液干燥提取物(其中加入了含氘碱)的β-辐射发射。在研究增殖的不同实验中，纯化的细胞制剂在96微孔平底板中以5x 10⁴细胞/孔(200μl终体积)的浓度培养，并在不同浓度的各种促细胞分裂剂存在下重复三次，并持续培养4天。

对特定刺激的应答依赖于研究的细胞密度和类型，以及培养时间和促细胞分裂剂浓度。

在结束细胞培养的20-24小时之前，每个孔加入1microCi的³[H]-胸苷；使用特定的培养收集器用玻璃过滤器通过抽吸来收集培养物。

DNA分析以每分钟的计数(c.p.m.)表达。每个检测重复进行三次，舍弃与三次重复的平均值的差值高于10％的数据，因为这些数据可能表示存在技术错误或培养污染。培养在每孔相同量的细胞和200μl相同体积下进行。所有促细胞分裂剂和细胞因子均首先通过进行剂量应答曲线和时间响应来测试。

11.定量多参数流式细胞仪(BD ^TM 流式细胞小球微阵列或CBA)的分析检测试验

根据生产商的说明书来进行CBA方案。微粒的选择根据图1的总结进行。最终选择展示少许光谱重叠的风险的那些。

表3和4示出了用于实验开发的每种试剂的目录数目和批次。样品的采集用BD FACS阵列生物分析系统(FACSArray，Becton Dickinson，San José，CA，美国)进行，结果的分析用软件FCAP Array(Becton Dickinson)在PC计算机上完成。

简言之，实验方案由用洗脱缓冲液的平板预洗脱组成。倾析之后，捕获微粒的混合物在漩涡中重悬。在适当的稀释物中加入标准物和样品。在永久性搅拌培养1小时之后，加入PE检测试剂并在室温下再次培养2小时。洗脱之后，在流式细胞仪中进行采集。

表3.-CBA Human Soluble Protein Multiplex Flex Set System试剂盒

表4.-CBA Flex Set试剂盒的设计中包含的试剂的批次

统计学分析

实验测试的结果根据分布类型以平均值和标准值与平均值估计误差表示。

对于统计学分析，首先通过使用Shapiro-Whilk常态的对比来分析分布的性质。用Mann-Whitney U非参数对比建立比较。在所有情况下，低于5％的显著性水平是有价值的(p＜0.05)。

统计学分析用软件SPSS 11.0(SPSS Inc.Headquarters，233S.Wacker Drive，11th floor.Chicago，Illinois 60606)进行。

化合物12的免疫调节效果的研究结果

化合物12在健康志愿者和类风湿性关节炎病人中通过外周血单核细胞 (PBMC)产生TNF-α、IFN-γ和其它细胞因子的免疫调节效果

实施例6.化合物12对TNF-α产生的影响

首先研究了在存在或不存在LPS的情况下，化合物12对健康志愿者的PMBC中TNF-α产生的效果。来自10名健康志愿者的PBMC(5x10⁴细胞/孔，200μl)在96孔、平底并具有低蒸发盖的组织培养板(353072 Falcon，Becton Dickinson labware，Franklin Lakes，USA，07417-1886NJ)上在添加了胎牛血清(原产地美国，Gibco ref.26140-079)和单独的浓度10^-6M溶剂或添加了10^-6M或10^-7M的化合物12的完全培养基(RPMI-1640 withglutamine Cat BE-12-70F，Cambrex Biosciences，B4880Verviers，比利时)中在LPS(10mg/ml；E.coli LPS 0111：B4菌株InvivoGene，San DiegoCA92121USA)存在或不存在的情况下平行培养两次，持续24小时。培养上清液在-20℃冷冻，用ELISA物种特异性(用于定量检测肿瘤坏死因子-α的酶联免疫吸附检测：人TNF-αELISA BM S223/4TEUCE，Bender Med System Inc，Burlinghane CA 94010)定量TNF-α的浓度。

图2示出了在培养物中存在化合物12，其浓度为10^-6M和10^-7M，以统计学显著方式减少在LPS刺激的PBMC培养物的上清液中定量测定的TNF-α浓度(p＜0.05)。然而，化合物12在10^-6M也降低了PBMC自发的TNF-α的产生。

表5.-健康志愿者的TNF-α产生。结果以所分泌的细胞因子的中位数±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应p值(相对于各实验条件的赋形剂的数据)包含在括号内。

化合物12的免疫调节效果进一步用PBMC在LPS刺激单核细胞之后或者单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28的组合物活化淋巴细胞之后产生的细胞因子来表征。该研究在来自健康志愿者和类风湿性关节炎病人的PBMC的培养物中存在或不存在滴定剂量的化合物12的情况下进行。

13名健康志愿者的PBMC(5x10⁴细胞/孔)培养于200μl添加了最高溶剂浓度(10^-6M)、或10^-6M和10^-7M的化合物12的完全培养基中，并且在LPS(10μg/ml)存在或不存在的情况下培养24小时。培养上清液冷冻至-20℃并以BD FACS Array生物分析仪(BD Biosciences Cat No.340128，San Diego CA 92121)使用特定试剂来同时测定预期细胞因子浓度(CBA Flex Multiplex Set(BD^TM Cytometric Bead Array，CBA：IL-8，IL-10，TNF-αand IFN-γBecton Dickinson Biosciences Pharmingen，San Diego CA 92121)。

以浓度为10^-6M和10^-7M存在于培养基中的化合物12以统计学显著的方式(p＜0.05)减少了通过LPS刺激的健康志愿者的PBMC产生的TNF-α。相反地，PBMC通过单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28刺激产生以及其自发产生(在不存在外援刺激的情况下观测)的TNF-α分泌物，都没有被化合物12改变。

表6.-健康志愿者的TNF-α产生。结果以所分泌的细胞因子的平均值±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应的p值(相对于每种实验条件下赋形剂的数据)包含在括号内。

在另一个实验中，来自7名类风湿性关节炎病人的PBMC(5x10⁴细胞/孔)以双份培养于200μl添加了最高溶剂浓度(10^-6M)、或10^-6M、10^-7M和10^-8M的化合物12的完全培养基中，并在存在或不存在LPS(10μg/ml)或抗-CD3(12.5ng/ml)(Orthoclone OKT3，Ortho Pharmaceutical Corporation，Raritan NJ，美国)+抗-CD28(1/3x10⁵)(Clon 15E8，Menarini，马德里，西班牙)的情况下培养24小时。培养上清液冷冻至-20℃，以BDFACS Array生物分析器使用专门用于测定该细胞因子浓度的CBA Flex Set(Becton Dickinson)根据生产厂商的说明书来定量TNF-α的浓度。

在来自类风湿性关节炎病人的LPS刺激的PBMC中，TNF-α的产生被浓度为10^-6M的化合物12显著地抑制(p＜0.05)(图4)。培养物中化合物12的存在既不抑制来自类风湿性关节炎病人的PBMC中TNF-α的自发产生，也不抑制通过单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28的刺激得到TNF-α。

表7.-类风湿性关节炎病人的TNF-α产生。结果以所分泌的细胞因子的平均值±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应的p值(相对于各实验条件下赋形剂的数据)包含在括号内。

实施例7.化合物12对IFN-γ的产生的影响。

13名健康志愿者的PBMC(5x 10⁴细胞/孔)以双份培养于添加了最高溶剂浓度(10^-6M)、和10^-6M、10^-7M、和10^-8M的化合物12的200μl完全培养基中，并且在存在或不存在LPS(10μg/ml)或者抗-CD3(12.5ng/ml)+抗-CD28(1/3x10⁵)的情况下培养24小时。培养上清液冷冻至-20℃，以BD FACS Array生物分析器使用专门用于测定IFN-γ浓度的CBA Flex Set(Becton Dickinson)根据生产厂商的说明书来定量TNF-α的浓度。

浓度为10^-6M的化合物12显著地抑制来自健康志愿者的PBMC在LPS刺激下或者单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28刺激下的IFN-γ的产生(p＜0.05)(图5)。

表8.-健康志愿者的INF-γ产生。结果以所分泌的细胞因子的平均值±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应的p值(相对于各实验条件下赋形剂的数据)包含在括号内。

化合物12没有改变来自健康志愿者的PBMC的IFN-γ的自发分泌。

来自8名类风湿性关节炎病人的PBMC(5x10⁴细胞/孔)以双份培养于200μL的添加了最高溶剂浓度(10^-6M)、和10^-6M、10^-7M和10^-8M的化合物12的完全培养基中，并在存在或不存在LPS(10μg/ml)或抗-CD3(12.5ng/ml)+抗-CD28(1/3x10⁵)的情况下培养24小时。培养上清液冷冻至-20℃，以BD FACS Array生物分析器使用专门用于测定IFN-γ浓度的CBAFlex试剂盒(Becton Dickinson)根据生产厂商的说明书来定量测定IFN-γ的浓度。

当以单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28刺激诱导之后，浓度为10^-6M、10^-7M和10^-8M的化合物12的存在显著地降低了来自类风湿性关节炎病人的PBMC中IFN-γ的产生(p＜0.05)(图6)。对于来自健康志愿者的PBMC，化合物12既不改变自发的IFN-γ分泌，也不改变LPS诱导下的IFN-γ分泌。

表9.-类风湿性关节炎病人的TNF-γ产生。结果以所分泌的细胞因子的平均值±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应的p值(相对于各实验条件下赋形剂的数据)包含在括号内。

实施例8.化合物12对白介素8(IL-8)的产生的影响

进一步研究了在存在或不存在LPS刺激和单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28的情况下化合物12对来自健康志愿者的PBMC的IL-12的产生的影响。来自13名健康志愿者的PBMC(5x 10⁴细胞/孔)以双份在200μl的添加了最高溶剂浓度(10^-6M)、和10^-6M、10^-7M和10^-8M的化合物12的完全培养基中培养，并且在存在或不存在LPS(10μg/ml)或者抗-CD3(12.5ng/ml)+抗-CD28(1/3x10⁵)的情况下培养24小时。培养上清液冷冻至-20℃，以BD FACS Array生物分析器使用专门用于测定IL-8的浓度的CBA Flex Set(Becton Dickinson)根据生产厂商的说明书来定量测定IL-8的浓度。

在浓度为10^-6M、10^-7M和10^-8M时，化合物12显著地抑制IL-8的自发产生(p＜0.05)(图7)。在化合物12浓度为10^-7M和10^-8M时观察到了单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28诱导的IL-8的产生的显著抑制。然而，没有观察到在PBMC的LPS刺激下对IL-8生产的影响。

表10.-健康志愿者的IL-8产生。结果以所分泌的细胞因子的平均值±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应的p值(相对于各实验条件下赋形剂的数据)包含在括号内。

还研究了来自类风湿性关节炎病人的PBMC中IL-8产生的效果。来自8名类风湿性关节炎患者的PBMC(5x10⁴细胞/孔)以双份培养于200μl添加了最高溶剂浓度(10^-6M)、和10^-6M、10^-7M和10^-8M的化合物12的完全培养基中，并在存在或不存在LPS(10μg/ml)或抗-CD3(12.5ng/ml)+抗-CD28(1/3x10⁵)的情况下培养24小时。培养上清液冷冻至-20℃，以BD FACSArray生物分析器使用专门用于测定IL-8浓度的CBA Flex Set根据生产厂商的说明书来定量IL-8的浓度。

培养基中浓度为10^-6M和10^-8M的化合物12的存在，显著地改变了来自类风湿性关节炎病人的PBMC中LPS诱导的IL-8的产生，但是既没有改变其自发的IL-8的产生，也没有改变由单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28联合诱导的IL-8的产生(图8)。总之结果显示化合物12对IL-8的改变可能有趣地展示了在健康和确定疾病的不同情况下的不同改变模式。

表11.-类风湿性关节炎病人的IL-8产生。结果以所分泌的细胞因子的平均值±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应的p值(相对于各实验条件下赋形剂的数据)包含在括号内。

实施例9化合物12对白细胞介素10(IL-10)产生的影响

研究了在存在和不存在LPS刺激和单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28的组合的情况下，化合物12对来自健康志愿者和类风湿性关节炎病人的PBMC中IL-10产生的影响。来自13名健康志愿者的PMBC(5x10⁴细胞/孔)以双份在200μl添加了最高溶剂浓度(10^-6M)、和10^-6M、10^-7M和10^-8M的化合物12的完全培养基中培养，并且在存在或不存在LPS(10μg/ml)或者抗-CD3(12.5ng/ml)+抗-CD28(1/3x10⁵)的情况下培养24小时。

另一方面，来自8名类风湿性关节炎病人的PMBC(5x 10⁴细胞每孔)以双份在200μl添加了最高溶剂浓度(10^-6M)、和10^-6M、10^-7M和10^-8M的化合物12的完全培养基中培养，并且在存在或不存在LPS(10μg/ml)或者抗-CD3(12.5ng/ml)+抗-CD28(1/3x10⁵)的情况下培养24小时。培养基上清液在-20℃下冷冻，以BD FACS Array生物分析器使用专门用于测定IL-10的浓度的CBA Flex Set根据生产厂商的说明书来定量测定IL-10的浓度。

在存在或不存在两种被研究的刺激的情况下，化合物12对来自健康志愿者的PBMC的IL-10产生没有影响(图9)。但是，在来自类风湿性关节炎病人的PBMC用LPS刺激后，培养基中浓度为10^-8的化合物12的存在显著地上调IL-10的产生(p＜0.05)。化合物12对来自类风湿性关节炎病人的PMBC的IL-10的自发产生或用单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28刺激后的产生没有显著的影响(图10)。

表12健康志愿者的IL-10产生。结果以所分泌的细胞因子的平均值±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应的p值(相对于各实验条件下赋形剂的数据)包含在括号内。

表13类风湿性关节炎病人的IL-10产生。结果以所分泌的细胞因子的平均值±标准误差值表示。统计学显著的结果以粗体表示，其对应的p值(相对于各实验条件下赋形剂的数据)包含在括号内。

化合物12对免疫系统细胞的其他影响

实施例10化合物12对PMBC的增殖反应的影响

在存在或不存在物植物血球凝集素(PHA)10μg/ml；PHA 2μg/ml+外源性IL-2补充(25IU/ml)，以及单克隆抗体抗CD3(12.5ng/ml)和抗CD28(1∶320.000)的结合的刺激的情况下，研究了化合物12对来自健康自愿者(n＝8)的PBMC的增殖反应的影响。

PBMC在完全培养基中于37℃和5％CO₂大气(细胞培养箱HERA Cell150，Thermoscientific，Thermoelectron，63505Lagenselbold，GE)下培养4天(50.000细胞/孔)。培养刺激条件是不存在或存在植物血球凝集素(PHASigma Ref#L-8902，马德里，西班牙)，10μg/ml；PHA 2μg/ml+外源性IL-2补充(25IU/ml，人重组IL-2，Macrolin，Chiron Ibérica，batch#SA753228/4，马德里，西班牙)以及单克隆抗体抗-CD3(12.5ng/ml)+抗-CD28(1∶320.000)。在培养的最后8小时期间，加入甲基-³H-胸苷(美国放射性化学试剂60Ci/mmol甲基-³H-胸苷，ITISA，马德里，西班牙)。细胞收集在玻璃纤维膜上，并嵌入到闪烁介质中(1450-441Meltilex A，de Wallac Oy，Ref#1450-441)。用β粒子计数器Wallac Oy定量DNA结合放射性。作为培养物的细胞活力的控制，在显微镜(Zeiss Axiovert 40CFL，Karl Zeiss Microimagen GmbH，

德国)下观察培养基中的细胞结构的密度和形态学，为了检测和定量PBMC中的研究分子可能存在的促有丝分裂直接作用而没有其他信号，并评估孵化期后的细胞活力。

在不存在和存在各种被研究的促有丝分裂刺激的情况下，培养基中化合物12的存在没有显著地改变来自健康志愿者的PBMC的增殖反应(图11a和11b)。

实施例11.化合物12对PBMC中的CD62L脱落的影响

研究化合物12对来自健康志愿者的PBMC的淋巴细胞和单核细胞中的CD62L脱落的影响。

当存在浓度为10^-6M的化合物12时，CD62L脱落(CD62L-藻红蛋白(PE)，clon BD SK 11 Cat No.341012，BD Biosciences)显著增加(p＜0.05)。值得注意地，在CD62L的脱落选择性地发生在淋巴细胞后，检测到CD62L-PE标记的几何平均荧光强度(MFI)降低，但在单核细胞中没有观察到显著性的差异(图12a和12b)。

表14淋巴细胞中的表面CD26L表达的平均荧光强度。p值对应各实验条件下的赋形剂的数据。

表15单核细胞中的表面CD26L表达的平均荧光强度。p值对应各实验条件下的赋形剂的数据。

Claims

1.式(I)化合物或其药物学上可接受的盐、前药和/或溶剂化物在制备用于治疗急性或慢性炎性疾病的药物中的用途，其通过抑制至少一种选自TNF-α和IFN-γ的促炎细胞因子的产生，或者通过免疫调节IL-8趋化因子和/或IL-10调控细胞因子，

其中：

R₁选自取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂环基；

R₂选自氢、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的环烷基、和N(R’R”)，其中R’和R”独立地为氢或C₁-C₆烷基；和

R₃是C_1-6烷基。

2.根据权利要求1的用途，其中急性或慢性炎性疾病选自急性和慢性血清阳性或血清阴性的寡关节炎和多关节炎、脊椎关节炎、肾小球肾炎、胶原病、肾小管间质性肾炎、代谢综合征、动脉粥样硬化、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺病、多发性硬化、脱髓鞘疾病、脑膜炎、脑炎、脑膜脑炎、炎症性神经根病和周围神经病、发炎性肠病、肝硬化、肝炎、心力衰竭、局部缺血疾病、肾衰竭、炎症性膀胱炎、良性前列腺增生症、前列腺炎、心肌炎、心包炎、葡萄膜炎、异位性皮炎、湿疹、荨麻疹、牛皮癣、酒渣鼻、过敏性鼻炎、败血症、感染性休克、多器官衰竭，系统性自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、脉管炎、皮肌炎、淀粉样变性或肉样瘤病，器官特异性自身免疫性疾病如重症肌无力、甲状腺炎或幼年型糖尿病、器官移植、感染和肿瘤诱导的炎症、TNF-α依赖性细胞衰退、坏死、细胞凋亡、移植物抗宿主病、恶病质和自分泌和旁分泌性病理细胞生长。

3.根据权利要求2所述的用途，其中慢性炎性疾病是血清阳性或血清阴性的慢性多关节炎。

4.根据权利要求3所述的用途，其中慢性多关节炎是类风湿性关节炎。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中R₁是取代或未取代的C₁-C₆烷基。

6.根据权利要求5所述的用途，其中R₁是甲基。

7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其中R₂是取代或未取代的环烷基。

8.根据权利要求7所述的用途，其中R₂是环戊基。