TWI403506B - 用於治療急性和慢性發炎疾病之５－（４－甲磺醯基－苯基）－噻唑衍生物類 - Google Patents

用於治療急性和慢性發炎疾病之５－（４－甲磺醯基－苯基）－噻唑衍生物類 Download PDF

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Description

用於治療急性和慢性發炎疾病之5-(4-甲磺醯基-苯基)-噻唑衍生物類
本發明關於衍生自5-(4-甲磺醯基-苯基)-噻唑之化合物類於製備用於治療急性或慢性發炎疾病或狀況(諸如類風濕性關節炎)之醫藥產品上之用途。
免疫學是區別自體與非自體之間之科學研究。對自體耐受性之崩解係自體免疫性疾病之起源。另外，其他狀況諸如移植、動脈粥樣硬化、敗血性及非敗血性急性或慢性發炎病理學和許多其他到目前為止不被視為自體免疫之疾病亦展現由免疫細胞所媒介之病理機制。大多數作者認為免疫發炎效應物反應之活化係基於二個信號：
-信號1包含刺激該細胞系抗原之受器(TCR-CD3 T細胞受器複合物)，以辨識該包埋在該主要組織相容性複合物(MHC)分子中之同源抗原。在B細胞中，細胞外可溶性或膜結合性抗原與該免疫球蛋白CD79(Ig/CD79)細胞系受器複合物交聯以遞送該信號1至該抗體分泌性淋巴細胞系。
-除抗原遞送之信號1之外，需要信號2以避免因反應低落(anergy)或細胞系刪除所導致之耐受性。信號2係由共刺激物遞送，諸如表現在專業抗原表現細胞(APC)(如人單核細胞及彼等之分化系統後代)之表面上之CD86。
在先天性免疫發炎反應中，危險信號會被刺激模式辨識受器(PRR)之微生物及自身調節性抗原或分裂原所提升。PRR傳信途徑諸如TLR4(革蘭氏陰性細菌細胞壁脂多醣或LPS之受器)遞送高量共刺激表面分子(也就是CD80或CD86)之表現。接下來，共刺激配位體CD80-CD86和T幫助細胞表面之CD28交聯。信號1(也就是抗CD3抗體交聯)與信號2(也就是CD28被特定抗體交聯)之組合實驗性地模擬有效發炎效應物免疫反應之天然條件。值得注意的是，經核准之免疫抑制藥物在高量共刺激之條件下對於抑制前發炎細胞介素級聯之活化上有若干困難。後者發生於自體免疫疾病和許多其他嚴重的急性或慢性發炎狀況中。
APC不只是後天免疫系統中決定免疫反應種類之關鍵，因為它們深切地影響該挑戰細胞系所媒介的是效應物(也就是T細胞幫助(Th)、細胞性細胞毒性(Th)、抗體產生(B細胞))反應或是耐受性反應(反應低落或細胞凋亡)。APC本身亦可遞送效應物直接免疫反應。一證據充分之實例係單核細胞在癌症病患中產製及釋放高量之腫瘤壞死因子α(TNF-α)。在該等病患中，TNF-α促進放大反應及血管內皮細胞之活化，伴隨介白素8(IL-8)和其他前發炎細胞介素之分泌以及前凝血劑活性。同時，TNF-α促進血栓形成及缺血性腫瘤壞死，此作用導致惡病質素(cachectin)或TNF-α之原始定義。然而，TNF-α係一涉及許多其他疾病狀況之多向性細胞介素。經年累月的證據顯示，LPS可刺激單核細胞分泌大量TNF-α，這強烈導致敗血性休克之發生。最近，高量TNF-α之不當產製及分泌被認為是自體免疫發炎疾病(諸如類風濕性關節炎、脊椎關節病、克隆氏病、葡萄膜炎及牛皮癬)之治療目標。因此，目前已經廣泛地認為使用抗TNF-α係治療該些疾病之最新策略，其中降低可獲得之生物活性TNF-α之量可能導致改善該病患之狀況。
就這方面來說，可能得益於TNF-α拮抗劑治療之疾病數目正在快速增加中，包括動脈粥樣硬化、代謝性徵候群、腦炎、病毒性肝炎、腎小球性腎炎、對腫瘤之不當發炎反應及敗血性休克等。
除了該些由若干體細胞產製者之外，TNF-α有二個主要的產製來源，單核細胞與T淋巴細胞。在獲得性免疫反應之過程中，令APC在前發炎指導情況下展示至危險信號刺激IL-12 p70(p35及p40之雜二聚體)分泌，後者係使該經活化之Th細胞之細胞介素分泌特性極化成為Th-1型之共刺激分子。Th1細胞展現特徵化之細胞介素特性，其中干擾素γ(IFN-γ)分泌係真正的足跡。該等細胞亦分泌高量之TNF-α。
由Th1分泌之IFN-γ促進許多對發炎疾病之了解上可能重要之效果。一方面，其進一步活化單核細胞且增加給定刺激所引起之TNF-α分泌量。另一方面，其促使TNF-α受器下游更強烈之信號途徑。總而言之，IFN-γ除了其本身之直接效果諸如抗病毒活性之外，還能增加MHC-II之表現且藉由增加TNF-α仍然強烈之效果以造成發炎及病灶。
前發炎級聯係由單核細胞之TNF-α或Th1細胞之IFN-γ及TNF-α產製所起動，該級聯透過其他前發炎細胞介素途徑(諸如IL-8)擴大。IL-8(不管其原始命名)被描述為一種由巨噬細胞和其他細胞種類(諸如上皮細胞)所產製之趨化激素，其亦可由內皮細胞合成，因此也被稱為CXCL8。雖然嗜中性顆粒細胞係IL-8之主要標靶細胞，但有相當廣泛種類之細胞(內皮細胞、巨噬細胞、肥大細胞、角質化細胞)對此趨化激素亦有反應。IL-8之主要功能係誘導其標靶細胞(例如嗜中性顆粒細胞)之趨化性。在嗜中性細胞中，移動及其主要功能吞噬作用所需之細胞生理系列反應亦被引發，諸如細胞內Ca2+增加、胞外分泌(例如組織胺釋放)及呼吸爆發。IL-8可由任何具有TLR之細胞分泌，TLR係與先天性免疫反應有關。IL-8之主要功能係募集嗜中性細胞以吞噬該引起抗原模式TLR之抗原。藉由傳送IL-8標靶細胞至內皮及其他標靶組織，因此IL-8除了在身體防禦上之作用以外，還與許多TNF-α之病理性作用之擴大及執行有關。
白血球之移動及回歸(homing)不僅由趨化激素和它們的受器所調節，亦由若干黏附分子調節。在這些黏附分子當中，選擇素CD62L被認為是防止白血球移動至淋巴結之治療目標，因此被當作排列非類固醇抗發炎藥物(NSAID)之活體外效果之評估參數。
許多免疫抑制劑及抗TNF-α分子會影響正常之免疫防禦機制，因為它們增進對免疫細胞之細胞毒性作用或抑制在成功效應物免疫反應之前之細胞系擴增底下之增生機制。
考慮到細胞外空間分泌之TNF-α(不論是細胞質膜插入或分泌之可溶性形式)之重要性，許多研究已致力於設計可阻斷細胞外TNF-α與TNF-受器I及/或TNF-受器II之交互作用之治療劑。最適切之方法為使用可溶性誘餌TNF-受器以捕捉TNF-α，且由於解離需要長時間而防止前發炎配位體與該細胞受器之交互作用。
第二種策略係以習知方式產製人化抗人TNF-α抗體或產製也以給定疾病相關之其他分子為標的之雙特異性單鏈分子(例如在類風濕性關節炎中之抗VEGF/抗TNF-α)。雖然上述之分子係TNF-α拮抗劑，它們限制它們的作用機制以阻斷胞外分泌之TNF-α。
能驅使TNF-α產製及分泌之詳盡但不完全之標的清單可能為：(a)驅使轉錄表現TNF-α之分子；(b)驅使TNF-α-RNA從細胞核運送至細胞質及RNA剪切之分子；(c)指引TNF-α轉譯之分子；(d)調節TNF-α-mRNA安定性之分子；(e)指引高基小胞至前TNF-α表面形式錨定處之細胞膜之分子；(f)與分泌釋放TNF-α有關之分子諸如TNF-α轉換酶(TACE)及(g)調節前TNF-α之表面形式之內化及其信號之分子。所有這些皆關於TNF-α產製及分泌之細胞標的。
雖然有以不同方式設計之阻斷TNF-α之產製之治療劑，若能發現選擇性阻斷不只是TNF-α產製還有其他關鍵前發炎細胞介素(如IFN-γ)產製之新穎藥物將受到高度重視。
發明摘要
本發明之作者意外發現式(I)化合物顯示一些高度有趣之免疫調節效果，它們可能適用於控制急性和慢性發炎疾病之病理機制，因此具有潛在的臨床應用價值。具體地說，本發明所使用之化合物已能抑制來自慢性發炎疾病(諸如類風溼性關節炎)病患之週邊血液單核細胞(PBMC)之TNF-α產製，亦能抑制該些細胞經T細胞刺激後之IFN-γ分泌。此外，式(I)化合物已能調控分泌趨化激素(即IL-8)和調節性細胞介素(即IL-10)之生物反應特性，且在健康及疾病狀態下以不同之方式調控。式(I)化合物之整體免疫調控效果不會對來自週邊血液之單核細胞造成任何毒性效應。另外，在細胞分裂刺激後之活化及增生反應並不受這些化合物之調節甚或增加。
在這一個小分子中就同時具有對數種前發炎細胞介素如TNF-α及IFN-γ之抑制效果與調節IL-8趨化激素及/或IL-10調節性細胞介素(所有均在系統性及器官特異性自體免疫異常、移植、急性和慢性發炎疾病、某些代謝性及退化性疾病與動脈粥樣硬化之病理生理學中具有關鍵重要性)之潛能，使式(I)化合物得以歸類於新穎之免疫調節劑類別，並以具有臨床及治療重要性之各種可能之再程序化層級之前發炎/調節性細胞介素及趨化激素之級聯為標的。
顯而易見的是，免疫細胞係無柄且進入器官以巡邏在發炎狀況中被浸潤之身體組織，其中免疫細胞聚集於根據疾病活性、目標器官及損害程度而分佈之病灶中。由於本發明所使用之化合物被預期可調節該病理生理過程之若干形態，因此可利用顯影試驗以特徵化受器數量、結合效率、受器佔用率及藥物探針濃度。由於白血球具有回歸特性，偵測該治療性目標也能得到有關該標靶細胞及該病灶部位之位置之資訊。
因此，式(I)化合物亦展現一種在藥物發展、臨床試驗及個體化醫藥上作為顯影生物標記之用途，這能提供的不只是藥物動力學、分佈及投藥之資訊，還包含在臨床前及臨床試驗中有關個體化反應模式之重要資料。後者可能導致定義經確效、可靠、個體化之臨床終點之替代生物標記，以供投予至需要該預後性及個體化評估式(I)化合物或其醫藥組成物之有效量之病患，以最佳化該領域之技藝人士所知之明確生物顯影技術。
根據第一態樣，本發明關於式(I)化合物：
或其醫藥上可接受之鹽、前藥及/或溶劑合物於製備用於治療急性或慢性發炎疾病之藥物上之用途，其中：R1 係選自氫、經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之芳基或經取代或未經取代之雜環基；R2 係選自經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之環烷基或N(R’R”)，其中R’和R”各別為氫或經取代或未經取代之C1 -C6 烷基；且R3 係未經取代之C1 -6 烷基。在特定實施態樣中，該用於治療急性或慢性發炎疾病之藥物的作用係藉由抑制至少一種選自TNF-α或IFN-γ之前發炎細胞介素之產生，或藉由免疫調節IL-8趨化激素及/或IL-10調節性細胞介素。
在本發明之另一特定實施態樣中，達成該抑制前發炎細胞介素TNF-α之產生係至少部份於TNF-α mRNA之表現量上。
在本發明之特定態樣中，該急性或慢性發炎疾病係選自急性和慢性血清陽性或血清陰性寡關節炎和多發性關節炎、脊椎關節病、腎小球性腎炎、膠原病、腎小管間質性腎炎、代謝性徵候群、動脈粥樣硬化、骨關節炎、氣喘、慢性阻塞性肺病、間質性肺病、多發性硬化症、脫髓鞘病、腦膜炎、腦炎、腦膜腦炎、發炎性神經根病變和週邊神經病變、發炎性腸病、硬化、肝炎、心衰竭、缺血性疾病、腎衰竭、發炎性膀胱炎、良性前列腺增生、前列腺炎、心肌炎、心包膜炎、葡萄膜炎、異位性皮膚炎、濕疹、蕁麻疹、牛皮癬、玫瑰痤瘡、過敏性鼻炎、敗血症、敗血性休克、多重器官衰竭、全身性自體免疫疾病(諸如全身性紅斑性狼瘡)、血管炎、皮膚肌炎、澱粉樣變性症或類肉瘤病、器官特異性自體免疫疾病(諸如重症肌無力)、甲狀腺炎或胰島炎、器官移植、感染和腫瘤引起之發炎、TNF-α依賴性細胞退化、壞死、細胞凋亡、移植物抗宿主病、惡病質或自體分泌和旁分泌病理性細胞生長。
這些治療適應症係至少異常之免疫反應、免疫調節異常、免疫干擾、免疫發病機制、免疫療法、免疫抑制或免疫調節性生物反應之後果。
在另一態樣中，本發明關於式(I’)化合物
或其醫藥上可接受之鹽、前藥及/或溶劑合物，其中：R1 係選自氫、經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之芳基或經取代或未經取代之雜環基；且R3 係未經取代之C1 -C6 烷基。
在第三態樣中，本發明之目的為一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如上述定義之式(I’)化合物或其醫藥上可接受之鹽、前藥及/或溶劑合物，及至少一種醫藥上可接受之載劑、佐劑及/或賦形劑。
本發明之另一態樣關於如上述定義之式(I’)化合物，其用途係作為藥物。
最後，本發明之另一態樣關於如上述定義之式(I)化合物(特別是式(I’)化合物)於顯影和藥理顯影技術中作為顯影生物標記之用途。該些生物標記可被用於找出免疫病灶、標靶細胞及標的分子。
 本發明之詳細說明
在本發明之上下文中，下列用語具有如下詳述之意義：用語「C1-6 烷基」係指由碳及氫原子所組成之線狀或分支烴鏈基團，不含不飽和烴，具有一至六個碳原子，且係以單鍵與其餘分子連接，例如甲基、乙基、n-丙基、i-丙基、n-丁基、t-丁基、n-戊基等。C1-6 烷基基團可選擇性地被一或多個取代基取代，諸如環烷基、芳基、雜環基、鹵基、羥基、烷氧基、氰基、胺基、硝基或烷硫基。
用語「環烷基」係指飽和或部分飽和之安定3至8元環狀基團，其僅由碳及氫原子組成，諸如環己基或環戊基。除非說明書中另外具體說明，用語「環烷基」係意圖包括可被至少一取代基選擇性地取代之環烷基基團，該取代基係獨立選自氫、C1-6 烷基基團、鹵基、羥基、-N(R3 )(R4 )，其中R3 及R4 係獨立選自氫及線狀或分支C1-6 烷基基團。
用語「芳基」係指安定之5至8元芳香環狀基團，且其僅由碳及氫原子組成，諸如苯基或環辛四烯。除非說明書中另外具體說明，用語「芳基」係意圖包括可被至少一取代基選擇性地取代之芳基基團，該取代基係獨立選自氫、C1-6 烷基基團、鹵基、羥基、-N(R3 )(R4 )，其中R3 及R4 係獨立選自氫及線狀或分支C1-6 烷基基團。
「雜環基」係指安定之3至8元環狀基團，其係由碳原子及一至五個選自氮、氧及硫之雜原子所組成。就本發明之目的而言，該雜環可能為部份或完全飽和或芳香。該雜環之實例包括但不限於吡咯啶、吡啶、噻吩、呋喃等。除非說明書中另外具體說明，用語「雜環基」係意圖包括可被至少一取代基選擇性地取代之雜環基基團，該取代基係獨立選自氫、C1-6 烷基基團、鹵基、羥基、-N(R3 )(R4 )，其中R3 及R4 係獨立選自氫及線狀或分支C1-6 烷基基團。
用語「鹵基」係指溴基、氯基、碘基或氟基。
用語「急性和慢性血清陽性或血清陰性寡關節炎和多發性關節炎」係指具有陽性或陰性類風濕性因子之涉及一或數個動關節之滑膜炎疾病，包括類風濕性關節炎及原發性及繼發性休格倫氏徵候群。
用語「脊椎關節病」係指涉及骶髂關節及/或脊椎及/或週邊關節之免疫病理性HLA-B27相關之發炎疾病，亦包括葡萄膜炎。
用語「腎小球性腎炎」係指腎小球之發炎病灶。
用語「腎小管間質性腎炎」係指涉及腎小管及腎間質之發炎疾病。
用語「膠原病」係指具有病理免疫機制之系統性發炎疾病，包括全身性紅斑性狼瘡(SLE)、皮膚肌炎及硬皮病。
用語「發炎性腸病」係指具有病理免疫機制之胃腸道發炎疾病，不論有或無系統性特徵，包括克隆氏病及潰瘍性結腸炎。
用語「阻塞性肺病」係指用力吐氣體積(FEV)可逆或不可逆降低之支氣管疾病，包括氣喘及慢性阻塞性肺病。
用語「間質性肺病」係指涉及肺間質之發炎疾病。
用語「脫髓鞘病」係指具有引發髓鞘溶解之病理免疫機制之中樞神經系統發炎疾病，包括多發性硬化症及視神經炎。
用語「腦膜炎、腦炎及腦膜腦炎」係指腦膜及/或中樞神經系統其他構造之發炎疾病。
用語「發炎性神經根病變和週邊神經病變」係指週邊神經系統之發炎疾病。
用語「發炎性膀胱炎」係指膀胱之發炎疾病。
用語「良性前列腺增生」係指前列腺之非惡性肥大及/或增生。
用語「異位性皮膚炎、濕疹及蕁麻疹」係指具有不論有或無關於IgE之免疫病理機制之過敏性皮膚疾病。
用語「牛皮癬」係指與免疫系統病理機制有關之過度角化及紅斑性皮膚反應。
用語「玫瑰痤瘡」係指皮膚之常見發炎狀況，特徵為在臉部中央出現紅斑(潮紅及發紅)，亦可橫過臉頰、鼻子或前額，較少出現在頸部及胸部。
用語「過敏性鼻炎」係指間歇性(亦稱為季節性)或持續性(亦稱為經年性)發炎鼻黏膜疾病，其與免疫過敏病理機制有關。
用語「敗血症、敗血性休克及多重器官衰竭」係指對微生物劑或其他致病因子之異常免疫反應所媒介之系統性發炎疾病。
用語「類肉瘤病及澱粉樣變性症」係指器官及/或系統性涉入且無明確定義原因之自發性免疫疾病，其中可觀察到異常之免疫反應。
用語「器官特異性自體免疫疾病」係指並無經定義之致病因子之免疫系統媒介之器官病灶，包括重症肌無力、甲狀腺炎、腦垂體炎、腎上腺炎及其他。
用語「器官移植」係指預防及治療經移植之細胞、組織及器官之排斥。
用語「感染和腫瘤引起之發炎」係指繼發於微生物劑或癌症刺激之異常免疫反應。
用語「TNF-α依賴性細胞退化、細胞凋亡或壞死」係指由TNF-α所引起之組織退化或死亡。
用語「移植物抗宿主病」係指由移植細胞所引起之發炎免疫反應。
用語「惡病質」係指由發炎或腫瘤性疾病所引起之系統性厭食或營養不良及體重減輕。
用語「動脈粥樣硬化」係指繼發於粥樣瘤或由發炎細胞(大部分為巨噬細胞)及含有脂質之細胞碎片堆積於動脈壁所引起之任何動脈硬化。
用語「缺血性疾病」係指繼發於組織氧合狀態及/或血流降低之器官病灶包括心臟及腦血管缺血。
用語「自體分泌和旁分泌病理性細胞生長」係指細胞利用TNF-α作為調節細胞活化及增生因子之細胞介素之惡性或良性疾病。
除非另外說明，本發明所使用之化合物係意圖包括只有一或多個同位素富集原子存在差異之化合物。舉例來說，具有本結構但以氘或氚取代氫，或以13 C-或14 C-富集碳或15 N-富集氮取代碳之化合物係屬於本發明之範圍內。
用語「其醫藥上可接受之鹽、溶劑合物或前藥」係關於當被投予至接受者時可(直接或間接)提供化合物諸如此處所描述者之鹽、溶劑合物或前藥。然而，將會發現醫藥上不可接受之鹽亦屬於本發明之範圍內，因為它們可被用於製備醫藥上可接受之鹽。鹽、前藥及衍生物可利用該最新所知之方法製備。「醫藥上可接受」係較佳地關於當投予至人或動物時為生理上可耐受且通常不會造成過敏反應或類似不利反應諸如胃異常、暈眩及該類似反應之分子實體及組成物。用語「醫藥上可接受」代表其經過聯邦或州政府之管理機構核准或被包括在美國藥典或其他普遍公認之用於動物特別是人之藥典。
舉例來說，本發明先前所描述之化合物之醫藥上可接受之鹽係利用習知化學方法從該含有鹼性或酸性單位之先前描述之化合物合成。該鹽通常藉由例如使該些化合物之游離酸性或鹼性形式與化學當量之在水或有機溶劑或二者之混合物中之適當鹼或酸反應而加以製備。不含水之介質諸如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈通常係較佳地。酸添加鹽之實例包括例如礦物酸添加鹽諸如氯化氫、溴化氫、碘化氫、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽及例如有機酸添加鹽諸如醋酸鹽、順丁烯二酸鹽、延胡索酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽及對甲苯磺酸鹽。鹼添加鹽之實例包括例如無機鹽諸如鈉、鉀、鈣、銨、鎂、鋁、鋰，及例如有機鹼鹽諸如乙二胺、乙醇胺、N,N-二烯基乙醇胺、還原葡糖胺及鹼性胺基酸鹽。
用語「前藥」在此處係定義為一種已經歷化學衍生作用諸如取代或添加額外化學基團以改變(為了醫藥用途)彼之一些物理化學特性(諸如溶解性或生物利用率)之化學化合物，例如衍生自活性化合物之酯或醚在被投予至個體後產生本身之活性化合物。用於從給定之活性化合物產製前藥之廣為週知之方法實例係為該領域之技藝人士所知，且可見於例如Krogsgaard-Larsen et al.,Textbook of Drug Design and Discovery,Taylor ＆ Francis(April 2002)。根據本發明，用語「溶劑合物」係用來代表有其他分子(最可能的是極性溶劑)經由非共價鍵與其結合之任何形式之本發明之化合物。溶劑合物之實例包括水合物及醇化物例如甲醇化物。
特別較佳之前藥係當該化合物被投予至病患時可增加本發明之化合物之生物利用率者(例如使經口投予之化合物更快地被吸收至血液中)或該些相對於原始化合物可增加原始化合物分佈至生物隔室(例如腦或淋巴系統)者。
本發明所使用之化合物可呈游離化合物或溶劑合物(例如水合物)之結晶形式也就是多形體，應了解的是二種形式皆屬於本發明之範圍內。溶合方法係該領域所普遍知悉。適當之溶劑合物係醫藥上可接受之溶劑合物。在特定實施態樣中，該溶劑合物係水合物。
鹽、溶劑合物及前藥可利用最新已知之方法製備。將可觀察到醫藥上不可接受之鹽、溶劑合物或前藥亦包括在本發明之範圍內，因為它們可被用於製備醫藥上可接受之鹽、溶劑合物或前藥。
式(I)化合物或彼等之鹽或溶劑合物係較佳地呈醫藥上可接受之形式或實質上純的形式。醫藥上可接受之形式被了解為特別是具有排除正常醫藥添加劑諸如稀釋劑及賦形劑之醫藥上可接受之純度，且不包含任何在正常劑量程度下被認為具有毒性之物質。該藥物之純度較佳係高於50%，更佳為高於70%，且仍然更佳係高於90%。在較佳之實施態樣中，其係高於95%之式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥。
以上述式(I)所顯示之本發明之化合物可包括依手性中心存在而定之鏡像異構物或依多鍵存在而定之異構物(例如Z、E)。各種異構物、鏡像異構物、非鏡像異構物及彼等之混合物係屬於本發明之範圍內。
在特定之實施態樣中，為了供顯影和藥理顯影技術上之用途，或在藥物發展、臨床試驗及個體化醫藥上作為生物標記之替代用途，式(I)化合物可經螢光或發光標籤或旗幟標示，該標記利用該領域之技藝人士所知之任何方法導入。
在本發明之特定實施態樣中，R1 係經取代或未經取代之C1 -C6 烷基。較佳之R1 係甲基。
在另一特定之實施態樣中，R2 係經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之環烷基。較佳的是，R2 係經取代或未經取代之環烷基。更佳的是，R2 係環戊基。在另一較佳之實施態樣中，R2 係經取代或未經取代之C1 -C6 烷基。較佳的是，R2 係經雜環基取代之C1 -C6 烷基。更佳的是，R2 係經環氧乙烷取代之C1 -C6 烷基。
在另一特定之實施態樣中，R3 係甲基。
在另一更為特定之實施態樣中，本發明所使用之式(I)化合物係選自下列化合物，或其醫藥上可接受之鹽、前藥及/或溶劑合物。
本發明所使用之式(I)化合物可利用可得到之合成方法獲得。舉例來說，它們可利用下列圖示所摘要之方法製備。
此方法首先包含化合物4-R3 -苯硫基乙酸之酯化反應以產生甲基酯衍生物。該反應可利用甲基化劑(諸如MeI)在鹽(諸如NaHCO3 )存在時進行，或利用MeOH作為甲基化劑在酸性介質存在時進行。
在下一步驟中，該甲基酯衍生物(選擇性地不經任何純化)利用氧化劑(例如發氧方(oxone))在該硫原子處氧化，因此從該硫醚基團得到該碸化合物。
接下來以諸如NBS之劑進行鹵化作用，導致在該酯基團之α-位置形成鹵化物。以不同之硫醯胺在加熱下進行此化合物之環化加成作用以產生高純度之R1 -經取代之5-(4-R3 -磺醯基-苯基)-4-羥基噻唑。
用於此環化加成作用之硫醯胺係得自對應如J. Med. Chem(34)2158-2165,1991 及J. Org. Chem.(65),13,3973,2000 中所述之勞森試劑之醯胺。該硫醯胺包括其中R1 係選自如上述定義之氫、經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之芳基或經取代或未經取代之雜環基之化合物。
經由羥基導入R2 基團可利用技藝人士所知之任何方法進行以產生本發明所使用之式(I)化合物。在特定實施態樣中，該羥基基團係與式R2 -Hal之鹵化物(較佳為R2 -Br)反應，以提供式(I)化合物。
在所提到之反應中使用之所有反應物可自商業購得。
在另一態樣中，本發明提供一種式(I’)化合物
或其醫藥上可接受之鹽、前藥及/或溶劑合物，其中：R1 係選自氫、經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之芳基或經取代或未經取代之雜環基；且R3 係未經取代之C1 -C6 烷基基團。
在特定之實施態樣中，R1 係經取代或未經取代之C1 -C6 烷基。較佳之R1 係甲基。
在另一特定之實施態樣中，R3 係甲基。
在另一特定之實施態樣中，本發明之式(I’)化合物係選自下列，或其醫藥上可接受之鹽、前藥及/或溶劑合物。
本發明另提供用於投予至病患之醫藥組成物，該醫藥組成物包含該新穎之本發明之式(I’)化合物，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑合物或前藥，及至少一種醫藥上可接受之載劑、佐劑及/或賦形劑。
在特定之實施態樣中，該式(I)化合物、其醫藥上可接受之鹽、前藥及/或溶劑合物將以治療上之有效量與一或多種醫藥上可接受之載劑、佐劑及/或賦形劑一起被調製成適當之醫藥組成物，以用於投予以預防及/或治療急性或慢性發炎疾病。
用語「載劑、佐劑及/或賦形劑」係關於與活性成分一起投予之分子實體或物質。該醫藥載劑、佐劑或賦形劑可為無菌液體，諸如水及油(包括該些來自石油或動物、植物或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及該類似物)、賦形劑、崩解劑、濕潤劑或稀釋劑。適當之醫藥載劑係描述於E.W. Martin之“Remington’s Pharmaceutical Sciences”。
該醫藥組成物可藉由任何適當之投予方法投予，例如經口、非經腸(例如皮下、腹腔內、靜脈內、肌肉內等)、經直腸投予等，通常係經口投予因為該被治療之疾病具慢性特徵。
在特定實施態樣中，該醫藥組成物可呈經口投予之醫藥形式，不論是固體或液體形式。經口投予醫藥形式之說明性實例包括錠劑、膠囊、顆粒、溶液、懸浮液等，且可包含習知之賦形劑諸如結合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、濕潤劑等，且可以習知方法製備。該醫藥組成物亦可呈例如無菌凍乾產品、懸浮液或溶液之適當劑型以適於彼等之非經腸投予；在此例中，該醫藥組成物將包括適當之賦形劑，諸如緩衝劑、界面活性劑等。在任何例中，該賦形劑將根據該選擇之投予醫藥形式加以選擇。有關投予藥物之不同醫藥形式及彼等之製劑之回顧文獻可見於“Tratado de Farmacia ”by C. Fauli i Trillo,10th Edition,1993,5,S.A. de Ediciones。
就其在治療上之應用，式(I)化合物將較佳地呈醫藥上可接受或實質上純的形式，也就是式(I)化合物具有排除醫藥上可接受之賦形劑之醫藥上可接受之純度，且不包含在正常劑量程度下被認為具有毒性之物質。式(I)化合物之純度較佳係高於50%，更佳為高於70%，更佳係高於90%。在較佳之實施態樣中，純度高於95%。
欲被投予之式(I)化合物之治療上之有效量一般來說將視所欲治療之個體、該個體罹患之疾病之嚴重性、所選擇之投予方法等其他因素而定。因此，本發明所提到之劑量必須僅被視為該領域之技藝人士之參考原則，技藝人士必須根據前述變異參數調整劑量。然而，式(I)化合物可一天投予一次或多次，例如一天1、2、3或4次，典型之每日總量從每天0.1至1000毫克/公斤體重，較佳為每天10毫克/公斤體重。
式(I)化合物、其醫藥上可接受之鹽、前藥及/或溶劑合物以及包含彼等之醫藥組成物可與其它用於治療急性和慢性發炎疾病之額外藥物一起使用。該額外藥物可形成該相同醫藥組成物之部分，或者以分開之組成物之形式提供以與該包含式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽、前藥或溶劑合物之醫藥組成物同時或非同時投予。
在本發明之範圍內，用語「急性和慢性發炎疾病」係關於起因於在異常共刺激係病理機制之狀況下活化及病理涉及發炎/免疫細胞及發炎性細胞介素級聯之任何疾病、異常或狀況。主要牽涉之細胞係發炎/免疫細胞諸如單核細胞、巨噬細胞、APC、T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、漿細胞、顆粒細胞及肥大細胞，或與欲治療之疾病有關之上述細胞亞群之組合。
用語「細胞介素」係指會影響其他細胞功能之分泌蛋白質，特別是關於調控免疫系統之細胞之間或與發炎反應有關之細胞之間之交互反應。該等細胞介素係TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IFN-γ(干擾素-γ)、IL-8(介白素-8)趨化激素及調節性細胞介素IL-10(介白素-10)。IL-10之產製係由高量TNF-α引起，其藉由阻斷前發炎細胞介素之轉錄作用促使形成對TNF-α產製之負向回饋。
在本發明之特定態樣中，該急性或慢性發炎疾病係選自急性和慢性血清陽性或血清陰性寡關節炎和多發性關節炎、脊椎關節病、腎小球性腎炎、膠原病、腎小管間質性腎炎、代謝性徵候群、動脈粥樣硬化、骨關節炎、氣喘、慢性阻塞性肺病、間質性肺病、多發性硬化症、脫髓鞘病、腦膜炎、腦炎、腦膜腦炎、發炎性神經根病變和週邊神經病變、發炎性腸病、硬化、肝炎、心衰竭、缺血性疾病、腎衰竭、發炎性膀胱炎、良性前列腺增生、前列腺炎、心肌炎、心包膜炎、葡萄膜炎、異位性皮膚炎、濕疹、蕁麻疹、牛皮癬、玫瑰痤瘡、過敏性鼻炎、敗血症、敗血性休克、多重器官衰竭、全身性自體免疫疾病(諸如全身性紅斑性狼瘡)、血管炎、皮膚肌炎、澱粉樣變性症或類肉瘤病、器官特異性自體免疫疾病(諸如重症肌無力)、甲狀腺炎或胰島炎、器官移植、感染和腫瘤引起之發炎、TNF-α依賴性細胞退化、壞死、細胞凋亡、移植物抗宿主病、惡病質或自體分泌和旁分泌病理性細胞生長。
在較佳之實施態樣中，該急性或慢性發炎疾病係血清陽性或血清陰性慢性多發性關節炎，更佳的是類風濕性關節炎。
本發明之另一態樣係一種用於治療急性或慢性發炎疾病之方法，該方法包含投予治療上有效量之如上定義之式(I)化合物或其醫藥組成物至需要該治療病患。
在本說明書之上下文中用語「治療」代表投予具有本發明之化學式之化合物以預防、減輕或消除疾病或一或多種與該疾病有關之徵狀。「治療」亦包括預防、減輕或消除該疾病之生理後果。
在本發明之上下文中用語「減輕」被認為是代表該接受治療病患之狀況之任何改進，包括主觀性地(病患之感覺或給人之感覺)及客觀性地(測量參數)。
本發明之另一態樣係指如上述定義之式(I)化合物於顯影和藥理顯影技術中作為顯影生物標記之用途；特別是用以找出免疫病灶、標靶細胞及標的分子。在特定之實施態樣中，本發明係指如上述定義之式(I’)化合物於顯影和藥理顯影技術中作為顯影生物標記之用途；較佳的是用以找出免疫病灶、標靶細胞及標的分子。
藥理顯影技術將快速成長之適當臨床前(分子、細胞、器官及全動物追蹤及概念機制驗證、療效檢驗等)及臨床(人醫學)活體內顯影技術組合所得到生物標記之範圍擴展至該些此處描述且作為醫藥使用之化合物所產生之有用訊息資料。
本發明利用實施例另外解說如下。此解釋不得被視為對本發明之範圍之限制，因為其係於申請專利範圍中定義。
實施例
合成
實施例1.合成(4-甲基苯硫基)-乙酸甲酯
將1.82克(10毫莫耳)之4-甲基苯硫基乙酸溶解於30毫升之DMF中，接著加入1.34克(16毫莫耳)之NaHCO3 ；該攪拌混合物係經攪拌約15分鐘。接下來，添加1.9毫升之ICH3 同時在室溫中持續攪拌24小時。待此時間結束後，將該混合物倒在水/冰上。由於沒有沉澱發生，添加醚以萃取。該有機相經水清洗及無水硫酸鈉乾燥後，該有機相在旋轉蒸發器中濃縮以得到1.92克(9.7毫莫耳，97 %產率)之無色油，經光譜資料證實具有該期待之結構。此產物將不經純化地用於下一個合成方法之步驟，因為其在TLC(洗出液二氯甲烷/甲醇9/1)上得到單一斑點。
RMN1 H(CDCl3 )：7.2(s,4H)3.7(s,3H)3.5(s,2H)2.4(s,3H CH3 S)
RMN13 C(CDCl3 )：171.5 136.9 130.4 129.4 126.4 51.6 40.2 15.5
實施例2.合成(4-甲基磺醯基-苯基)-乙酸甲酯
將30.7克(50毫莫耳)之發氧方(oxone)溶液(於80毫升之水中)逐滴添加至含有3.4克(17.3毫莫耳)實施例1所得到之化合物之於100毫升甲醇之溶液中，保持該反應在水/冰浴中進行。待添加完成後，持續攪拌5小時，允許溫度上升至室溫。接著，部分溶劑在減壓下濃縮，該沉澱固體以水重複過濾清洗。待乾燥後，此固體重3克。過濾出來之水以二氯甲烷萃取，該有機相經水清洗並在無水硫酸鈉上乾燥，在旋轉蒸發器中濃縮以得到一多於預期產出4克(17毫莫耳，100 %產率)之產物。此固體於57℃熔化分解，其純度經HPLC測定為99%。光譜資料證實該期待之結構：
RMN1 H(CDCl3 )：7.9(d,2H)7.5(d,2H)3.7(s,s 3+2H)3.1(s,3H)
RMN13 C(CDCl3 )：170.80 140.13 139 130.33 127.63 52.31 44.49 40.82
實施例3.合成溴基-(4-甲基磺醯基-苯基)-乙酸甲酯
將20克(87.62毫莫耳)之該酯溶解於300毫升之四氯化碳中；按比例添加19克(105毫莫耳)之N -溴琥珀醯亞胺、2克(12.18毫莫耳)之偶氮雙異丁腈及0.1毫升之溴。該反應混合物係於80℃加熱3小時，接著冷卻、過濾並以二氯甲烷清洗。該濾液經水然後經濃鹽水清洗。令該溶液經無水硫酸鈉乾燥，在真空中濃縮以產生28克之油，其利用快速層析法以庚烷/乙酸乙酯(1/1)作為洗提液進行純化。濃縮該更純之餾份產出19.63克(72.94%產率)之溴代衍生化合物。
熔點：81.8-83.3℃
NMR1 H(CDCl3 )：7.9(d,2H) 7.75(d,2H) 5.4(s,1H) 3.8(s,3H) 3.1(s,3H)
NMR13 C(CDCl3 )：168.0(C) 141.6(C) 141.1(C) 129.8(CH) 127.8(CH) 53.7(CH) 44.7(CH3 )及44.2(CH3 )ppm
實施例4.合成2-甲基-5-(4-甲基磺醯基-苯基)-4-羥基噻唑
將實施例3所獲得之16.7克(54.3毫莫耳)之該酯溶解於400毫升之甲苯中，接著添加19毫升之吡啶及4.08克(54.34毫莫耳)之硫代醯胺。該反應混合物於80℃(水浴溫度)加熱同時攪拌2小時。接著，令該混合物靜置冷卻，將該沉澱固體過濾並以水(2×50毫升)然後以醚(2×30毫升)清洗。令該產物在真空中乾燥以產生7克(26毫莫耳，47.86%產率)之膏狀固體，熔點216-226℃。
光譜資料證實該期待產物之結構。
RMN1 H(d6 DMSO)δ：11.8(s,1H)7.8(m,4H)3.1(s,3H)2.6(s,3H)ppm
RMN13 C(d6 DMSO)：162.9(C) 159.4(C) 146.2(C)143.0(C) 128.0(CH) 126.1(CH) 104.4(C) 44.2(CH3 ) 19.9(CH3 )ppm
實施例5.合成4-環戊氧基-5-(4-甲基磺醯基-苯基)-2-甲基-噻唑
將實施例4所獲得之7.0克(26毫莫耳)之羥基噻唑與8.8克(63.67毫莫耳)之碳酸鉀溶解於200毫升之DMF中。逐滴添加14毫升(130毫莫耳)之溴環戊烷。該反應混合物係於80℃加熱3小時，接著冷卻，將該混合物倒在冰/水上，並以乙酸乙酯萃取。該有機相經水清洗(3×100毫升)，以無水硫酸鈉乾燥，並經過庚烷/醚(1/1)結晶濃縮以產生12克之粗物質。利用快速層析法以庚烷/乙酸乙酯(2/1)作為洗提液純化該產物，以得到6.7克(19.85毫莫耳，76.39%產率)之化合物12。
熔點：124.6-125.2℃
NMR1 H(CDCl3 )：7.9(dd,4H) 5.4(m,1H) 3.0(s,3H) 2.6(s,3H) 1.7-2.0(m,8H)ppm
NMR13 C(CDCl3 )：162.6(C) 159.5(C) 138.3(C) 137.1(C) 128.1(CH) 126.8(CH) 109.1(C) 83.7(CH) 45.0(CH3)33.5(CH2 ) 24.1(CH2 ) 20.4(CH3 )ppm
生物測定
材料及方法
1.個體
該試驗係以靜脈穿刺採集健康志願者與類風濕性關節炎病患之肝素化週邊血液進行。
健康志願者係醫院業務內之例行控制下之捐血者。
被納入此試驗之類風濕性關節炎病患符合美國風濕病學會之診斷標準,在納入訪視時呈現臨床活性疾病,且經20毫克/週口服甲胺喋呤治療至少6個月。疾病活性之程度定義如下：a)DAS28≧3.2及/或b)6個或更多之腫脹關節及6個或更多之疼痛關節。排除標準如下考量：a)在納入訪視時患有主動傳染性疾病；b)在納入前患有腫瘤疾病；c)患有其他在納入訪視前至少一年尚未完全緩解之系統性或器官特異性自體免疫疾病；d)患有嚴重之腎、心或肝狀況，該狀況與該些由主要疾病之類風濕性關節炎所引起之變化程度無關；e)因為與主要疾病無關之狀況導致整體狀態嚴重惡化；f)在納入訪視前的一年內已接受皮質類固醇、免疫抑制劑、細胞靜止劑或任何其他對免疫系統具有已知活性之藥物之治療，但上述劑量之甲胺喋呤除外；g)納入訪視時懷孕或在產後期。
該試驗係經西班牙馬德里阿爾卡拉大學調查委員會核准。
2.材料
-MultiGuard Barrier吸管尖(美國猶他州鹽湖城索羅森(Sorenson)公司)
-MicroAmpPCR 0.2毫升反應試管(美國加州福斯特市應用生物系統(Applied Biosystems)公司目錄編號N8010540)
-Fast Optical 96孔條碼反應板(應用生物系統公司)
-丟棄式細胞刮勺(美國麻州劍橋市科斯達(Costar)公司3010)
-　組織培養板，6孔平底低蒸發蓋(美國紐澤西州富蘭克林湖市貝克頓迪更生實驗室用品公司(Becton Dickinson Labware)353046 Falcon)
-　組織培養板，96孔平底低蒸發蓋(美國紐澤西州07417-1886富蘭克林湖市貝克頓迪更生實驗室用品公司(Becton Dickinson Labware)353073 Falcon)
-　非滅菌板，96孔V型板(西班牙馬德里市索里亞格雷納公司(Soria Greiner)格雷納)
-　丟棄式巴斯德吸管(德國商標)
-　體積可調式微量移液器20、200、1000及5000微升(法國吉爾森公司(Gilson))
-　艾本德(Eppendorf)多道移液器4780(德國漢堡)
-　艾本德無菌吸管尖(德國漢堡)
-　Virgin丙烯無菌吸管尖(西班牙馬德里達斯實驗室(Daslab))
-　無菌塑膠試管5及10毫升(西班牙馬德里達斯實驗室)
-　無菌離心管15及50毫升(美國富蘭克林湖BD Falcon)
-　細胞計數聚苯乙烯試管5毫升(美國富蘭克林湖BD Falcon)
-　肝素採血管10毫升(比利時泰爾茂歐洲公司(Terumo Europe)Venojet)
-　血漿分離管10毫升(英國普利矛斯BD Vacutainer)
-Pipetboy plus移液管吸注器(德國福羅實驗室(Flow Lab.))
-Millex-GS 22微米無菌過濾器(法國莫爾賽姆密里博(Millipore)公司)
-透明蓋玻片(德國赫希曼(Hirschman)公司)
-Neubauer計算盤(德國薩里吉亞(Saaringia)公司)
-Herasafe HS12垂直層流排氣櫃(德國賀利氏(Heraeus)公司)
-Heracell 150二氧化碳細胞培養箱(德國賀利氏公司)
-貝克曼(Beckman)冷凍離心機
-Multifuge 3SR離心機(德國賀利氏公司)
--70℃冷凍櫃(西班牙特拉薩市塞拉塔(Selecta)公司)
-奧林巴斯(Olympus)CHS-2顯微鏡(日本東京奧林巴斯公司)
-流式細胞儀FACScalibur(美國山景城貝克頓迪更生公司)，分析軟體BD Cellquest Pro v.5.5.1版
-BD FACS陣列生物分析儀
-酵素免疫分析讀取儀(福羅實驗室Titertek Multiscan Plus)
-貝克曼放射活性貝他計數器
-AutoMACS分選儀(德國貝爾吉施-格拉德巴赫美天旎生物技術公司(Myltenyi Biotec))
-Nanodrop分光光度計(美國麻州沃爾瑟姆賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific))
-GeneAmp 9700 PCR系統(應用生物系統公司)
-7900 HT快速即時Q-PCR系統(應用生物系統公司)
3.用於分離及識別細胞亞群之試劑
-簡單氯化物鹽水(SSF)Apiroserum(西班牙馬德里艾比斯(Ibys)公司)
-Lymphoprep淋巴細胞分離液(挪威奧斯陸奈格特(Nyegaard)公司Ficoll-Hypaque梯度溶液)
-台昐藍(德國布克斯福祿克(Flucke)公司)
-PBS FACS FLOW溶液(貝克頓迪更生公司)
-HEPES緩衝液(西格瑪(Sigma)公司和百瑞克(Panreac)公司之試劑)
-甲基-3 H胸腺核苷(3 [H]-T)，特定活性60居禮/毫莫耳(西班牙馬德里ITISA美國放射化學公司)
-CliniMACS CD14試劑(美天旎生物技術公司)
-用於免疫螢光及流式細胞試驗之單株抗體：表1
4.用於細胞培養中之試劑
-由RPMI-1640(比利時韋爾維耶坎布雷克斯生物科技(Cambrex BioSciences)公司B4800)構成之添加1% L-麩醯胺酸200毫莫耳和25毫莫耳Hepes(美國加州爾灣福羅實驗室)之完全培養基
-胎牛血清(FCS)(美國紐約州格蘭德島吉勃可(Gibco)公司)
-培養基：使用添加10% FCS之完全培養基，加熱至57℃45分鐘以去除所有血清中之補體
-植物血球凝集素M(PHA)(西班牙馬德里西格瑪公司產品批號115K4132編號L-8902)
-LPS(美國加州92121聖地牙哥市英維偉基因(InvivoGene)公司大腸桿菌0111：B4株)
-抗生素混合物。胺苄青黴素鈉10毫克/毫升(西班牙托利多比徹姆A(Beecham A.)公司商品名Britapen)、硫酸建它黴素1.6毫克/毫升(西班牙馬德里伊斯蒂夫SA博士(Dr. Esteve SA)塔馬諦(Tamadit)實驗室)及兩性黴素B 0.5微克/毫升(西班牙巴塞隆納埃斯普盧格斯(Esplugues)施貴寶(Squibb)公司商品名Fungizona)之混合物被加入至培養基中。
-抗CD3單株抗體(美國紐澤西州力登奧多醫藥公司(Orthopharmaceutical Corporation)商品名Orthoclone OKT3)
-抗CD28單株抗體(西班牙馬德里梅納里尼(Menarini)公司商品名Clon 15E8)
5.用於mRNA分離、逆轉錄及即時定量PCR(Q-PCR)之試劑
-Illustra RNAspin mRNA純化套組(英國白金漢郡GE健康照護公司目錄編號25-0500-72)
-高產量cDNA逆轉錄套組(應用生物系統目錄編號4368814)
-TaqMan基因表現通用混合液(應用生物系統目錄編號4369016)
-用於人TNF-α ID編號HS00174128_m1[FAM]之TaqMan基因表現分析(應用生物系統目錄編號4331182)
-人ACTB(β-肌動蛋白)內源對照[VIC](應用生物系統目錄編號4326315E)
6.取得生物樣本
a)靜脈血液：單核細胞係自肘前靜脈穿刺採集之靜脈血液獲得。採集50毫升之血液並儲存於肝素鋰試管(Venojet)，接著以食鹽水1/1(體積/體積)稀釋，所有皆在無菌條件下進行。
b)收集人細胞亞型。為了分離PBMC，其餘之血液成分係以Ficoll上之密度梯度分離。此方法係基於血液細胞之密度上的差異。在含有經稀釋及肝素化之血液的50毫升離心管中，小心地在其上加入15毫升之Ficoll-Hipaque(密度1.077克/毫升)。在離心(400xg)45分鐘後，得到由二個介面分開之三層(紅血球、Ficoll及血漿)：PBMC係包含在介於稀釋血漿及Ficoll之間的介面層。其可利用巴斯德吸管吸出收集。以此方式收集到之細胞被重懸於SSF並離心(300xg離心10分鐘)；丟棄上清液(清洗步驟)，該細胞團塊被重懸於含有10% PBS之RPMI 1640培養基。
c)純化PBMC單核細胞：新鮮循環之單核細胞係以帶有CD14特異性抗體之順磁微球利用自動磁性細胞分選儀自PBMC分離。CD14係LPS受器複合物之次單位，該LPS受器複合物位於習知循環人單核細胞之表面上，其表現被發展性地控制限制於單核細胞而非其他PBMC亞群，允許提供快速且有效之單一步驟陽性純化人單核細胞，利用商業購得之AutoMACS分選儀(德國貝爾吉施-格拉德巴赫美天旎生物技術公司D-51429)將它們從其餘之PBMC亞型中分選出來。該程序係遵照製造商之詳細說明進行。簡言之，將108 PBMC重懸於5毫升無菌塑膠試管中之完全培養基，於4℃與帶有CD14抗體之磁性微球(CliniMACS CD14試劑，美天旎生物技術公司)培養20分鐘後，加至AutoMACSTM 細胞分選儀(美天旎生物技術公司)並使用雙陽性選擇分選程式。單核細胞會先被留置於AutoMACS的二個管柱中，其他細胞群被洗脫並與單核細胞分離。單核細胞接著在釋放施用於管柱之順磁場後被洗脫流出，並以5毫升無菌塑膠管收集。
7.計數及存活性試驗
所有細胞懸浮液之細胞濃度及存活性係利用0.1%稀釋之台昐藍及Neubauer計算盤顯微鏡計算決定。活細胞之百分比係根據染料排出之能力而定。只有當細胞存活率高於95%才繼續該試驗。
8.血清細胞介素之ELISA定量
為了定量細胞介素之血清濃度，將採集之血液儲存於含有抗凝劑及不含抗凝劑之試管中(分別利用肘前靜脈穿刺及動脈導管採血)。令血液在實驗室室溫中凝集，接著離心以分離血清(600xg離心20分鐘)。收集上清液，過濾，等量分裝並儲存於-70℃。利用表2描述之商業套組進行不同細胞介素之濃度測定。
使該上清液解凍回溫至室溫，其與被固定在培養板底部及經不同時間培養之個別抗細胞介素抗體反應。接著，進行清洗，加入該相關公司所建議之物質以容許比色反應發生，其與存在上清液中之細胞介素之量成比例。該結果係由酵素免疫分析讀取儀Multiscan Plus(福羅實驗室Titertek Multiscan Plus)測定。這些結果係與標準曲線比較，該標準曲線得自公司所提供之已知濃度之各細胞介素。
標準曲線之分析及後續之內插法係由軟體Delta Soft II 4.1版(生物金屬公司(Biometallics,Inc.))在蘋果麥金塔電腦上進行。細胞介素濃度被轉換成莫耳數以計算各例之分子比例及可溶性分子之數量。
9.免疫表現型測定
使用FITC或藻紅素標示(PE)之二種顏色之單株抗體之直接免疫螢光技術。FITC係可被488奈米波長之雷射光激發而發射525奈米波長之螢光物質，其可被商業流式細胞儀偵測並輕易地與雷射光及PE發射波長區別。PE係可被488奈米波長之雷射光激發及發射波長為570奈米之螢光物質，其可被流式細胞儀偵測並輕易地區分。利用表1所述之抗體進行直接標示：PBMC標示：該方法利用96孔V型板進行標示。在各孔中加入5×104 細胞，之後以400xg離心5分鐘。經過清洗後，細胞被重懸，並加入5微升之對應單株抗體。細胞經再次重懸，令該孔板在4℃暗處培養20分鐘。接著加入150微升之PBS，並清洗二次。最後，細胞於150微升PBS中重懸並收集在細胞儀之試管中，加入PBS使終體積成為0.3毫升。
在進行計算時，使用配備氬雷射(調至488奈米波長)之FACSCalibur流式細胞儀以誘發FITC及藻紅素螢光。該儀器除了螢光通道之外，亦提供有關大小(FSC)及細胞複雜度(SSC)之資訊。
不經標示及其他以和該試驗所使用之單株抗體(IgG1-FITC、PE、TC，IgG2a FITC、PE、TC)相等同型之單株抗體不相關標示之試驗細胞被用來作為陰性對照組。
使用Flow Jo軟體V8.4(美國奧勒岡州艾許蘭市97520樹星公司(Tree Star,Inc.))進行流式細胞儀資料之分析，以評估經AutoMACS分離之週邊血液單核細胞之純度。
10.細胞培養及功能試驗
一般培養條件：所有細胞培養均在垂直層流排氣櫃中以無菌條件操作，使用無菌丟棄式材料或以環氧乙烷或滅菌裝置滅菌。培養物被保存於5%二氧化碳及95%相對濕度之37℃培養箱中。
11.3 [H]-胸腺核苷增生試驗
在受到分裂原刺激時，淋巴細胞經歷胚細胞樣轉變及細胞分化過程。用於定量細胞增生之方法係3 [H]-胸腺核苷併入DNA重新合成之測定，在其結束及收集之前偵測從細胞培養乾燥萃取物(該氚化基被加入之物)發射之貝他放射線。在研究增生之不同實驗中，經純化之細胞製劑在含有不同濃度之各種分裂原的情形下，以5×104 細胞/孔(200微升終體積)之濃度培養於96微量孔之平底板中4天並重複三次。
對特定刺激之反應取決於密度及所研究之細胞種類，以及培養時間及該致分裂劑之濃度。
在細胞培養完成前的20至24個小時，在各孔中加入1微居禮之3 [H]-胸腺核苷；使用特定培養收集器經玻璃過濾器抽取以收集培養物。
DNA合成係以每分鐘計數(cpm)表示。各試驗重複進行三次，三次重複之平均值之變異性高於10%之該些資料被拒絕，因為可能表示技術誤差或培養物污染。培養係以每孔固定量之細胞以及固定體積200微升進行。所有分裂原及細胞介素首先以劑量反應曲線及時間反應進行測試。
12.定量性多參數流式細胞儀之分析測定試驗(BDTM 流式細胞小球微陣列術或CBA)
CBA實驗流程係根據製造商之說明進行。微粒之選擇係根據圖1摘要進行。該些顯示稍許光譜重疊風險者最後被選擇。
表3及4顯示此實驗發展所使用之各試劑之目錄編號及批號。樣本之取得係由BD FACS陣列生物分析儀(美國加州聖荷西市貝克頓迪更生公司FACSArray)進行，結果係於PC個人電腦以軟體FCAP Array(貝克頓迪更生公司)完成分析。
簡言之，該實驗流程包括以清洗緩衝液預先清洗培養板。在傾倒後，捕捉微球之混合物經振盪重懸。在該適當之稀釋液中加入標準物及樣本。經永磁攪拌培養1小時後，加入PE偵測試劑並再次於室溫中培養2小時。經過清洗後，在流式細胞儀進行取樣。
13.純化mRNA
mRNA分離係利用Illustrat RNAspin純化套組根據製造商之詳細說明(目錄編號24-0500-72)進行。簡言之，藉由離心收集5×106 細胞，添加緩衝液RA1及劇烈振盪以溶解細胞。在該溶解物中加入一份體積之70%乙醇，經劇烈混合，裝填至RNA結合管柱上。管柱以8000xg離心30秒，以允許mRNA附著至該管柱基質。藉由添加膜脫鹽緩衝液(MDB)及11000G離心1分鐘以移除管柱中之鹽。污染DNA之移除係藉由在基質上添加95微升之DNA酶反應混合物並於室溫中培養15分鐘。管柱基質經緩衝液RA2清洗一次及緩衝液RA3清洗二次。最後，該純化之RNA被洗脫於100微升之H2 O中，以Nanodrop分光光度計使用Nanodrop 1.2版本軟體定量後，立即儲存於-80℃。
14.自mRNA逆轉錄成cDNA
mRNA逆轉錄成cDNA係利用高產量cDNA逆轉錄套組(應用生物系統目錄編號4368814)根據製造商之詳細說明進行。簡言之，在0.2毫升之PCR試管中混合0.5微克之全mRNA與2微升之10倍RT緩衝液、0.8微升之25倍dNTP混合物(100毫莫耳)、2微升之10倍RT隨機引子、1微升之MultiScribe逆轉錄酶、4.2微升之不含核酸酶之水，終體積成為20微升。逆轉錄反應係於GenAmp 9700 Thermal Cycler(應用生物系統公司)中進行，使用下列程式：25℃ 10分鐘之步驟，37℃ 120分鐘之步驟及最後85℃5秒之步驟。
15.即時Q-PCR分析
人TNF-α mRNA表現專用之定量PCR係利用TNF TaqMan基因表現分析(應用生物系統ID編號HS00174128_m1)及TaqMan基因表現通用混合液(應用生物系統目錄編號4369016)根據製造商之說明進行。人β-肌動蛋白內源對照(目錄編號4326315E)被用於相對定量TNF-α基因轉錄活化時之TNF-α倍數調控。簡言之，反應係於Fast Optical 96孔條碼反應板(應用生物系統目錄編號4346906)中進行，終體積為20微升/孔。每孔中包括之反應混合物為5微升之cDNA、10微升之2倍Taqman基因表現通用混合液、2微升之20倍TNF-α(及/或β-肌動蛋白)之TaqMan基因表現分析與3微升之不含核酸酶之水。該光學板係於7900HT快速即時Q-PCR系統(應用生物系統目錄編號4351405)中進行反應，使用下列熱循環條件：第1步：保持50℃之溫度2分鐘；第2步：保持95℃之溫度10分鐘；35個循環：溫度95℃10秒鐘，溫度60℃1分鐘。所有樣本均作為技術對照重複測定以避免操作誤差。擴大反應之相對定量係利用包括於Q-PCR儀器(應用生物系統)中之RQ Manager 1.2軟體分析。
統計分析
實驗測試之結果係以平均值及平均值之標準與估計誤差(根據分佈種類)表示。
就統計分析而言，首先利用薛卜若-維克(Shapiro-Whilk)之常態分佈檢定分析分佈之特性。曼-惠特尼(Mann-Whitney)之非參數U檢驗被用來建立比較。在所有例子中，低於5%顯著程度為有意義的(p<0.05)。
統計分析係利用軟體SPSS 11.0(伊利諾州60606芝加哥南瓦克大道233號11樓SPSS公司總部)進行。
化合物4、5、6、9、10、12、15、16及17之免疫調節效應試驗結果
對健康志願者及類風濕性關節炎病患之週邊血液單核細胞(PBMC)產製TNF-α、IFN-γ及其他細胞介素之免疫調節效應。
實施例6.化合物5及12對TNF-α產製之影響
首先研究化合物5及12在LPS存在或不存在之情況下對於健康志願者之PBMC產製TNF-α之影響。來自健康志願者之PBMC(5×104 細胞/孔，200微升)係於96孔平底低蒸發蓋組織培養板(美國紐澤西州07417-1886富蘭克林湖市貝克頓迪更生實驗室用品公司353072 Falcon)平行重覆二次培養，使用添加胎牛血清(原美國，吉勃可編號26140-079)及濃度10-6 莫耳之單獨溶劑或添加10-6 莫耳、10-7 莫耳或10-8 莫耳之所示化合物之完全培養基(含麩醯胺酸之RPMI-1640，比利時B4800韋爾維耶坎布雷克斯生物科技公司編號BE-12-70F)，在LPS(10微克/毫升；美國加州92121聖地牙哥市英維偉基因大腸桿菌LPS 0111:B4株)存在及不存在之情況下培養24小時。培養上清液被冷凍於-20℃，以物種專一性ELISA定量TNF-α之濃度(用於定量偵測腫瘤壞死因子-α之酵素連結免疫吸附試驗：人TNF-α ELISA BM S223/4TEUCE，加州94010柏林格姆班德醫學系統公司)。
如表5所示，當化合物5以10-7 莫耳之濃度存在於培養物中時，顯著降低受到LPS刺激之健康志願者PBMC之TNF-α產製(p<0.05)。
圖2顯示化合物12以10-6 莫耳或10-7 莫耳之濃度存在於培養物中時，以統計顯著之方式降低受到LPS刺激之PBMC培養物之上清液中經定量之TNF-α濃度(p<0.05)。另外，10-6 莫耳之化合物12亦降低PBMC自發性之TNF-α產製。
化合物12之免疫調節效應被進一步以PBMC之細胞介素產製情況加以特徵化，該單核細胞受到LPS刺激或以單株抗體抗CD3與抗CD28之組合活化淋巴細胞。此試驗係於來自健康志願者及類風濕性關節炎病患之PBMC培養物中，以滴定劑量之化合物12存在或不存在的情況下進行。
來自13名健康志願者之PBMC(5×104 細胞/孔)係於添加最高溶劑濃度(10-6 莫耳)、或10-6 莫耳及10-7 莫耳之化合物12之200微升之完全培養基中，在LPS(10微克/毫升)存在或不存在的情況下培養(重複二次)24小時。培養上清液係冷凍於-20℃，且利用同時測定該指定細胞介素濃度之特定試劑(CBA Flex Multiplex Set，BDTM 流式細胞小球微陣列術，CBA：IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ，加州92121聖地牙哥貝克頓迪更生生物科技醫藥公司)以BD FACS陣列生物分析儀(加州92121聖地牙哥BD生物科技公司目錄編號340128)進行定量。
以濃度10-6 莫耳及10-7 莫耳存在於培養基中之化合物12以統計顯著方式(p<0.05)減少受到LPS刺激之健康志願者PBMC之TNF-α產製(圖3)。相反的，不論是經單株抗體抗CD3及抗CD28刺激或PBMC自發性(無外源性刺激存在)之TNF-α分泌均未受到化合物12之調節。
在另一實驗中，來自7名類風濕性關節炎病患之PBMC(每孔5×104 細胞)係於添加最高溶劑濃度(10-6 莫耳)或10-6 莫耳、10-7 莫耳及10-8 莫耳之化合物12之200微升之完全培養基中，在LPS(10微克/毫升)或抗CD3(12.5奈克/毫升)(美國紐澤西州力登奧多醫藥公司Orthoclone OKT3)+抗CD28(1/3×105 )(西班牙馬德里梅納里尼公司Clon 15E8)存在或不存在的情況下培養(重複二次)24小時。培養上清液係冷凍於-20℃，且利用專門測定該細胞介素濃度之CBA Flex Set(貝克頓迪更生)以BD FACS陣列生物分析儀根據製造商說明加以定量TNF-α之濃度。
在經LPS刺激之類風濕性關節炎病患之PBMC中，TNF-α之產製受到濃度10-6 莫耳之化合物12之顯著抑制(p<0.05)(圖4)。培養基中所含有之化合物12並不抑制類風濕性關節炎病患之PBMC之自發性TNF-α產製，亦不抑制經單株抗體抗CD3及抗CD28刺激後之TNF-α產製。
此外，接著探討化合物12對於來自9名健康志願者之PBMC所純化分離出之單核細胞在LPS存在或不存在的情況下產製TNF-α之影響。來自各健康志願者之PBMC係經分離，利用自動磁活化細胞分選術(MACS)純化他們的單核細胞。將108 PBMC重懸於5毫升無菌塑膠試管中之完全培養基，於4℃與帶有CD14抗體之磁性微球(CliniMACS CD14試劑，德國貝爾吉施-格拉德巴赫美天旎生物技術公司D-51429))一起培養，加至AutoMACSTM 細胞分選儀(美天旎生物技術公司)以純化他們的CD14+ PBMC亞群(習知之單核細胞)。該經分離之單核細胞在經FITC標示之CD3及經PE標示之CD14特異性抗體染色後於5毫升之細胞計數聚苯乙烯試管中利用直接免疫螢光及多色流式細胞儀來測定它們的純度。定量該指定之T細胞(CD3)及單核細胞(CD14)表面受器之表面分佈係於FACScalibur分析儀(貝克頓迪更生)中進行。結果之分析係利用Flow Jo流式細胞儀軟體(美國奧勒岡州樹星公司)進行。該經分離之PBMC CD3- CD14+ 單核細胞之純度係例行性地＞98%之活細胞，單核細胞根據它們特別的正向散射光(FSC)及側向散射光(SCC)特性被圈選，以允許定義明顯之單核細胞群集和其餘之淋巴細胞(圖5)。單核細胞(1.25×105 細胞/孔，5毫升)係培養於6孔平底低蒸發蓋之組織培養板(353046 Falcon，貝克頓迪更生)，使用添加胎牛血清及濃度10-6 莫耳之單獨溶劑或添加10-6 莫耳之化合物12之完全培養基，並在10克/毫升之LPS存在或不存在之情況下培養經過動力學實驗所示之時間期。不含細胞之上清液及細胞被同時儲存於如圖6及7所示之動力學實驗中，以利用細胞中之mRNA之量及上清液中之蛋白質之量來測定TNF-α基因產物之表現。如上所述，上清液被冷凍儲存於-20℃，該分泌之TNF-α蛋白質之濃度係利用BD TNF-α之CBA試劑(貝克頓迪更生生物科學醫藥公司)以BD FACS陣列生物分析儀(貝克頓迪更生)根據製造商說明而加以測量。該黏附之單核細胞係利用丟棄式細胞刮勺(美國麻州02139劍橋市科斯達公司3010)從培養板上收集，並立即進行細胞mRNA分離、mRNA定量及逆轉錄反應與定量即時聚合酶連鎖反應(Q-PCR)試驗，以於7900 HT快速即時Q-PCR系統(美國加州福斯特市應用生物系統)中測定TNF-α基因之mRNA表現量。
圖5顯示高度富集之單核細胞(98.30±0.17%)被用於此包含9名健康志願者之試驗中，以分析此PBMC亞群中TNF-α之mRNA表現及蛋白質分泌之動力學。如預期地，圖6顯示TNF-α之mRNA表現在LPS刺激之試管內人單核細胞中被強烈誘導(48.35+17.46倍，p<0.001)，在基準期之活體外狀況中(0小時)實質上不表現，非常早期地活化基因表現之動力學特性在2.5小時達到高峰，而短暫轉錄產生快速下降因此TNF-α之mRNA在24小時下降至接近基準期之水準(圖6方塊)。在缺乏LPS之刺激時，TNF-α之基因表現不被活化，且TNF-α特定mRNA在此試管內系統維持其基準期之活體外水準(圖6菱形)。值得注意的是，化合物12顯著降低該經LPS刺激之TNF-α mRNA高峰誘導，其中純化之單核細胞係來自健康志願者，並於7900 HT快速即時Q-PCR系統中以人TNF-α專用之TaqMan基因表現分析測量(33.72±15.88%，p<0.01)(圖6三角形)。另外，TNF-α基因表現mRNA之量在LPS刺激該純化之單核細胞的5及8小時後亦顯著降低(分別為27.14±9.07%，p<0.01；及36.45±11.58%，p<0.01)。我們得到的結論是，化合物12在來自健康志願者之PBMC純化單核細胞中顯著降低該LPS刺激之TNF-α mRNA誘導，且在所有該試驗之期間仍發生誘導之變化而不影響TNF-α基因產物表現之向上及向下調節之高峰動力學。和未經LPS刺激之人單核細胞中非常低之TNF-α基因表現與mRNA誘導之快速動力學所觀察到一致的是，TNF-α蛋白質之分泌啓動快速，但伴隨著從mRNA轉譯成蛋白質、其處理、分泌及釋放至培養基之完整生物過程所需之延遲時間，使得預期之高峰產量在LPS刺激該缺乏化合物12之對照培養基中之PBMC純化單核細胞之8小時後出現(圖7方形)。在只含有溶劑載劑但不含LPS及化合物12之單核細胞培養不誘發TNF-α之分泌(圖7菱形)。值得注意的是，化合物12顯著減少該經LPS刺激之TNF-α分泌蛋白質之高峰生產(8小時)，其中純化之單核細胞係來自健康志願者，並於FACS陣列生物生物分析儀中以人TNF-α專用之CBA試劑套組測量(31.52±14.38%，p<0.01)(圖7三角形)。如同上面顯示在TNF-α mRNA誘導之動力學所發生的情況，TNF-α分泌蛋白質之量從0小時刺激該培養之後的產製動力學監測之時間點均較低。事實上，統計分析顯示，化合物12在2.5小時、5小時及24小時亦顯著抑制由LPS刺激之來自健康志願者之純化PBMC單核細胞之TNF-α分泌蛋白質(分別為45.56±16.25%，p<0.01；41.33±13.37%，p<0.01；及51.17±15.62%)。由於該伴隨之資料顯示，化合物12顯著地抑制來自9名健康捐贈者之PBMC純化單核細胞中TNF-α基因產物表現之mRNA及蛋白質之量，我們接下來要研究的是，由化合物12所促使之TNF-αmRNA誘導之抑制量與TNF-α分泌蛋白質之減少量之間是否具有統計顯著相關性，以它們個別之表現高峰進行回歸分析測定。值得注意的是，我們發現化合物12對於該純化單核細胞之TNF-α基因產物表現之mRNA與分泌蛋白質之間的免疫調節效應具有顯著相關性(r2 =0.7952)。綜合上述結果，這顯示化合物12抑制LPS刺激之純化單核細胞之TNF-αmRNA誘導量是一個可用來說明化合物12對TNF-α分泌抑制之免疫調節效果之實質部份之機制。
實施例7.化合物4、5、6、9、10、12、15、16及17對IFN-γ產製之影響
使來自健康志願者之PBMC(每孔5×104 細胞)於僅添加最高溶劑濃度(10-6 莫耳)，或添加10-6 莫耳、10-7 莫耳或10-8 莫耳之測試化合物之200微升完全培養基中，在LPS(10微克/毫升)或抗CD3(12.5奈克/毫升)+抗CD28(1/3×105 )存在及不存在之情況下培養(重覆二次)24小時。培養上清液被冷凍於-20℃，利用專門用於測定IFN-γ濃度之CBA Flex Set(貝克頓迪更生)根據製造商之說明以BDFACS陣列生物分析儀定量IFN-γ之濃度。
濃度10-7 莫耳或10-8 莫耳之化合物16顯著地抑制經LPS刺激之健康志願者PBMC之IFN-γ產製(p<0.05)。另外，10-6 莫耳之濃度抑制經單株抗體抗CD3及抗CD28所誘發之IFN-γ產製(p<0.05)。10-6 莫耳、10-7 莫耳及10-8 莫耳之化合物16顯著抑制健康志願者PBMC之IFN-γ自發性分泌(p<0.05)。
濃度10-6 莫耳、10-7 莫耳及10-8 莫耳之化合物4顯著地抑制經LPS刺激之健康志願者PBMC之IFN-γ產製(p<0.05)。另外，濃度10-6 莫耳之化合物4亦顯著抑制經單株抗體抗CD3及抗CD28所誘發之IFN-γ產製(p<0.05)。化合物4並不顯著調節健康志願者PBMC之IFN-γ之自發性分泌。
濃度10-6 莫耳或10-7 莫耳之化合物5顯著地抑制經LPS刺激之健康志願者PBMC之IFN-γ產製(p<0.05)。另外，10-6 莫耳濃度之化合物5亦顯著抑制經單株抗體抗CD3及抗CD28所誘發之IFN-γ產製(p<0.05)。濃度10-6 莫耳及10-7 莫耳之化合物16亦抑制健康志願者PBMC之IFN-γ自發性分泌(p<0.05)。
濃度10-6 莫耳之化合物6顯著地抑制經LPS刺激之健康志願者PBMC之IFN-γ產製(p<0.05)。其於10-7 莫耳及10-8 莫耳顯著降低健康志願者PBMC之IFN-γ自發性分泌(p<0.05)。
濃度10-7 莫耳及10-8 莫耳之化合物9顯著地抑制來自5名健康志願者之PBMC之IFN-γ自發性分泌(p<0.05)。
濃度10-8 莫耳之化合物10顯著地抑制經LPS刺激之健康志願者PBMC之IFN-γ產製(p<0.05)。另外，在濃度10-6 莫耳時，其亦顯著抑制經單株抗體抗CD3及抗CD28所刺激之PBMC IFN-γ產製(p<0.05)。化合物10並不調節健康志願者PBMC之IFN-γ之自發性分泌。
濃度10-7 莫耳之化合物17顯著地抑制來自5名健康志願者之經LPS刺激之PBMC之IFN-γ產製(p<0.05)。其於10-7 莫耳顯著抑制志願者PBMC之IFN-γ自發性分泌。
濃度10-8 莫耳之化合物15顯著地抑制來自5名健康志願者之經LPS刺激之PBMC之IFN-γ產製(p<0.05)。其不顯著調節健康志願者PBMC之IFN-γ之自發性或CD3+CD28刺激分泌。
濃度10-6 莫耳之化合物12顯著地抑制經LPS刺激或經單株抗體抗CD3及抗CD28刺激之健康志願者PBMC之IFN-γ產製(p<0.05)(圖8)。
化合物12並不調節健康志願者PBMC之IFN-γ之自發性分泌。
使來自8名類風濕性關節炎病患之PBMC(每孔5×104 細胞)於添加最高溶劑濃度(10-6 莫耳)，及10-6 莫耳、10-7 莫耳及10-8 莫耳之化合物12之200微升完全培養基中，在LPS(10微克/毫升)或抗CD3(12.5奈克/毫升)+抗CD28(1/3×105 )存在及不存在之情況下培養(重覆二次)24小時。培養上清液被冷凍於-20℃，利用專門用於測定IFN-γ濃度之CBA Flex Set根據製造商之說明以BD FACS陣列生物分析儀測定IFN-γ之濃度。
以10-6 莫耳、10-7 莫耳及10-8 莫耳之濃度存在的化合物12顯著地降低來自類風濕性關節炎病患之PBMC在經單株抗體抗CD3及抗CD28刺激時所誘發之IFN-γ產製(p<0.05)(圖9)。化合物12不調節來自類風濕性關節炎病患之PBMC之自發性IFN-γ分泌或LPS誘發之分泌。
實施例8。化合物5、6、12及16對介白素8(IL-8)產製之影響
進一步研究化合物5、6、12及16對於來自健康志願者之PBMC產製IL-8之影響，同時在LPS刺激及單株抗體抗CD3及抗CD28存在及不存在時評估。使來自健康志願者之PBMC(每孔5×104 細胞)於僅添加最高溶劑濃度(10-6 莫耳)，或添加10-6 莫耳、10-7 莫耳或10-8 莫耳之測試化合物之200微升完全培養基中，在LPS(10微克/毫升)或抗CD3(12.5奈克/毫升)+抗CD28(1/3×105 )存在及不存在之情況下培養(重覆二次)24小時。培養上清液被冷凍於-20℃，利用專門用於測定IL-8濃度之CBA Flex Set根據製造商之說明以BD FACS陣列生物分析儀定量IL-8之濃度。
在所有刺激條件及化合物之測試濃度下，化合物16明顯降低來自5名捐贈者PBMC之IL-8產製。另外，在10-7 莫耳之濃度下，其顯著抑制健康志願者PBMC之IL-8自發性分泌(p<0.05)。
在所有刺激條件及化合物之測試濃度下，化合物16明顯降低來自5名捐贈者PBMC之IL-8產製。另外，在10-7 莫耳之濃度下，其顯著抑制健康志願者PBMC之IL-8自發性分泌(p<0.05)。
在所有化合物之測試濃度下，化合物6明顯降低5名捐贈者之PBMC在CD3+CD28抗體刺激及自發性釋放條件下之IL-8產製。另外，在後者條件下，其以10-6 莫耳之濃度顯著抑制健康志願者PBMC之IL-8自發性分泌(p<0.05)。
在10-6 莫耳、10-7 莫耳及10-8 莫耳之濃度下，化合物12顯著抑制IL-8之自發性產製(p<0.05)(圖10)。10-7 莫耳及10-8 莫耳濃度之化合物12顯著抑制由單株抗體抗CD3及抗CD28所誘發之IL-8產製。然而，沒有觀察到對LPS刺激PBMC之IL-8產製之影響。
亦研究對於類風濕性關節炎病患之PBMC產製IL-8之影響。使來自8名類風濕性關節炎病患之PBMC(每孔5×104 細胞)於添加最高溶劑濃度(10-6 莫耳)，及10-6 莫耳、10-7 莫耳及10-8 莫耳之化合物12之200微升完全培養基中，在LPS(10微克/毫升)或抗CD3(12.5奈克/毫升)+抗CD28(1/3×105 )存在及不存在之情況下培養(重覆二次)24小時。培養上清液被冷凍於-20℃，利用專門用於測定IL-8濃度之CBA Flex Set根據製造商之說明以BD FACS陣列生物分析儀測定IL-8之濃度。
以10-6 莫耳及10-8 莫耳之濃度存在於培養中之化合物12顯著地調節來自類風濕性關節炎病患之PBMC中由LPS所誘發之IL-8產製，但是無法調節自發性及單株抗體抗CD3及CD28之組合所誘發之IL-8產製(圖11)。所有結果顯示化合物12對IL-8之調節可能在明顯之健康及定義疾病條件下顯示明確之調節模式。
實施例9。化合物5、12及16對介白素10(IL-10)產製之影響
研究化合物5、12及16對於來自健康志願者及類風濕性關節炎病患(化合物12)之PBMC，在LPS刺激及單株抗體抗CD3及抗CD28之組合存在及不存在時對IL-10產製之影響。使來自健康志願者之PBMC(每孔5×104 細胞)於僅添加最高溶劑濃度(10-6 莫耳)，及添加10-6 莫耳、10-7 莫耳或10-8 莫耳之測試化合物之200微升完全培養基中，在LPS(10微克/毫升)或抗CD3(12.5奈克/毫升)+抗CD28(1/3×105 )存在及不存在之情況下培養(重覆二次)24小時。培養上清液被冷凍，並利用CBA Flex Set(貝克頓迪更生)根據製造商之說明測定人IL-10之濃度。
在培養中添加化合物16無法調節來自健康捐贈者PBMC之自發性及LPS誘發之IL-10產製。依此方法，在10-7 莫耳及10-8 莫耳之濃度下，其顯著地向上調節或向下調節健康志願者PBMC在經CD3+CD28刺激後之IL-10分泌(p<0.05)，這與在相同條件下之Multiplex分析中所觀察到之10-6 莫耳顯著抑制IFN-γ產製形成對照(p<0.05)。
在培養中添加化合物5對於來自5名捐贈者PBMC之IL-10產製造成極小變化，在該化合物之所有測試濃度中，不論LPS刺激或CD3+CD28抗體誘發產製之細胞介素分泌量非常輕微的增加偶而降低。依此方法，在10-7 莫耳之濃度下，經CD3+CD28刺激之健康志願者PBMC所分泌之IL-10被增加(p<0.05)。
另一方面，使來自8名類風濕性關節炎病患之PBMC(每孔5×104 細胞)於添加最高溶劑濃度(10-6 莫耳)，及10-6 莫耳、10-7 莫耳及10-8 莫耳之化合物12之200微升完全培養基中，在LPS(10微克/毫升)或抗CD3(12.5奈克/毫升)十抗CD28(1/3×105 )存在及不存在之情況下培養(重覆二次)24小時。培養上清液被冷凍於-20℃，利用專門用於測定IL-10濃度之CBA Flex Set根據製造商之說明以BD FACS陣列生物分析儀測定IL-10之濃度。
化合物12對於來自健康志願者之PBMC在二種測試刺激存在及不存在之情形下之IL-10產製並無影響(圖12)。然而，化合物12以10-8 莫耳之濃度存在於培養中，顯著向上調節類風濕性關節炎病患之PBMC在受到LPS刺激後之IL-10產製(p<0.05)。化合物12對於類風濕性關節炎病患PBMC之自發性或單株抗體抗CD3及抗CD28刺激後之IL-10產製並無顯著效果(圖13)。
對免疫系統細胞之其他效果
實施例10.化合物4、5、6、9、12及16對PBMC增生反應之影響
研究化合物4、5、6、9、12及16在植物血球凝集素(PHA)10微克/毫升；PHA 2微克/毫升加外源性IL-2添加劑(25國際單位/毫升)，及單株抗體抗CD-3(12.5奈克/毫升)與抗CD-28(1:320.000)之組合之刺激存在或不存在下對來自健康志願者之PBMC增生反應之影響。
PBMC(每孔50000細胞)係於完全培養基中以37℃及5%二氧化碳大氣(細胞培養箱HERA Cell 150，德國朗根塞爾博德63505賽默飛世爾科技)培養4天。培養刺激條件為含有或不含植物血球凝集素(PHA，西班牙馬德里西格瑪編號L-8902)10微克/毫升；PHA 2微克/毫升加外源性IL-2添加劑(25國際單位/毫升，人重組IL-2 Macrolin，西班牙馬德里凱龍伊比利亞(Chiron Iberica)公司批號SA753228/4)，及單株抗體抗CD-3(12.5奈克/毫升)與抗CD-28(1:320.000)。在培養的最後8小時加入甲基-3 H胸腺核苷(西班牙馬德里ITISA美國放射化學公司，甲基-3 H胸腺核苷60居禮/毫莫耳)。細胞以玻璃纖維濾膜收集並埋入閃爍培養基中(1450-441 Meltilex A,de Wallac Oy,Ref#1450-441)。DNA併入放射活性係利用貝他粒子計數器(華雷克奧伊(Wallac Oy)公司)定量。作為培養細胞存活性之對照組，這些在顯微鏡(德國哥廷根卡爾蔡司顯微圖像有限公司Zeiss Axiovert 40CFL)下根據含有培養基但無其他信號之細胞培養的密度及型態學觀察，以偵測及定量該研究分子對PBMC之可能的致分裂直接作用，並評估培養後之細胞存活性。
培養中存在之化合物16並不顯著調節來自6名健康志願者之PBMC在各種研究之致分裂刺激存在或不存在下之增生反應(表28)。高劑量之IL-10已知可抑制CD3+CD28抗體誘發之增生反應，表示調節IL-1含量不是這裡分析之明確實驗條件所作用之主要機制。其不像許多一般之免疫抑制劑為負向影響T細胞增生之免疫抑制化合物。
培養中存在之化合物4並不顯著調節來自6名健康志願者之PBMC在各種研究之致分裂刺激存在或不存在下之增生反應(表29)。這表示此化合物不像許多一般之免疫抑制劑為負向影響T細胞增生之免疫抑制化合物。
只有以最高10-6 莫耳測試劑量之培養中之化合物5顯著抑制來自6名健康志願者之PBMC在CD3+CD28抗體刺激時之增生反應(p<0.05，表30)。這項特徵區別此化合物與其它結構相關化合物，它們具有相同之一些結構和功能特性。
培養中存在之化合物6並不顯著調節來自6名健康志願者之PBMC對任何所示刺激之增生反應(p<0.05；表31)。這表示此化合物不像許多一般之免疫抑制劑為負向影響T細胞增生之免疫抑制化合物。
培養中存在之化合物9並不顯著抑制健康志願者之PBMC對任何所示刺激之增生反應(p<0.05；表32)。這表示此化合物不像許多一般之免疫抑制劑為負向影響T細胞增生之免疫抑制化合物。
培養中存在之化合物12並不顯著調節健康志願者之PBMC在各種研究之致分裂刺激存在或不存在下之增生反應(圖14a及14b)。
實施例11.化合物12對PBMC釋放CD62L之影響
研究化合物12對於來自健康志願者之PBMC之淋巴細胞及單核細胞釋放CD62L之影響。
當化合物12以10-6 莫耳之濃度存在時，CD62L(CD62L-藻紅素(PE)，clon BD SK11目錄編號341012，BD生物科技公司)之釋放顯著增加(p<0.05)。值得注意的是，在CD62L釋放後所偵測到之CD62L-PE標示之幾何平均螢光強度(MFI)之降低選擇性地發生在淋巴細胞，但單核細胞中並未觀察到顯著差異(圖15a及15b)。
實施例12。鼠內毒血症：化合物12對TNF-α血清濃度之經口活性
使用體重30至35克及飼養無特定病原標準環境下之CD1公鼠。這些動物禁食(14至16小時；每組12隻；每籠≒500平方公分6隻)，可任意飲用蔗糖(8%)及NaCl(0.2%)之營養溶液。經口測試治療係以每公斤10毫升體積比之懸浮液給予(載劑Tween 80 0.1%-NaCl 0.9%)。經過1小時後，藉由腹腔內注射來自大腸桿菌血清型055:B5(西格瑪L-2880)之脂多糖(以1毫克/公斤劑量及10毫升/公斤體積比溶解於無菌食鹽水中)以誘發鼠毒血症。在LPS注射(ip)90分鐘後，以異氟烷麻醉小鼠，經心臟穿刺採集0.5至0.8毫升之血液；該血液樣本經過離心(6000rpm；10分鐘；4℃)，取二份血清樣本冷凍於-70℃直到測量血清TNF-α濃度(EIA：來自R＆D系統之小鼠TNF/TNFSF1A Quantikine)。得到之結果摘列於表35及圖16。
以100及200毫克/公斤/10毫升劑量經口給予之化合物12在此大腸桿菌LPS(ip)誘發鼠內毒血症之實驗模型中顯示活性；其相較於載劑組以統計顯著方式降低血清TNF-α含量。
實施例13.化合物12在小鼠膠原誘發關節炎模型中之抗關節炎活性
使用飼養於適當環境之8週齡DBA/1J公鼠。第0天，動物在尾根部接受100微克之牛膠原二型乳化於完全弗氏佐劑(1/1)之皮下注射免疫。初次免疫後的16天，以上述相同程序補強小鼠，但這次以不完全弗氏佐劑乳化膠原(1/1)。在第19及29天，動物接受40微克之LPS(大腸桿菌0111:B4)腹腔注射。藥理治療始於第20天，每天進行近一個月。關節炎指數每週評估三次，利用雙測量系統：所有腳掌厚度(數位式游標卡尺)及各肢體之臨床分數(目視評估0至4級)。在試驗結束時，取得血清樣本以測定IL-6濃度(BD生物科技之EIA)。得到之結果摘列於表36及圖17。
以100毫克/公斤腹腔注射及300毫克/公斤口服之化合物12在小鼠膠原誘發之關節炎模型中顯示顯著之抗關節炎作用。
圖1：經選擇之微球用於流式細胞小球微陣列術(CBA)顯影時之不同螢光特性。
圖2：化合物12對於受到LPS刺激之健康志願者(n=10)PBMC產製TNF-α之影響。矩形柱代表各樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之中位數及標準誤差。星號代表各實驗條件之對應資料相較於賦形劑具有統計顯著差異性(p<0.05)。
圖3：化合物12對於受到LPS或TCR/CD3+CD28刺激之健康志願者(n=13)PBMC產製TNF-α之影響。矩形柱代表樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之平均值及標準誤差。星號代表各個不同之實驗條件之對應資料相較於賦形劑具有統計顯著差異性(p<0.05)。
圖4：化合物12對於來自類風濕性關節炎病患(n=7)之PBMC產製TNF-α之影響。矩形柱代表各樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之平均值及標準誤差。星號代表各個不同之實驗條件之對應資料相較於賦形劑具有統計顯著差異性(p<0.05)。
圖5：利用FACSCalibur分析儀定量自健康志願者PBMC分離之AutoMACS分選單核細胞之純度。左圖顯示FSC(細胞大小)×SSC(顆粒性)分佈之散點圖，其顯示被包括在圈選出之單核細胞族群閘門內之全活細胞之百分比(98.5%)。右圖顯示T淋巴細胞與單核細胞標記表現之模式，其顯示左圖定義之單核細胞閘門內之99.6%之細胞具有普通人循環單核細胞之CD14+ CD3- 典型表現型。基準背景值(象限)係利用同型吻合特異性對照組設定；即使不是全部之大部分細胞(99.8%)係於左上之「單核細胞象限」。該顯示之資料係自代表9個獨立進行試驗之志願者之PBMC純化單核細胞之中位數結果。
圖6：在經LPS刺激之來自健康志願者PBMC純化之單核細胞中，化合物12對TNF-α mRNA表現動力學之影響。該曲線表示在單獨與溶劑載劑(◆菱形)或在10-6 莫耳之化合物12存在(▲三角形)或不存在(■方形)之LPS刺激培養後，在所示時間點TNF-α mRNA相較於內部β-肌動蛋白mRNA家務基因對照之表現量變化之動力學，二種基因產物在各時間點皆於7900HT快速即時Q-PCR系統計算。該動力學之時間點(0小時、2.5小時、5小時、8小時及24小時)係顯示於橫軸。TNF-α/β-肌動蛋白mRNA表現比之誘導倍數係顯示於縱軸。該顯示之資料係自代表9個獨立進行試驗之志願者之TNF-α mRNA表現動力學試驗之中位數結果。
圖7：在經LPS刺激之來自健康志願者PBMC純化之單核細胞中，化合物12對TNF-α蛋白質分泌動力學之影響。該曲線表示在單獨與溶劑賦形劑(◆菱形)或在10-6 莫耳之化合物12存在(▲三角形)或不存在(■方形)之LPS刺激培養後，在所示時間點該分泌之TNF-α蛋白質之變化之動力學。該動力學之時間點(0小時、2.5小時、5小時、8小時及24小時)係顯示於橫軸。在BD FACSarray生物分析儀中藉由細胞介素CBA定量所測量之TNF-α蛋白質之量係根據各時間點計算以顯示於縱軸。該顯示之資料係自代表9個獨立進行試驗之志願者之TNF-α蛋白質動力學試驗之中位數結果。
圖8：化合物12對於來自健康志願者(n=13)之PBMC產製IFN-γ之影響。矩形柱代表各樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之平均值及標準誤差。星號代表該所示實驗條件之對應資料相較於賦形劑具有統計顯著差異性(p<0.05)。
圖9：化合物12對於來自類風濕性關節炎病患(n=8)之PBMC產製IFN-γ之影響。矩形柱代表各樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之平均值及標準誤差。星號代表各個不同之實驗條件之對應資料相較於賦形劑具有統計顯著差異性(p<0.05)。
圖10：化合物12對於來自健康志願者(n=13)之PBMC產製IL-8之影響。矩形柱代表各樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之平均值及標準誤差。星號代表各實驗條件之對應資料相較於賦形劑具有統計顯著差異性(p<0.05)。
圖11：化合物12對於來自類風濕性關節炎病患(n=8)之PBMC產製IL-8之影響。矩形柱代表各樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之平均值及標準誤差。星號代表各實驗條件之對應資料相較於賦形劑具有統計顯著差異性(p<0.05)。
圖12：化合物12對於來自健康志願者(n=13)之PBMC產製IL-10之影響。矩形柱代表各樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之平均值及標準誤差。未發現統計差異性。
圖13：化合物12對於來自類風濕性關節炎病患(n=8)之PBMC產製IL-10之影響。矩形柱代表各樣本在不同實驗條件下進行二次培養所得到之平均值及標準誤差。星號代表該對應資料相較於賦形劑具有統計顯著差異性(p<0.05)。
圖14：在PHA、PHA加IL-2或單株抗體抗CD-3(T3)與抗CD-28之組合之刺激存在或不存在下，化合物12(a)與賦形劑(b)對於來自健康志願者(n=8)之PBMC增生反應之影響。
圖15：化合物12對於來自健康志願者之PBMC之淋巴細胞(a)及單核細胞(b)釋放CD62L之影響。
圖16：化合物12對於血清TNF-α之量之影響。
圖17：小鼠膠原誘發之關節炎模型中以腳掌平均厚度(a)及臨床分數(b)評估化合物12之抗關節炎活性。

Claims (19)

  1. 一種式(I)化合物 或其醫藥上可接受之鹽於製備用於治療急性或慢性發炎疾病之藥物上之用途，其中：R1 係選自經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之C3 -C8 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C8 芳基或經取代或未經取代之C3 -C8 雜環基，其中1至5個碳原子係各別經選自N、O或S之雜原子替代；R2 係選自經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之C3 -C8 環烷基或N(R’R”)，其中R’和R”各別為氫或經取代或未經取代之C1 -C6 烷基；且R3 係未經取代之C1 -6 烷基。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該用於治療急性或慢性發炎疾病之藥物的作用係藉由抑制至少一種選自TNF-α或IFN-γ之前發炎細胞介素之產生，或藉由免疫調節IL-8趨化激素及/或IL-10調節性細胞介素。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中係至少部份於TNF-α mRNA之表現量上達成該抑制前發炎細胞介素 TNF-α之產生。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該急性或慢性發炎疾病係選自急性和慢性血清陽性或血清陰性寡關節炎和多發性關節炎、脊椎關節病、腎小球性腎炎、膠原病、腎小管間質性腎炎、代謝性徵候群、動脈粥樣硬化、骨關節炎、氣喘、慢性阻塞性肺病、間質性肺病、多發性硬化症、脫髓鞘病、腦膜炎、腦炎、腦膜腦炎、發炎性神經根病變和週邊神經病變、發炎性腸病、硬化、肝炎、心衰竭、缺血性疾病、腎衰竭、發炎性膀胱炎、良性前列腺增生、前列腺炎、心肌炎、心包膜炎、葡萄膜炎、異位性皮膚炎、濕疹、蕁麻疹、牛皮癬、玫瑰痤瘡、過敏性鼻炎、敗血症、敗血性休克、多重器官衰竭、全身性自體免疫疾病(包括全身性紅斑性狼瘡)、血管炎、皮膚肌炎、澱粉樣變性症或類肉瘤病、器官特異性自體免疫疾病(包括重症肌無力)、甲狀腺炎或胰島炎、器官移植、感染和腫瘤引起之發炎、TNF-α依賴性細胞退化、壞死、細胞凋亡、移植物抗宿主病、惡病質或自體分泌和旁分泌病理性細胞生長。
  5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該慢性發炎疾病係血清陽性或血清陰性慢性多發性關節炎。
  6. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該慢性多發性關節炎係類風濕性關節炎。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中R1 係經取代或未經取代之C1 -C6 烷基。
  8. 如申請專利範圍第7項之用途，其中R1 係甲基。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中R2 係經取代或未經取代之C3 -C8 環烷基。
  10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中R2 係環戊基。
  11. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中R3 係甲基。
  12. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該式(I)化合物係選自下列化合物： 或其醫藥上可接受之鹽。
  13. 一種用於治療急性或慢性發炎疾病之醫藥組成物，該醫藥組成物包含治療上有效量之如申請專利範圍第1項所定義之式(I)化合物。
  14. 一種式(I’)化合物 或其醫藥上可接受之鹽，其中：R1 係選自經取代或未經取代之C1 -C6 烷基、經取代或未經取代之C3 -C8 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C8 芳基或經取代或未經取代之C3 -C8 雜環基，其中1至5個碳原子係各別經選自N、O或S之雜原子替代；且R3 係未經取代之C1 -C6 烷基。
  15. 如申請專利範圍第14項之化合物，其中R1 係經取代或未經取代之C1 -C6 烷基。
  16. 如申請專利範圍第15項之化合物，其中R1 係甲基。
  17. 如申請專利範圍第14項之化合物，該化合物係選自下列： 或其醫藥上可接受之鹽。
  18. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如申請專利範圍第14至17項中任一項所定義之式(I’)化合物或其醫 藥上可接受之鹽，及至少一種醫藥上可接受之載劑、佐劑及/或賦形劑。
  19. 如申請專利範圍第14至17項中任一項之式(I’)化合物，其用途係作為藥物。
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