JP2021528969A - ナチュラルキラー細胞 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団、それを産生する方法及びその治療上の適用に関する。より具体的には、本発明は、ＮＫ細胞産生に関連する特定の転写因子の発現を増加させることによるＮＫ細胞の増殖に関する。

Description

本発明は、増殖ナチュラルキラー（ＮＫ、Natural Killer）細胞集団、それを産生する方法及びその治療上の適用に関する。より具体的には、本発明は、ＮＫ細胞産生に関連する特定の転写因子の発現を増加させることによるＮＫ細胞の増殖に関する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、がん性細胞、病原体感染性細胞やその他損傷した細胞に対して細胞傷害性であるため、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞への関心は高まってきている。ＮＫ細胞は、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ、innate lymphoid cell）、具体的には大型顆粒細胞傷害性リンパ球であり、これは、免疫応答の自然及び適応アームをつなぐ。このＮＫ細胞は、末梢血中を循環するリンパ球の１０〜１５％を作り上げている。ＮＫ細胞はまた、免疫系において最も高いレベルの細胞傷害活性を示す。したがって、ＮＫ細胞の機能性又は数を変化させると、感染症及びがんに対する免疫系の機能に影響する。例えば、日本における広範な研究では、４０歳を超える人のコホートにおけるＮＫ細胞レベルの減少が、著しく高いがんの発生率と関連することが示されている。
Ｂ細胞及びＴ細胞と同様に、これらのＮＫ細胞は、リンパ球系共通前駆（ＣＬＰ、Common Lymphoid Progenitor）細胞に由来し、次いでこれは、造血幹細胞（ＨＳＣ、Haematopoietic Stem Cell）に由来する。しかし、ＮＫ細胞は、特異的細胞表面抗原受容体を欠くためＢ及びＴ細胞とは異なる。このため、ＮＫ細胞は、がん性細胞及び病原体感染性細胞を事前感作なしに殺傷することが可能であり、これによりＮＫ細胞は、自然免疫応答の一部であるとされる。このＮＫ細胞はまた、適応免疫応答に直接影響することにより腫瘍免疫監視においても重要な役割を有する。
ＮＫ細胞を活性化すると、パーフォリン、及びグランザイムを含有する細胞質顆粒の放出が引き起こされる。パーフォリンは重合して、Ｃａ２＋の存在下で標的細胞上に細孔を形成する。グランザイムは、これらの標的細胞内の細孔に入り、ＤＮＡ断片化及びアポトーシスを引き起こし得る。ＮＫ細胞はまた、サイトカインを分泌することができ、これが免疫の適応アームにおいて他の免疫細胞の作用を引き起こす。
病原体感染及びがん細胞に対する免疫応答におけるＮＫ細胞の重要性のため、複数の臨床試験において、養子移植プロトコルによるＮＫ細胞の有効性が試験されている。養子移植では、ドナーの血液から単離したＮＫ細胞をエクスビボで増殖させ、健常で機能性のＮＫ細胞に成熟させた後、レシピエントへ輸注する。しかし、効果的とするために、ＮＫ細胞ドナーをそのＫＩＲ遺伝子型についてスクリーニングすることが重要であり、ここでドナーは、レシピエントに適切なＫＩＲ対立遺伝子多型を有し、標的細胞を認識して破壊可能とする必要がある。いずれにしても、増殖させた産物は、臨床的成功率が予想よりも低く、がん性又は感染性細胞を殺傷する能力が低いことが試験により見出された。したがって、現在の養子移植プロトコルに対する重要な障壁が存在する。
代替的治療法は、内在性ＮＫ細胞の数を増加させることである。１つの方法は、ＮＫ細胞の発生に必須のサイトカインの投与である。ＩＬ−２及びＩＬ−１５の投与は、ＮＫ細胞の発生を増強することが予想された。ＩＬ−２は、ＮＫ細胞の増殖及び細胞傷害性を増進させ、一方、ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の発生及び増殖を増進させる。しかし、インビボでの試験では、サイトカインは、非常に高用量であっても、ＮＫ細胞の最小限の増殖を刺激して半減期を減少させるのみであることが見出された。さらに、サイトカインを投与すると、免疫応答が不適切に活性化されＮＫ細胞アポトーシスが誘導されるため、全身毒性を生じることが多い。
したがって、従来の方法及び技術を使用すると、大量のＮＫ細胞の産生は、困難であり、高細胞傷害性を有する完全機能性のＮＫ細胞の産生は、より困難である。ＮＫ細胞数を選択的に増加させる利用可能な薬物は現在、存在しない。したがって、治療的及び研究的使用のための大量の機能性ＮＫ細胞をエクスビボ及びインビボの両方で産生する、ＮＫ細胞産生の新規の方法を開発することが求められている。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、がん性、病原体感染性又は損傷した細胞を破壊する免疫系において重要な役割を有する。ＮＫ細胞数又は機能性を強化すると、これらの細胞の殺傷が増加すると予想されている。ＮＫ細胞養子移植及び内在性ＮＫ細胞のサイトカイン増強などの既存の療法は、その有効性の点では非常に成功しているとは言えない。
ＮＫ細胞は、骨髄中のＨＳＣから分化し、リンパ節、脾臓、末梢血、肺及び肝臓を含む、リンパ球系及び非リンパ球系組織にわたって分布する。特定のサイトカイン及び転写因子は、ＨＳＣのＮＫ細胞への発生を促すのに必要とされる。各サイトカイン及び転写因子は、正確な時間及び濃度で存在して、ＨＳＣからＮＫ細胞への分化を推し進めなければならない。しかし、ＮＫ細胞成熟化を支配する、サイトカイン及び転写因子の正確な体系は、未だ完全には理解されていない。
特に、本発明者らは、Ｎｆｉｌ３としても公知の、Ｅ４結合タンパク質４（Ｅ４ｂｐ４、E4 binding protein 4）に着目した。ＨＳＣにおけるＥ４ｂｐ４の過剰発現によりインビトロでのＮＫ細胞産生が非常に増強されるため、Ｅ４ｂｐ４の上方制御は、ＮＫ細胞の産生を増加させる有望な戦略である。しかし、転写因子は、その構造及び機能のため、薬物にするのが困難であり得る。例えば、転写因子は、通常、酵素活性又は補助因子結合部位を欠いている。本発明者らは、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害すると、ＮＫ細胞産生が増加することをこれまでに示した。特には、本発明者らは、ＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストＳＲ８２７８を使用してＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害すると、Ｅ４ｂｐ４発現が増加し、次いで、ＮＫ細胞産生が増加することを実証した。ＲＥＶ−ＥＲＢの多くの合成リガンドが、当技術分野において生成されている。しかし、スクリーニングでは、圧倒的多数のこのようなリガンドが、アゴニストとして同定されている（３００種を超えて同定されている）。アンタゴニストリガンドＳＲ８２７８の薬理学的プロファイルは、臨床環境における使用に適しないものである。その上、ＳＲ８２７８の作用機序に関する情報がなく、この分子周辺の適する構造活性相関がないため、他のアンタゴニスト化合物の発見が妨げられている。
本発明者らは、ここで、化合物のライブラリーを生成し、いくつかのこのような化合物において、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性が、ＳＲ８２７８と比較して向上したことを実証した。したがって、このような化合物は、ＮＫ細胞のエクスビボでの増殖を向上させると同時に薬理学的特性の向上をもたらす可能性を有することにより、臨床適用における使用にさらに適切なものとなっている。また、化合物は、好ましい薬理学的特性、例えば、良好な代謝安定性及び低毒性を示し得る。
したがって、本発明では、ＮＫ細胞集団を増殖させるためのエクスビボでの方法であって、
ａ）個体から得られた、造血前駆細胞（ＨＰＣ、haematopoietic progenitor cell）を含む試料を、培養するステップと、
ｂ）前記試料をＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物に接触させるステップと、
ｃ）前記細胞をインビトロで増殖させてＮＫ細胞集団を産生させるステップと
を含み、前記化合物が、式（Ｉ）：
Figure 2021528969
［式中、−−−−−−は、すべて存在する結合又は存在しない結合のいずれかを表し、
Ｒ１は、Ｃ１−６ヒドロカルビルから選択され、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、−ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１又は２以上の基と置換されていてもよく、
Ｒ２は、５〜１０員のヘテロ環及びＣ１−６ヒドロカルビルから選択され、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１又は２以上の基と置換されていてもよく、
Ｘは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択されるか又は存在せず、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−又は−ＣＲ’２−から選択され、
Ｚは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択されるか又は存在せず、
各Ｒａは、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択され、
各Ｒｂは、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル及び−ＯＲ’から独立的に選択され、
Ｒｃは、Ｈ及びＣ１−４ヒドロカルビルから選択され、
各Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル及び−Ｐｈから独立的に選択される］
を有するか又は薬学的に許容されるこの塩であり、ただし上記化合物が、
Figure 2021528969
ではない、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、−−−−−−は、すべて存在する結合を表し、化合物は、式Ia：
Figure 2021528969
による閉環構造である。
Ｒ１は、非置換であり、したがって、好ましくは、Ｃ１−６アルキル及びＣ１−６アルケニルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は、Ｃ１−６アルキルから、さらにより好ましくは、Ｃ１−４アルキルから、例えば、メチル、エチル及びプロピルから選択され得る。
Ｒ２は、（ｉ）置換されていてもよい５〜１０員のヘテロ環、好ましくは、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール環であって、５〜１０員のヘテロアリール環は、好ましくは、置換されていてもよい５、６又は９員のヘテロアリール環であり、５、６又は９員のヘテロアリール環は、置換されていてもよい、フラニル、チオフェニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピロリル、トリアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル（benzimidazolyl）、アザインドリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンズイソオキサゾリル（benzisoxazolyl）及びベンゾオキサゾリルから選択されていてもよい、５〜１０員のヘテロ環、及び（ii）置換されていてもよいフェニル、好ましくは、置換されているフェニルから選択されてもよく、及び／又はＲ２は、非置換であるか、又はＣ１−４アルキル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、−ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１若しくは２の基と置換され、好ましくは、Ｒ２は、非置換であるか、又は−Ｍｅ、−ＯＭｅ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｉ及び−ＳＭｅから独立的に選択される１若しくは２の基と置換されていてもよい。
Ｘは、−Ｏ−であることがあり、Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−であることがあり、Ｚは、−Ｏ−であるか、若しくは存在しないことがあり、好ましくは、Ｚは、存在しないことがあり、各Ｒａは、Ｈ、Ｃ１−４アルキル及び−ＯＲ’から、好ましくは、Ｈ及びＣ１−４アルキルから独立的に選択されることがあり、より好ましくは、各Ｒａは、Ｈであり、各Ｒｂは、Ｈ及びＣ１−４アルキルから独立的に選択され、好ましくは、各Ｒｂは、Ｈであり、Ｒｃは、Ｈであることがあり、並びに／又は各Ｒ’は、Ｈ及びＣ１−４アルキルから、好ましくは、Ｈ、メチル及びエチルから、より好ましくは、メチル及びエチルから独立的に選択されることがある。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒｂ及びＲｃは、すべてＨであり、これにより化合物は、式（II）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｘ、Ｙ及びＺは、本明細書に定義される。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒａはまた、すべてＨであり、これにより化合物は、式（III）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＺは、本明細書において定義され、
好ましくは、Ｘは、Ｏであり、これにより化合物は、式（IV）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ及びＺは、本明細書において定義され、
より好ましくは、Ｙは、Ｃ（Ｏ）であり、これにより化合物は、式（Ｖ）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２及びＺは、本明細書において定義され、
さらにより好ましくは、Ｒ１は、エチルであり、これにより化合物は、式（VI）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ２及びＺは、本明細書において定義され、
またさらにより好ましくは、化合物は、式（VII）：
Figure 2021528969
を有する閉環構造であり、式中、Ｒ２及びＺは、本明細書に定義される。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、化合物は、
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
から選択される式を有し、好ましくは、化合物は、式：
Figure 2021528969
を有し、より好ましくは、化合物は、式：
Figure 2021528969
を有する。
典型的には、前記化合物は、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を低下させることによりＥ４ｂｐ４発現を増加させる。本発明の方法のいくつかの実施形態では、前記化合物は、ＲＥＶ−ＥＲＢ−α及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢ−β、好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢ−β、より好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢ−α及びＲＥＶ−ＥＲＢ−βの活性を低下させる。いくつかの好ましい実施形態では、前記化合物は、ＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニスト、好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢ−α及びＲＥＶ−ＥＲＢ−βのアンタゴニストである。
本発明によれば、前記方法は、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下でＨＰＣを培養するステップをさらに含んでいてもよく、ＨＰＣを培養する容器がＮｏｔｃｈリガンドでコーティングされていてもよい。いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎｏｔｃｈリガンドは、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）又はＤＬＬ４の機能を保持するこの断片であり、及び／又は（ｂ）Ｎｏｔｃｈリガンドは、前記ＨＰＣの単離後４日に、又は前記ＨＰＣの単離後４日から存在する。細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養するステップの後にＩＬ−１５の存在下で培養されることがあり、並びに／又はＨＰＣは、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ及び／若しくは幹細胞因子（ＳＣＦ）と組み合わせたＮｏｔｃｈリガンド、好ましくは、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ及びＳＣＦと組み合わせたＮｏｔｃｈリガンドの存在下で培養されることがあり、細胞をＮｏｔｃｈリガンドの存在下で培養するステップ及びＩＬ−１５の存在下で培養するステップのいずれか又は両方が、間質支持細胞（stromal support cell）の非存在下で行われていてもよく、好ましくは、両方のステップが、間質支持細胞の非存在下で行われる。
本発明によれば、方法は、ＨＰＣをＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じる化合物と接触させ、これによりＥ４ｂｐ４活性の上昇を生じるステップであって、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化が、Ｅ４ｂｐ４のＳＵＭＯ化及び／又はリン酸化の減少であってもよく、好ましくは、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化において生じる化合物が、（ａ）Ｅ４ｂｐ４の残基Ｋ１０、Ｋ１１６、Ｋ２１９、Ｋ３３７及び／若しくはＫ３９４又はこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいてＳＵＭＯ化を減少させ、及び／又は（ｂ）Ｅ４ｂｐ４の残基Ｓ２８６、Ｓ３０１及び／若しくはＳ４５４又はこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいてリン酸化を減少させる、ステップをさらに含み得る。
ＨＰＣの試料は、骨髄、臍帯血及び／又は末梢血から得ることができる。
本発明は、ＮＫ細胞の少なくとも８５％がＣＤ５６＋及びＣＤ４５＋である、本発明の方法により得られた増殖ＮＫ細胞集団をさらに提供する。
本発明では、本発明の増殖ＮＫ細胞集団並びに薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む組成物をさらに提供する。
また、患者におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の産生を増加させることによる療法の方法における使用のためのＲＥＶ−ＥＲＢ活性の作用を阻害する化合物であって、本明細書に定義する本発明の化合物である、化合物を本発明により提供する。
本発明では、患者におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の産生を増加させることによる療法の方法における同時、別々、又は逐次の使用のための混合調製物として、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物及びＮｏｔｃｈリガンドを含む産物であって、前記化合物が、本発明の化合物であり、前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）又はＤＬＬ４の機能を保持するこの断片であってもよい、産物をさらに提供する。本発明によれば、療法の前記方法は、（ａ）がん、感染性疾患（急性又は慢性）、自己免疫疾患、又は女性の不妊若しくは妊娠と関連する疾患若しくは障害から選択される疾患又は障害を治療する方法、又は（ｂ）ウイルス感染症、細菌感染症、プロテスト感染症（protest infection）、真菌感染症及び／又は蠕虫感染症の治療の方法であり得る。
本発明では、本発明による、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する治療有効量の化合物及び任意のＮｏｔｃｈリガンドを前記患者に投与するステップを含む、それを必要とする患者におけるＮＫ細胞数を増加させることによる治療の方法であって、好ましくは、Ｎｏｔｃｈリガンドが、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）又はＤＬＬ４の機能を保持するこの断片である、方法をさらに提供する。
本発明の使用のための化合物若しくは産物、又は本発明の治療の方法は、抗体媒介免疫療法と組み合わせて使用することがあり、前記化合物又は産物は、抗体媒介免疫療法を施す前、同時、又は後の投与用であってもよい。
また、本発明では、化合物が、
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
ではないという条件で、本明細書に定義する式（Ｉ）の化合物を提供する。
ＮＫ細胞発生経路である。ＮＫ細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から分化したものである。ＮＫ細胞は、ＨＳＣからリンパ球系共通前駆（ＣＬＰ）細胞、ＮＫ前駆（ＮＫＰ、NK progenitor）細胞、未熟ＮＫ（ｉＮＫ、immature NK）細胞、成熟ＮＫ（ｍＮＫ、mature NK）細胞及び最終的に通常型ＮＫ（ｃＮＫ、conventional NK）細胞に発生し、これらは血中を循環する。経路図の下部は、ＮＫ細胞の発生に必要とされる、サイトカイン及び転写因子である。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の発生に必要とされる主要なサイトカインのうちの１つである。他は、図に示す移行に必要とされる転写因子である。 （Ａ）例となる１段階ＮＫ細胞増殖方法のタイムラインである。ＨＰＣは、単離し、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７及びＳＣＦサイトカインを加えて培養し得る。次いで２日目に、これらを、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物を培養培地に加えたか又は加えず、ＩＬ−１５サイトカインを加えていてもよいＯＰ９間質細胞に移した。（Ｂ）ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物及びＮｏｔｃｈリガンドを使用したＮＫ細胞の発生の例となる２段階培養の模式図である。 新たに生成した化合物のＲＥＶ−ＥＲＢａ活性に対する作用である。ウミシイタケ１０ｎｇ、Ｂｍａｌ−ｌｕｃ １００ｎｇ、ＲＥＶ−ＥＲＢα １０ｎｇ及びＢＳＭ ２８０ｎｇを使用した薬物スクリーニングについての２重ルシフェラーゼの結果である。化合物を１０μＭの濃度で試験した。化合物４、７、８、１１及び１２は、有意なアンタゴニスト活性を示してＢｍａｌ−ｌｕｃ発現が増加し、一方、化合物ＡＧ１、ＡＧ２及びＡＧ５は、アゴニストでありＢｍａｌ−ｌｕｃのシグナルが減少する（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１及び＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。 新たに生成したさらなる化合物のＲＥＶ−ＥＲＢａ活性に対する作用である。ウミシイタケ１０ｎｇ、Ｂｍａｌ−ｌｕｃ １００ｎｇ、ＲＥＶ−ＥＲＢα １０ｎｇ及びＢＳＭ ２８０ｎｇを使用した薬物スクリーニングについての２重ルシフェラーゼの結果である。化合物を１０μＭの濃度で試験した。化合物７２、４、７及び１１は、有意なアンタゴニスト活性を示してＢｍａｌ−ｌｕｃ発現が増加し、一方、化合物ＡＧ２は、アゴニストでありＢｍａｌ−ｌｕｃのシグナルが減少する（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１及び＊＊＊はｐ＜０．００１）。 新たに生成したさらなる化合物のＲＥＶ−ＥＲＢα活性に対する作用である。ウミシイタケ１０ｎｇ、Ｂｍａｌ−ｌｕｃ １００ｎｇ、ＲＥＶ−ＥＲＢα １０ｎｇ及びＢＳＭ ２８０ｎｇを使用した薬物スクリーニングについての２重ルシフェラーゼの結果である。化合物を１０μＭの濃度で試験した。化合物７１〜７３、４、７及び１１は、有意なアンタゴニスト活性を示してＢｍａｌ−ｌｕｃ発現が増加し、一方、化合物ＡＧ２は、アゴニストでありＢｍａｌ−ｌｕｃのシグナルが減少する（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１及び＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。 新たに生成した化合物のＲＥＶ−ＥＲＢβ活性に対する作用である。ウミシイタケ１０ｎｇ、Ｂｍａｌ−ｌｕｃ １００ｎｇ、ＲＥＶ−ＥＲＢβ １０ｎｇ及びＢＳＭ ２８０ｎｇを使用した薬物スクリーニングについての２重ルシフェラーゼの結果である。化合物を１０μＭの濃度で試験した。化合物４は、有意なアンタゴニスト活性を示してＢｍａｌ−ｌｕｃ発現が増加し、一方、化合物ＡＧ２は、アゴニストでありＢｍａｌ−ｌｕｃのシグナルが減少する（＊はｐ＜０．０５及び＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。 新たに生成したさらなる化合物のＲＥＶ−ＥＲＢα活性に対する作用である。ウミシイタケ１０ｎｇ、Ｂｍａｌ−ｌｕｃ １００ｎｇ、ＲＥＶ−ＥＲＢα １０ｎｇ及びＢＳＭ ２８０ｎｇを使用した薬物スクリーニングについての２重ルシフェラーゼの結果である。化合物を１０μＭの濃度で試験した。化合物４、７、１１、２７及び２８は、有意なアンタゴニスト活性を示してＢｍａｌ−ｌｕｃ発現が増加し、一方、化合物ＡＧ５は、アゴニストでありＢｍａｌ−ｌｕｃのシグナルが減少する（＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１及び＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。 新たに生成したさらなる化合物のＲＥＶ−ＥＲＢβ活性に対する作用である。ウミシイタケ１０ｎｇ、Ｂｍａｌ−ｌｕｃ １００ｎｇ、ＲＥＶ−ＥＲＢβ １０ｎｇ及びＢＳＭ ２８０ｎｇを使用した薬物スクリーニングについての２重ルシフェラーゼの結果である。化合物を１０μＭの濃度で試験した。化合物１８及び１９は、アンタゴニスト活性を示してＢｍａｌ−ｌｕｃ発現が増加し、一方、化合物ＡＧ２は、アゴニストでありＢｍａｌ−ｌｕｃのシグナルが減少する（＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。 各アッセイ条件についてのＮＫ細胞の総数を示すＮＫ細胞発生アッセイの結果である。化合物７は、ＮＫ細胞数の有意な増加を示し、化合物１１についても、ＳＲ８２７８及びアゴニスト化合物ＡＧ２と比較して増加が観察される（＊はｐ＜０．０５）。 各アッセイ条件についてのＮＫ細胞の総数を示すＮＫ細胞発生アッセイの結果である。化合物７、１１及び７２は、ＳＲ８２７８及びアゴニスト化合物ＡＧ２と比較してＮＫ細胞数の有意な増加を示す（＊＊はｐ＜０．０１及び＊＊＊はｐ＜０．００１）。
定義
本明細書において使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上明白に他に指示しない限り複数の参照対象を含む。
用語、含むは、「含む」（開放的定義）と「からなる」（閉鎖的定義）の両方を包含する。言い換えれば、実施形態、説明、態様又は開示が列挙する特徴（複数可）を含む場合、本発明はまた、前記特徴（複数可）からなる前記実施形態、説明、態様又は開示を包含する。
用語「化学的に実現可能な」は、有機構造の一般的に理解される法則に反しない、結合配列又は化合物を意味し、例えば、天然には存在しない５価の炭素原子を特定の状況において含む、特許請求の範囲の定義における構造は、特許請求の範囲内には存在しないことが理解される。本明細書において開示する構造は、これらの実施形態のすべてにおいて、「化学的に実現可能な」構造のみを含むことを意図し、化学的に実現可能ではない、列挙する任意の構造は、例えば、可変の原子又は基によって示す構造により、本明細書において開示することを意図せず、本発明の部分を形成しない。
化学構造の「アナログ」は、用語を本明細書において使用する場合、親構造との実質的類似性を保存する化学構造を指すが、これは、親構造から容易には合成的に得られないことがある。親化学構造から容易に合成的に得られる関連化学構造は、「誘導体」と呼ぶ。
置換基を特定の同一性を有する１又は２以上の原子、又は「結合」であると明示する場合、立体配置は、置換基が、化学的に実現可能な結合配置において特定の置換基に直接隣接した基が相互に直接結合する「結合」である場合を指す。
特定の立体化学又は異性体形態を特に指示しない限り、キラル、ジアステレオマー、ラセミの形態のすべての構造を意図する。本発明において使用する化合物は、描写から明らかであるように、任意又はすべての不斉原子に濃縮又は分解した光学異性体を任意の濃縮度で含み得る。ラセミとジアステレオマーの両方の混合物並びに個々の光学異性体は、エナンチオマー又はジアステレオマーのこれらのパートナーを実質的に含まないように単離又は合成することができ、これらはすべて本発明の範囲内に存在する。
本明細書において使用する場合、用語「安定化合物」及び「安定構造」は、反応混合物から有用な純度までの単離及び効果的な治療薬への製剤化に耐えるのに十分に頑強な化合物を示すことを意味する。安定化合物のみを本明細書において検討する。
当技術分野において周知のような化学基の一般的略称を使用し、例えば、Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチル、ｉ−Ｐｒ＝イソプロピル、Ｂｕ＝ブチル、ｔ−Ｂｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル、Ｐｈ＝フェニル、Ｂｎ＝ベンジル、Ａｃ＝アセチル、Ｂｚ＝ベンゾイル等である。
基を列挙する場合、例えば、カルボキサミド基Ｃ（＝Ｏ）ＮＲのように、基が、構造において２以上の配向で存在して、２以上の分子構造を生じる得るとき、分子構造における基の配向を文脈上明白に制限しない限り、例えば、Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）−Ｙ又はＸ−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）−Ｙのように、基は、可能な任意の配向で存在し得ることが理解される。
ヒドロカルビル基は、炭素及び水素のみからなる基であるが、本明細書に定義するように、基は１又は２以上の回数、置換し得る。ヒドロカルビル基は、直鎖及び分枝状の基を含む。式（Ｉ）の化合物は、炭素原子１〜６、特には、炭素原子１〜４又は炭素原子１〜３を有するヒドロカルビル基を典型的に有する。本明細書において使用する場合、用語「ヒドロカルビル」は、芳香族及び非芳香族の基を包含する。好ましいヒドロカルビル基は、アルキル、アルケニル及びアルキニル基を含み、これらは以下にさらに記載する。
アルキル基は、炭素原子１〜約２０、典型的には、炭素原子１〜１２、炭素原子１〜８、炭素原子１〜６を有する、直鎖及び分枝状のアルキル基及びシクロアルキル基を含む。直鎖アルキル基の例としては、炭素原子１〜８を有するもの、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、及びｎ−オクチル基が挙げられる。分枝状アルキル基の例としては、イソプロピル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、及び２，２−ジメチルプロピル基が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用する場合、用語「アルキル」は、ｎ−アルキル、イソアルキル、及びアンテイソアルキル（anteisoalkyl）基並びに他の分枝鎖形態のアルキルを包含する。代表的置換アルキル基は、本明細書に定義するように１又は２以上の回数、置換することができる。
シクロアルキル基は、環式アルキル基、例えば、それらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチル基である。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基は、３から約８〜１２環員を有することがあるが、他の実施形態では、環状炭素原子の数は、３から４、５、６又は７員の範囲である。シクロアルキル基は、多環式シクロアルキル基、例えば、それらに限定されないが、ノルボルニル、アダマンチル、ボルニル、カンフェニル（camphenyl）、イソカンフェニル（isocamphenyl）、及びカレニル（carenyl）基、並びに縮合環、例えば、それらに限定されないが、デカリニル（decalinyl）等をさらに含む。また、シクロアルキル基は、上に定義する直鎖又は分枝鎖のアルキル基と置換する環を含む。代表的置換シクロアルキル基は、本明細書に定義するような、一置換又は２回以上置換した基であり得る。
アルケニル基は、例えば、上記のアルキル基であるが、少なくとも１つの炭素−炭素２重結合を含むアルキル基である。したがって、アルケニル基は、直鎖及び分枝状のアルケニル基及び非芳香族シクロアルケニル基を含む。アルケニル基は、必然ではないが、好ましくは、２重結合の部分を形成する炭素によって残りの分子に結合する。代表的置換アルケニル基は、本明細書に定義するような、一置換又は２回以上置換した基であり得る。
アルキニル基は、例えば、上記のアルキル基であるが、少なくとも１つの炭素−炭素３重結合を含むアルキル基である。したがって、アルキニル基は、直鎖及び分枝状アルキニル基を含む。アルキニル基は、必然ではないが、好ましくは、３重結合の部分を形成する炭素によって残りの分子に結合する。代表的置換アルキニル基は、本明細書に定義するような、一置換又は２回以上置換した基であり得る。
ヘテロ環基／ヘテロ環又は用語「ヘテロ環」は、３環員以上を含む芳香族及び非芳香族環化合物を含み、この環員の１又は２以上は、ヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ及びＳであるが、これらに限定されない。したがって、ヘテロ環は、シクロヘテロアルキル、若しくはヘテロアリール、又は多環式である場合、これらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態では、ヘテロ環基は、３から約２０環員を含むが、式（Ｉ）の化合物では、ヘテロ環は、５から１０環員を典型的に有する。ヘテロ環は、ヘテロ原子１を有する５員環、ヘテロ原子２を有する６員環等であり得る。炭素原子の数足すヘテロ原子の数の合計は、環原子の総数に等しい。また、ヘテロ環は、１又は２以上の２重結合を含み得る。ヘテロアリール環は、ヘテロ環基の実施形態である。句「ヘテロ環基」は、縮合芳香族及び非芳香族基を含むものを含む縮合環種を含む。例えば、ジオキソラニル（dioxolanyl）環及びベンズジオキソラニル（benzdioxolanyl）環系（メチレンジオキシフェニル環系）はともに、本明細書における意味の範囲内において、ヘテロ環基である。また、句は、本明細書に記載のヘテロ原子を含む多環式の環系を含む。ヘテロ環基は、非置換であり得るか、又は上に考察したように置換し得る。
ヘテロアリール基は、５以上の環員を含む芳香環化合物であり、この環員の１又は２以上は、ヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ及びＳであるが、これらに限定されず、例えば、ヘテロアリール環は、５から約８〜１２環員を有し得る。式（Ｉ）の化合物では、ヘテロアリール環は、５から約１０環員を典型的に有する。ヘテロアリール基は、芳香族電子構造を有する様々なヘテロ環基である。同様に、ヘテロアリールは、ヘテロ原子１を有する５員環、ヘテロ原子２を有する６員環等であり得る。炭素原子の数足すヘテロ原子の数の合計は、環原子の総数に等しい。ヘテロアリール基は、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、ピリジニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、インドリル、アザインドリル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、アザベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イミダゾピリジニル、イソオキサゾロピリジニル（isoxazolopyridinyl）、チアナフタレニル、プリニル、キサンチニル、アデニニル、グアニニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、キノキサリニル、及びキナゾリニル基のような基を含むが、これらに限定されない。ヘテロアリール基は、非置換であり得るか、又は上に考察するような基と置換し得る。代表的置換ヘテロアリール基は、１又は２以上の回数、上に列挙したもののような基と置換し得る。
ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。
当業者に周知のような「塩」は、有機化合物、例えば、カルボン酸、スルホン酸、又はアミンを、イオンの形態で、対イオンと組み合わせて含む。例えば、アニオンの形態の酸は、カチオン、例えば、金属カチオン、例えば、ナトリウム、カリウム等を有する塩；テトラアルキルアンモニウム塩、例えば、テトラメチルアンモニウムを含む、例えば、ＮＨ４＋若しくは種々のアミンのカチオンを有するアンモニウム塩、又は他のカチオン、例えば、トリメチルスルホニウム等を有する塩を形成し得る。「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」塩は、塩化物塩又はナトリウム塩のように、ヒトが摂取するのに認可されているイオンから形成される塩であり、一般に非毒性である。「双性イオン」は、分子内塩であり、例えば、イオン化可能な少なくとも２つの基を有し、一方がアニオン及び他方がカチオンを形成して、相互に釣り合うように作用する分子において形成され得る。例えば、アミノ酸、例えば、グリシンは、双性イオンの形態で存在し得る。「双性イオン」は、本明細書における意味の範囲内において、塩である。本発明の化合物は、塩の形態を取り得る。用語「塩」は、遊離酸、又は本発明の化合物である、遊離塩基の付加塩を包含する。塩は、「薬学的に許容される塩」であり得る。用語「薬学的に許容される塩」は、薬学的適用における有用性を提供する範囲の毒性プロファイルを有する塩を指す。
それにもかかわらず、薬学的に許容されない塩は、高結晶化度のような特性を有することがあり、例えば、本発明の化合物の合成、精製又は製剤化のプロセスにおける有用性のような、本発明の実践における有用性を有する。
適する薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸又は有機酸から調製し得る。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、及びリン酸が挙げられる。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、アラリファティック（araliphatic）、ヘテロ環式、カルボキシ及びスルホンクラスの有機酸から選択されることがあり、この例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸、及びガラクツロン酸が挙げられる。薬学的に許容されない酸付加塩の例としては、例えば、過塩素酸塩及びテトラフルオロホウ酸が挙げられる。
本発明の化合物の適する薬学的に許容される塩基付加塩は、例えば、金属塩を含み、アルカリ金属、アルカリ土類金属及び遷移金属の塩、例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛のような塩を含む。また、薬学的に許容される塩基付加塩は、塩基性アミンから生成する有機塩、例えば、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）及びプロカインのような塩を含む。薬学的に許容されない塩基付加塩の例としては、リチウム塩及びシアン酸塩が挙げられる。薬学的に許容されない塩は、医薬としては一般に有用ではないが、このような塩は、例えば、式（Ｉ）の化合物の合成、例えば、再結晶によるこれらの精製における中間体として有用であり得る。このような塩のすべては、例えば、適切な酸又は塩基を式（Ｉ）による化合物と反応させることにより、式（Ｉ）による対応化合物から、従来の手段によって調製し得る。用語「薬学的に許容される塩」は、非毒性の無機若しくは有機酸及び／又は塩基付加塩を指し、例えば、参照により本明細書に組み込むLit et al., Salt Selection for Basic Drugs (1986), Int J. Pharm., 33, 201-217を参照されたい。
「水和物」は、水分子を有する組成物に存在する化合物である。組成物は、１水和物若しくは２水和物のように、化学量論的量の水を含み得るか、又はランダムな量の水を含み得る。本明細書において用語を使用する場合、「水和物」は、固体を指し、すなわち、水溶液中の化合物は、水和し得るが、本明細書において用語を使用する場合、水和物ではない。
「溶媒和物」は、水以外の溶媒が水に代わることを除いて類似の組成物である。例えば、メタノール又はエタノールは、「アルコレート」を形成することができ、これもやはり化学量論的又は非化学量論的であり得る。本明細書において用語を使用する場合、「溶媒和物」は、固体を指し、すなわち、溶媒中の化合物は、溶媒和し得るが、本明細書において用語を使用する場合、溶媒和物ではない。
当業者に周知のような「プロドラッグ」は、患者に投与可能な物質であり、この場合、物質は、患者の体内における生化学物質、例えば、酵素の作用により、活性な医薬成分にインビボで変換される。プロドラッグの例としては、カルボン酸基のエステルが挙げられ、これは、ヒト及び他の哺乳動物の血流に見出されるように、内因性エステラーゼにより加水分解され得る。適するプロドラッグ誘導体の選択及び調製のための従来の手順は、例えば、"Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985に記載されている。
加えて、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群により記載されている場合、これによって本発明もまた、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素又は構成要素の亜群により記載されていることを当業者は認識する。例えば、Ｘが、臭素、塩素、及びヨウ素からなる群から選択されるものとして記載されている場合、Ｘが臭素である請求項並びにＸが臭素及び塩素である請求項は、十分に説明される。その上、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュ群により記載されている場合、これによって本発明もまた、マーカッシュ群の個々の構成要素又は構成要素の亜群の任意の組合せにより記載されていることを当業者は認識する。したがって、例えば、Ｘが臭素、塩素、及びヨウ素からなる群から選択されるものとして記載されており、Ｙがメチル、エチル、及びプロピルからなる群から選択されるものとして記載されている場合、Ｘが臭素であり、Ｙがメチルである請求項は、十分に説明される。
必然的に整数である変数の値、例えば、アルキル基の炭素原子の数又は環上の置換基の数が、例えば、０〜４の範囲として記載されている場合、値が０以上４以下の任意の整数、すなわち０、１、２、３又は４であり得ることを意味する。
種々の実施形態では、本発明の方法において使用するような、化合物又は１組の化合物は、上に列挙する実施形態の任意の組合せ及び／又は部分的組合せのいずれか１つであり得る。
種々の実施形態では、実施例のいずれか又は例となる化合物のうちに示す化合物を提供する。
条件は、開示する範疇又は実施形態のいずれかに適用することがあり、この場合、上に開示する他の実施形態又は種のいずれか１又は２以上は、このような範疇又は実施形態から除外し得る。
ナチュラルキラー細胞
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫系の中で最も高いレベルの細胞傷害活性を示す。ＮＫ細胞は、Ｂ細胞及びＴ細胞に類似しているが、特定の細胞表面抗原受容体を欠いている。代わりに、ＮＫ細胞は、モチーフを認識する、活性化及び阻害受容体を有する。
ＮＫ細胞は、血液並びにリンパ節及び脾臓などの末梢リンパ器官中を循環する。これらは、サイトカインにより、又は標的細胞に遭遇すると活性化された状態となり得る。標的細胞の認識及び除去は、阻害及び活性化シグナルの釣り合いに基づく。活性化シグナルは、リガンドに結合する活性化受容体（ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０）により生成され、これは、がん性細胞、病原体感染性細胞及び損傷した細胞だけでなく、健常な細胞にも存在し得る。一方、阻害シグナルは、ＮＫ細胞上の阻害受容体（ＫＩＲ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）が、通常すべての健常な細胞に存在する主要組織適合抗原（ＭＨＣ、Major Histocompatibility Complex）クラスＩ分子に結合する場合に生成される。標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子は、存在しないか、又は非常に下方制御され、そのため理想的なＮＫ細胞標的となっている。これによりＮＫ細胞が、標的と健常な細胞を識別することが可能となった。ＮＫ細胞が標的細胞を認識及び殺傷するために、活性化シグナル全体は、阻害シグナルよりも大きくなければならない。
ＮＫ細胞は、がん性細胞、病原体感染性細胞及び損傷した細胞を事前感作なしに認識及び殺傷し、そのためＮＫ細胞は、自然免疫応答の一部となっている。例えば、ＮＫ細胞は、ウイルス感染に対する初期応答をもたらし、その後、Ｔ細胞の感染細胞殺傷が生じる。ＮＫ細胞は、標的細胞を数分以内に殺傷することができる。ＮＫ細胞はまた、サイトカインを分泌し、免疫系の他の部分を「兵器化」する。例えば、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞エフェクター機能を増進させ、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ、antibody-directed cellular cytotoxicity）を増強する。
ＮＫ細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から図１に提示する経路を介して分化する。より詳細には、ＮＫ細胞は、ＨＳＣからリンパ球系共通前駆（ＣＬＰ）細胞、プレＮＫ前駆（ｐｒｅ−ＮＫＰ）細胞、ＮＫ前駆（ＮＫＰ）細胞、未成熟ＮＫ（ｉＮＫ）細胞、成熟ＮＫ（ｍＮＫ）細胞及び最終的に通常型ＮＫ（ｃＮＫ）細胞に発生し、これらは血流を循環する。この用語は、マウスにおけるＮＫ細胞発生に由来するが、対応する経路は、ヒトＮＫ細胞発生においても生じる。例えば、ＨＳＣは、複数の先駆体の段階（段階１、２及び３）、その後の成熟ＮＫ細胞への発生（段階４及び５）を通じて発生する。一貫性のために、ＨＳＣ、ＣＬＰ、プレＮＫＰ、ＮＫＰ、ｉＮＫ、ｍＮＫ、ｃＮＫ及びＮＫ細胞の表現を本明細書において使用する。
しかし、本発明の文脈において、これらの用語は、ヒト命名法の段階１〜５と互換性を有する。図１の経路図の下部は、ＮＫ細胞発生に必須の、サイトカイン及び転写因子である。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の発生に必要とされる主要なサイトカインの１つである。特定の間質細胞などの他の外因子はまた、ＮＫ細胞の発生及び成熟に必要とされる。本発明によれば、造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、ＨＳＣ、ＣＬＰ及びまたＮＫＰなどの多分化能前駆細胞を含有する異種集団である。ＨＰＣは、発生経路にまだ深く関与していないため、系列陰性細胞と呼ばれる。したがって、本発明の文脈において、ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及びＮＫＰ細胞は、すべてＨＰＣであり、ＨＰＣに言及する場合、これと矛盾する明示的な記述がない限り、ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及び／若しくはＣＬＰ細胞のいずれか、又はこれらの任意の組合せへの言及となる。
免疫応答におけるＮＫ細胞の重要性のために、複数の臨床試験では、ＮＫ細胞の有効性を養子移植プロトコルにおいて試験した。典型的には、これは同種間の移植であり、ＮＫ細胞を健常なドナーから単離し、増殖させる。しかし、標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の下方制御は、部分的であり、ドナー及びレシピエント由来のＫＩＲ遺伝子型は、類似していてもよい。このため、レシピエントに注入されるＮＫ細胞は、様々な個人由来であっても、そのＫＩＲがＭＨＣクラスＩ分子を認識する場合、標的細胞に結合しない可能性がある。したがって、ＮＫ細胞ドナーをそのＫＩＲ遺伝子型についてスクリーニングしなければならないことは重要であり、ここでドナーは、標的細胞を認識して破壊することを可能とする、レシピエントに適切なＫＩＲ対立遺伝子多型を有していなければならない。その上、増殖させた産物は、臨床的成功率が予想よりも低く、がん性又は感染性細胞を殺傷する能力が低いことが見出されている。
ＮＫ細胞は、そのマーカー発現、その機能／活性、又はこれらの組合せの点から定義することができる。このような定義は、当分野において標準であり、マーカー発現及び／又はＮＫ細胞活性を評価し得る方法は、公知である。したがって、当業者は、標準的方法及び定義を使用して、細胞をＮＫ細胞として分類することが容易に可能である。
例えば、ｍＮＫ及びｃＮＫ細胞は、表面マーカーであるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）及び／又はＣＤ５６、典型的には、ヒトにおけるＣＤ１６とＣＤ５６の両方、並びにいくつかのマウス系統におけるＮＫ１．１又はＮＫ１．２の発現により認識することができる。ＮＫｐ４６は、ｍＮＫ及びｃＮＫ細胞の別のマーカーであり、ヒト及びいくつかのマウス系統において発現する。したがって、ＮＫｐ４６は、ＣＤ１６及び／若しくはＣＤ５６を（ヒトにおいて）有するか若しくは有しない、又はＮＫ１．１若しくはＮＫ１．２を（マウスにおいて）有するか若しくは有しないＮＫ細胞のマーカーとして使用することができる。本発明によるＮＫ細胞の同定／定義に使用され得るマーカーの他の例としては、Ｌｙ４９、ナチュラル細胞傷害性受容体（ＮＣＲ、natural cytotoxicity receptor）、ＣＤ９４、ＮＫＧ２、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ、killer-cell immunoglobulin-like receptor）及び／若しくは白血球阻害受容体（ＩＬＴ又はＬＩＲ、leukocyte inhibitory receptor）、或いはＣＤ１６及び／若しくはＣＤ５６（ヒトにおいて）又はＮＫ１．１／ＮＫ１．２（マウスにおいて）の組合せを含む、これらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による成熟ＮＫ細胞（即ち、ｍＮＫ及びｃＮＫ細胞）は、ＣＤ５６＋及びＣＤ４５＋であり、またＣＤ１６＋であり得る。本明細書において使用する場合、成熟ヒトＮＫ細胞の用語は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ（段階４）及びＣＤ５６ｄｉｍ（段階５）であるＮＫ細胞を包含し、これらは、ともにＣＤ５６＋である。成熟ＮＫ細胞はまた、ＣＤ３４、並びにリンパ球マーカーであるＣＤ３及び／又はＣＤ１９などのマーカーの非存在により定義することができる。したがって、本発明の成熟ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ３−及び／若しくはＣＤ１９−、又はＣＤ５６＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ３−及びＣＤ１９−など、これらの任意の組合せであり得る。
加えて又は或いは、ＮＫは、その活性の点から同定／定義することができる。例えば、ＮＫ細胞は、その細胞質内における細胞溶解性顆粒の存在により、αデフェンシンなどの抗菌分子を分泌するその能力、及び／又はＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＦＧ−βなどのサイトカインを分泌するその能力により同定／定義することができる。
本明細書において他に記述がない限り、ＮＫ細胞に言及する場合、ｉＮＫ、ｍＮＫ及びｃＮＫ細胞への言及を含む。ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及びＮＫＰは、典型的にそれ自体を指す。
増殖ＮＫ細胞集団
本明細書において開示するように、本発明は、ＮＫ細胞の増殖させた集団（本明細書において、増殖ＮＫ細胞集団又はＮＫ細胞集団と互換的に呼ばれる）を生成する方法を提供する。本発明のＮＫ細胞に関する、本明細書における任意の開示はまた、本発明の増殖ＮＫ細胞集団に適用することができる。
したがって、本発明は、増殖ＮＫ細胞集団を提供する。典型的には、本発明の増殖ＮＫ細胞集団は、ｉＮＫ細胞、ｍＮＫ細胞及び／若しくはｃＮＫ細胞、又はこれらの組合せを含む。前記集団は、ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及び／若しくはＮＫＰ、又はこれらの組合せなどのＨＰＣを含み得るが、これらのＨＰＣの大部分が集団においてＮＫ細胞に分化しているため、このような細胞の数は、ＮＫ細胞の数に対して典型的に少ない。前記集団は、他の免疫及び／又は非免疫細胞を含み得る。また、このような任意の細胞の数は、集団に存在するＮＫ細胞の数に対して典型的に少ない。
非限定的な例として、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上、最大１００％の本発明の増殖ＮＫ細胞集団の細胞は、ＮＫ細胞であり得る。典型的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の本発明の増殖ＮＫ細胞集団の細胞は、ＮＫ細胞である。
いくつかの実施形態では、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上、最大１００％の本発明の増殖ＮＫ細胞集団の細胞は、成熟ＮＫ細胞（即ち、ｍＮＫ細胞及び／又はｃＮＫ細胞）である。好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％又はそれ以上の本発明の増殖ＮＫ細胞集団の細胞は、成熟ＮＫ細胞である。
ＨＰＣ（ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及び／又はＮＫＰを含む）の数は、増殖させたＮＫ細胞集団の細胞の４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満であり得る。典型的には、ＨＰＣ（ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及び／又はＮＫＰを含む）の数は、増殖させたＮＫ細胞集団の細胞の２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満又はそれ以下である。
他の免疫及び／又は非免疫細胞の数は、増殖させたＮＫ細胞集団の細胞の４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満であり得る。典型的には、他の免疫及び／又は非免疫細胞の数は、増殖させたＮＫ細胞集団の２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％、さらにより好ましくは２％未満又はそれ以下である。
本明細書において記載するように、本発明の方法により作製した増殖ＮＫ細胞集団は、従来の養子移植方法により作製したＮＫ細胞集団に対していくつかの利点を提供する。特に、本発明の方法は、従来の方法と比較して、より多数のＮＫ細胞を有する増殖ＮＫ細胞集団の産生を可能とする。さらに、本発明の集団における、より大きい割合のＮＫ細胞は、機能性であり、好ましくは、多数のＮＫ細胞が「枯渇した（exhausted）」従来の方法により得られた集団と比較して、完全に機能性である。
本明細書において使用する場合、用語「枯渇した」は、ＮＫ細胞の文脈において、ＮＫ細胞又は増殖ＮＫ細胞集団が、細胞傷害機能、サイトカイン産生及び／又はＡＤＣＣなど、エフェクター機能のうちの少なくともいくつかを失ったことを意味する。したがって、枯渇したＮＫ細胞又は増殖ＮＫ細胞集団は、生着の障害、細胞傷害機能の障害、サイトカイン産生の変化若しくは障害及び／又はＡＤＣＣの障害を示し得る。例えば、枯渇したＮＫ細胞又は枯渇したＮＫ細胞集団は、そのエフェクター機能のうちの１つの少なくとも５０％の減少を示し得る。例えば、サイトカイン分泌の少なくとも５０％の減少、ＡＤＣＣの少なくとも５０％の減少及び／又は細胞傷害活性の少なくとも５０％の減少を示し得る。これらの値は、本明細書において定義する適切な任意の対照に対して定量化され得る。適切な任意の技術を使用してエフェクター機能を判定し、したがって、それにより定量及び減少させることができる。適した技術は、当分野において公知である。或いは及び／又は加えて、枯渇したＮＫ細胞は、１つ若しくは２つ以上の（本明細書に記載の）阻害受容体の発現の増加及び／又は１つ若しくは２つ以上の（本明細書に記載の）活性化受容体の発現の減少などのマーカー発現の変化を示し得る。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａ及び／又はＴｉｍ３の発現の増加は、ＮＫ細胞枯渇のマーカーとして使用され得る。また、これらのマーカーの発現は、本明細書において定義する適切な任意の対照に対して定量化され得る。
対照的に、用語「機能性」及び「完全に機能性」は、ＮＫ細胞の文脈において、ＮＫ細胞又は増殖ＮＫ細胞集団が、所与の免疫チャレンジに応答する場合、予想されるエフェクター機能のすべてを有することを意味する。したがって、（完全に）機能性のＮＫ細胞又は増殖ＮＫ細胞集団は、ＮＫ細胞が免疫チャレンジに応答して活性化される場合にインビボで観察されるような、細胞傷害機能、サイトカイン産生及び／又はＡＤＣＣを典型的に示し、従来の方法を使用して産生したＮＫ細胞と比較して生着の増強を典型的に示す。或いは及び／又は加えて、（完全）機能性ＮＫ細胞は、１つ若しくは２つ以上の（本明細書に記載の）活性化受容体の発現の増加及び／又は１つ若しくは２つ以上の（本明細書に記載の）阻害受容体の発現の減少などのマーカー発現の変化を示し得る。非限定的な例として、機能性（成熟）ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ４５＋、好ましくはＣＤ５６＋とＣＤ４５＋の両方であり得る。
非限定的な例として、ＮＫ細胞の細胞傷害性は、「標的細胞」と共インキュベートしたＮＫ細胞における脱顆粒アッセイを使用して判定することができる。脱顆粒アッセイは、ＮＫ細胞集団におけるＣＤ１０７ａの発現の分析を含む。ＣＤ１０７ａの量は、サイトカイン分泌及びＮＫ細胞媒介性の標的細胞の溶解と相関する。ＮＫ細胞はまた、機能性ＮＫ細胞が活性化される場合に分泌される主要なサイトカインである、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の発現について分析することができる。機能性のＮＫ細胞は、対照と比較した場合、ＣＤ１０７ａ並びにＩＦＮ−γを同様に又は高く発現するはずである。
本発明の方法により作製した増殖ＮＫ細胞集団におけるＮＫ細胞数／機能性の任意の増加は、本明細書に記載の対照方法により得られたＮＫ細胞集団のＮＫ細胞数／機能と比較することができる。対照方法は、ＮＫ細胞集団を産生するための当分野において公知の任意の標準的方法であってもよい。例えば、対照方法は、本発明によるＲＥＶ−ＥＲＢ阻害物質を使用する方法ではなく従来の養子移植技術を使用し得る。このような対照／標準方法により産生したＮＫ細胞及びＮＫ細胞集団は、本明細書に記載の対照細胞及び集団として使用され得る。
本発明の増殖ＮＫ細胞集団が、従来法で調製したＮＫ細胞集団と比較して優位に少ない枯渇したＮＫ細胞を含むが、代わりに、より高い割合の完全機能性ＮＫ細胞を含有するため、これにより患者を治療するために細胞をより少量使用することが有利にも可能となる。
本明細書において記載するように、本発明の方法は、大量の「枯渇した」ＮＫ細胞を有する集団を産生する従来の方法と比較してより高い割合の（完全）機能性ＮＫ細胞を有する増殖させたＮＫ細胞集団を産生する。典型的には、本発明の増殖ＮＫ細胞集団において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上、最大１００％の本発明の増殖ＮＫ細胞集団のＮＫ細胞は、（完全）機能性である。典型的には、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％又はそれ以上の本発明の増殖ＮＫ細胞集団のＮＫ細胞は、本明細書の任意の定義（例えば、マーカー及び／又はエフェクター機能の定義）に従って完全機能性である。
本発明の増殖ＮＫ細胞集団は、本明細書に開示の任意の方法により産生することができる。典型的には、本発明の増殖ＮＫ細胞集団は、本明細書に開示のエクスビボでの方法により産生する。
Ｅ４ｂｐ４
Ｅ４ｂｐ４（Ｎｆｉｌ３としても公知）は、塩基性ロイシンジッパータンパク質転写因子であり、これはＩＬ−３発現の制御に関与し、概日時計の調整に関与する。ヒトＥ４ｂｐ４遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６４３１８、バージョンＸ６４３１８．１）に示す。図１に示すように、Ｅ４ｂｐ４は、ＣＬＰにおいて発現し、血液幹前駆細胞からのＮＫ細胞の産生において重要である。Ｅ４ｂｐ４遺伝子が欠失したマウスは、機能性ＮＫ細胞を有しないが、正常数のＴ及びＢ細胞を有する。対照的に、インビトロでのＨＳＣにおけるＥ４ｂｐ４の過剰発現により、ＮＫ細胞産生が増加する。したがって、Ｅ４ｂｐ４は、ＨＳＣからのＮＫＰの発生を制御する、系列分化決定因子である（図１）。抹消ｍＮＫ細胞におけるＥ４ｂｐ４の特異的消失が、ＮＫ細胞数又はサイトメガロウイルス感染に対する応答に影響しないため、Ｅ４ｂｐ４のＮＫ細胞における重要な機能は、発生経路の初期段階に特異的である。加えて、Ｅ４ｂｐ４は、Ｉｄ２及びＥｏｍｅｓなど、ＮＫ細胞発生において必須である他の転写因子を調節する。
ＩＬ−７及びＩＬ−１５は、Ｅ４ｂｐ４発現を調節することが示されているが、一般に、外因性又は内因性の刺激がＥ４ｂｐ４にどのように影響するのかについては、ほとんど知られていない。Ｅ４ｂｐ４などの転写因子は、その構造及び機能のため、標的化することが困難であり得る。例えば、これらは通常、酵素活性又は補助因子結合部位を欠いている。しかし、本発明者らは、ＲＥＶ−ＥＲＢの活性を阻害する化合物を使用すると、Ｅ４ｂｐ４発現が増加し得ることを、これまでに実証した（ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５０５４２、特には実施例を参照、この全体を参照により本明細書に組み込む）。さらに、本発明者らは、Ｅ４ｂｐ４発現を増加させるＲＥＶ−ＥＲＢ阻害物質の使用により、ＮＫ細胞数の増加がもたらされることを実証した。理論に束縛されることは望まないが、ＲＥＶ−ＥＲＢは、ポルフィリンヘムに結合し、この特徴によりＲＥＶ−ＥＲＢが新薬の開発につながる標的となると考えられる（下記参照）。まとめると、本発明者らは、ＲＥＶ−ＥＲＢを標的化し、その活性を阻害することにより、Ｅ４ｂｐ４発現を増加させ、これにより、ＮＫ細胞数を増加させることが可能であることを示した。したがって、本発明は、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物、並びにＥ４ｂｐ４発現の増加、及びこれによるＮＫ細胞数の増加におけるその使用に関係する。
Ｅ４ｂｐ４発現の増加
したがって、本発明は、増殖させたＮＫ細胞集団を産生するためのエクスビボでの方法、並びにそれを必要とする患者においてＮＫ細胞数を増加させるための治療的方法及び適用を提供する。本明細書において開示するように、前記方法及び適用は、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物の使用を含む。典型的には、前記化合物は、Ｅ４ｂｐ４発現を増加させることにより作用する。
Ｅ４ｂｐ４発現の増加は、対照に対して測定することができる。したがって、ＨＰＣ、増殖させたＮＫ細胞集団の試料、又は本発明により治療する患者から得られた試料におけるＥ４ｂｐ４発現は、対照におけるＥ４ｂｐ４発現と比較し得る。発現は、遺伝子及び／又はタンパク質発現の点から定量化することができ、対照（例えば、ハウスキーピング遺伝子又はタンパク質）の発現と比較することができる。Ｅ４ｂｐ４遺伝子、ｍＲＮＡ転写物及び／若しくはタンパク質の質量、モル量、濃度若しくはモル濃度のような、Ｅ４ｂｐ４遺伝子、ｍＲＮＡ転写物及び／若しくはタンパク質の実際量、又はＨＰＣ、増殖させたＮＫ細胞集団の試料若しくは本発明により治療する患者及び対照から得られた試料中１細胞あたりのｍＲＮＡ分子の数は、評価し、対照から得られた対応する値と比較することができる。或いは、ＨＰＣ、増殖ＮＫ細胞集団の試料、又は本発明により治療する患者から得られた試料におけるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、１つ又は２つ以上の遺伝子及び／又はタンパク質の質量、モル量、濃度又はモル濃度を定量化することなく、対照のＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現と比較することができる。
典型的には、対照は、Ｅ４ｂｐ４発現の増加が影響しない等価な集団又は試料である。非限定的な例として、Ｅ４ｂｐ４発現を増加させるためにＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物により患者を治療する場合、適した対照は、化合物を投与されていない異なる個体、又は化合物を投与する前の同一の個体であり得る。公知の方法を含む、エクスビボでのＮＫ細胞の増殖のための従来の方法は、本発明による対照方法であると考えることができる。
本発明の文脈において、Ｅ４ｂｐ４発現の増加に言及する場合、Ｅ４ｂｐ４発現が、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％増加することを意味すると理解され得る。典型的には、Ｅ４ｂｐ４発現は、対照と比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％又はそれ以上増加する。
Ｅ４ｂｐ４発現の増加に言及する場合、Ｅ４ｂｐ４発現が、対照に対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はそれ以上増加することを意味すると理解され得る。典型的には、Ｅ４ｂｐ４遺伝子発現は、対照と比較して少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍又はそれ以上増加する。典型的には、Ｅ４ｂｐ４タンパク質発現は、対照と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも６倍又はそれ以上増加する。
本発明によるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、定量的及び／又は定性的分析により判定することができる。典型的には、遺伝子発現は、ｍＲＮＡレベルの点から表すことができる。
本発明によるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、Ｅ４ｂｐ４ ｍＲＮＡ転写物及び／又はタンパク質の質量、Ｅ４ｂｐ４遺伝子、ｍＲＮＡ転写物及び／又はタンパク質のモル量、Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の濃度、並びにＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質のモル濃度を包含する。この発現レベルは、適切な任意の単位で示すことができる。例えば、Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の濃度は、ｐｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｍｌ又はμｇ／ｍｌで示すことができる。
本発明によるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、直接的又は間接的に測定することができる。
本発明によるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の相対発現量は、対照に対して、適切な任意の技術を使用して判定することができる。適した標準的技術は、当分野において公知であり、例えば、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及びＲＴ−ｑＰＣＲである。
Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、対照と比較して少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間増加し得る。好ましくは、Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、少なくとも１２〜７２時間増加する。典型的には、これは、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する化合物の最後の投与に対して評価される。
Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、対照と比較して少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回又はそれ以上の培養中のＮＫ細胞先駆体の継代で増加し得る。Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、無制限に変化し得る。
ＲＥＶ−ＥＲＢ
ＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質は、細胞内転写因子の核内受容体ファミリーのメンバーである。ヒトＲＥＶ−ＥＲＢα遺伝子（Ｎｒ１ｄ１）のｍＲＮＡ配列は、配列番号３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１７２４、バージョンＮＭ＿０２１７２４．４）に示す。ヒトＲＥＶ−ＥＲＢβ遺伝子（Ｎｒ１ｄ２）のｍＲＮＡ配列は、配列番号５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ３０７６９３、バージョンＡＢ３０７６９３．１）に示す。ＲＥＶ−ＥＲＢは、概日時計を調節し、軟骨組織の崩壊の調節とも関係づけられている。
本発明者らは、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害が、Ｅ４ｂｐ４発現の顕著な増加を誘発するのに十分であり、次いで、これによりＮＫ細胞の増殖がもたらされて、ＮＫ細胞数の増加が生じることを、これまでに実証した（ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５０５４２、特には実施例を参照、この全体を参照により本明細書に組み込む）。ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害により、ＮＫ細胞数の増加がもたらされる可能性があり、典型的には、得られたＮＫ細胞は、本明細書に定義するように（完全）機能性である。ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害効果は、Ｅ４ｂｐ４依存的に媒介される。理論に束縛されることは望まないが、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害すると、Ｅ４ｂｐ４発現が増加し（Ｅ４ｂｐ４発現は、通常、ＲＥＶ−ＥＲＢにより抑制される）、Ｅ４ｂｐ４が、ＮＫ細胞の産生を刺激するように作用する（図１に示すように）と考えられる。特に、本発明者らは、低分子のＳＲ８２７８をＲＥＶ−ＥＲＢのポルフィリンヘム部分に結合させて、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害及びＮＫ細胞数の増加を生じさせることが可能であることをこれまでに実証した。
しかし、ＳＲ８２７８の薬理学的プロファイルは、臨床環境における使用には理想的でないものである。その上、ＳＲ８２７８の作用機序に関する情報がなく、この分子周辺の適する構造活性相関がないため、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性を有する他の化合物の発見が妨げられている。実際、ＲＥＶ−ＥＲＢの多くの合成リガンドが、当技術分野において生成されているが、圧倒的多数のこのようなリガンドが、アゴニストとして同定されており、３００種を超えるＲＥＶ−ＥＲＢアゴニストが、同定されている。本発明者らは、新規化合物のライブラリーを生成し、このような化合物において、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性が、公知のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害物質ＳＲ８２７８と比較して向上したことを実証した。
したがって、本発明は、このような改善ＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニスト、すなわち、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用に対する阻害活性が向上した化合物、並びにＥ４ｂｐ４発現及びこれによるＮＫ細胞数の増加における、このような化合物の使用に関する。
ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害
本発明は、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物、即ち、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する化合物の使用に関する。ＲＥＶ−ＥＲＢ活性は、適切な任意の手段により阻害することができる。適した標準的技術は、当分野において公知である。阻害は、例えば、使用する化合物の性質（下記参照）、例えば、任意の直接的又は間接的相互作用における立体的干渉又はＲＥＶ−ＥＲＢの阻害に応じた、適した任意の機序により生じ得る。本発明の文脈において、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害物質（本明細書においてＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストと互換的に呼ばれる）は、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を部分的又は完全に阻害、減少、抑制又は除去する任意の化合物である。
ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の減少は、対照に対して測定することができる。したがって、ＮＫ先駆若しくは前駆細胞、増殖させたＮＫ細胞集団の試料中、又は本発明により治療する患者から得られた試料中のＲＥＶ−ＥＲＢ活性は、対照におけるＲＥＶ−ＥＲＢ活性と比較することができる。活性は、任意の適切な観点、例えば、ＲＥＶ−ＥＲＢのＥ４ｂｐ４遺伝子との結合、又は本明細書に定義するＥ４ｂｐ４発現の観点から定量化することができる。任意の適切な技術又は方法は、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の定量化に使用することができる。適した技術は、当分野において公知であり、例えば、ルシフェラーゼアッセイを使用してレポーター遺伝子の発現を定量化する。
典型的には、対照は、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物を添加していない、等価な集団又は試料、例えば、化合物を投与していない異なる個体、又は化合物を投与する前の同一の個体から得られた試料である。公知の方法を含む、エクスビボでのＮＫ細胞の増殖のための従来の方法は、本発明による対照方法であると考えることができる。
本発明の文脈において、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害に言及する場合、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性が、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％減少し、最大で完全に（１００％）ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害することを意味すると理解され得る。典型的には、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性は、対照と比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％又はそれ以上減少する。
ＲＥＶ−ＥＲＢの活性は、定量的及び／又は定性的分析により判定することができ、直接的又は間接的に測定することができる。
対照に対するＲＥＶ−ＥＲＢ活性は、適切な任意の技術を使用して判定することができる。適した標準的技術は、当分野において公知であり、例えば、Ｅ４ｂｐ４発現の定量化、及び／又はルシフェラーゼアッセイによる。
ＲＥＶ−ＥＲＢの活性は、対照と比較して少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間阻害され得る。好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢの活性は、少なくとも１２〜７２時間減少する。典型的には、これは、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する化合物の最後の投与に対して評価される。
ＲＥＶ−ＥＲＢの活性は、対照と比較して少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回又はそれ以上の細胞の継代で阻害され得る（インビボ、又はエクスビボ若しくはインビトロで培養）。ＲＥＶ−ＥＲＢの活性は、阻害される可能性があり、並びに／又はＥ４ｂｐ４遺伝子及び／若しくはタンパク質の発現レベルは、無制限に変化し得る。
本発明の文脈において、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害に任意に言及する場合、ＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβの活性を阻害することを意味すると理解され得る。好ましい実施形態では、ＲＥＶ−ＥＲＢαとＲＥＶ−ＥＲＢβの両方の活性が阻害される。したがって、本発明は、ＲＥＶ−ＥＲＢα活性を阻害する化合物（即ち、ＲＥＶ−ＥＲＢαアンタゴニストとも呼ばれる、ＲＥＶ−ＥＲＢα阻害物質）及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβ活性を阻害する化合物（即ち、ＲＥＶ−ＥＲＢβアンタゴニストとも呼ばれる、ＲＥＶ−ＥＲＢβ阻害物質）を含む、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する化合物に関する。好ましい実施形態では、本発明は、ＲＥＶ−ＥＲＢαとＲＥＶ−ＥＲＢβの両方の活性を阻害する化合物（即ち、ＲＥＶ−ＥＲＢα及びＲＥＶ−ＥＲＢβ阻害物質、ＲＥＶ−ＥＲＢα及びＲＥＶ−ＥＲＢβアンタゴニストとも呼ばれる）に関する。
ＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニスト／阻害物質
本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、ＲＥＶ−ＥＲＢに特異的であり得る。特異的については、化合物が、ＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβに結合し、他のいかなる分子、特に他のいかなるタンパク質に対しても顕著な交差反応性がないことが理解される。例えば、ＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβに特異的な修飾物質は、ヒト好中球エラスターゼとの顕著な交差反応性を示さない。交差反応性は、任意の適した方法により評価することができる。ＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβ阻害物質のＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβ以外の分子との交差反応性は、阻害物質が他の分子に少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％ＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβに結合するときと同程度に強く結合する場合に顕著であると考えられ得る。ＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβに特異的な阻害物質は、ヒト好中球エラスターゼなどの別の分子と９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満のＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβに結合する強度で結合し得る。好ましくは、阻害物質は、他の分子に２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満、２％未満又は１％未満のＲＥＶ−ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢβに結合する強度で結合する。
本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、オフターゲット効果を有し得る。オフターゲット効果は、ＲＥＶ−ＥＲＢ以外の標的に対する活性である。典型的には、オフターゲット効果を有する化合物は、非ＲＥＶ−ＥＲＢ標的に対する活性が、ＲＥＶ−ＥＲＢに対する活性と比較して顕著でない場合に、本発明により包含される。オフターゲット効果が顕著であるかどうかは、化合物の対象となる使用に依存し得る。非限定的な例として、オフターゲット効果を中枢神経系にもたらし得る化合物は、本明細書に開示するエクスビボでの方法において使用する化合物にとって重要ではないが、本明細書に開示するインビボでの治療適応にとって重要であり得る（オフターゲット効果の規模に応じて）。潜在的な任意のオフターゲット効果の存在及び規模は、当分野において公知の標準的方法を使用して容易に評価することができる。
低分子
本明細書に記載するようにＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害するために使用する本発明の化合物は、低分子である。本明細書に定義するように、低分子は、低分子量化合物、典型的には、有機化合物である。典型的には、低分子は、９００Ｄａの最大分子量を有し、細胞膜を通過して急速な拡散を可能とする。いくつかの実施形態では、低分子の最大分子量は、５００Ｄａである。典型的には、低分子は、１ｎｍほどのサイズを有する。
本発明によれば、低分子は、ＲＥＶ−ＥＲＢのポルフィリンヘム部分に結合することによりＲＥＶ−ＥＲＢ活性に阻害効果をもたらすことができる。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物は、ＲＥＶ−ＥＲＢのポルフィリンヘム部分に結合し、これによりＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物である。或いは、低分子は、異なる機序により、例えば、ＲＥＶ−ＥＲＢの非ヘム部分に結合することにより作用し得る。低分子の産生のための標準的技術は、当分野において公知であり、この低分子は、本明細書に記載するＲＥＶ−ＥＲＢ阻害作用について容易に試験することができるものである。
Figure 2021528969
ポルフィリンヘムの構造
発明者らは、ＳＲ８２７８の足場に基づく、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する（本明細書において互換的にＲＥＶ−ＥＲＢの作用の阻害と呼ぶ）新たな化合物を、特に、アミド置換基及び／又はエチルエステル基を変異させることにより生成した。したがって、本発明において使用する化合物は、式（Ｉ）：
Figure 2021528969
［式中、−−−−−−は、すべて存在する結合又は存在しない結合のいずれかを表し、
Ｒ１は、Ｃ１−６ヒドロカルビルから選択され、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、−ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１又は２以上の基と置換されていてもよく、
Ｒ２は、５〜１０員のヘテロ環及びＣ１−６ヒドロカルビルから選択され、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１又は２以上の基と置換されていてもよく、
Ｘは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択されるか又は存在せず、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−及び−ＣＲ’２−から選択され、
Ｚは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択されるか又は存在せず、
各Ｒａは、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択され、
各Ｒｂは、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル及び−ＯＲ’から独立的に選択され、
Ｒｃは、Ｈ及びＣ１−４ヒドロカルビルから選択され、
各Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル及び−Ｐｈから独立的に選択される］
を有するか又は薬学的に許容されるこの塩であり、ただし上記化合物が、
Figure 2021528969
ではない。
上記のように、−−−−−−は、すべて存在する結合又は存在しない結合のいずれかを表す。したがって、本発明は、式（Ia）の閉環構造と式（Ib）の開環構造の両方：
Figure 2021528969
に関する。
好ましくは、−−−−−−は、すべて存在する結合を表し、化合物は、式（Ia）の閉環構造である。
式（Ｉ）の化合物では、Ｒ１は、Ｃ１−６ヒドロカルビルから選択され、Ｃ１−４ヒドロカルビル（好ましくはＣ１−４アルキル）、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１又は２以上の基と置換されていてもよい。Ｒ１は、好ましくは、非置換であり、例えば、好ましくは、Ｃ１−６ヒドロカルビルから、好ましくは、Ｃ１−６アルキル及びＣ１−６アルケニルから選択される。より好ましくは、Ｒ１は、Ｃ１−６アルキルから、好ましくは、Ｃ１−４アルキルから、例えば、メチル、エチル及びプロピルから選択される。エチル基は、特に好ましい。
式（Ｉ）の化合物では、Ｒ２は、５〜１０員のヘテロ環及びＣ１−６ヒドロカルビルから選択され、置換されていてもよい。好ましくは、Ｒ２は、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロ環から選択される。
Ｒ２の５〜１０員のヘテロ環は、好ましくは、１〜４、より好ましくは１又は２のヘテロ原子を含む。ヘテロ原子は、好ましくは、酸素、窒素及びイオウから選択される。ヘテロ環は、複数の同一のヘテロ原子、例えば、窒素原子２、又はヘテロ原子の混合物、例えば、窒素原子及び酸素原子を含み得ることが理解される。
Ｒ２は、好ましくは、５〜１０員のヘテロアリール環から、より好ましくは、５、６又は９員のヘテロアリール環から選択される。５員ヘテロアリール環の非限定的な例としては、フラニル、チオフェニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピロリル及びトリアゾリルが挙げられる。６員ヘテロアリール環の非限定的な例としては、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニルが挙げられる。９員ヘテロアリール環の非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、アザインドリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンズイソオキサゾリル及びベンゾオキサゾリルが挙げられる。置換されていてもよい５員ヘテロアリール環は、特に好ましい。
Ｒ２が、置換されていてもよいＣ１−６ヒドロカルビルである場合、これは、好ましくは、置換されていてもよいフェニル及び置換されていてもよいＣ１−６アルキルから選択される。
Ｒ２が、置換されていてもよいフェニルである場合、フェニル基は、好ましくは、置換されている。
Ｒ２が、置換されていてもよいＣ１−６アルキルである場合、アルキル基は、好ましくは、非置換であり、例えば、Ｒ２は、好ましくは、Ｃ２−４アルキルから、例えば、エチル、プロピル（例えば−ｉＰｒ）及びブチル（例えば−ｔＢｕ）から選択される。
Ｒ２は、Ｃ１−４ヒドロカルビル（好ましくはＣ１−４アルキル）、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１又は２以上の基と置換されていてもよい。好ましくは、Ｒ２は、非置換であるか、又は１又は２のこのような基と置換されている。Ｒ２の特に好ましい置換基は、−Ｍｅ、−ＯＭｅ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｉ及び−ＳＭｅを含む。
式（Ｉ）の化合物では、Ｘは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択されるか、又は存在しない。Ｘは、好ましくは、−Ｏ−である。
式（Ｉ）の化合物では、Ｙは−Ｃ（Ｏ）−及び−ＣＲ’２−から選択される。Ｙは、好ましくは、−Ｃ（Ｏ）−である。
式（Ｉ）の化合物では、Ｚは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択されるか、又は存在しない。好ましくは、Ｚは、−Ｏ−から選択されるか、又は存在しない。Ｒ２が、アルキル基である場合、Ｚは、好ましくは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択され、好ましくは−Ｏ−である。Ｒ２が、ヘテロ環である場合、Ｚは、好ましくは、存在しない。
式（Ｉ）の化合物では、各Ｒａは、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル（好ましくはＣ１−４アルキル）、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される。好ましくは、各Ｒａは、Ｈ、Ｃ１−４アルキル及び−ＯＲ’から、より好ましくは、Ｈ及びＣ１−４アルキルから独立的に選択される。より好ましくは、各Ｒａは、好ましくはＨである。
式（Ｉ）の化合物では、各Ｒｂは、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル（好ましくはＣ１−４アルキル）及び−ＯＲ’から独立的に選択される。好ましくは、各Ｒｂは、Ｈ及びＣ１−４アルキルから独立的に選択され、より好ましくはＨである。
式（Ｉ）の化合物では、Ｒｃは、Ｈ及びＣ１−４ヒドロカルビル（好ましくはＣ１−４アルキル）から選択される。好ましくは、ＲｃはＨである。
式（Ｉ）の化合物では、各Ｒ’は、Ｈ及びＣ１−４ヒドロカルビル（好ましくはＣ１−４アルキル）及び−Ｐｈから独立的に選択される。好ましくは、各Ｒ’は、Ｈ及びＣ１−４アルキルから、より好ましくは、Ｈ、メチル及びエチルから、より好ましくは、メチル及びエチルから独立的に選択される。
好ましい実施形態では、Ｒｂ及びＲｃは、すべてＨであり、このため本発明において使用する化合物は、式（II）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ並びにＸ、Ｙ及びＺは、これまでに定義するものである。
さらに好ましい実施形態では、Ｒａはまた、すべてＨであり、このため本発明において使用する化合物は、式（III）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＺは、これまでに定義するものである。
さらに好ましい実施形態では、Ｘは、−Ｏ−であり、本発明において使用する化合物は、式（IV）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ及びＺは、これまでに定義するものである。
さらに好ましい実施形態では、Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−であり、本発明において使用する化合物は、式（Ｖ）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２及びＺは、これまでに定義するものである。
またさらに好ましい実施形態は、Ｒ１が、エチルである化合物であり、式（VI）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ２及びＺは、これまでに定義するものである。
例えば、化合物は、閉環構造であることがあり、式（VII）：
Figure 2021528969
を有し、式中、Ｒ２及びＺは、これまでに定義するものである。
本発明による化合物の特定の例は、以下の表１に提示する。
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
化合物７、１１、２７、７２及び７３は、好ましい。
化合物７及び１１は、特に好ましい。
Figure 2021528969
式（Ｉ）の化合物は、ＳＲ８２７８ではなく、すなわち、
Figure 2021528969
ではない。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物はまた、国際公開第２０１３／０３３３１０号パンフレット又は国際公開第２０１５／１０３５２７号パンフレットのいずれにも開示されていない。例えば、本発明の化合物それ自体に関して、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2021528969
Figure 2021528969
Figure 2021528969
から選択されない。
いくつかの実施形態では、及び本発明の化合物それ自体に関して、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2021528969
ではない。
しかし、上に同定する化合物それ自体は、本発明の産物ではない。それにもかかわらず、このような化合物は、本明細書に記載する方法及び医学的使用／治療的症状において使用し得る。
本発明の化合物が、１又は２以上のキラル中心を含む場合、化合物は、存在する可能性があり、純粋なエナンチオマー若しくはジアステレオマーの形態として、又はラセミ混合物として単離し得ることが理解される。したがって、本発明は、本発明の化合物の、可能な任意のエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物又はこの混合物を含む。したがって、式（Ｉ）の化合物は、ラセミ混合物において、又は単一のエナンチオマー、すなわち：
Figure 2021528969
として使用し得る。
式（Ｉ）の化合物は、回転異性体形態を有し得るか、又は回転活性を有さないことがある。回転異性体形態は、緩く回転する形態及び速く回転する形態を含む。いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物の速く回転する形態が、好ましい。例えば、以下である。
Figure 2021528969
式（Ｉ）の化合物又はこの塩は、２つの化学化合物が、２原子間の水素原子の交換により、共有結合を形成するいずれかと容易に相互変換可能な、互変異性の現象を示し得る。互変異性化合物が、相互に移動平衡で存在するため、これらは、同一の化合物の異なる異性体形態であると考えられ得る。本明細書における式図が、可能な互変異性形態のうちの１つのみを表し得ることが理解される。しかしまた、本発明は、任意の互変異性形態を包含し、式図において利用する互変異性形態のいずれか１つであっても制限するべきではないことが理解される。本明細書における式図は、可能な互変異性形態の１つのみを表すことがあり、本明細書は、本明細書において図示するのに好都合な形態だけでなく、描かれる化合物のすべての可能な互変異性形態を包含することが理解される。したがって、本発明による式（Ｉ）の化合物は、互変異性体を包含する（ケト・エノール及びアミド−イミド酸の形態を含む）。
したがって、１つの互変異性体として本明細書に示す構造は、他の互変異性体を含むことをも意図する。
化合物は、本明細書における定義の節に定義するように、体内で式（Ｉ）の化合物に変換するプロドラッグの形態、並びに塩、水和物及び溶媒和物の形態で使用し得る。
本発明の化合物は、ＳＲ８２７８と比較して向上したＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性を典型的に有する。この阻害活性は、適切な任意の手段、例えば、当技術分野で公知の従来の手段及び／又は本明細書に記載の方法により測定し得る。本発明の文脈において、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性が向上した化合物に言及する場合、化合物により、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性が、対照ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、例えばＳＲ８２７８を使用して得られるＲＥＶ−ＥＲＢ活性における低下よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％低下することを意味することが理解され得る。典型的には、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％以上、対照ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、例えばＳＲ８２７８を使用して得られるＲＥＶ−ＥＲＢ活性における低下と比較して低下する。
ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性が向上した化合物に言及する場合、前記化合物が、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はこれ以上、対照ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、例えばＳＲ８２７８と比較して、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害において有効であることを意味することが理解され得る。言い換えれば、改善ＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストによるＲＥＶ−ＥＲＢの阻害は、対照ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、例えばＳＲ８２７８によるＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍又はこれ以上、優れている。典型的には、改善ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍又はこれ以上、対照ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、例えばＳＲ８２７８と比較して、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害において有効である。
本発明の低分子は、標的タンパク質分解キメラ（PROTAC又はPROTAC試薬とも呼ばれる）の形態で使用し得る。ＰＲＯＴＡＣは、標的タンパク質とユビキチンリガーゼを同時に結合させて、標的のユビキチン化及び分解を可能とする異種二機能性低分子である。より詳細には、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、典型的に、標的タンパク質（本発明の場合は、ＲＥＶ−ＥＲＢ）のリガンド及びＥ３リガーゼ認識ドメインのリガンドを含む。このようなＰＲＯＴＡＣの使用により、Ｅ３リガーゼをＰＲＯＴＡＣ結合ＲＥＶ−ＥＲＢに動員して、ユビキチンのＥ３リガーゼ複合体から標的タンパク質（本発明の場合は、ＲＥＶ−ＥＲＢ）への移行を誘導する。ＰＲＯＴＡＣが標的のユビキチン化を十分な程度誘導すると、このＰＲＯＴＡＣはプロテアソームにより認識及び分解される。
非限定的な例として、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、Ｅ３リガーゼのリガンドを本明細書に記載の低分子阻害物質にリンカーを介してコンジュゲートさせることにより生成することができる。好ましい実施形態では、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、本発明の低分子阻害物質にリンカーを介して連結する、Ｅ３ ＲＩＮＧ Ｃｕｌｌｉｎリガーゼのフォンヒッペル・リンドウタンパク質（ＶＨＬ、von Hippel Lindau）又はＣＲＬ４ Ｅ３ ＲＩＮＧ Ｃｕｌｌｉｎリガーゼ複合体の一部である、セレブロンのリガンドを含む。
変異体配列
少なくとも８０％の配列同一性は、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の配列同一性（本明細書に提示する、ありとあらゆる配列及び／又は本明細書に提示する、ありとあらゆる配列番号に対する）を含む。
多様な任意の配列アラインメント方法は、包括的方法、個別的方法及びハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法等をこれらに限定することなく含む、パーセント同一性を判定するために使用することができる。パーセント同一性を判定するプロトコルは、当業者の範囲内における日常的手順である。包括的方法では、分子の初めから終わりまでの配列を整列させ、それぞれの残基対のスコアを加算することにより、及びギャップペナルティを課すことにより最良のアラインメントを判定する。非限定的な方法としては、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照；及び反復改良、例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Bioｌ. 823-838 (1996)を参照、が挙げられる。個別的方法では、入力したすべての配列に共有される１つ又は２つ以上の保存モチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法としては、例えば、Match-box、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)を参照；Gibbs sampling、例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131) Science 208-214 (1993)を参照；Align-M、例えば、Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20 (9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照、が挙げられる。したがって、パーセント配列同一性は、従来の方法により判定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。
上記に提供する特定の配列の変異体は、変異体配列と上記に提供する特定の参照配列との間で異なるヌクレオチド又はアミノ酸の数を列挙することにより代替的に定義することができる。したがって、一実施形態では、配列は、５以下、４以下、３以下、２以下のヌクレオチドの位置、例えば、１以下のヌクレオチドの位置で上記に提供する特定の配列と異なるヌクレオチド配列を含む（又はからなる）ことができる。保存的置換が好ましい。
本明細書に記載するバリアント核酸分子及びペプチドは、典型的に、対応する分子の活性をさらに保持する。したがって、例えば、本発明のバリアントＲＥＶ−ＥＲＢ分子は、Ｅ４ｂｐ４の発現を阻害する野生型ＲＥＶ−ＥＲＢの能力を保持する。バリアント分子は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最で大１００％までの対応する野生型配列の活性を保持し得る。これは、本明細書に記載する他の任意のバリアントにも等しく適用する。
本発明の化合物は、標識化（又はタグ化）してもよい。適切な任意の標識を使用することができる。適した標識は、当分野において公知である。
Ｎｏｔｃｈリガンド
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、Ｔ細胞の発生の促進及び付随するＢ細胞の発生の抑制と主に関連する。哺乳動物は、４種のＮｏｔｃｈ受容体−Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ４を有し、このすべては、ヘテロ２量体の１回膜貫通タンパク質である。哺乳動物は、２種の標準的Ｎｏｔｃｈリガンド−デルタ（Delta）型及びジャグド（Jagged）型を有し、これらはまとめてＤＳＬリガンドとして知られる。３つのデルタ様リガンド（ＤＬＬ）、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３及びＤＬＬ４、並びに２つのジャグド（ＪＡＧ）リガンド、ＪＡＧ１及びＪＡＧ２が存在する。ＤＬＬ及びＪＡＧリガンドは、次のドメイン：ＮｏｔｃｈリガンドのＮ末端のモジュ−ル（ＭＮＮＬ）ドメイン及びＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ−２（ＤＳＬ）ドメインを典型的に含み、これらはともに多数のＥＧＦ反復を有する。ＤＬＬ３は、６つのＥＧＦ反復を含む。ＤＬＬ１及びＤＬＬ４は、８つのＥＧＦ反復を含む。ＪＡＧ１及びＪＡＧ２は、１６のＥＧＦ反復を含む。また、多数の非標準的リガンドが存在し、これらは、膜結合型又は分泌型であり得る。
本明細書において明示的な記述がない限り、本明細書におけるＮｏｔｃｈリガンドへの言及は、任意のＮｏｔｃｈリガンド、例えば、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３及び／又はＮｏｔｃｈ４のリガンド、好ましくは、少なくともＮｏｔｃｈ１のリガンドへの言及である。ヒトＮｏｔｃｈ１のタンパク質配列は、配列番号１０に示す（GenBank受託番号ＣＲ４５７２２１、バージョンＣＲ４５７２２１．１）。典型的には、本発明における使用のＮｏｔｃｈリガンドは、標準的Ｎｏｔｃｈリガンドである。いくつかの好ましい実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ、より好ましくはＤＬＬ４である。ヒトＤＬＬ４のタンパク質配列は、配列番号８に示す（GenBank受託番号ＡＦ２５３４６８、バージョンＡＦ２５３４６８．１）。
また、本明細書におけるＮｏｔｃｈリガンドへの言及は、前記断片が、Ｎｏｔｃｈ結合及びこの断片が由来するＮｏｔｃｈリガンドの賦活活性を保持する条件で、この断片を包含する。本発明における使用に適するＮｏｔｃｈリガンドの断片は、本発明者らにより、これまでに記載されている（その全体を参照により本明細書に組み込むＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５０８１８、特には１５及び１６頁並びに実施例を参照）。Ｎｏｔｃｈリガンド断片の好ましい例としては、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｎ−ＥＧＦ１）及びＮｏｔｃｈリガンド（Ｎ−ＥＧＦ２）、例えば、ＤＬＬ４（Ｎ−ＥＧＦ１）及びＤＬＬ４（Ｎ−ＥＧＦ２）が挙げられる。
或いは、又は加えて、Ｎｏｔｃｈリガンド、この断片、又はＮｏｔｃｈリガンド、例えばＤＬＬ４の作用（例えば、機能／活性）を模倣する分子は、リガンド／断片／ミメティックのＮｏｔｃｈ受容体に対する親和性を変化させ、典型的には上昇させるアミノ酸の変異のような修飾を含み得る。このような修飾を同定するための技術は、当技術分野において公知である。例えば、Ｎｏｔｃｈリガンド／断片／ミメティックの親和性を上昇させるアミノ酸は、酵母表面提示を使用して同定することができる。また、このような修飾は、本発明者らにより、これまでに記載されている（この全体を参照により本明細書に組み込むＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５０８１８、特には１６頁を参照）。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＤＬＬ４リガンド、この断片又はミメティックは、アミノ酸の置換、Ｇ２８Ｓ、Ｆ１０７Ｌ及びＬ２０６Ｐ、より好ましくはＧ２８Ｓ、Ｆ１０７Ｌ、Ｎ１１８Ｉ、Ｉ１４３Ｆ、Ｈ１９４Ｙ、Ｌ２０６Ｐ及び／又はＫ２１５Ｅを含む。
非限定的なさらなる例として、ＤＬＬ４の機能性断片は、完全長ＤＬＬ４の少なくとも残基６５〜１１４及び１７９〜２１９を含み、好ましくは、これらをＮｏｔｃｈリガンドとの相互作用を可能とする正しい立体構造で保持する。
加えて、本発明は、Ｎｏｔｃｈリガンドの作用（例えば、活性／機能）を模倣する分子（本明細書においてミメティックとも呼ぶ）の使用を包含する。例えば、所望のＮｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）の作用を模倣する、ペプチド、ステープルペプチド、ペプトイド及びペプチドミメティックの使用を、本発明により包含する。ペプチドミメティックは、天然ペプチドと関連する安定性及びバイオアベイラビリティに関してペプチドに対して利点を有し得る。ペプチドミメティックは、生物学的機能のために設計した親ペプチドの主鎖又は側鎖の修飾を有し得る。ペプチドミメティックのクラスの例としては、ペプトイド及びβ−ペプチド、並びにＤ−アミノ酸を組み込むペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
合成ペプチド及びペプチドミメティック（例えば、ペプトイド）を生成するための方法は、標準的及び非標準的Ｎｏｔｃｈリガンドの配列のように、当技術分野において公知である。したがって、所望のＮｏｔｃｈリガンドの作用を模倣する、適する分子を、公知の技術を使用し、公知のＮｏｔｃｈリガンド配列に基づいて生成することは、当業者にとって日常的である。非限定的な例として、ペプチドミメティックは、ＤＬＬ４への結合に関与することが知られているＮｏｔｃｈ（例えばＮｏｔｃｈ１）の鍵となる残基、例えば、Ｎｏｔｃｈ（Ｎｏｔｃｈ１）の残基４１５（Ｅ４１５）、４１８（Ｌ４１８）、４２０（Ａ４２０）、４２１（Ｎ４２１）、４２２（Ｐ４２２）、４２４（Ｅ４２４）、４２５（Ｈ４２５）、４３６（Ｆ４３６）、４４７（Ｐ４４７）、４４８（Ｒ４４８）、４５０（Ｅ４５０）、４５２（Ｄ４５２）、４６９（Ｄ４６９）、４７７（Ｉ４７７）、４８０（Ｐ４８０）の１又は２以上、又はこれらの任意の組合せと相互作用するように設計し得る。
本発明の方法は、ＮＫ細胞の産生又はこの作用を模倣する分子を増加させることが可能な、特には、本明細書に開示するようにＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する本発明の化合物、又はＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じ、このため、本明細書に開示するようにＥ４ｂｐ４活性を上昇させる化合物と相乗的に作用し得る、任意のＮｏｔｃｈリガンド又はこの断片の使用を包含し得る。
Ｅ４ｂｐ４が、Ｎｏｔｃｈ１遺伝子の制御領域にインビボで直接結合し、このためＮｏｔｃｈの転写制御を増強し得ること、及びＮｏｔｃｈ１発現Ｅ４ｂｐ４−／−マウスが、著しく減少することを本発明者らは、これまでに示した。これを受けて、本発明者らは、ＮｏｔｃｈリガンドのマウスＨＳＣ及び超早期前駆細胞への短期的曝露により、重要な転写因子Ｅ４ｂｐ４の非存在下であっても、ＮＫ細胞の発生が促進し得ることを見出した。さらには、本発明者らは、Ｎｏｔｃｈリガンドのデルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）が、ＮＫ細胞増殖の刺激において特に有効であることを示した。
したがって、本発明は、本明細書に記載するＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物の使用と組み合わせた、ＨＰＣのＮｏｔｃｈリガンドへの曝露によるＮＫ細胞の増殖に関する。本発明のエクスビボ又はインビトロでの方法では、これは、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下でＨＰＣを培養するステップを含み得る。インビボ方法では、これは、化合物をＮｏｔｃｈリガンドとともに投与するステップを含み得る。好ましい実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ４、又はＤＬＬ４の機能を保持する、この断片若しくはバリアントである。
バリアント配列は、ＲＥＶ−ＥＲＢと関連して本明細書において記載する。この開示は、とりわけ、Ｎｏｔｃｈリガンドのバリアント及びこの断片／ミメティックに等しく及び独立的に適用する。本発明のバリアントＮｏｔｃｈリガンド／断片／ミメティックは、典型的には、対応する本発明のＮｏｔｃｈリガンド／断片／ミメティックの活性を少なくとも保持する。したがって、例えば、本発明のバリアントＤＬＬ４リガンド又はこの断片は、Ｎｏｔｃｈ１に結合し、及び／又はＮＫ細胞産生を増強する、対応するＤＬＬ４分子の能力を保持する。いくつかの実施形態では、バリアントＤＬＬ４リガンド／断片／ミメティックは、対応する非修飾ＤＬＬ４リガンド／断片／ミメティックよりも優れた活性を有する。このようなバリアントは、本発明者らにより、これまでに記載されている（その全体を参照により本明細書に組み込むＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５０８１８、特には１７及び１８頁を参照）。非限定的な例として、Ｎｏｔｃｈリガンド／この断片／ミメティック／バリアント（例えば、ＤＬＬ４リガンド／この断片／ミメティック／バリアント）は、１μＭ未満、９００ｎＭ未満、８００ｎＭ未満、７００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満又はこれ以下、好ましくは、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満又はこれ以下のＮｏｔｃｈ１への結合についてのＫＤ値を有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントＮｏｔｃｈリガンド／断片／ミメティック（例えば、バリアントＤＬＬ４リガンド／断片／ミメティック）は、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍又はこれ以上、対応する未修飾Ｎｏｔｃｈリガンド／断片／ミメティックに対して、ＮＫ細胞数を増加させるか、又はＮＫ細胞産生の増加を生じさせ得る。バリアントＮｏｔｃｈリガンド／断片／ミメティック（例えば、バリアントＤＬＬ４リガンド／断片／ミメティック）は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又はこれ以上、対応する非修飾ＤＬＬ４リガンド／断片／ミメティックと比較して、ＮＫ細胞数を増加させ得る。
本発明のＮｏｔｃｈリガンド／断片／ミメティックは、標識（又はタグ化）し得る。任意の適切な標識を使用し得る。適する標識は、当技術分野において公知である。
Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾
本発明者らは、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化により、Ｅ４ｂｐ４活性が高まり得ることをこれまでに示した（その全体を参照により本明細書に組み込むＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５０８１８、特には３３〜３６頁及び実施例１〜５を参照）。その上、Ｅ４ｂｐ４活性が翻訳後修飾の変化により高まると、（本明細書に定義するように）ＮＫ細胞数が増加する。
したがって、本発明の方法は、個体／患者から得られた、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む試料を、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じる化合物に接触させ、これによりＥ４ｂｐ４活性の上昇を生じるステップをさらに含み得る。したがって、本明細書に記載するようにＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させる化合物は、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する本発明の方法及び化合物と組み合わせて使用し得る。この組合せは、本明細書に記載するようにＮｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）の使用と組み合わせて、さらに使用し得る。
同様に、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させるか若しくはこれに影響する化合物は、したがって、患者におけるＮＫ細胞の産生を増加させて、Ｅ４ｂｐ４活性を上昇させるために、又はそれを必要とする患者におけるＮＫ細胞数を増加させることによる治療の方法における使用のために、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を低下させることによるＥ４ｂｐ４発現の増加に関する本明細書に開示する効能、及びＮｏｔｃｈリガンドの存在下でＨＰＣを培養することによるＮＫ細胞数の増加に関する本明細書に開示する任意の効能とともに、本発明に従って使用し得る。
ＮＫ細胞数を増加させる方法、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物の文脈においてＮＫ細胞を増殖させる方法、並びに／又はＮｏｔｃｈリガンド、前記化合物及び集団に関する前記方法及び治療的症状により産生された増殖ＮＫ細胞集団に関連する本明細書における開示のいずれかは、とりわけ、Ｅ４ｂｐ４活性を上昇させてＮＫ細胞数を増加させる開示の方法に適用する。非限定的な例として、フィーダー細胞層、増殖因子及び／又は他の培養条件並びに治療する疾患は、本明細書に開示する、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害に関する翻訳後修飾の態様及び／又はＮｏｔｃｈリガンドの態様に関連して、同一であり得る。ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又はＥ４ｂｐ４翻訳後修飾因子は、同時に、別々に又は逐次、使用し得る。Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させる化合物を、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物と組み合わせて使用する場合、典型的には、試料をＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物に接触させた後、翻訳後修飾因子に接触させる。Ｎｏｔｃｈリガンドをも使用する場合、典型的には、Ｅ４ｂｐ４翻訳後修飾因子は、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物及びＮｏｔｃｈリガンドの後に使用し、好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、ともに使用するか、又はより好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、（本明細書に記載するように）Ｎｏｔｃｈリガンドの前に使用する。
翻訳後修飾の種類
前記方法は、Ｅ４ｂｐ４活性の上昇を生じる翻訳後修飾のいかなる変化をも包含する。翻訳後修飾の非限定的な例としては、リン酸化、ＳＵＭＯ化、疎水基の付加（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化）、共同因子の付加、小さな化学基の付加（例えば、アシル化、アルキル化、アミド化、グリコシル化）、糖化、カルバミル化、カルボニル化、化学修飾（例えば、アミド分解）及び／又は構造変化が挙げられる。典型的には、本発明による翻訳後修飾の変化により、野生型（未修飾）Ｅ４ｂｐ４内の１又は２以上のリン酸化部位におけるリン酸化の減少、及び／若しくは野生型（未修飾）Ｅ４ｂｐ４内の１又は２以上のＳＵＭＯ化部位におけるＳＵＭＯ化の減少、又はこれらの組合せが生じる。発明者らによりこれまでに示したように（その全体を参照により本明細書に組み込むＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５０８１８、特には３３〜３６頁及び実施例１〜５を参照）、野生型（未修飾）Ｅ４ｂｐ４は、残基Ｋ１０、Ｋ１１６、Ｋ２１９、Ｋ３３７及び／若しくはＫ３９４若しくはこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいて典型的にＳＵＭＯ化される。典型的には、野生型（未修飾）Ｅ４ｂｐ４は、少なくとも残基Ｋ２１９（又は対応する残基）においてＳＵＭＯ化される。或いは、又は加えて、野生型（未修飾）Ｅ４ｂｐ４は、残基Ｓ２８６、Ｓ３０１及びＳ４５４若しくはこれらに対応する残基、又はこれらの任意の組合せにおいて典型的にリン酸化される。したがって、いくつかの実施形態では、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させる化合物は、残基Ｋ２１９（又はこれに対応する残基）においてＳＵＭＯ化を減少、阻害若しくは切断し、及び／又は残基Ｓ２８６、Ｓ３０１及びＳ４５４（又は対応する残基）若しくはこれらの任意の組合せにおいてリン酸化を減少、阻害若しくは切断する。したがって、本発明によれば、化合物は、（ａ）Ｅ４ｂｐ４の残基Ｋ１０、Ｋ１１６、Ｋ２１９、Ｋ３３７及び／若しくはＫ３９４若しくはこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいてＳＵＭＯ化を減少させ、及び／又は残基Ｓ２８６、Ｓ３０１及び／若しくはＳ４５４若しくはこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいてリン酸化を減少させるために使用し得る。
Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させて、Ｅ４ｂｐ４の活性を上昇させるか、又はこのＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾に影響することが可能な任意の化合物は、本発明に従って使用し得る。いくつかの実施形態では、前記化合物は、野生型（未修飾）Ｅ４ｂｐ４において生じる、リン酸化及び／又はＳＵＭＯ化を阻害、減少又は切断する。任意の適切なキナーゼ阻害物質は、Ｅ４ｂｐ４のリン酸化を阻害、減少又は切断するために使用し得る。適するキナーゼ阻害物質は、当技術分野において公知であり、これらの選択は、当業者にとって日常的である。例えば、Ｅ４ｂｐ４をリン酸化するキナーゼの現在の理解に基づいて、ホスホイノシチド依存タンパク質キナーゼ−１（ＰＤＫ１）及び／又はカゼインキナーゼ１イプシロン（ＣＫ１イプシロン）の阻害物質を使用することは、適切であり得る。適するキナーゼ阻害物質の非限定的な例としては、４−（４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ベンズアミド（Ｄ４４７６）及び４，５，６，７−テトラブロモ−２−アザベンズイミダゾール，４，５，６，７−テトラブロモベンゾトリアゾール（ＴＢＢ）が挙げられる。
Ｅ４ｂｐ４活性の上昇
Ｅ４ｂｐ４活性（例えば、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾によりもたらされるもの）の上昇は、対照に対して測定し得る。したがって、増殖ＮＫ細胞集団であるＮＫ先駆体又は前駆体細胞の試料、又は本発明に従って治療する個体／患者から得られた試料におけるＥ４ｂｐ４の活性は、対照におけるＥ４ｂｐ４の活性と比較し得る。活性は、適切な条件、例えば、Ｅ４ｂｐ４の任意の下流標的の発現の増加により定量し得る。適切な任意の技術又は方法を、Ｅ４ｂｐ４活性を定量するために使用し得る。適する技術は、当技術分野において公知であり、例えば、レポーター遺伝子の発現を定量するためのルシフェラーゼアッセイが挙げられる。
典型的には、対照は、本発明に従って処理されたことがない、等価な集団又は試料である。例えば、化合物を使用してＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させるか又はこれに影響させる例では、対応する対照は、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させるか又はこれに影響させるために、いかなる化合物も加えていない、集団又は試料であり得る。別の例として、化合物を使用してＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する例では、対応する対照は、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害するために、いかなる化合物も加えていない、集団又は試料であり得る。別の例として、化合物を使用してＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害し、化合物を使用してＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させるか又はこれに影響させる例では、対応する対照は、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害するため、又はＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させるか若しくはこれに影響させるために、いかなる化合物も加えていない、集団又は試料であり得る。
対照は、本発明に従って治療された異なる個体、又は治療前の同一の個体から得られた試料であり得る。公知の方法を含む、ＮＫ細胞のエクスビボでの増殖のための従来の方法は、本発明による対照方法であると考えられ得る。
本発明の文脈では、Ｅ４ｂｐ４活性の上昇に言及する場合、Ｅ４ｂｐ４の活性が、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はこれ以上、対照に対して上昇することを意味すると理解され得る。典型的には、Ｅ４ｂｐ４活性は、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍又はこれ以上、対照と比較して上昇する。Ｅ４ｂｐ４活性は、ＮＫ細胞数の増加の判定において、間接的に測定し得る。したがって、ＮＫ細胞数は、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はこれ以上、対照に対して増加し得る。典型的には、ＮＫ細胞数は、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍又はこれ以上、対照と比較して増加する。
Ｅ４ｂｐ４の活性は、定量的及び／又は定性的分析により判定することがあり、直接的又は間接的に測定することがある。対照に対するＥ４ｂｐ４の活性は、適切な任意の技術を使用して判定し得る。適する標準的技術は、当技術分野において公知である。
Ｅ４ｂｐ４の活性は、対照と比較して少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、上昇し得る。好ましくは、Ｅ４ｂｐ４の活性は、少なくとも１２〜７２時間、上昇する。典型的には、これは、Ｅ４ｂｐ４を翻訳後修飾する化合物の最後の投与に対して評価する。
Ｅ４ｂｐ４の活性は、対照と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０又はこれ以上の培養細胞の継代の間、上昇し得る。Ｅ４ｂｐ４の活性は、無制限に上昇し得る。
ＮＫ細胞を増殖させる方法
本発明は、ＮＫ細胞集団を増殖させるための方法に関する。この方法は、インビトロ、インビボ又はエクスビボであり得る。前記方法は、（本明細書に記載するように）ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物とともにＨＰＣを含有させるステップ、及び前記細胞を増殖させてＮＫ細胞集団を産生するステップを含む。本発明の方法により、ＮＫ細胞の迅速な増殖が可能となり、その培養に必要とされる時間が低減し、これにより枯渇のリスクが低減し、患者に輸注した場合にＮＫ細胞の細胞傷害性が増強する。
前記方法をインビボで実行した場合、前記方法は、本明細書に記載の治療的方法となる。このような実施形態では、本発明の治療適応及び適用に関する、本明細書におけるすべての開示は、前記方法に適用可能である。
典型的には、本発明の方法は、エクスビボである。したがって、本発明は、（ａ）個人から得られた試料を含むＮＫ先駆細胞を培養するステップと、（ｂ）前記試料をＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物に接触させるステップと、（ｃ）前記細胞をインビトロで増殖させてＮＫ細胞集団を産生するステップとを含むＮＫ細胞集団を増殖させるためのエクスビボでの方法を提供する。化合物は、本明細書に記載の本発明の任意のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物であり得る。典型的には、前記化合物により、本明細書に記載するようにＲＥＶ−ＥＲＢ活性が減少することによってＥ４ｂｐ４発現が増加する。好ましい実施形態では、化合物は、本明細書に定義する式（II）を有し、より好ましくは、化合物は、本明細書に定義する式（III）を有し、さらにより好ましくは、化合物は、本明細書に定義する式（IV）を有し、さらにより好ましくは、化合物は、本明細書に定義する式（Ｖ）を有する。本発明の方法において使用し得る特定の化合物の例は、本明細書に記載し、化合物７及び１１は、特に好ましい。
さらなる外的刺激、例えば、増殖因子及び／又はサイトカインは、ＮＫ細胞の産生をさらに増強するために使用し得る。適する外的刺激の非限定的な例としては、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、Ｆｌｔ３Ｌ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−３及び／若しくはＩＬ−６、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ及び／若しくはＳＣＦ、又はこれらの任意の組合せを使用する。より好ましくは、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ及びＳＣＦを使用する。
非限定的な例として、ＩＬ−７は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌ又はこれ以下の濃度で使用し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−７は、約５０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ又は約５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。非限定的な例として、Ｆｌｔ３Ｌは、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌ又はこれ以下の濃度で使用し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、約５０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ又は約５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。非限定的な例として、ＳＣＦは、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ又はこれ以下の濃度で使用し得る。いくつかの実施形態では、ＳＣＦは、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１２０ｎｇ／ｍｌ、約１１０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ又は約７５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。
非限定的な例として、ＩＬ−１５は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下の濃度で使用し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５は、約５０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ又は約１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、約３０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用する。
或いは、又は加えて、ＨＰＣは、適する支持／間質細胞又は細胞層上又はこれとともに培養し得る。任意の適切な間質細胞を使用することができ、ＯＰ９間質細胞及び／又はＥＬ０８−１Ｄ２間質細胞を含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、エクスビボでの方法は、典型的には、実質的に一定の培養条件下で、患者から得られた試料中のＨＰＣを培養し、本発明の化合物に接触させ、増殖させてＮＫ細胞集団を形成する単一の段階を含む。典型的には、これは、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及び／又はＩＬ−１５、好ましくはこれらの因子のすべてのような因子とＨＰＣをインキュベートするステップを含む。ＨＰＣはまた、好ましくは、ＥＬ０８−１Ｄ２間質細胞などの、間質細胞／細胞層上、又は間質細胞／細胞層により培養する。
いくつかの実施形態では、エクスビボでの方法は、２つの段階を含む。第１の段階は、リンパ球系産生段階であり、ここで患者から得られた試料中のＨＰＣを培養する。典型的には、これは、リンパ球系産生と関連するサイトカイン及び増殖因子、例えば、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７及び／又はＳＣＦとＨＰＣをインキュベートするステップを含む。この段階は、少なくとも１日、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間又はそれ以上持続し得る。いくつかの好ましい実施形態では、この段階は、２日間持続する。エクスビボでの方法の第２の段階は、ＮＫ細胞増殖の段階である。典型的には、これは、培養したＨＳＣを適した間質（支持）細胞層、例えば、ＯＰ９間質細胞に移すステップ並びにＮＫ細胞発生と関連するサイトカイン及び増殖因子、例えば、ＩＬ−１５により培養するステップを含む。本発明の化合物は、典型的に、この第２の段階の間に、好ましくは、この第２の段階の開始時に添加する。第２の段階は、残りのエクスビボでの培養期間（上記に定義するように）持続する。培養培地は、この第２の段階の間、必要に応じてたびたび交換して、ＮＫ細胞増殖を促進してもよい。この第２の段階は、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間又はこれ以上、持続し得る。いくつかの好ましい実施形態では、この段階は、少なくとも１週間、持続する。
ＨＰＣを含む試料は、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間又はそれ以上エクスビボで培養することができる。典型的には、前記試料は、少なくとも９日間培養して増殖ＮＫ細胞集団を産生する。これらの培養期間は、エクスビボでの方法の全培養期間である。即ち、２つの段階がある場合、これらの期間は、全体（段階１に加えて段階２）である。ＮＫ細胞の産生のためのＨＰＣの例となる培養スキームは、図２Ａに提示する。
本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、試料中のＨＰＣを単離して１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内、又はＮＫ細胞先駆体を単離した同日にＨＰＣを含む試料に添加することができる。典型的には、これは、試料が患者から得られた同日である。好ましくは、本発明の化合物は、試料中のＨＰＣを単離して２日以内、さらにより好ましくは、ＨＰＣの単離後２日目に試料に添加する。いくつかの実施形態では、化合物は、複数の時点で、例えば、培養培地を交換するときに加える。非限定的な例として、本発明の化合物は、ＨＰＣを単離後２日に加え、次いで、ＨＰＣの単離後５日目に再び加え得る。本開示は、例えば、本明細書に記載する、１段階及び２段階方法、並びに／又は本明細書に記載する、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／若しくはＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させる化合物をも使用する方法についての、本発明のすべての方法に適用する。
適切な任意の濃度の本発明の化合物は、これが、本明細書に記載するようにＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害し、ＮＫ細胞集団の増殖において有用性を有するという条件で、使用し得る。非限定的な例として、本発明の任意の態様では、本発明の化合物は、約２〜約２０μＭ、約２〜約１５μＭ、約５〜約１５μＭ、約５〜約１４μＭ、約４〜約１３μＭ、約５〜約１２μＭ、約５〜約１１μＭ、又は好ましくは、約５〜約１０μＭの最終濃度で使用し得る。
本発明者らは、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）及びＲＥＶ−ＥＲＢ阻害の使用を組み合わせると、ＮＫ細胞集団を増強し、インビボでの治療的使用に適する大量の機能性ＮＫ細胞の産生を、現在の方法よりも迅速に可能とするための強力な手段となることを、これまでに実証した。
したがって、本発明では、ＮＫ細胞集団を増殖させるためのエクスビボでの方法であって、（ａ）個体／患者から得られた、ＨＰＣを含む試料を、（本明細書に記載する）ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物とともに培養するステップと、（ｂ）Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）の存在下で前記細胞を培養するステップと、（ｃ）前記細胞をインビトロで増殖させてＮＫ細胞集団を産生させるステップとを含む、方法を提供する。ステップ（ａ）及び（ｂ）は、同時発生的に又は任意の順序で実行し得る。例えば、ステップ（ａ）は、はじめに実行し、その後ステップ（ｂ）を実行することがあり、これにより、細胞は、はじめにＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物に曝露され、次いで、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養される。或いは、ステップ（ｂ）は、はじめに実行し、その後ステップ（ａ）を実行することがあり、これにより、細胞は、はじめにＮｏｔｃｈリガンドの存在下で、次いで、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物の存在下で培養される。或いは、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、同時発生的に実行することがあり、これにより、細胞は、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物及びＮｏｔｃｈリガンドの存在下で同時に培養される。
いくつかの好ましい実施形態では、ステップ（ａ）をはじめに、その後ステップ（ｂ）を実行することがあり、これにより、細胞は、はじめにＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物の存在下で、次いで、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養される。したがって、このような実施形態において、本発明では、ＮＫ細胞集団を増殖させるためのエクスビボでの方法であって、（ａ）個体／患者から得られた、ＨＰＣを含む試料を、（本明細書に記載する）ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物とともに培養するステップと、（ｂ）Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）の存在下で前記細胞を培養するステップと、（ｃ）前記細胞をインビトロで増殖させてＮＫ細胞集団を産生させるステップとを含む、方法を提供する。
典型的には、Ｎｏｔｃｈリガンドは、本明細書に記載するＮｏｔｃｈリガンドである。好ましくは、Ｎｏｔｃｈリガンドは、本明細書に記載する、ＤＬＬ４、又はＤＬＬ４の機能を保持するこの断片である。
Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）は、溶液中（例えば、培養培地中）に存在するか、又はＨＰＣを培養する容器をコーティングするために使用し得る。好ましくは、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）は、ＨＰＣを培養する容器をコーティングするために使用する。非限定的な例として、Ｎｏｔｃｈリガンドを使用する、本発明の任意の態様では、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）は、約１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約２５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ又はこれ以下の濃度で使用し得る。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）は、約５０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ又は約５μｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０μｇ／ｍｌの濃度で使用する。さらなる基質及び／又はリンカーは、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）の培養容器の表面への付着を促進するために使用し得る。このような基質の例は、当技術分野において公知であり、例えば、ポリ−Ｌ−リジンが挙げられる。
上記のように、ＨＰＣは、間質支持細胞若しくはフィーダー細胞、又はこの集団の存在下又は非存在下で培養し得る。Ｎｏｔｃｈリガンドを使用するいくつかの好ましい実施形態では、細胞は、間質支持細胞又はこの集団の非存在下で培養する。
いくつかの実施形態では、エクスビボでの方法は、典型的には、実質的に一定の培養条件下で（すなわち、方法のステップ（ａ）及び（ｂ）を同時発生的に実行する）、個体／患者から得られた試料中のＨＰＣを培養し、本発明の化合物及びＮｏｔｃｈリガンドに接触させ、増殖させてＮＫ細胞集団を形成させる、単一の段階を含む。典型的には、これは、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及び／又はＩＬ−１５のような因子、好ましくは、このような因子のすべてとともにＨＰＣをインキュベートするステップを含む。ＨＰＣは、間質細胞／細胞層、例えば、ＥＬ０８−１Ｄ２間質細胞の存在下又は非存在下で培養し得る。
いくつかの実施形態では、エクスビボでの方法は、２つの段階（図２に示すスキームに類似する）を含む。第１の段階は、個体／患者から得られた試料中のＨＰＣを培養する、リンパ系産生段階である。典型的には、これは、リンパ系産生と関連するサイトカイン及び増殖因子、例えば、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７及び／又はＳＣＦとともにＨＰＣをインキュベートするステップを含む。この段階は、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間又はこれ以上、持続し得る。いくつかの好ましい実施形態では、この段階は、２日間、持続する。
この後に、ＮＫ細胞増殖の段階が続く。典型的には、これは、ＮＫ細胞の発生と関連するサイトカイン及び増殖因子、例えば、ＩＬ−１５中で細胞を培養するステップを含み、培養したＨＳＣを適する間質（支持）細胞層、例えば、ＯＰ９間質細胞に移すステップを含み得る。第２の段階は、（本明細書に定義する）残りのエクスビボでの培養期間持続する。培養培地は、第２の段階において必要に応じて交換して、ＮＫ細胞増殖を促進し得る。交換する前に培養培地中に存在する任意のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又はＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾を変化させる化合物は、同一又は異なる濃度のいずれかで、新鮮培養培地とともに再び投与し得る。非限定的な例として、ＨＰＣの単離後２日に本発明の化合物を加え、ＨＰＣの単離後５日目に培地を交換する場合、化合物は、単離後５日目に、新鮮培地とともに再び投与し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、段階１（リンパ系産生）において、Ｎｏｔｃｈリガンドは、第２の段階（ＮＫ細胞増殖）において加える。他の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、段階１（リンパ系産生）において、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、第２の段階（ＮＫ細胞増殖）において加える。さらに他の実施形態では、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物とＮｏｔｃｈリガンドの両方は、第１の段階（リンパ系産生）において加える。さらなる実施形態では、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物とＮｏｔｃｈリガンドの両方は、第２の段階（ＮＫ細胞増殖段階）において加える。ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物及びＮｏｔｃｈリガンドを同一の段階（段階１又は段階２のいずれか）において加える場合、この段階は、さらに分割して、（ｉ）ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物をＮｏｔｃｈリガンドの前に加え得るか、又は（ii）ＮｏｔｃｈリガンドをＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物の前に加え得る。或いは、Ｎｏｔｃｈリガンド及びＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、同一の段階において同時に加え得る。図２Ｂでは、本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物及びＮｏｔｃｈリガンドの組合せの態様についての、種々の方法スキームのいくつかの実施形態を例示する。図２Ｂに含む投与のタイミングは、非限定的であり、適切な任意の投与タイミング、例えば、本明細書に記載するタイミングを使用し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害剤は、段階１において（例えば、０日目又は２日目に）加え、Ｎｏｔｃｈリガンドは、後に（例えば、２又は４日目にそれぞれ）加える。
典型的には、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、第１の段階において加え、Ｎｏｔｃｈリガンドは、第２の段階において、好ましくは、この第２の段階の開始時に加える。
ＨＰＣを含む試料は、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間又はこれ以上、エクスビボで培養し得る。典型的には、前記試料は、少なくとも９日間培養して、増殖ＮＫ細胞集団を産生させる。このような培養期間は、エクスビボでの方法の総培養期間である。すなわち、２つの段階が存在する場合、このような期間は、総計期間（段階１足す段階２）である。
本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、試料中のＨＰＣを単離して１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内に、又はＮＫ細胞先駆体を単離した同日に、ＨＰＣを含む試料に加え得る。典型的には、これは、患者から試料を得る同日である。好ましくは、本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、試料中のＨＰＣを単離して２日以内、例えば、ＨＰＣを単離した日に、試料に加える。最も好ましくは、本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物は、ＨＰＣの単離後２日に、試料に加える。いくつかの実施形態では、化合物は、複数の時点で、例えば、培養培地を交換するときに加える。非限定的な例として、本発明の化合物は、ＨＰＣの単離後２日に加え、次いで、ＨＰＣの単離後５日目に再び加える。
本発明のＮｏｔｃｈリガンドは、試料中のＨＰＣを単離して１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内に、又はＮＫ細胞先駆体を単離した同日に、ＨＰＣを含む試料に加え得る。典型的には、これは、患者から試料を得る同日である。好ましくは、本発明のＮｏｔｃｈリガンドは、試料中のＨＰＣを単離して４日以内、例えば、ＨＰＣの単離後２日目に、試料に加える。最も好ましくは、本発明のＮｏｔｃｈリガンドは、ＨＰＣの単離後２又は４日に、試料に加える。したがって、典型的には、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＨＰＣの単離後４日に又はＨＰＣの単離後４日から存在する。
本発明の好ましい実施形態は、（ｉ）ＨＰＣを単離する日に、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物及びＮｏｔｃｈリガンドを試料に加えるステップ、（ii）ＨＰＣを単離する日に、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物を試料に加え、ＨＰＣの単離後２日に、Ｎｏｔｃｈリガンドを試料に加えるステップ、又は（iii）ＨＰＣの単離後２日に、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物を試料に加え、ＨＰＣの単離後４日目に、Ｎｏｔｃｈリガンドを試料に加えるステップを含み、選択肢（iii）は、特に好ましい。発明者らによりこれまでに実証したように、このような特定の条件により、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害とＮｏｔｃｈリガンドとの間の相乗作用が最大化され、このためＮＫ細胞の増殖が最大化される。
加えて、細胞は、（本明細書に記載する）さらなる外的刺激の存在下で、Ｎｏｔｃｈリガンドと組み合わせて培養し得る。非限定的な例として、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＩＬ−１５とともに使用し得る。例えば、細胞は、はじめにＮｏｔｃｈリガンドに、次いでＩＬ−１５に曝露し得る。或いは、細胞は、はじめにＩＬ−１５の存在下で、次いでＮｏｔｃｈリガンドの存在下で培養し得る。或いは、細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンド及びＩＬ−１５の存在下で同時に培養し得る。好ましくは、細胞は、はじめにＮｏｔｃｈリガンド、次いでＩＬ−１５の存在下で培養する。
ＨＰＣは、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤＬＬ４）の存在下で培養し得る。典型的には、７２時間〜１週間である。細胞は、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間又はこれ以上、所望の数のＮＫ細胞が産生されるまでＩＬ−１５の存在下で培養し得る。例えば、Ｉｌ−１５中で培養するステップは、１週間若しくはこれ以上の長さ、７〜９日の長さ、又は約２週間の長さであり得る。
或いは、このような期間は、細胞継代数の条件により測定し得る。例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０又はこれ以上の細胞継代である（インビボ、又はエクスビボ若しくはインビトロでの培養のいずれか）。
Ｎｏｔｃｈリガンド及びＩＬ−１５への曝露期間は、独立的であり、任意のＮｏｔｃｈ培養期間を、任意のＩＬ−１５培養期間と組み合わせて使用し得る。いくつかの好ましい実施形態では、Ｎｏｔｃｈの曝露／培養は、７２時間〜１週間の長さであり、ＩＬ−１５の曝露／培養は、１週間（又はこれ以上）の長さである。
典型的には、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ及び／又はＳＣＦは、Ｎｏｔｃｈリガンドとともに使用する。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＣは、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ及びＳＣＦの存在下で、Ｎｏｔｃｈリガンドとともに培養する。
本発明の方法（ＨＰＣをＮｏｔｃｈリガンドと接触させるステップを含む方法と含まない方法の両方）は、本明細書に記載するように、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じ、これによりＥ４ｂｐ４活性の上昇を生じる化合物と、ＨＰＣを接触させるステップをさらに含み得る。Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化は、本明細書に記載する、Ｅ４ｂｐ４のＳＵＭＯ化及び／又はリン酸化の減少であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じる化合物は、Ｅ４ｂｐ４の残基Ｋ１０、Ｋ１１６、Ｋ２１９、Ｋ３３７及び／若しくはＫ３９４若しくはこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいてＳＵＭＯ化を減少させ、及び／又はＥ４ｂｐ４の残基Ｓ２８６、Ｓ３０１及び／若しくはＳ４５４若しくはこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいてリン酸化を減少させる。
Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じる、適切な任意の濃度の化合物は、これが、本明細書に記載するようにＥ４ｂｐ４の活性を上昇させ、ＮＫ細胞集団の増殖において有用性を有するという条件で、使用し得る。非限定的な例として、本発明の任意の態様では、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じる化合物は、約０．１〜約２０μＭ、約０．１〜約１５μＭ、約０．５〜約１５μＭ、約０．５〜約１４μＭ、約０．５〜約１２μＭ、約０．５〜約１１μＭ、又は約０．５〜約１０μＭ、例えば、約５〜約１０μＭの最終濃度で使用し得る。いくつかの好ましい実施形態では、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じる化合物は、約０．５〜約５μＭ、より好ましくは、約０．５〜約２μＭ、さらにより好ましくは、約０．５〜約１μＭの最終濃度で使用し得る。
ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又はＥ４ｂｐ４翻訳後修飾を変化させる化合物は、本明細書に記載するように、同時に、別々に、又は逐次、使用し得る。
ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又はＥ４ｂｐ４翻訳後修飾を変化させる化合物のそれぞれは、単一の治療若しくは適用として、又は複数の治療若しくは適用において（本明細書に記載するようにインビトロとエクスビボの両方又はインビボ方法において）独立して使用し得る。複数の適用では、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回又はこれ以上の適用を使用し得る。複数の適用は、本発明の方法又は治療に従って、適切な任意の時点で適用し得る。非限定的な例として、本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又はＥ４ｂｐ４翻訳後修飾を変化させる化合物は、１日２回、１日１回、１日おきに、３日に１回又は毎週、それぞれ独立的に適用し得る。典型的には、本発明のＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又はＥ４ｂｐ４翻訳後修飾を変化させる化合物は、培養培地を交換するときに必要に応じて、独立的に適用し得る。
本発明の方法は、モジュレートする（１つ又は２つ以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質のＨＰＣにおける発現及び／又は活性を増加又は減少させてＮＫ細胞増殖を促進する）ステップをさらに含むことができる。このモジュレーションは、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害するために使用するものと同一の本発明の化合物を含む、本発明の化合物により誘発することができる。或いは、１つ又は２つ以上の追加の化合物は、１つ又は２つ以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質の発現及び／又は活性をモジュレートするために使用することができる。前記モジュレーションは、直接的又は間接的に生じ得る。間接的モジュレーションは、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する本発明の化合物により生じる下流効果を包含する。
本発明のすべての方法では、個体／患者から得られた、ＨＰＣを含む試料は、骨髄、臍帯血及び／又は末梢血から得られた試料であり得る。したがって、試料は、臍帯血若しくは末梢血試料、又は骨髄試料或いは生検であり得る。試料は、本発明の方法によって産生されたＮＫ細胞集団により治療される個体（すなわち、患者）から得られ得る。或いは、試料は、健常な個体から得られる。
本発明によれば、ＨＰＣを含む試料は、（本明細書に記載する）十分な数のＨＰＣを含み、これにより、本発明に従って前記試料を化合物と接触させることにより増殖ＮＫ細胞集団を得ることが可能な、個体由来の任意の試料である。典型的には、試料は、ＨＳＣを含む。好ましくは、前記試料は、本明細書に記載する臍帯血若しくは末梢血試料又は骨髄試料或いは生検のように、ＨＳＣを濃縮する。
本発明の方法は、対照に対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はそれ以上のＮＫ細胞数の増加をもたらすことができる。典型的には、ＮＫ細胞の数は、対照と比較して少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍又はそれ以上増加する。
本発明の方法は、表現型的に成熟したＮＫ細胞の産生を促進し得る。言い換えれば、本発明の方法は、成熟ＮＫ細胞集団に達するのに掛かる時間を削減し得る。方法の実行時間の削減により、当技術分野において公知のＮＫ細胞増殖のための従来の方法に対するさらなる利点がもたらされる。非限定的な例として、ＮＫ細胞の増殖のための現在の臨床的手順では、約２０％の成熟ＮＫ細胞を含むＮＫ細胞集団の産生に２週間以上掛かり得る。対照的には、本発明の方法は、等価な集団を１０日又はこれ以下、好ましくは、１週間又はこれ以下で達成し得る。本発明の方法は、少なくとも４０％の成熟ＮＫ細胞、好ましくは、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％又は少なくとも４９％の成熟ＮＫ細胞、さらにより好ましくは、少なくとも５０％の成熟ＮＫ細胞の集団を、３週間若しくはこれ以下、２０日若しくはこれ以下、１９日若しくはこれ以下、１８日若しくはこれ以下、１７日若しくはこれ以下、１６日若しくはこれ以下、１５日若しくはこれ以下、２週間若しくはこれ以下、１３日若しくはこれ以下、又は１２日若しくはこれ以下で達成し得る。好ましくは、本発明の方法は、少なくとも４５％の成熟ＮＫ細胞の集団を２週間以内又はこれ以下で達成することができる。
典型的には、本発明のエクスビボでの方法は、増殖ＮＫ細胞集団を精製する最終ステップを含む。これにより、本明細書に記載する治療的投与のための純粋な集団が確保される。増殖ＮＫ細胞集団の精製は、適切な任意の手段によってであってもよい。標準的細胞精製方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ、fluorescence-activated cell sorting）及び磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ、magnetic-activated cell sorting）を含む細胞選別は、当分野において公知である。
それらに限定されないが、Ｎｏｔｃｈリガンド及びＲＥＶ−ＥＲＢ阻害化合物の組合せを含む方法を含む、本発明のいくつかの方法では、最終細胞集団におけるＮＫ細胞の％は、非常に高いことがある（典型的には８５％よりも高く、好ましくは９０％よりも高く、より好ましくは９５％よりも高く、１００％に接近し得る）。このような例では、最終精製ステップは、省略してもよい。
治療適応
本発明は、患者におけるＮＫ細胞の産生を増加させることによる療法の方法における使用のためのＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストを提供する。
療法の前記方法における使用のためのＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストは、本明細書に記載する任意のＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストであり得る。典型的には、前記方法における使用のためのＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストにより、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を減少させることによってＥ４ｂｐ４発現が増加する。
典型的には、療法の方法は、（本明細書に記載する）ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物を患者又は対象に投与するステップを含む。
また、本発明では、患者におけるＮＫ細胞の産生を増加させることによる療法の方法における同時、別々、又は逐次の使用のための混合調製物として、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物及びＮｏｔｃｈリガンドを含む産物を提供する。
療法の前記方法における使用のためのＮｏｔｃｈリガンドは、本明細書に記載する任意のＮｏｔｃｈリガンドであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ４又はＤＬＬ４の機能を保持するこの断片である。本発明の任意のＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニスト及び任意のＮｏｔｃｈリガンドを、組み合わせて使用し得る。
典型的には、前記ＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニスト及びＮｏｔｃｈリガンド産物に関する療法の方法は、（本明細書に記載する）産物を患者又は対象に投与するステップを含む。Ｎｏｔｃｈリガンド及びＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストは、同時に、別々に、又は逐次、投与し得る。別々又は逐次の投与では、Ｎｏｔｃｈリガンドをはじめに、その後、ＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニストを投与し得るか、又はこの逆である。
逐次の投与は、２つの産物を直ちに相次いで投与すること、又は第２の産物を、第１の産物を投与して１分以内、２分以内、３分以内、４分以内、５分以内、１０分以内、１５分以内、２０分以内、２５分以内、３０分以内、４５分以内、１時間以内若しくはこれ以上に投与することを意味し得る。
別々の投与は、第２の産物を、第１の産物を投与して１時間以内、２時間以内、３時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内又はこれ以上に投与することを意味し得る。
本明細書において使用する場合、用語「ＮＫ細胞の数を増加させる」及び「ＮＫ細胞の産生を増加させる」は、本発明の化合物が、患者におけるＮＫ細胞数の顕著な増加を誘発することを意味すると理解され得る。このＮＫ細胞数の増加は、対照に対して測定することができる（Ｅ４ｂｐ４発現の増加及びＲＥＶ−ＥＲＢ活性の阻害の文脈において本明細書に記載するように）。
ＮＫ細胞数の増加及び／又はＮＫ細胞産生の増加に言及する場合、対照に対する増加倍数の点から定量化することができる。典型的には、本発明の化合物は、対照に対して少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍又はそれ以上の、ＮＫ細胞数を増加させるか、又はＮＫ細胞産生の増加を生じさせることができる。
或いは、ＮＫ細胞数の増加及び／又はＮＫ細胞産生の増加に言及する場合、ＮＫ細胞数が、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又はそれ以上増加することを意味すると理解され得る。典型的には、ＮＫ細胞数は、対照と比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％又はそれ以上増加する。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞数の増加及び／又はＮＫ細胞産生の増加は、試料又は患者におけるＮＫ細胞の絶対数、例えば、ＮＫ細胞の割合、例えば、循環するリンパ球集団におけるＮＫ細胞の割合の点で定義することができる。例えば、本発明の化合物は、ＮＫ数の増加をもたらし、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％又はそれ以上のＮＫ細胞の割合を生じることができる。
ＮＫ細胞の数は、定量的及び／又は定性的分析により判定することができ、直接的又は間接的に測定することができる。ＮＫ細胞の数は、対照に対して、適切な任意の技術を使用して判定することができる。適した標準的技術、例えば、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ及びＭＡＣＳは、当分野において公知である。
ＮＫ細胞の数は、対照と比較して少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１カ月又はそれ以上増加し得る。典型的には、これは、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を阻害する化合物の最後の投与に対して評価する。
ＮＫ細胞の数は、患者由来の試料又は（本発明のエクスビボでの方法由来の）培養試料中の全ＮＫ細胞数の点から定量化することができる。
本発明の治療的使用及び方法の文脈において、「対象」又は「患者」（これらの用語は本明細書において互換的に使用される）は、ＮＫ細胞数の増加から恩恵を得る任意の動物患者である。典型的な動物患者は、哺乳動物、例えば、霊長類である。好ましくは、患者は、ヒトである。
したがって、本発明は、（本明細書に記載するように）ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する、治療有効量の化合物を前記患者に投与するステップを含む、それを必要とする患者においてＮＫ細胞数を増加させることによる治療の方法を提供する。また、（本明細書に記載する）ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する治療有効量の化合物及び（本明細書に記載する）Ｎｏｔｃｈリガンドを前記患者に投与するステップを含む、それを必要とする患者におけるＮＫ細胞数を増加させることによる治療の方法を提供する。
加えて、本発明は、医薬の製造における、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物の使用を提供する。前記医薬により、患者におけるＮＫ細胞の数が増加する。加えて、本発明では、医薬の製造におけるＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物及びＮｏｔｃｈリガンドの使用を提供する。前記医薬により、患者におけるＮＫ細胞数が増加する。
本発明の治療的使用又は方法は、治療有効量の本発明の化合物又は産物を、単独又は他の治療薬と併せて、患者に投与するステップを含むことができる。
本明細書において使用する場合、用語「治療」又は「治療する」は、治療的又は予防性（preventative）／予防的（prophylactic）手段を包含する。
本発明の化合物はまた、予防療法として使用することができる。本明細書において使用する場合、用語「予防する」は、ＮＫ細胞数を増加させ、及び／又は症状の重症度若しくは強度を減少させることにより治療することができる疾患又は障害と関連する前記症状の発症を予防することを含む。用語「予防する」は、このような疾患又は障害、特に本明細書に記載する感染性疾患に対する防御免疫を誘導又は提供することを含む。免疫は、適切な任意の技術を使用して定量化することができ、この例は、当分野において公知である。
本発明の化合物又は産物は、ＮＫ細胞数を増加させることにより治療することができる疾患又は障害を既に有する患者に投与することができる。例えば、患者は、本明細書に記載する感染性疾患又はがんを有するのではないかと疑われることがあり、前記疾患又は障害の症状を示すこともあり又は示さないこともある。このような患者に投与した場合、本発明の化合物又は産物により、１つ若しくは２つ以上の症状の重症度が治癒、遅延、減少するか、若しくは改善し、及び／又はこのような治療を行わない場合の予想を超えて対象の生存を延長することができる。
或いは、本発明の化合物又は産物は、特定の感染性疾患に最終的に感染するか、又は本明細書に記載する疾患若しくは障害を発症する可能性のある患者に投与して、１つ若しくは２つ以上の症状の重症度が治癒、遅延、減少するか、若しくは改善し、及び／又はこのような治療を行わない場合の予想を超えて対象の生存を延長するか、或いは、感染性疾患の場合、患者を前記疾患の伝染から防ぐことを助けることができる。
本発明の治療及び予防療法は、種々の年齢の多様な種々の対象に適用可能である。ヒトに関しては、療法は、子供（例えば、乳児、５歳未満の小児、年長の小児又は１０代の若者）及び大人に適用可能である。他の動物対象（例えば、霊長類などの哺乳動物）に関しては、療法は、未熟な対象及び成熟した／大人の対象に適用可能である。
本発明は、患者におけるＮＫ細胞の数を増加させることにより有利に治療することができる任意の疾患又は障害の治療に関する。このような疾患及び障害は、がん、感染性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患及び女性不妊症又は妊娠に関連する疾患又は障害を含む。本発明により治療することができる感染性疾患は、ウイルス感染症、及び細菌、原生生物、真菌又は蠕虫病原体を含む他の病原体による感染症を含む。典型的には、前記病原体は、その生活環において少なくとも１つの細胞内相を有する細胞内病原体である。特に所望の感染症は、ウイルス感染症、及び公衆衛生の観点から特に重要な人畜共通感染症を含む。本発明により治療することができるがんは、膀胱がん、血液がん、白血病、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、腎がん、肝がん、肺がん、メラノーマ、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん及び子宮がんを含む。本発明により治療することができる自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症及び肥満によるインスリン抵抗性を含む。本発明において使用する場合、女性不妊症又は妊娠に関連する疾患又は障害の用語は、胎児発育遅延、早期分娩、子宮血管再構築の異常及び妊娠高血圧腎症を含むが、これらに制限されない。
本発明の化合物又は産物は、１つ又は２つ以上の追加の治療薬又は治療と併せて使用することができ、これは典型的に、治療する疾患又は障害のための従来の治療から選択することができる。非限定的な例として、本発明の化合物又は産物が、肺がんなどのがんの治療における使用のためのものである場合、前記化合物又は産物は、放射線療法、化学療法又は手術などの、肺がんのための従来の治療と併せて使用することができる。１つ又は２つ以上の追加の治療薬又は治療と併せて使用する場合、本発明の化合物は又は産物、１つ又は２つ以上の追加の治療薬又は治療を施す前、同時、又は後に投与することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の化合物又は産物は、抗体媒介免疫療法と併せて使用するためのものである。抗体媒介免疫療法は、抗体を患者へ投与して疾患特異的抗原を標的化するステップを含む。このような抗体は、ＮＫ細胞の特異性及び殺活性を増加させるために使用することができ、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域の受容体を発現する。これらのＦｃ受容体の活性化は、ＮＫ細胞活性化を誘導し、活性化したＮＫ細胞によりサイトカインの分泌及び細胞傷害性顆粒の放出を生じ、疾患抗原を発現する細胞の溶解を引き起こす。このような併用療法は、（腫瘍特異的抗原に対する抗体を使用する）がんの治療に特に好ましい。免疫療法において使用するいかなる抗体も、本発明の化合物と併せて使用することができる。このような抗体の非限定的な例として、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性リンパ腫）、抗ガングリオシドＤ２（抗ＧＤ２）ｍＡｂ（神経芽細胞腫、メラノーマ）、抗ヒト上皮増殖因子（抗ＨＥＲ２）ｍＡｂ（乳及び胃がん）、抗上皮増殖因子受容体（抗ＥＧＦＲ）ｍＡｂ（直腸結腸及び頭頸部がん）が挙げられる。
他の態様では、本発明は、（本明細書に記載する）増殖させたＮＫ細胞集団の本明細書に記載する治療的使用又は方法における使用を提供する。本発明の化合物又は産物の治療適応に関するありとあらゆる本明細書における開示は、本発明の増殖ＮＫ細胞集団の治療上の適用に等しくかつ独立して適用することができる。非限定的な例として、本発明は、療法の方法における、例えば、がん、感染性疾患、自己免疫疾患又は女性不妊症若しくは妊娠に関連する疾患若しくは障害の治療における使用のための（本明細書に記載する）増殖ＮＫ細胞集団を提供する。別の非限定的な例として、本発明は、治療有効量の増殖ＮＫ細胞集団を患者に投与するステップを含む、それを必要とする前記患者におけるＮＫ細胞数を増加させることによる治療の方法を提供する。
医薬組成物及び製剤
「化合物及び産物」は、本明細書において本発明の「治療的／予防的組成物」、「製剤」又は「医薬」を含み得る。
本発明の（上に定義する）化合物又は増殖ＮＫ細胞集団は、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤と組み合わせるか又はそれらに加えて投与することができる。或いは又は加えて、本発明の化合物又は増殖ＮＫ細胞集団は、塩、賦形剤、希釈剤、アジュバント、免疫調節剤及び／又は抗菌化合物のうちの１つ又は２つ以上とさらに組み合わせることができる。
式（Ｉ）の化合物は、塩、特には、薬学的に許容される塩の形態であり得る。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸等などの有機酸で形成される酸付加塩を含む。遊離のカルボキシ基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩基に由来し得る。
免疫原性組成物、治療製剤、医薬及び予防製剤の投与は、一般に、従来の経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、又は粘膜経路による。投与は、非経口的注入、例えば、皮下、皮内又は筋肉内注射によってであってもよい。例えば、抗体又は本発明の増殖ＮＫ細胞集団を含む製剤は、静脈内、筋肉内、皮内、又は皮下投与に特に適し得る。低分子ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害物質の投与は、静脈内、筋肉内、皮内、若しくは皮下などの注射、又は経口投与によってであり得る（経口バイオアベイラビリティを典型的に示す５００Ｄａ未満の分子量を有する低分子）。
したがって、本発明の免疫原性組成物、治療製剤、医薬及び予防製剤は、液体溶液又は懸濁液として注射剤として調製することができる。注射前の液体の溶液又は懸濁液に適した固体形態は、代替的に調製することができる。調製物はまた、乳化、又はリポソーム若しくはマイクロカプセル中にペプチドで被包することができる。
免疫原性有効成分（本発明の化合物又は増殖させたＮＫ細胞集団など）は、薬学的に許容され、有効成分と適合する賦形剤と混合することが多い。適した賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール等及びこれらの組合せである。加えて、必要に応じて、ワクチンは、湿潤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を増強するアジュバントのような少量の補助物質を含有してもよい。
一般に、担体は、薬学的に許容される担体である。薬学的に許容される担体の非限定的な例として、水、生理食塩水、及びリン酸緩衝食塩水が挙げられる。しかし、いくつかの実施形態では、組成物が本発明の化合物を含む場合、これは、凍結乾燥形態であってもよく、その場合、これは、ＢＳＡなどの安定剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物をチオメルサール又はアジ化ナトリウムなどの保存剤とともに処方して長期保管を容易とすることが望まれ得る。
有効であり得る追加のアジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、complete Freunds adjuvant）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、Incomplete Freunds adjuvant）、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａなどのサポニンの精製抽出分画、ＱＳ−２１などのサポニンの誘導体、ＩＳＣＯＭ／ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどのサポニンをベースとした脂質粒子、ＬＴＫ６３及び／又はＬＴＫ７２のような大腸菌（E. coli）易熱性毒素（ＬＴ、labile toxin）変異株、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、２％のスクアレン／Tween 80エマルション中の、細菌、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出した３つの成分を含有するＲＩＢＩ、Novartis社により開発されたＭＦ５９製剤、並びにGSK Biologicals社（リクサンサール、ベルギー）により開発されたＡＳ０２、ＡＳ０１、ＡＳ０３及びＡＳ０４アジュバント製剤を含むが、これらに制限されない。
緩衝剤の例としては、コハク酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、phosphate buffered saline；ｐＨ６．５及び７．５）を含むが、これらに制限されない。
他の投与方式に適する追加の製剤は、坐薬、及び場合によっては、経口製剤又はエアロゾルとしての散布に適した製剤を含む。坐薬では、従来の結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含むことができ、このような坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。
経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常利用する賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態を取る。
本発明の化合物又は産物の投与の用量範囲は、所望の治療作用を生じる範囲である。必要とされる用量範囲が、化合物の詳細な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の、性質、程度又は重症度、もしあれば禁忌、及び主治医の判断に依存することが認識される。これらの用量レベルの差異は、最適化のための標準の経験的通例を使用して調整することができる。同様に、本発明の方法、特にエクスビボでの方法における使用のための本発明の化合物又は産物の用量は、当業者により容易に決定することができ、ＮＫ細胞数の所望の増加を生じ、及び／又はＮＫ細胞の所望の増殖を誘発して、増殖させたＮＫ細胞集団を産生する任意の用量である。非限定的な例として、本発明による化合物７又は１１の用量は、約２〜約２０μＭ、約２〜約１５μＭ、約５〜約１５μＭ、約５〜約１４μＭ、約４〜約１３μＭ、約５〜約１２μＭ、約５〜約１１μＭ、又は好ましくは約５〜約１０μＭの最終濃度を生じ得る。
本発明はまた、（本明細書に記載する）増殖させたＮＫ細胞集団の製剤処方における使用を提供する。本発明の化合物の処方に関する本明細書のありとあらゆる開示は、本発明の増殖ＮＫ細胞集団の治療上の適用に等しくかつ独立して適用することができる。
配列番号の説明
配列番号１−Ｅ４ｂｐ４遺伝子配列（Ｘ６４３１８．１）
1 gcccctttct ttctcctcgt cggcccgaga gcaggaacac gataacgaag gaggcccaac
61 ttcattcaat aaggagcctg acggatttat cccagacggt agaacaaaag gaagaatatt
121 gatggatttt aaaccagagt ttttaaagag cttgagaata cggggaaatt aatttgttct
181 cctacacaca tagatagggt aaggttgttt ctgatgcagc tgagaaaaat gcagaccgtc
241 aaaaaggagc aggcgtctct tgatgccagt agcaatgtgg acaagatgat ggtccttaat
301 tctgctttaa cggaagtgtc agaagactcc acaacaggtg aggacgtgct tctcagtgaa
361 ggaagtgtgg ggaagaacaa atcttctgca tgtcggagga aacgggaatt cattcctgat
421 gaaaagaaag atgctatgta ttgggaaaaa aggcggaaaa ataatgaagc tgccaaaaga
481 tctcgtgaga agcgtcgact gaatgacctg gttttagaga acaaactaat tgcactggga
541 gaagaaaacg ccactttaaa agctgagctg ctttcactaa aattaaagtt tggtttaatt
601 agctccacag catatgctca agagattcag aaactcagta attctacagc tgtgtacttt
661 caagattacc agacttccaa atccaatgtg agttcatttg tggacgagca cgaaccctcg
721 atggtgtcaa gtagttgtat ttctgtcatt aaacactctc cacaaagctc gctgtccgat
781 gtttcagaag tgtcctcagt agaacacacg caggagagct ctgtgcaggg aagctgcaga
841 agtcctgaaa acaagttcca gattatcaag caagagccga tggaattaga gagctacaca
901 agggagccaa gagatgaccg aggctcttac acagcgtcca tctatcaaaa ctatatgggg
961 aattctttct ctgggtactc acactctccc ccactactgc aagtcaaccg atcctccagc
1021 aactccccga gaacgtcgga aactgatgat ggtgtggtag gaaagtcatc tgatggagaa
1081 gacgagcaac aggtccccaa gggccccatc cattctccag ttgaactcaa gcatgtgcat
1141 gcaactgtgg ttaaagttcc agaagtgaat tcctctgcct tgccacacaa gctccggatc
1201 aaagccaaag ccatgcagat caaagtagaa gcctttgata atgaatttga ggccacgcaa
1261 aaactttcct cacctattga catgacatct aaaagacatt tcgaactcga aaagcatagt
1321 gccccaagta tggtacattc ttctcttact cctttctcag tgcaagtgac taacattcaa
1381 gattggtctc tcaaatcgga gcactggcat caaaaagaac tgagtggcaa aactcagaat
1441 agtttcaaaa ctggagttgt tgaaatgaaa gacagtggct acaaagtttc tgacccagag
1501 aacttgtatt tgaagcaggg gatagcaaac ttatctgcag aggttgtctc actcaagaga
1561 cttatagcca cacaaccaat ctctgcttca gactctgggt aaattactac tgagtaagag
1621 ctgggcattt agaaagatgt catttgcaat agagcagtcc attttgtatt atgctgaatt
1681 ttcactggac ctgtgatgtc atttcactgt gatgtgcaca tgttgtctgt ttggtgtctt
1741 tttgtgcaca gattatgatg aagattagat tgtgttatca ctctgcctgt gtatagtcag
1801 atagtcatat gcgtaaggct gtatatatta agnttttatt tttgttgttc tattataaag
1861 tgtgtaagtt accagtttca ataaaggatt ggtgacaaac acagaaaaaa aaaaaaaaaa
1921 aaa
配列番号２−Ｅ４ｂｐ４アミノ酸配列（Ｘ６４３１８．１）
MQLRKMQTVKKEQASLDASSNVDKMMVLNSALTEVSEDSTTGEDVLLSEGSVGKNKSSACRRKREFIPDEKKDAMYWEKRRKNNEAAKRSREKRRLNDLVLENKLIALGEENATLKAELLSLKLKFGLISSTAYAQEIQKLSNSTAVYFQDYQTSKSNVSSFVDEHEPSMVSSSCISVIKHSPQSSLSDVSEVSSVEHTQESSVQGSCRSPENKFQIIKQEPMELESYTREPRDDRGSYTASIYQNYMGNSFSGYSHSPPLLQVNRSSSNSPRTSETDDGVVGKSSDGEDEQQVPKGPIHSPVELKHVHATVVKVPEVNSSALPHKLRIKAKAMQIKVEAFDNEFEATQKLSSPIDMTSKRHFELEKHSAPSMVHSSLTPFSVQVTNIQDWSLKSEHWHQKELSGKTQNSFKTGVVEMKDSGYKVSDPENLYLKQGIANLSAEVVSLKRLIATQPISASDSG
配列番号３−ＲＥＶ−ＥＲＢα遺伝子配列（ＮＭ＿０２１７２４．４）
1 gggcacgagg cgctccctgg gatcacatgg tacctgctcc agtgccgcgt gcggcccggg
61 aaccctgggc tgctggcgcc tgcgcagagc cctctgtccc agggaaaggc tcgggcaaaa
121 ggcggctgag attggcagag tgaaatatta ctgccgaggg aacgtagcag ggcacacgtc
181 tcgcctcttt gcgactcggt gccccgtttc tccccatcac ctacttactt cctggttgca
241 acctctcttc ctctgggact tttgcaccgg gagctccaga ttcgccaccc cgcagcgctg
301 cggagccggc aggcagaggc accccgtaca ctgcagagac ccgaccctcc ttgctacctt
361 ctagccagaa ctactgcagg ctgattcccc ctacacactc tctctgctct tcccatgcaa
421 agcagaactc cgttgcctca acgtccaacc cttctgcagg gctgcagtcc ggccacccca
481 agaccttgct gcagggtgct tcggatcctg atcgtgagtc gcggggtcca ctccccgccc
541 ttagccagtg cccagggggc aacagcggcg atcgcaacct ctagtttgag tcaaggtcca
601 gtttgaatga ccgctctcag ctggtgaaga catgacgacc ctggactcca acaacaacac
661 aggtggcgtc atcacctaca ttggctccag tggctcctcc ccaagccgca ccagccctga
721 atccctctat agtgacaact ccaatggcag cttccagtcc ctgacccaag gctgtcccac
781 ctacttccca ccatccccca ctggctccct cacccaagac ccggctcgct cctttgggag
841 cattccaccc agcctgagtg atgacggctc cccttcttcc tcatcttcct cgtcgtcatc
901 ctcctcctcc ttctataatg ggagcccccc tgggagtcta caagtggcca tggaggacag
961 cagccgagtg tcccccagca agagcaccag caacatcacc aagctgaatg gcatggtgtt
1021 actgtgtaaa gtgtgtgggg acgttgcctc gggcttccac tacggtgtgc acgcctgcga
1081 gggctgcaag ggctttttcc gtcggagcat ccagcagaac atccagtaca aaaggtgtct
1141 gaagaatgag aattgctcca tcgtccgcat caatcgcaac cgctgccagc aatgtcgctt
1201 caagaagtgt ctctctgtgg gcatgtctcg agacgctgtg cgttttgggc gcatccccaa
1261 acgagagaag cagcggatgc ttgctgagat gcagagtgcc atgaacctgg ccaacaacca
1321 gttgagcagc cagtgcccgc tggagacttc acccacccag caccccaccc caggccccat
1381 gggcccctcg ccaccccctg ctccggtccc ctcacccctg gtgggcttct cccagtttcc
1441 acaacagctg acgcctccca gatccccaag ccctgagccc acagtggagg atgtgatatc
1501 ccaggtggcc cgggcccatc gagagatctt cacctacgcc catgacaagc tgggcagctc
1561 acctggcaac ttcaatgcca accatgcatc aggtagccct ccagccacca ccccacatcg
1621 ctgggaaaat cagggctgcc cacctgcccc caatgacaac aacaccttgg ctgcccagcg
1681 tcataacgag gccctaaatg gtctgcgcca ggctccctcc tcctaccctc ccacctggcc
1741 tcctggccct gcacaccaca gctgccacca gtccaacagc aacgggcacc gtctatgccc
1801 cacccacgtg tatgcagccc cagaaggcaa ggcacctgcc aacagtcccc ggcagggcaa
1861 ctcaaagaat gttctgctgg catgtcctat gaacatgtac ccgcatggac gcagtgggcg
1921 aacggtgcag gagatctggg aggatttctc catgagcttc acgcccgctg tgcgggaggt
1981 ggtagagttt gccaaacaca tcccgggctt ccgtgacctt tctcagcatg accaagtcac
2041 cctgcttaag gctggcacct ttgaggtgct gatggtgcgc tttgcttcgt tgttcaacgt
2101 gaaggaccag acagtgatgt tcctaagccg caccacctac agcctgcagg agcttggtgc
2161 catgggcatg ggagacctgc tcagtgccat gttcgacttc agcgagaagc tcaactccct
2221 ggcgcttacc gaggaggagc tgggcctctt caccgcggtg gtgcttgtct ctgcagaccg
2281 ctcgggcatg gagaattccg cttcggtgga gcagctccag gagacgctgc tgcgggctct
2341 tcgggctctg gtgctgaaga accggccctt ggagacttcc cgcttcacca agctgctgct
2401 caagctgccg gacctgcgga ccctgaacaa catgcattcc gagaagctgc tgtccttccg
2461 ggtggacgcc cagtgacccg cccggccggc cttctgccgc tgcccccttg tacagaatcg
2521 aactctgcac ttctctctcc tttacgagac gaaaaggaaa agcaaaccag aatcttattt
2581 atattgttat aaaatattcc aagatgagcc tctggccccc tgagccttct tgtaaatacc
2641 tgcctccctc ccccatcacc gaacttcccc tcctccccta tttaaaccac tctgtctccc
2701 ccacaaccct cccctggccc tctgatttgt tctgttcctg tctcaaatcc aatagttcac
2761 agctgagctg gcttcaaaaa aaaaaaaaaa aaa
配列番号４−ＲＥＶ−ＥＲＢαアミノ酸配列（ＮＭ＿０２１７２４．４）
MTTLDSNNNTGGVITYIGSSGSSPSRTSPESLYSDNSNGSFQSLTQGCPTYFPPSPTGSLTQDPARSFGSIPPSLSDDGSPSSSSSSSSSSSSFYNGSPPGSLQVAMEDSSRVSPSKSTSNITKLNGMVLLCKVCGDVASGFHYGVHACEGCKGFFRRSIQQNIQYKRCLKNENCSIVRINRNRCQQCRFKKCLSVGMSRDAVRFGRIPKREKQRMLAEMQSAMNLANNQLSSQCPLETSPTQHPTPGPMGPSPPPAPVPSPLVGFSQFPQQLTPPRSPSPEPTVEDVISQVARAHREIFTYAHDKLGSSPGNFNANHASGSPPATTPHRWENQGCPPAPNDNNTLAAQRHNEALNGLRQAPSSYPPTWPPGPAHHSCHQSNSNGHRLCPTHVYAAPEGKAPANSPRQGNSKNVLLACPMNMYPHGRSGRTVQEIWEDFSMSFTPAVREVVEFAKHIPGFRDLSQHDQVTLLKAGTFEVLMVRFASLFNVKDQTVMFLSRTTYSLQELGAMGMGDLLSAMFDFSEKLNSLALTEEELGLFTAVVLVSADRSGMENSASVEQLQETLLRALRALVLKNRPLETSRFTKLLLKLPDLRTLNNMHSEKLLSFRVDAQ
配列番号５−ＲＥＶ−ＥＲＢβ遺伝子配列（ＡＢ３０７６９３．１）
1 atggaggtga atgcaggagg tgtgattgcc tatatcagtt cttccagctc agcctcaagc
61 cctgcctctt gtcacagtga gggttctgag aatagtttcc agtcctcctc ctcttctgtt
121 ccatcttctc caaatagctc taattctgat accaatggta atcccaagaa tggtgatctc
181 gccaatattg aaggcatctt gaagaatgat cgaatagatt gttctatgaa aacaagcaaa
241 tcgagtgcac ctgggatgac aaaaaatcat agtggtgtga caaaatttag tggcatggtt
301 ctactgtgta aagtctgtgg ggatgtggcg tcaggattcc actatggagt tcatgcttgc
361 gaaggctgta agggtttctt tcggagaagt attcaacaaa acatccagta caagaagtgc
421 ctgaagaatg aaaactgttc tataatgaga atgaatagga acagatgtca gcaatgtcgc
481 ttcaaaaagt gtctgtctgt tggaatgtca agagatgctg ttcggtttgg tcgtattcct
541 aagcgtgaaa aacagaggat gctaattgaa atgcaaagtg caatgaagac catgatgaac
601 agccagttca gtggtcactt gcaaaatgac acattagtag aacatcatga acagacagcc
661 ttgccagccc aggaacagct gcgacccaag ccccaactgg agcaagaaaa catcaaaagc
721 tcttctcctc catcttctga ttttgcaaag gaagaagtga ttggcatggt gaccagagct
781 cacaaggata cctttatgta taatcaagag cagcaagaaa actcagctga gagcatgcag
841 ccccagagag gagaacggat tcccaagaac atggagcaat ataatttaaa tcatgatcat
901 tgcggcaatg ggcttagcag ccattttccc tgtagtgaga gccagcagca tctcaatgga
961 cagttcaaag ggaggaatat aatgcattac ccanatggcc atgccatttg tattgcaaat
1021 ggacattgta tgaacttctc caatgcttat actcaaagag tatgtgatag agttccgata
1081 gatggatttt ctcagaatga gaacaagaat agttacctgt gcaacactgg aggaagaatg
1141 catctggttt gtccaatgag taagtctcca tatgtggatc ctcataaatc aggacatgaa
1201 atctgggaag aattttcgat gagcttcact ccagcagtga aagaagtggt ggaatttgca
1261 aagcgtattc ctgggttcag agatctctct cagcatgacc aggtcaacct tttaaaggct
1321 gggacttttg aggttttaat ggtacggttc gcatcattat ttgatgcaaa ggaacgtact
1381 gtcacctttt taagtggaaa gaaatatagt gtggatgatt tacactcaat gggagcaggg
1441 gatctgctaa actctatgtt tgaatttagt gagaagctaa atgccctcca acttagtgat
1501 gaagagatga gtttgtttac agctgttgtc ctggtatctg cagatcgatc tggaatagaa
1561 aacgtcaact ctgtggaggc tttgcaggaa actctcattc gtgcactaag gaccttaata
1621 atgaaaaacc atccaaatga ggcctctatt tttacaaaac tgcttctaaa gttgccagat
1681 cttcgatctt taaacaacat gcactctgag gagctcttgg cctttaaagt tcacccttaa
配列番号６−ＲＥＶ−ＥＲＢβアミノ酸配列（ＡＢ３０７６９３．１）
MEVNAGGVIAYISSSSSASSPASCHSEGSENSFQSSSSSVPSSPNSSNSDTNGNPKNGDLANIEGILKNDRIDCSMKTSKSSAPGMTKNHSGVTKFSGMVLLCKVCGDVASGFHYGVHACEGCKGFFRRSIQQNIQYKKCLKNENCSIMRMNRNRCQQCRFKKCLSVGMSRDAVRFGRIPKREKQRMLIEMQSAMKTMMNSQFSGHLQNDTLVEHHEQTALPAQEQLRPKPQLEQENIKSSSPPSSDFAKEEVIGMVTRAHKDTFMYNQEQQENSAESMQPQRGERIPKNMEQYNLNHDHCGNGLSSHFPCSESQQHLNGQFKGRNIMHYPXGHAICIANGHCMNFSNAYTQRVCDRVPIDGFSQNENKNSYLCNTGGRMHLVCPMSKSPYVDPHKSGHEIWEEFSMSFTPAVKEVVEFAKRIPGFRDLSQHDQVNLLKAGTFEVLMVRFASLFDAKERTVTFLSGKKYSVDDLHSMGAGDLLNSMFEFSEKLNALQLSDEEMSLFTAVVLVSADRSGIENVNSVEALQETLIRALRTLIMKNHPNEASIFTKLLLKLPDLRSLNNMHSEELLAFKVH
配列番号７−デルタ様リガンド４遺伝子配列（ＡＦ２５３４６８．１）
1 atggcggcag cgtcccggag cgcctctggc tgggcgctac tgctgctggt ggcactttgg
61 cagcagcgcg cggccggctc cggcgtcttc cagctgcagc tgcaggagtt catcaacgag
121 cgcggcgtac tggccagtgg gcggccttgc gagcccggct gccggacttt cttccgcgtc
181 tgccttaagc acttccaggc ggtcgtctcg cccggaccct gcaccttcgg gaccgtctcc
241 acgccggtat tgggcaccaa ctccttcgct gtccgggacg acagtagcgg cggggggcgc
301 aaccctctcc aactgccctt caatttcacc tggccgggta ccttctcgct catcatcgaa
361 gcttggcacg cgccaggaga cgacctgcgg ccagaggcct tgccaccaga tgcactcatc
421 agcaagatcg ccatccaggg ctccctagct gtgggtcaga actggttatt ggatgagcaa
481 accagcaccc tcacaaggct gcgctactct taccgggtca tctgcagtga caactactat
541 ggagacaact gctcccgcct gtgcaagaag cgcaatgacc acttcggcca ctatgtgtgc
601 cagccagatg gcaacttgtc ctgcctgccc ggttggactg gggaatattg ccaacagcct
661 atctgtcttt cgggctgtca tgaacagaat ggctactgca gcaagccagc agagtgcctc
721 tgccgcccag gctggcaggg ccggctgtgt aacgaatgca tcccccacaa tggctgtcgc
781 cacggcacct gcagcactcc ctggcaatgt acttgtgatg agggctgggg aggcctgttt
841 tgtgaccaag atctcaacta ctgcacccac cactccccat gcaagaatgg ggcaacgtgc
901 tccaacagtg ggcagcgaag ctacacctgc acctgtcgcc caggctacac tggtgtggac
961 tgtgagctgg agctcagcga gtgtgacagc aacccctgtc gcaatggagg cagctgtaag
1021 gaccaggagg atggctacca ctgcctgtgt cctccgggct actatggcct gcattgtgaa
1081 cacagcacct tgagctgcgc cgactccccc tgcttcaatg ggggctcctg ccgggagcgc
1141 aaccaggggg ccaactatgc ttgtgaatgt ccccccaact tcaccggctc caactgcgag
1201 aagaaagtgg acaggtgcac cagcaacccc tgtgccaacg ggggacagtg cctgaaccga
1261 ggtccaagcc gcatgtgccg ctgccgtcct ggattcacgg gcacctactg tgaactccac
1321 gtcagcgact gtgcccgtaa cccttgcgcc cacggtggca cttgccatga cctggagaat
1381 gggctcatgt gcacctgccc tgccggcttc tctggccgac gctgtgaggt gcggacatcc
1441 atcgatgcct gtgcctcgag tccctgcttc aacagggcca cctgctacac cgacctctcc
1501 acagacacct ttgtgtgcaa ctgcccttat ggctttgtgg gcagccgctg cgagttcccc
1561 gtgggcttgc cgcccagctt cccctgggtg gccgtctcgc tgggtgtggg gctggcagtg
1621 ctgctggtac tgctgggcat ggtggcagtg gctgtgcggc agctgcggct tcgacggccg
1681 gacgacggca gcagggaagc catgaacaac ttgtcggact tccagaagga caacctgatt
1741 cctgccgccc agcttaaaaa cacaaaccag aagaaggagc tggaagtgga ctgtggcctg
1801 gacaagtcca actgtggcaa acagcaaaac cacacattgg actataatct ggccccaggg
1861 cccctggggc gggggaccat gccaggaaag tttccccaca gtgacaagag cttaggagag
1921 aaggcgccac tgcggttaca cagtgaaaag ccagagtgtc ggatatcagc gatatgctcc
1981 cccagggact ccatgtacca gtctgtgtgt ttgatatcag aggagaggaa tgaatgtgtc
2041 attgccacgg aggtataa
配列番号８−デルタ様リガンド４アミノ酸配列（ＡＦ２５３４６８．１）
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSFPWVAVSLGVGLAVLLVLLGMVAVAVRQLRLRRPDDGSREAMNNLSDFQKDNLIPAAQLKNTNQKKELEVDCGLDKSNCGKQQNHTLDYNLAPGPLGRGTMPGKFPHSDKSLGEKAPLRLHSEKPECRISAICSPRDSMYQSVCLISEERNECVIATEV
配列番号９−ヒトＮｏｔｃｈ１ ｃＤＮＡ配列（ＣＲ４５７２２１．１）
1 atgtcaaaca tgagatgtgt ggactgtggc acttgcctgg gtcacacacg gaggcatcct
61 acccttttct ggggaaagac actgcctggg ctgaccccgg tggcggcccc agcacctcag
121 cctgcacagt gtcccccagg ttccgaagaa gatgctccag caacacagcc tgggccccag
181 ctcgcgggac ccgacccccc gtgggctccc gtgttttgta ggagacttgc cagagccggg
241 cacattgagc tgtgcaacgc cgtgggctgc gtcctttggt cctgtccccg cagccctggc
301 agggggcatg cggtcgggca ggggctggag ggaggcgggg gctgcccttg ggccacccct
361 cctagtttgg gaggagcaga tttttgcaat accaagtata gcctatggca gaaaaaatgt
421 ctttaa
配列番号１０−ヒトＮｏｔｃｈ１タンパク質配列（ＣＲ４５７２２１．１）
MSNMRCVDCGTCLGHTRRHPTLFWGKTLPGLTPVAAPAPQPAQCPPGSEEDAPATQPGPQLAGPDPPWAPVFCRRLARAGHIELCNAVGCVLWSCPRSPGRGHAVGQGLEGGGGCPWATPPSLGGADFCNTKYSLWQKKCL
［実施例］
本発明を以下の実施例によりさらに明らかにするが、これは、純粋に本発明の例示であり、制限では決してないことを意図する。
新たな化合物の設計
未変化のＳＲ８２７８の中心的足場及びエステル置換基を維持して、発明者らは、はじめに、チオフェン環を置換ベンゼン環により置換した、化合物１〜３を設計した。このような化合物の分析及び特性決定により、次の化合物：アルコキシ鎖を有する４〜５、単純ヘテロ芳香族５員環を有する６〜１０及びヒンダードヘテロ芳香族５員環を有する１１〜１３を設計した。このような化合物の合成については、これらの特性決定とともに、以下の関連する節に記載する。すべての化合物は、（ＳＲ８２７８及び誘導体についての文献と一致するように）合成してラセミ化合物として試験した。
Figure 2021528969
反応条件：（ａ）ＥｔＯＨ、濃縮Ｈ２ＳＯ４、灌流、一晩。（ｂ）Ａについて＝Ｃｌ、ＴＥＡ、ＤＣＭ、ｒｔ、一晩；Ａについて＝ＯＨ、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＴＥＡ、ＤＭＦ、ｒｔ、一晩。
１の調製のために記載のものと類似の手順に従って、硫酸を触媒として使用したメタノール（ＭｅＯＨ）中のカルボン酸のエステル化、及びＴＥＡを塩基として使用した３，４−ジクロロベンゾイルクロリドによる中間体１６の縮合により、エチルエステル１４を得た。化合物１５は、１から調製した。これまでに記載したように、エステル基の加水分解は、塩基性条件を使用して実施し、アミド基の導入は、エタノールアミンによるＥＤＣ／ＨＯＢｔカップリングにより達成した。
Figure 2021528969
合成条件：（ａ）ＭｅＯＨ、Ｈ２ＳＯ４、灌流、一晩：（ｂ）３，４−ジクロロベンゾイルクロリド、ＴＥＡ、ＤＭＣ、ｒｔ、一晩：（ｃ）ＮａＯＨ ２．０Ｍ、ＭｅＯＨ：Ｈ２０（８０：２０）、ｒｔ、４時間；（ｄ）エチルアミン、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＴＥＡ、ＤＭＦ、ｒｔ、一晩。
化合物１６〜６３及び７６を、スキーム３に従って得た。
Figure 2021528969
反応条件：（ａ）ＥｔＯＨ、濃縮Ｈ２ＳＯ４、灌流、１６時間。（ｂ）Ｔ３Ｐ、ＤＩＰＥＡ、ＴＨＦ、ｒｔ、１６時間。
化合物６４〜７５を、スキーム４に従って得た。
Figure 2021528969
反応条件：Ｂについて＝−ＯＣ（Ｏ）Ｃｌ又は−ＮＣＯ（すなわち６４〜６６及び７０について）、ＤＣＭ、ＴＥＡ、ｒｔ、１８時間；Ｂについて＝−ＣＯＯＨ（すなわち６７、６９、７１、７２及び７５について）、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＴＥＡ、ＤＭＦ、ｒｔ、１８時間；Ｂについて＝−Ｃ（Ｏ）Ｈ（すなわち６８、７３及び７４について）、ＡｃＯＨ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３、ＤＣＥ又はＤＣＭ、ｒｔ、７２時間。
エチル１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、中間体（Ｉｎｔ．）
無水エタノール（２５ｍＬ）中の１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（１．００ｇ、４．６８ｍｍｏｌ）の溶液を室温（ｒｔ）及びＮ２雰囲気下で、濃縮Ｈ２ＳＯ４（１．００ｍＬ、７．１５ｍｍｏｌ）により処理し、反応混合物を、分子ふるい４Åの存在下で１８時間灌流させながら撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残余物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（３０ｍＬ）中に再懸濁して飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ、３×１５ｍＬ）及び鹹水（３×１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）、ろ過、並びに減圧下で蒸発させた。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、３：１、Ｒｆ：０．５１）により精製してＩｎｔ．を黄色の油（６５０ｍｇ、６７％）として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝７．２０〜７．１２（ｍ，３Ｈ，Ａｒ）、７．０９〜７．０４（ｍ，１Ｈ，Ａｒ）、４．２６（ｑ，Ｊ＝７．１，２Ｈ，Ｈ２）、４．１７（ｄ，Ｊ＝１６．２，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．１１（ｄ，Ｊ＝１６．２，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、３．７６（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，４．６，１Ｈ，Ｈ４）、３．１２（ｄｄ，Ｊ＝１８．０，１６．２，１Ｈ，Ｈ５ｉ）、２．９８（ｄｄ，Ｊ＝１８．０，１６．２，１Ｈ，Ｈ５ｉｉ）、２．１３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、１．３３（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（ＣＤＣｌ３）δ＝１７３．２１（Ｃ３）、１３５．９０、１３３．８２、１２９．３４、１２６．３８、１２６．２６、１２６．２０、６０．６８（Ｃ２）、５５．５５（Ｃ４）、４６．９７（Ｃ１２）、３１．５０（Ｃ５）、１４．５７（Ｃ１）；ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝１．７３分；ｍ／ｚ ２０６．２９（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１２Ｈ１６ＮＯ２の計算値：２０６．１１８１；実測値：２０６．１１７５。
エチル２−（３，４−ジクロロベンゾイル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン３−カルボキシレート、化合物１
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のＩｎｔ．（２００ｍｇ、０．９６４ｍｍｏｌ）の溶液を０°及びＮ２雰囲気下で、ＴＥＡ（０．２０ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）により処理した。この混合物に、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の３，４−ジクロロベンゾイルクロリド（２０２ｍｇ、０．９６４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、反応混合物を一晩、室温に温めて置いた。溶媒を減圧下で除去し、残余物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（３０ｍＬ）中に再懸濁して１．０ＭのＨＣｌ（２×１５ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（３×１５ｍＬ）及び鹹水（３×１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）、ろ過、並びに減圧下で蒸発させた。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、５：１、Ｒｆ：０．４０）により精製して、白色の固体（２２５ｍｇ；収率：６２％）として１を得た。回転異性体の比率は、５．４：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝７．８１（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ，Ｈ１８）、７．７２（ｓ，１Ｈ，Ｈ１５）、７．４７（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ，Ｈ１９）、７．３３〜７．０９（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、５．１２（ｔ，Ｊ＝５．３，１Ｈ，Ｈ４）、４．５９（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．５２（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．０６（ｑ，Ｊ＝７．０，２Ｈ，Ｈ２）、３．２８（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、１．１１（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ，Ｈ１）。回転異性体Ｂ δ＝７．７６（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ，Ｈ１８）、７．６７（ｓ，１Ｈ，Ｈ１５）、７．４０（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ，Ｈ１９）、７．３３〜７．０９（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、４．９７（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．８０（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ４）、４．４６（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、３．９８（ｑ，Ｊ＝７．０，２Ｈ，Ｈ２）、３．１８（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、１．００（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７０．２７（Ｃ３）、１７０．０９（Ｃ３）、１６８．５６（Ｃ１３）、１６７．７６（Ｃ１３）、１３６．３８、１３６．１６、１３３．１１、１３２．７５、１３２．４９、１３１．９０、１３１．６１、１３１．５６、１３１．１０、１２８．９４、１２８．６２、１２８．２８、１２７．８１、１２７．１６、１２６．７７、１２６．６６、１２６．５４、１２５．９７、６１．２０（Ｃ２）、６０．７５（Ｃ２）、５６．２１（Ｃ４）、５２．７２（Ｃ４）、４７．４５（Ｃ１２）、４３．０９（Ｃ１２）、３０．６６（Ｃ５）、３０．１８（Ｃ５）、１３．９５（Ｃ１）、１３．８３（Ｃ１）；ＬＣ−ＭＳ（５０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝７．４９分；ｍ／ｚ ３７８．２６（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ１８ＮＯ３Ｃｌ２の計算値：３７８．０６６４；実測値：３７８．０６７７。
エチル２−（３，４−ジフルオロベンゾイル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン３−カルボキシレート、化合物２
化合物２は、３，４−ジフルオロベンゾイルクロリド（０．３０ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を使用して、化合物１のために記載する手順に従ってｉｎｔ．（５００ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、５：１、Ｒｆ：０．３７）により精製して、経時的に結晶化する淡黄色の油（５４７ｍｇ；収率：６６％）として２を得た。回転異性体の比率は、５：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝７．６３〜７．０５（ｍ，８Ｈ）、５．０９（ｔ，Ｊ＝５．３，１Ｈ，Ｈ４）、４．５８（ｄ，Ｊ ＝１５．６，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．５１（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．０４（ｑ，Ｊ＝６．９，２Ｈ，Ｈ２）、３．２５（ｄｄ，Ｊ＝１５．８，５．９，２Ｈ，Ｈ５）、１．０９（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ，Ｈ１）。回転異性体Ｂ δ＝７．６３〜７．０５（ｍ，８Ｈ）、４．９５（ｄ，Ｊ＝１７．６，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．７８（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ４）、４．４２（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、３．９６（ｑ，Ｊ＝７．０，２Ｈ，Ｈ２）、３．１６（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、０．９７（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７０．３４（Ｃ３）、１７０．０９（Ｃ３）、１６８．８４（Ｃ１３）、１６７．９６（Ｃ１３）、１５０．３５（Ｃ１６）、１５０．２５（Ｃ１６）、１４８．３９（Ｃ１７）、１４８．２８（Ｃ１７）、１３３．１７、１３３．００、１３２．７８、１３１．８８、１３１．６５、１２９．３６、１２８．３２、１２７．８４、１２７．４６、１２７．１６、１２６．６６、１２６．５６、１２５．９４、１２４．４２、１２３．９４、１１８．１５、１１８．０１、１１６．７６、１１６．６２、１１６．４１、１１６．２７、６１．１９（Ｃ２）、６０．７３（Ｃ２）、５６．２４（Ｃ４）、５２．７８（Ｃ４）、４７．５６（Ｃ１２）、４３．１２（Ｃ１２）、３０．６３（Ｃ５）、３０．２１（Ｃ５）、１３．９５（Ｃ１）、１３．８１（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（５０〜９８％ ＭｅＣＮ）ｒｔ＝７．３１分；ｍ／ｚ ３４６．２２（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ１８ＮＯ３Ｆ２の計算値：３４６．１２５５；実測値：３４６．１２６４。
エチル２−（４−フルオロベンゾイル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、化合物３
化合物３は、４−フルオロベンゾイルクロリド（０．１９ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を使用して、化合物１のために記載する手順に従ってｉｎｔ．（３３０ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、３：１、Ｒｆ：０．２１）により精製した後、Ｉｓｏｌｅｒａ上でｎ−Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃのスローグラジエント法（２〜９８％ＥｔＯＡｃ）を行って、経時的に結晶化する透明な油（３１５ｍｇ；収率：６１％）として３を得た。回転異性体の比率は、５．４：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝７．６４〜７．０３（ｍ，８Ｈ，Ａｒ）、５．１５（ｔ，Ｊ＝４．７，１Ｈ，Ｈ４）、４．６２（ｄ，Ｊ＝１６．０，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．５４（ｄ，Ｊ＝１６．０，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．０７（ｑ，Ｊ＝６．７，２Ｈ，Ｈ２）、３．２８（ｄｄ，Ｊ＝１５．８，５．９，２Ｈ，Ｈ５）、１．１２（ｔ，Ｊ＝６．７，３Ｈ，Ｈ１）。回転異性体Ｂ δ＝７．６４〜７．０３（ｍ，８Ｈ，Ａｒ）、５．０１（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．７８（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ４）、４．４８（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、３．９７（ｑ，Ｊ＝６．７，２Ｈ，Ｈ２）、３．１８（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、０．９９（ｔ，Ｊ＝６．７，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７０．４７（Ｃ３）、１７０．２３（Ｃ３）、１７０．１４（Ｃ１３）、１６９．１９（Ｃ１３）、１３３．２５、１３２．８６、１３１．８４、１２９．５３、１２９．１１、１２８．３０、１２７．８８、１２７．１４、１２６．６６、１２５．８７、１１５．７６、１１５．５９、６１．１４（Ｃ２）、６０．６８（Ｃ２）、５６．３３（Ｃ４）、５２．７０（Ｃ４）、４７．６７（Ｃ１２）、４３．１３（Ｃ１２）、３０．７５（Ｃ５）、３０．１９（Ｃ５）、１３．９６（Ｃ１）、１３．８２（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（５０〜９８％ ＭｅＣＮ）ｒｔ＝６．４２分；ｍ／ｚ ３２８．２１（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ１９ＮＯ３Ｆの計算値：３２８．１３４９；実測値：３２８．１３４９。
ジエチル３，４−ジヒドロイソキノリン−２，３（１Ｈ）−ジカルボキシレート、化合物４
化合物４は、クロロギ酸エチル（０．０５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を使用して、化合物１のために記載する手順に従ってＩｎｔ．（１１０ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、３：２、Ｒｆ：０．３６）により精製して、淡黄色の油（２３５ｍｇ；収率：８７％）として４を得た。回転異性体の比率は、５：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝７．２４〜７．０７（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、５．１３（ｄｄ，Ｊ＝６．０，３．２，１Ｈ，Ｈ４）、４．７７〜４．７３（ｄ，Ｊ＝１６．０，２Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．５７〜４．５３（ｄ，Ｊ＝１６．０，２Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．２１（ｍ，２，Ｈ１４）、４．０７（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２８〜３．１５（ｄｄ，Ｊ＝３８．０，１６．０，２Ｈ，Ｈ５）、１．３３（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ，Ｈ１５）、１．１１（ｍ，３Ｈ，Ｈ１）。回転異性体Ｂ δ＝７．２４〜７．０７（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、４．９０（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、４．７８〜４．７４（ｄ，Ｊ＝１６．０，２Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．６０〜４．５６（ｄ，Ｊ＝１６．０，２Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．２１（ｍ，２Ｈ，Ｈ１４）、４．０７（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２７〜３．１３（ｄｄ，Ｊ＝３８．０，１６．０，２Ｈ，Ｈ５）、１．２５（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ，Ｈ１５）、１．１１（ｍ，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１６７．５９（Ｃ３）、１５７．２１（Ｃ１３）、１４４．６５、１３２．０４、１２９．８２、１２７．９０、１２７．１３、１２６．６５、６８．５６、６６．６２、６１．１３、５３．９３（Ｃ４）、４４．５９（Ｃ１２）、３１．３３（Ｃ５）、１４．４１（Ｃ１５）、１４．３２（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ ＭｅＣＮ）ｒｔ＝１０．３５分；ｍ／ｚ ２７８．２１（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１５Ｈ２０ＮＯ４の計算値：２７８．１３９２；実測値：２７８．１３９６。
２−ｔｅｒｔ−ブチル３−エチル３，４−ジヒドロイソキノリン−２，３（１Ｈ）−ジカルボキシレート、化合物５
化合物５は、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルデカルボネート（Ｂｏｃ無水物）（２５２ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．２０ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を使用して、無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＩｎｔ（２００ｍｇ、０．９６４ｍｍｏｌ）から調製した。反応混合物をＮ２雰囲気下、ｒｔで一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残余物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（３０ｍＬ）中に再懸濁して飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ、３×１５ｍＬ）及び鹹水（３×１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）、ろ過、並びに減圧下で蒸発させた。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、５：１、Ｒｆ：０．５６）により精製して、透明な油（２３３ｍｇ；収率：７９％）として５を得た。回転異性体の比率は、５：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝７．３７〜６．９７（ｍ，４Ｈ，Ａｒ）、４．７２〜４．６４（ｔ，Ｊ＝４．７，１Ｈ，Ｈ４）、４．６６〜４．３８（ｍ，２Ｈ，Ｈ１２）、４．０６〜４．０１（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２０〜３．０４（ｄｄ，Ｊ＝４８．０，１５．１，１Ｈ，Ｈ５ｉ）、３．３．２１〜３．０３（ｄｄ，Ｊ＝６０．０，１２．１，１Ｈ，Ｈ５ｉｉ）、１．３９（ｓ，９Ｈ，Ｈ１５）、１．０８（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ，Ｈ１）。回転異性体Ｂ δ＝７．３７〜６．９７（ｍ，４Ｈ，Ａｒ）、４．９１（ｔ，Ｊ＝４．７，１Ｈ，Ｈ４）、４．６６〜４．３８（ｍ，２Ｈ，Ｈ１２）、４．０１〜３．９５（ｑ，Ｊ＝８．０，４．０，２Ｈ，Ｈ２）、３．１４（ｄ，Ｊ＝４．６，２Ｈ，Ｈ５）、１．４７（ｓ，９Ｈ，Ｈ１５）、１．０６〜１．０１（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７１．９５（Ｃ３）、１７１．４８（Ｃ３）、１５５．０８（Ｃ１３）、１５４．５２（Ｃ１３）、１３４．４４、１３３．４４、１３３．０８、１３２．４０、１２８．５７、１２８．０８、１２７．３３、１２７．１０、１２６．６５、１２６．５５、８０．２４（Ｃ１４）、８０．０４（Ｃ１４）、６１．０３（Ｃ２）、５４．５０（Ｃ４）、５２．９５（Ｃ４）、４４．７６（Ｃ１２）、４４．１５（Ｃ１２）、３１．４４（Ｃ５）、３１．２２（Ｃ５）、２８．５２（Ｃ１５）、２８．３５（Ｃ１５）、１４．５０（Ｃ１）、１４．４０（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ ＭｅＣＮ）ｒｔ＝７．５９分；ｍ／ｚ ３０６．３１（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ２４ＮＯ４の計算値：３０６．１７０５；実測値：３０６．１７０７。
エチル２−（チオフェン−２−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、化合物６
化合物６は、２−チオフェンカルボニルクロリド（０．１３ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を使用して、化合物１のために記載する手順に従ってＩｎｔ．（２３０ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、３：１、Ｒｆ：０．３１）により精製した後、Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮのスローグラジエント法（２〜９８％ＭｅＣＮ）による逆相Ｉｓｏｌｅｒａを行って（２７１ｍｇ；収率：７７％）黄色の油（１４５ｍｇ；収率：−）として６を得た。回転異性体の比率は、５：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）では、非常に急速に分解され、ＮＭＲの評価が不可能であり、１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）では、非常に急速に分解され、ＮＭＲの評価が不可能であった。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ ＭｅＣＮ）ｒｔ＝１１．０９分；ｍ／ｚ ３１６．１９（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ１８ＮＯ３Ｓの計算値：３１６．１００７；実測値：３１６．１０１６。
エチル２−（フラン−２−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、化合物７
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の２−フロ酸（１６１ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の溶液をＴＥＡ（０．２７ｍＬ、１．９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣカップリング剤（２５７ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１８１ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）により処理し、ｒｔで５分間、撹拌して置いた。この混合物に、Ｉｎｔ．（２００ｍｇ、０．９６０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をＮ２雰囲気下、ｒｔで一晩、撹拌して置いた。ｄＨ２Ｏ ６０ｍＬを加えて反応を停止させ、産物をＥｔＯＡｃ（３×１５ｍＬ）により抽出した。すべての有機画分をともに混合させ、５％のＬｉＣｌ（３×１５ｍＬ）で洗浄して、微量のＤＭＦ、ＮａＨＣＯ３（３×１５ｍＬ）及び鹹水（３×１５ｍＬ）を除去し、乾燥（ＭｇＳＯ４）、ろ過、並びに減圧下で蒸発させた。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、３．５：１、Ｒｆ：０．２２）により精製して、淡黄色の油（２６６ｍｇ；収率：９３％）として７を得た。回転異性体の比率は、室温での１Ｈ ＮＭＲにおいてシグナルが融合して現れたため、評価が不可能であった。１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝８．１６〜７．７７（ｄ，Ｊ＝４４．０，１Ｈ，Ｈ１５）、７．３７〜７．００（ｍ，５Ｈ，Ｈ７〜１０，Ｈ１６），）、６．６９（ｄ，Ｊ＝２２．３，１Ｈ，Ｈ１７）、５．４４（ｂｒ，０．３５Ｈ，Ｈ４ｂ）、５．１３（ｂｒ，０．６５Ｈ，Ｈ４ａ）、５．１１〜５．０７（ｄ，Ｊ＝１６．０，０．６Ｈ，Ｈ１２ａｉ）、４．９３〜４．８９（ｄ，Ｊ＝１６．０，０．６Ｈ，Ｈ１２ａｉｉ）、４．８３〜４．７９（ｄ，Ｊ＝１６．０，０．４Ｈ，Ｈ１２ｂｉ）、４．５９〜４．５５（ｄ，Ｊ＝１６．０，０．４Ｈ，Ｈ１２ｂｉｉ）、４．００（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２４（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ５）、１．０２（ｓ，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７１．３０（Ｃ３）、１７０．９２（Ｃ３）、１５９．８６（Ｃ１３）、１５９．６７（Ｃ１３）、１４７．６７、１４７．０５、１４６．０３、１４５．６６、１３３．６５、１３３．２０、１３２．８７、１３２．７６、１２８．２６、１２７．５３、１２７．２４、１２６．８９、１２６．６１、１１７．３５（Ｃ１７）、１１６．８７（Ｃ１７）、１１２．０６（Ｃ１６）、６１．３８（Ｃ２）、６１．０９（Ｃ２）、５５．９２（Ｃ４）、５３．４９（Ｃ４）、４７．０９（Ｃ１２）、４４．４６（Ｃ１２）、３２．１１（Ｃ５）、３０．９９（Ｃ５）、１４．３７（Ｃ１）；ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ ＭｅＣＮ）ｒｔ＝４．１６分；ｍ／ｚ ３００．３３（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ１８ＮＯ４の計算値：３００．１２３６；実測値：３００．１２４７。
エチル２−（イソオキサゾール−５−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン３−カルボキシレート、化合物８
化合物８は、５−カルボニルクロリド（０．３１ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を使用して、化合物１のために記載する手順に従ってＩｎｔ．（３７５ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、１：１、Ｒｆ：０．７３及びｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、３：１、Ｒｆ：０．２４）により精製して、淡黄色の油（３９５ｍｇ；収率：６９％）として８を得た。回転異性体の比率は、４．７：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝８．８２（ｄ，Ｊ＝３２．９，１Ｈ，Ｈ１６）、７．３４〜７．２１（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、７．０９（ｄ，Ｊ＝７１．４，１Ｈ，Ｈ１５）、５．２０（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、４．９３〜４．８９（ｄ，Ｊ＝１５．７，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．８３〜４．７９（ｄ，Ｊ＝１５．７，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ，４．０２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２６（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、１．０６（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ，Ｈ１）。回転異性体Ｂ δ＝８．８２（ｄ，Ｊ＝３２．９，１Ｈ，Ｈ１６）、７．３４〜７．２１（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、７．０９（ｄ，Ｊ＝７１．４，１Ｈ，Ｈ１５）、５．２０（ｍ，１Ｈ，Ｈ４）、４．８４（ｍ，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．６５〜４．６１（ｄ，Ｊ＝１５．７，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．０２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２６（ｍ，２Ｈ，ＭＲｅｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１７ Ｈ５）、０．９９（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７０．６６（Ｃ３）、１７０．３２（Ｃ３）、１６２．６８（Ｃ１３）、１６２．２０（Ｃ１３）、１５８．７４（Ｃ１４）、１５８．３０（Ｃ１４）、１５１．６７（Ｃ１５）、１５１．５４（Ｃ１５）、１３３．１０、１３２．５３、１３２．３３、１２８．３９、１２８．２７、１２７．７７、１２７．４５、１２７．３４、１２６．９９、１２６．６４、１０７．９０（Ｃ１６）、１０７．５６（Ｃ１６）、６１．６７（Ｃ２）、６１．３２（Ｃ２）、５６．０７（Ｃ４）、５３．６７（Ｃ４）、４６．９７（Ｃ１２）、４４．５１（Ｃ１２）、３１．８４（Ｃ５）、３０．８０（Ｃ５）、１４．３７（Ｃ１）、１４．２６（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝１０．０３分；ｍ／ｚ ３０１．３１（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１６Ｈ１６Ｎ２Ｏ４の計算値：３０１．１１８８；実測値：３０１．１１８９。
エチル２−（オキサゾール−５−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、化合物９
化合物９は、１，３−オキサゾール−５−カルボン酸（１５０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を使用して、化合物７のために記載するＥＤＣカップリング手順に従ってＩｎｔ．（３２５ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、１．５：１、Ｒｆ：０．４２）により精製した後、逆相Ｉｓｏｌｅｒａ上でＨ２Ｏ：ＭｅＣＮのスローグラジエント法（２〜９８％ＭｅＣＮ）を行って、透明な油（３２０ｍｇ；収率：６８％）として９を得た。回転異性体の比率は、ほとんどのシグナルが融合して現れたため、評価が困難であった。ピークのいくつかは、別々に現れて７．６：４の比率を示し、これは室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝８．６７（ｓ，１Ｈ，Ｈ１５）、８．０３（ｓ，１Ｈ，Ｈ１６）、７．３２〜７．２１（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、５．２０（ｔ，Ｊ＝５．３，１Ｈ，Ｈ４）、５．０４（ｄ，Ｊ＝１５．４，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．９２（ｄ，Ｊ＝１５．５，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．０６〜３．９５（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２３（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ５）、１．０１（ｂｒ，３Ｈ，Ｈ１）。回転異性体Ｂ δ＝８．５９（ｓ，１Ｈ，Ｈ１５）、７．７５（ｓ，１Ｈ，Ｈ１６）、７．３２〜７．２１（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、５．４０（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ４）、４．８３（ｄ，Ｊ＝１７．２，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．５９（ｄ，Ｊ＝１７．２，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．０６〜３．９５（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２７（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ５）、１．０１（ｂｒ，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７０．９９（Ｃ３）、１７０．６３（Ｃ３）、１５８．７５（Ｃ１３）、１５８．２９（Ｃ１３）、１５４．２８（Ｃ１５）、１５３．７８（Ｃ１５）、１４４．８９（Ｃ１４）、１４４．４６（Ｃ１４）、１３３．１９、１３３．００、１３２．７４、１３２．０１、１３１．３６、１２８．２８、１２７．６０、１２７．２８、１２６．９４、１２６．７４、６１．５７（Ｃ２）、６１．１８（Ｃ２）、５５．８２（Ｃ４）、５３．３６（Ｃ４）、４６．８１（Ｃ１２）、４４．４１（Ｃ１２）、３１．９６（Ｃ５）、３０．９８（Ｃ５）、１４．５３（Ｃ１）、１４．３４（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝８．９５分；ｍ／ｚ ３０１．３１（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１６Ｈ１６Ｎ２Ｏ４の計算値：３０１．１１８８；実測値：３０１．１２０１。
エチル２−（チアゾール−５−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン３−カルボキシレート、化合物１０
化合物１０は、１，３−チアゾール−５−カルボン酸（１５０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を使用して、化合物７のために記載するＥＤＣカップリング手順に従ってＩｎｔ．（２８６ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、２：３、Ｒｆ：０．３７）により精製して、透明な油（１２５ｍｇ；収率：３５％）として１０を得た。回転異性体の比率は、室温での１Ｈ ＮＭＲにおいてピークが融合して現れたため、評価が不可能であった。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝９．３２（ｓ，１Ｈ，Ｈ１５）、８．５６〜８．０６（ｍ，１Ｈ，Ｈ１６）、７．２９〜７．１８（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、５．１９（ｓ，１Ｈ，Ｈ４）、４．９６（ｍ，１．７Ｈ，Ｈ１２ａ，Ｈ１２ｂｉ）、４．５３（ｄ，Ｊ＝１３．６，０．３Ｈ，Ｈ１２ｂｉｉ）、４．０１（ｑ，Ｊ＝８，２Ｈ，Ｈ２）、３．２４（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ５）、１．１０（ｂｒ，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１６３．０１（Ｃ３）、１６２．１０（Ｃ３）、１５８．２３（Ｃ１３）、１５７．４９（Ｃ１３）、１４５．０６（Ｃ１５）、１４３．６８（Ｃ１５）、１３３．３８、１３３．０５、１３２．５２、１２９．３６、１２８．６６、１２８．２７、１２７．６０、１２７．２４、１２６．７４、１２５．７７、６１．７３（Ｃ２）、６１．１９（Ｃ２）、５７．０４（Ｃ４）、５３．８６（Ｃ４）、４８．０８（Ｃ１２）、４４．４５（Ｃ１２）、３１．５８（Ｃ５）、３１．０２（Ｃ５）、１４．３５（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝９．３８分；ｍ／ｚ ３１７．２３（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１６Ｈ１７Ｎ２Ｏ３Ｓの計算値：３１７．０９６０；実測値：３１７．０９６８。
エチル２−（４−メチルオキサゾール−５−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、化合物１１
化合物１１は、４−メチルオキサゾール−５−カルボン酸（１５０ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を使用して、化合物７のために記載するＥＤＣカップリング手順に従ってＩｎｔ．（２９１ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎＨｅｘ対ＥｔＯＡｃ、１：１、Ｒｆ：０．２０）により精製して、透明な油（２１６ｍｇ；収率：５８％）として１１を得た。回転異性体の比率は、ほとんどのシグナルが融合して現れたため、評価が困難であった。ピークのいくつかは、別々に現れて４．７：４の比率を示し、これは室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝８．５３（ｓ，０．５５Ｈ，Ｈ１５ａ）、８．４２（ｓ，０．４５Ｈ，Ｈ１５ｂ）、７．２３（ｂｒ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、５．２６（ｂｒ，０．４５Ｈ，Ｈ４ｂ）、５．０７（ｂｒ，０．５５Ｈ，Ｈ４ａ）、４．９２（ｄ，Ｊ＝１６．０，０．４５Ｈ，Ｈ１２ｂｉ）、４．８０（ｍ，１．１Ｈ，Ｈ１２ａ）、４．５６（ｄ，Ｊ＝１６．０，０．４５Ｈ，Ｈ１２ｂｉｉ）、４．０３（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、２．３３（ｓ，３Ｈ，Ｈ１７）、１．０８〜０．９９（ｍ，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７１．４５（Ｃ３）、１７０．７４（Ｃ３）、１５９．７４（Ｃ１３）、１５８．０１（Ｃ１３）、１５２．２１（Ｃ１５）、１５１．９２（Ｃ１５）、１３９．８６、１３９．３９、１３４．５９、１３４．０８、１３２．９８、１３２．４４、１２９．３５、１２８．６５、１２８．２８、１２７．８９、１２７．５９、１２７．２３、１２５．７６、６１．２３（Ｃ２）、５５．７４（Ｃ４）、５３．５３（Ｃ４）、４６．６７（Ｃ１２）、４４．３８（Ｃ１２）、３２．０４（Ｃ５）、３０．７４（Ｃ５）、１４．３５（Ｃ１）、１３．１８（Ｃ１７）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝９．５５分；ｍ／ｚ ３１５．２８（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ１９Ｎ２Ｏ４の計算値：３１５．１３４５；実測値：３１５．１３５２。
エチル２−（４−メチルチアゾール−５−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、化合物１２
化合物１２は、４−メチルチアゾール−５−カルボン酸（１５０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を使用して、化合物７のために記載するＥＤＣカップリング手順に従ってＩｎｔ．（２５７ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎＨｅｘ対ＥｔＯＡｃ、２：３、Ｒｆ：０．４３）により精製して、透明な油（１９６ｍｇ；収率：６０％）として１２を得た。回転異性体の比率は、ほとんどのシグナルが融合して現れたため、評価が困難であった。ピークのいくつかは、別々に現れて７．２：４の比率を示し、これは室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）＝９．１８（ｓ，１Ｈ，Ｈ１５）、７．２２（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、５．１６（ｂｒ，ＭＲｅｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１７ ０．６５Ｈ，Ｈ４ａ）、４．９７（ｄ，Ｊ＝１５．５，０．３５Ｈ，Ｈ１２ｂｉ）、４．８４（ｓ，０．３５Ｈ，Ｈ４ｂ）、４．５６（ｂｒ，１．６５Ｈ，Ｈ１２ａ＋Ｈ１２ｂｉｉ）、４．０３（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２２（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、２．４６（ｂｒ，３Ｈ，Ｈ１７）、１．１１（ｍ，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７０．６７（Ｃ３）、１６３．６６（Ｃ１３）、１５４．９６、１５２．４７、１３３．４１、１３２．０９、１２８．３４、１２７．７２、１２７．１９、１２６．４９、１２４．７９、６１．３９（Ｃ２）、５３．５２（Ｃ４）、４７．４３（Ｃ１２）、３０．５８（Ｃ５）、１６．２５（Ｃ１７）、１４．３９（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝９．５９分；ｍ／ｚ ３３０．９４（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ１９Ｎ２Ｏ３Ｓの計算値：３３１．１１１６；実測値：３３１．１１３０。
エチル２−（４−メチル−２−フェニルチアゾール−５−カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、化合物１３
化合物１３は、４−メチル−２−フェニルチアゾール−５−カルボン酸（２１３ｍｇ、０．９７４ｍｍｏｌ）を使用して、化合物７のために記載するＥＤＣカップリング手順に従ってＩｎｔ．（２４０ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）から調製した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、５：２、Ｒｆ：０．３２）により精製して、オレンジ色の油（２９８ｍｇ；収率：７５％）として１３を得た。回転異性体の比率は、室温での１Ｈ ＮＭＲにおいてシグナルが融合して現れたため、評価が不可能であった。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）＝７．９７（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ１７＋Ｈ２１）、７．５３（ｍ，３Ｈ，Ｈ１８〜２０）、７．２３（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、５．１５〜５．５４（ｍ，３Ｈ，Ｈ４＋Ｈ１２）、４．０６（ｂｒ，２Ｈ，Ｈ２）、３．２４（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、２．４８（ｓ，３Ｈ，Ｈ２３）、１．１１（ｂｒ，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７０．６０（Ｃ３）、１６７．２２（Ｃ１５）、１５３．１０（Ｃ１３）、１３２．８３、１３１．３０、１２９．８２、１２８．４０、１２７．１９、１２６．７５、６１．４７（Ｃ２）、５３．５７（Ｃ４）、４７．６０（Ｃ１２）、３０．６８（Ｃ５）、１６．５９（Ｃ２３）、１４．４０（Ｃ１）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝１２．８５分；ｍ／ｚ ４０７．４４（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ２３Ｈ２３Ｎ２Ｏ３Ｓの計算値：４０７．１４２９；実測値：４０７．１４１８。
メチル２−（３，４−ジクロロベンゾイル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート、化合物１４
化合物１４は、ｉｎｔ．のために記載する手順に従って、メタノール（１０ｍＬ）中の１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンカルボン酸（１５０ｍｇ、０．７０２ｍｍｏｌ）のエステル化後の中間体から調製した。１６は、さらには精製せずに使用し（９０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、化合物１のためのこれまでに記載する手順に従い、３，４−クロロベンゾイルクロリド（９８ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を使用した。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、２：１、Ｒｆ：０．５４）により精製して、白色の粉末（１２３ｍｇ；収率：７３％）として１４を得た。回転異性体の比率は、５．４：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１ＨＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝７．８（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ，Ｈ１８）、７．７１（ｓ，１Ｈ，Ｈ１４）、７．４７（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ，Ｈ１７）、７．２８〜７．１０（ｍ，４Ｈ，Ｈ６〜９）、５．１７（ｔ，Ｊ＝８，１Ｈ，Ｈ３）、４．５６（ｄｄ，Ｊ＝２４．０，１６．０，２Ｈ，Ｈ１１）、３．６２（ｓ，３Ｈ，Ｈ１）、３．２８（ｄｄ，Ｊ＝１６．０，６．１，２Ｈ，Ｈ４）。回転異性体Ｂ δ＝７．７４（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ，Ｈ１８）、７．６９（ｓ，１Ｈ，Ｈ１４）、７．４０（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ，Ｈ１７）、７．２８〜７．１０（ｍ，４Ｈ，Ｈ６〜９）、５．０１（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１１ｉ）、４．８４（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ３）、４．４２（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１１ｉｉ）、３．５３（ｓ，３Ｈ，Ｈ１）、３．２２〜３．１２（ｍ，２Ｈ，Ｈ４）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１７１．３２（Ｃ２）、１７１．１４（Ｃ２）、１６９．０３（Ｃ１２）、１６８．２６（Ｃ１２）、１３６．７６、１３６．５８、１３３．４７、１３３．２８、１３３．１６、１３２．２６、１３２．０８、１３１．５６、１２９．４６、１２９．１７、１２８．８１、１２８．３６、１２７．６７、１２７．１５、１２６．４５、５６．６４（Ｃ３）、５５．３６（Ｃ３）、５３．０５（Ｃ１）、５２．７０（Ｃ１）、４７．８８（Ｃ１１）、４３．４０（Ｃ１１）、３０．９５（Ｃ４）、３０．５２（Ｃ４）。ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ ＭｅＣＮ）ｒｔ＝１２．４４分；ｍ／ｚ ３６４．２８（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１８Ｈ１６ＮＯ３Ｃｌ２の計算値：−３６４．０５０７；実測値：３６４．０４９９。
２−（３，４−ジクロロベンゾイル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、中間体１７
中間体１７は、塩基性条件下で加水分解後に化合物１（２５０ｍｇ、０．６６３ｍｍｏｌ）から調製した。１は、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（８０：２０）（１５ｍＬ）中に溶解し、２．０ＭのＮａＯＨ（７．５ｍＬ）を混合物に滴下して加えた。反応混合物をｒｔで５時間、撹拌して置いた。溶媒を減圧下で除去し、残余物を水（３０ｍＬ）中に再懸濁した。混合物を１．０ＭのＨＣｌによりｐＨ４に酸性化し、産物をＥｔＯＡｃ（３×１５ｍＬ）により抽出し、鹹水（３×１５ｍＬ）で洗浄、乾燥（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。１７は、白色の固体（２３０ｍｇ；収率：１００％）として得、さらには精製せずに使用した。回転異性体の比率は、１：１であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝１２．９８（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、７．７８（ｄ，Ｊ＝１５．７，１Ｈ，Ｈ１６）、７．６８（ｓ，１Ｈ，Ｈ１３）、７．４４（ｄ，Ｊ＝２３．０，１Ｈ，Ｈ１７）、７．３１〜７．０８（ｍ，４Ｈ，Ｈ５〜８）、５．１４（ｔ，Ｊ＝４．８，１Ｈ，Ｈ２）、４．５４（ｓ，２Ｈ，Ｈ１０）、３．２７〜３．０９（ｍ，２Ｈ，Ｈ３）。回転異性体Ｂ δ＝１２．９８（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、７．７６（ｄ，Ｊ＝１５．７，１Ｈ，Ｈ１６）、７．６６（ｓ，１Ｈ，Ｈ１３）、７．４２（ｄ，Ｊ＝２３．０，１Ｈ，Ｈ１７）、７．３１〜７．０８（ｍ，４Ｈ，Ｈ５〜８）、４．９７（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１０ｉ）、４．６８（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ２）、４．４８（ｄ，Ｊ＝１７．７，１Ｈ，Ｈ１０ｉｉ）、３．２７〜３．０９（ｍ，２Ｈ，Ｈ３）；ＬＣ−ＭＳ（５０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝４．９９分；ｍ／ｚ ３５０．２５（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１７Ｈ１４ＮＯ３Ｃｌ２の計算値：３５０．０３５１；実測値：３５０．０３５６。
２−（３，４−ジクロロベンゾイル）−Ｎ−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキサミド、化合物１５
化合物１５は、中間体１７から調製した。ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の１７（１００ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）の溶液をＴＥＡ（０．０８０ｍＬ、０．５７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣカップリング剤（７６．５ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（５４．１ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）により処理し、ｒｔで５分間、撹拌して置いた。この混合物に２．０Ｍのエチルアミン（０．１７MRes Drug Discovery & Development 2017ｍＬ、０．３４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をＮ２雰囲気下、ｒｔで一晩、撹拌して置いた。ｄＨ２Ｏ ４０ｍＬを加えて反応を停止させ、産物をＥｔＯＡｃ（３×１５ｍＬ）により抽出した。すべての有機画分をともに混合させ、５％のＬｉＣｌ（３×１５ｍＬ）で洗浄して、微量のＤＭＦ、ＮａＨＣＯ３（３×１５ｍＬ）及び鹹水（３×１５ｍＬ）を除去し、乾燥（ＭｇＳＯ４）、ろ過、並びに減圧下で蒸発させた。粗製物をクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ対ＥｔＯＡｃ、１：１、Ｒｆ：０．２６）により精製して、淡黄色の油（７４ｍｇ；収率：６９％）として１５を得た。回転異性体の比率は、５．４：４であり、室温での１Ｈ ＮＭＲ積分値から得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）回転異性体Ａ δ＝７．９４（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ，ＮＨ）、７．７９（ｓ，１Ｈ，Ｈ１５）、７．７７（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ，Ｈ１９）、７．４９（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ，Ｈ１８）、７．２４〜７．０５（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、４．８８（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ４）、４．５０（ｍ，２Ｈ，Ｈ１２）、３．１１（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、３．０３（ｑ，Ｊ＝４．０，２Ｈ，Ｈ２）、０．９０（ｔ，Ｊ＝６．７，３Ｈ，Ｈ１）。回転異性体Ｂ δ＝７．９４（ｔ，Ｊ＝５．５，１Ｈ，ＮＨ）、７．７２（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ，Ｈ１９）、７．６２（ｓ，１Ｈ，Ｈ１５）、７．３６（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ，Ｈ１８）、７．２４〜７．０５（ｍ，４Ｈ，Ｈ７〜１０）、４．９６（ｄ，Ｊ＝１７．１，１Ｈ，Ｈ１２ｉ）、４．５６（ｍ，１Ｈ，Ｈ１２ｉｉ）、４．３６（ｂｒ，１Ｈ，Ｈ４）、３．１１（ｍ，２Ｈ，Ｈ５）、２．９２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２）、０．８１（ｔ，Ｊ＝６．７，３Ｈ，Ｈ１）；１３Ｃ／ｐｐｍ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ＝１６９．４５（Ｃ３）、１６９．１４（Ｃ３）、１６８．２７（Ｃ１３）、１６７．９７（Ｃ１３）、１３７．０９、１３６．６４、１３３．６７、１３３．４７、１３２．６０、１３２．４４、１３２．３０、１３２．１７、１３１．２９、１３０．９８、１３０．８５、１２９．２３、１２８．３７、１２８．０３、１２７．７７、１２７．４８、１２７．０５、１２６．７０、１２６．４８、１２６．３４、１２５．８０、５６．８８（Ｃ４）、５３．６０（Ｃ４）、４７．６８（Ｃ１２）、４３．４９（Ｃ１２）、３３．５３（Ｃ２）、３３．４５（Ｃ２）、３１．６４（Ｃ５）、３０．７４（Ｃ５）、１４．７３（Ｃ１）、１４．５６（Ｃ１）；ＬＣ−ＭＳ（２０〜９８％ＭｅＣＮ）ｒｔ＝１０．８７分；ｍ／ｚ ３７７．１８（［Ｍ＋Ｈ］＋）；ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ Ｃ１９Ｈ１９Ｎ２Ｏ２Ｃｌ２の計算値：３７７．０８２４；実測値：３７７．０８２１。
ＲＥＶ−ＥＲＢαアンタゴニスト活性についての化合物のスクリーニング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を解凍し、１０％のＦＣＳ及び１％のＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ中に３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。細胞を２４ウェルプレート内に播種した（ＤＭＥＭ ０．５ｍＬ＋１０％ＦＣＳ中７・１０４細胞／ウェル）。播種後２４時間に、細胞にＢｍａｌ−ｌｕｃ １００ｎｇ、内部対照としてｐＲＬ−ＣＭＶウミシイタケ１０ｎｇ、及びＲＥＶ−ＥＲＢα １０ｎｇ又は対照として空のベクターｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした。すべての条件は、ＢＳＭを使用することによりＤＮＡ総計４００ｎｇと等しくした。トランスフェクション試料を調製するために、各条件に必要とする算出量のＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭにより調製し、Fugeneを５：２のFugene：ＤＮＡ比で加えた。混合物をボルテックスして確実に均一とし、ｒｔで１５分間インキュベートして置いた。後に、各ＤＮＡ混合物を、事前に播種した細胞を含む２４ウェルプレート内に移し、各条件は、３連で反復した。トランスフェクション後５時間に、細胞を化合物２〜１２、ＡＧ１〜ＡＧ５又は媒体としてのＤＭＳＯにより処理した。ＤＭＥＭ中の化合物の溶液を、最終的に所望のものよりも２倍の濃度で調製し、このような溶液０．５ｍＬを各ウェルに加えた。トランスフェクション後２４時間に、細胞を溶解し、Dual-Luciferase Reporter Assay System E2920（Promega社）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。実験を実施するために、受動的溶解緩衝液（ＰＬＢ）（１：５希釈）５０μＬを各ウェルに加え、３０分間穏やかに撹拌することにより細胞を溶解した。各細胞ライセートを９６ウェルプレートに移した。Dual-Glo試薬５０μＬを各ウェル内に分注し、穏やかに軽くたたいて混合し、１０分間インキュベートした。ホタルルシフェラーゼの発光は、Tecan VICTOR Light Luminescent計数機器を使用して測定した。次いで、Stop&Glo試薬５０μＬを分注してホタル活性を停止させ、ウミシイタケルシフェラーゼを活性化し、１０分間インキュベートして測定した。ホタル活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。結果は、補正したパラメトリックなウェルチのｔ検定を使用して分析した。
Figure 2021528969
２．得られたデータは、図３に示し、３連で行う３回の独立的実験から得られた平均値及び標準誤差として表す。
図３から明らかなように、化合物４、７、８、１１及び１２はすべて、ＳＲ８２７８と比較してルシフェラーゼ発現の有意な増加をもたらし（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１及び＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）、これらがＳＲ８２７８よりも強力なＲＥＶ−ＥＲＢαアンタゴニストであることを示した。
ＲＥＶ−ＥＲＢαアンタゴニスト活性についてのさらなる化合物のスクリーニング
化合物７０〜７２（実施例１に記載のように生成）を使用して、実施例２の方法を反復した。化合物４、７及び１１（実施例２において試験）を、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性のための陽性対照として使用し、アゴニスト化合物ＡＧ２（これも実施例２において試験）及びＤＭＳＯも比較物として試験した。
得られたデータを図４に示し、３連で行う２回の独立的実験から得られた平均値及び標準誤差として表す。化合物７２では、ＳＲ８２７８を使用して得られる作用よりも優れた、ＲＥＶ−ＥＲＢに対する阻害作用が観察され、結果は、統計学的に有意であり（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１及び＊＊＊はｐ＜０．００１）、これがＳＲ８２７８よりも強力なＲＥＶ−ＥＲＢαアンタゴニストであることを示した。
ＲＥＶ−ＥＲＢαアンタゴニスト活性についてのさらなる化合物のスクリーニング
化合物６４〜６６、６９及び７０〜７３（実施例１に記載のように生成）を使用して、実施例２の方法を反復した。再度、化合物４、７及び１１（実施例２において試験）を、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性のための陽性対照として使用し、アゴニスト化合物ＡＧ２（これも実施例２において試験）及びＤＭＳＯも比較物として試験した。
得られたデータを図５に示し、３連で行う３回の独立的実験から得られた平均値及び標準誤差として表す。ＲＥＶ−ＥＲＢに対する阻害作用が、すべての化合物、特には、化合物７１〜７３について観察され、結果は、統計学的に有意であった（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１及び＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。
ＲＥＶ−ＥＲＢβアンタゴニスト活性についての化合物のスクリーニング
実施例２の方法を反復したが、ＲＥＶ−ＥＲＢβ １０ｎｇをＲＥＶ−ＥＲＢαの代わりに使用した。化合物４、６６、６９及び７３を試験した（実施例１に記載のように生成）。アゴニスト化合物ＡＧ２及びＤＭＳＯも比較物として試験した。
得られたデータを図６に示し、３連で行う３回の独立的実験から得られた平均値及び標準誤差として表す。ＲＥＶ−ＥＲＢに対する阻害作用が、すべての化合物、特には、化合物４について観察され、結果は、統計学的に有意であった（＊はｐ＜０．０５及び＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。
ＲＥＶ−ＥＲＢαアンタゴニスト活性についてのさらなる化合物のスクリーニング
化合物１６〜１９、２７、２８及び４４（実施例１に記載のように生成）を使用して、実施例２の方法を反復した。再度、化合物４、７及び１１（実施例２において試験）を、ＲＥＶ−ＥＲＢ阻害活性のための陽性対照として使用し、アゴニスト化合物ＡＧ２（これも実施例２において試験）及びＤＭＳＯも比較物として試験した。
得られたデータを図７に示し、３連で行う３回の独立的実験から得られた平均値及び標準誤差として表す。ＲＥＶ−ＥＲＢに対する阻害作用が、特には、化合物２７及び２８について観察され、結果は、統計学的に有意であった（＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１及び＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。
ＲＥＶ−ＥＲＢβアンタゴニスト活性についてのさらなる化合物のスクリーニング
化合物１８及び１９（実施例１に記載のように生成）を使用して、実施例５の方法を反復した。アゴニスト化合物ＡＧ５及びＤＭＳＯも比較物として試験した。
得られたデータを図８に示し、３連で行う２回の独立的実験から得られた平均値及び標準誤差として表す。ＲＥＶ−ＥＲＢに対する阻害作用が、両方の化合物について観察された（＊＊＊＊はｐ＜０．０００１）。
ＲＥＶ−ＥＲＢαの阻害物質により、産生されたＮＫ細胞の総数が増加する
化合物７及び１１をＳＲ８２７８とともにスクリーニングした。
マウス。この試験において使用するすべてのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝的背景に関して野生型であり、６〜１２週齢であった。すべての畜産及び実験手順は、英国内務省の規制及び研究所のガイドラインに従って実施した。
ＯＰ９細胞株及び細胞培養物。ＯＰ９は、これとともに共培養すると、造血前駆細胞のリンパ球の分化を支持することで知られる、マウス骨髄由来の間質細胞株である。ＯＰ９−ＧＦＰ細胞は、２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Sigma-Aldrich社）で培養した。これらを２５００細胞／ウェルで２４ウェルプレート内に分割して２日後、Ｌｉｎ細胞をこれらの上に移した。細胞を５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下で維持した。
骨髄からの系統陰性細胞の単離。マウスの脚骨及び寛骨を、２％のＦＢＳを加えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に粉砕して、骨髄細胞を解放した。細胞懸濁液を４０μｍのろ過器によりろ過し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳを４０ｍＬまでつぎ足し、５００×ｇで４分間、遠心分離した。細胞をＰＢＳ ２ｍＬ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートカクテル（抗Ｂ２２０（ＲＡ３／６Ｂ２）抗体２０μＬ、抗ＣＤ２（ＲＭ２−５）抗体２０μＬ、抗Ｔｅｒ１１９（ＴＥＲ１１９）抗体２０μＬ、抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）抗体２０μＬ、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）抗体５μＬ及びＧｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）抗体５μＬ（すべてeBioscience社より））により４℃で５分間、染色した。次いで、細胞を洗浄し、遠心分離し、anti-PE Microbeads（Miltenyi社）とともに４℃で１５分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＬＤカラム（Miltenyi社）を通過させて、カラムを流れる非染色Ｌｉｎ細胞の負の選択を可能とした。細胞５０μＬを採取し、フローサイトメトリーを使用して枯渇後の純度を確認した。
インビトロでの系統陰性細胞からのＮＫ細胞の発生。２４ウェルプレート内１０％の胚性幹細胞適性ＦＢＳ（ＥＳ−ＦＢＳ）、１％のＰ／Ｓ、５０μＭのβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、１０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）（R&D Systems社）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７（R&D Systems社）及び１００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）（R&D Systems社）を各ウェルに添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma-Aldrich社）１ｍＬに、Ｌｉｎ細胞を５×１０５細胞で播種し、２日間培養した。ＯＰ９−ＧＦＰ間質細胞との共培養のために、２４ウェルプレート内２０％のＥＳ−ＦＢＳ、１％のＰ／Ｓ、５０μＭのβ−ＭＥ及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（R&D Systems社）を各ウェルに添加したアルファＭＥＭ（Sigma Aldrich社）１ｍＬに、細胞を３×１０４細胞で移し、７日間培養した。２日目に、細胞をＯＰ９とともに移すと同時に、化合物を加えた。５日目に上清を除去し、新たな培地を化合物とともに加えた。細胞を５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下で維持した。
フローサイトメトリー。７日間培養した後、細胞を回収し、４０μｍのろ過器を通してろ過してＯＰ９細胞を除去し、ＰＢＳで洗浄した。５００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離後、適切な蛍光色素コンジュゲート抗体を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）緩衝液（１％ＢＳＡを加えたＰＢＳ）１００μＬにより１：３００希釈で用いて、４℃で１５分間、暗所で、これらを染色した。抗体は、ＣＤ３（ｅ４５０）、ＮＫ１．１（ＡＰＣ）、ＮＫｐ４６（Ｐｅｒｃｐ ｅ７１０）及びＰｌを含み、これらのすべては、抗マウスであり、eBioscience社から入手可能である。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬで洗浄し、遠心分離して、ＦＡＣＳ緩衝液３００μＬに再懸濁した。補正は、抗マウスＩｇ，ｋ及び抗ラット／ハムスターＩｇ，ｋ Compensation Particles Set（BD（商標）Combead社）を使用して設定した。フローサイトメトリー分析は、BD LSRFortessa（商標）セルアナライザー（Becton Dickinson Bioscience社）を使用して行い、データ分析は、FlowJoを使用して実施した。
１０μＭの化合物７及び１１の両方を加えると、ＳＲ８２７８と比較してＮＫ細胞の総数の増加が示され、化合物７の場合では、有意に増加した（図９）（＊はｐ＜０．０５）。
ＲＥＶ−ＥＲＢαのさらなる阻害物質により、産生されたＮＫ細胞の総数が増加する
５μＭの化合物７及び１１並びに５及び１０μＭの化合物７２を使用して、実施例７の方法を反復した。
５μＭの７及び１１並びに５及び１０μＭの化合物７２を加えると、ＳＲ８２７８と比較してＮＫ細胞の総数の有意な増加が示された（図１０）（＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１）。

Claims (24)

  1. ＮＫ細胞集団を増殖させるためのエクスビボでの方法であって、
    ｄ）個体から得られた、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む試料を、培養するステップと、
    ｅ）前記試料を、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物に接触させるステップと、
    ｆ）前記細胞をインビトロで増殖させてＮＫ細胞集団を産生させるステップと
    を含み、前記化合物が、式（Ｉ）：
    Figure 2021528969
     ［式中、−−−−−−は、すべて存在する結合又は存在しない結合のいずれかを表し、
    Ｒ１は、Ｃ１−６ヒドロカルビルから選択され、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、−ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１又は２以上の基と置換されていてもよく、
    Ｒ２は、５〜１０員のヘテロ環及びＣ１−６ヒドロカルビルから選択され、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、−ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１又は２以上の基と置換されていてもよく、
    Ｘは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択されるか又は存在せず、
    Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−又は−ＣＲ’２−から選択され、
    Ｚは、−Ｏ−及び−ＮＲ’−から選択されるか又は存在せず、
    各Ｒａは、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択され、
    各Ｒｂは、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル及び−ＯＲ’から独立的に選択され、
    Ｒｃは、Ｈ及びＣ１−４ヒドロカルビルから選択され、
    各Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１−４ヒドロカルビル及び−Ｐｈから独立的に選択される］
    を有するか又は薬学的に許容されるこの塩であり、ただし前記化合物が、
    Figure 2021528969
     ではない、前記方法。
  2. −−−−−−が、すべて存在する結合を表し、かつ、化合物が、式Ia：
    Figure 2021528969
     による閉環構造である、請求項１に記載の方法。
  3. Ｒ１が、非置換であり、したがって、好ましくは、Ｃ１−６アルキル及びＣ１−６アルケニルから選択され、より好ましくは、Ｒ１が、Ｃ１−６アルキルから、さらにより好ましくは、Ｃ１−４アルキルから、例えば、メチル、エチル及びプロピルから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. Ｒ２が、
    （ｉ）置換されていてもよい５〜１０員のヘテロ環、好ましくは、置換されていてもよい５〜１０員のヘテロアリール環であって、前記５〜１０員のヘテロアリール環が、好ましくは、置換されていてもよい５、６又は９員のヘテロアリール環であり、前記５、６又は９員のヘテロアリール環が、置換されていてもよい、フラニル、チオフェニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピロリル、トリアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、アザインドリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンズイソオキサゾリル及びベンゾオキサゾリルから選択されていてもよい、５〜１０員のヘテロ環、及び
    （ii）置換されていてもよいフェニル、好ましくは、置換されているフェニル
    から選択され、及び／又は
    Ｒ２が、非置換であるか、又はＣ１−４アルキル、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’２、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｐｈ、−ＣＦ３及びハロゲンから独立的に選択される１若しくは２の基と置換され、好ましくは、Ｒ２が、非置換であるか、又は−Ｍｅ、−ＯＭｅ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｉ及び−ＳＭｅから独立的に選択される１若しくは２の基と置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. ａ）Ｘが、−Ｏ−であり、
    ｂ）Ｙが、−Ｃ（Ｏ）−であり、
    ｃ）Ｚが、−Ｏ−であるか、若しくは存在せず、好ましくは、Ｚが、存在せず、
    ｄ）各Ｒａが、Ｈ、Ｃ１−４アルキル及び−ＯＲ’から、好ましくは、Ｈ及びＣ１−４アルキルから独立的に選択され、より好ましくは、各Ｒａが、Ｈであり、
    ｅ）各Ｒｂが、Ｈ及びＣ１−４アルキルから独立的に選択され、好ましくは、各Ｒｂが、Ｈであり、
    ｆ）Ｒｃが、Ｈであり、並びに／又は
    ｇ）各Ｒ’が、Ｈ及びＣ１−４アルキルから、好ましくは、Ｈ、メチル及びエチルから、より好ましくは、メチル及びエチルから独立的に選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. Ｒｂ及びＲｃが、すべてＨであり、これにより化合物が、式（II）：
    Figure 2021528969
     を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｘ、Ｙ及びＺが、請求項１〜５に定義される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. Ｒａが、すべてＨであり、これにより化合物が、式（III）：
    Figure 2021528969
     を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＺが、請求項１〜５において定義され、
    好ましくは、Ｘが、−Ｏ−であり、これにより化合物が、式（IV）：
    Figure 2021528969
     を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｙ及びＺが、請求項１〜５において定義され、
    より好ましくは、Ｙが、−Ｃ（Ｏ）−であり、これにより化合物が、式（Ｖ）：
    Figure 2021528969
     を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２及びＺが、請求項１〜５において定義され、
    さらにより好ましくは、Ｒ１が、エチルであり、これにより化合物が、式（VI）：
    Figure 2021528969
     を有し、式中、Ｒ２及びＺが、請求項１〜５において定義され、
    またさらにより好ましくは、化合物が、式（VII）：
    Figure 2021528969
     を有する閉環構造であり、式中、Ｒ２及びＺが、請求項１〜５に定義される、請求項６に記載の方法。
  8. 化合物が、
    Figure 2021528969
    Figure 2021528969
    Figure 2021528969
    Figure 2021528969
    Figure 2021528969
    から選択される式を有し、好ましくは、化合物が、式：
    Figure 2021528969
     を有し、より好ましくは、化合物が、式：
    Figure 2021528969
     を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 化合物が、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性を低下させることによりＥ４ｂｐ４発現を増加させる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 化合物が、ＲＥＶ−ＥＲＢ−α及び／又はＲＥＶ−ＥＲＢ−β、好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢ−β、より好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢ−α及びＲＥＶ−ＥＲＢ−βの活性を低下させる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 化合物が、ＲＥＶ−ＥＲＢアンタゴニスト、好ましくは、ＲＥＶ−ＥＲＢ−α及びＲＥＶ−ＥＲＢ−βのアンタゴニストである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  12. Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下でＨＰＣを培養するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法であって、前記ＨＰＣを培養する容器が、前記Ｎｏｔｃｈリガンドでコーティングされていてもよい、前記方法。
  13. （ａ）Ｎｏｔｃｈリガンドが、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、又はＤＬＬ４の機能を保持するその断片であり、及び／又は
    （ｂ）Ｎｏｔｃｈリガンドが、前記ＨＰＣの単離の４日後に、又は前記ＨＰＣの単離の４日後から存在する、請求項１２に記載の方法。
  14. ａ）細胞が、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下で培養するステップの後にＩＬ−１５の存在下で培養され、並びに／又は
    ｂ）ＨＰＣが、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ及び／若しくは幹細胞因子（ＳＣＦ）と組み合わせたＮｏｔｃｈリガンド、好ましくは、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３Ｌ及びＳＣＦと組み合わせたＮｏｔｃｈリガンドの存在下で培養され、
    前記細胞をＮｏｔｃｈリガンドの存在下で培養するステップ及びＩＬ−１５の存在下で培養するステップのいずれか又は両方が、間質支持細胞の非存在下で行われていてもよく、好ましくは、両方のステップが、間質支持細胞の非存在下で行われる、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. ＨＰＣをＥ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化を生じる化合物と接触させ、これによりＥ４ｂｐ４活性の上昇を生じるステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法であって、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化が、Ｅ４ｂｐ４のＳＵＭＯ化及び／又はリン酸化の減少であってもよく、好ましくは、Ｅ４ｂｐ４の翻訳後修飾の変化において生じる化合物が、
    ａ）Ｅ４ｂｐ４の残基Ｋ１０、Ｋ１１６、Ｋ２１９、Ｋ３３７及び／若しくはＫ３９４又はこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいてＳＵＭＯ化を減少させ、及び／又は
    ｂ）Ｅ４ｂｐ４の残基Ｓ２８６、Ｓ３０１及び／若しくはＳ４５４又はこれらに対応する残基の１若しくは２以上、又はこれらの任意の組合せにおいてリン酸化を減少させる、前記方法。
  16. ＨＰＣの試料が、骨髄、臍帯血及び／又は末梢血から得られたものである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 請求項１〜１６のいずれかに記載の方法により得られた増殖ＮＫ細胞集団であって、前記ＮＫ細胞の少なくとも８５％が、ＣＤ５６＋及びＣＤ４５＋である、前記増殖ＮＫ細胞集団。
  18. 請求項１７に記載の増殖ＮＫ細胞集団と、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む組成物。
  19. 患者におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の産生を増加させることによる療法の方法における使用のための、ＲＥＶ−ＥＲＢ活性の作用を阻害する化合物であって、請求項１〜１１のいずれかに定義される、前記化合物。
  20. 患者におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の産生を増加させることによる療法の方法における同時、別々、又は逐次の使用のための混合調製物として、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する化合物と、Ｎｏｔｃｈリガンドとを含む産物であって、前記化合物が、請求項１〜１１のいずれかに定義される化合物であり、前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）又はＤＬＬ４の機能を保持するこの断片であってもよい、前記産物。
  21. 療法の方法が、
    ａ）がん、感染性疾患（急性又は慢性）、自己免疫疾患又は女性不妊症若しくは妊娠に関連する疾患若しくは障害から選択される疾患又は障害を治療する方法である、又は
    ｂ）ウイルス感染症、細菌感染症、プロテスト感染症、真菌感染症及び／又は蠕虫感染症の治療の方法である、請求項１９に記載の使用のための化合物又は請求項２０に記載の使用のための産物。
  22. 請求項１〜１１のいずれかに定義する、ＲＥＶ−ＥＲＢの作用を阻害する治療有効量の化合物と、任意でＮｏｔｃｈリガンドとを、患者に投与するステップを含む、それを必要とする前記患者におけるＮＫ細胞数を増加させることによる治療の方法であって、好ましくは、前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）又はＤＬＬ４の機能を保持するこの断片であってもよい、前記方法。
  23. 抗体媒介免疫療法と組み合わせて使用する、請求項１９若しくは２１に記載の使用のための化合物、請求項２０若しくは２１に記載の使用のための産物、又は請求項２２に記載の治療の方法であって、前記化合物又は産物が、抗体媒介免疫療法を施す前、同時、又は後の投与用であってよい、前記化合物、産物又は方法。
  24. 請求項１〜１１のいずれかに定義する式（Ｉ）の化合物であって、
    Figure 2021528969
    Figure 2021528969
    Figure 2021528969
    ではないことを条件とする、前記化合物。
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