JP7225107B2 - ナチュラルキラー細胞 - Google Patents

Description

本発明は、増殖ナチュラルキラー（ＮＫ、Natural Killer）細胞集団、それを産生する方法及びその治療上の適用に関する。より具体的には、本発明は、ＮＫ細胞産生に関連する特定の転写因子の発現を増加させることによるＮＫ細胞の増殖に関する。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、がん性細胞、病原体感染性細胞やその他損傷した細胞に対して細胞傷害性であるため、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞への関心は高まってきている。ＮＫ細胞は、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ、innate lymphoid cell）、具体的には大型顆粒細胞傷害性リンパ球であり、これは、免疫応答の自然及び適応アームをつなぐ。このＮＫ細胞は、末梢血中を循環するリンパ球の１０～１５％を作り上げている。ＮＫ細胞はまた、免疫系において最も高いレベルの細胞傷害活性を示す。したがって、ＮＫ細胞の機能性又は数を変化させると、感染症及びがんに対する免疫系の機能に影響する。例えば、日本における広範な研究では、４０歳を超える人のコホートにおけるＮＫ細胞レベルの減少が、著しく高いがんの発生率と関連することが示されている。

Ｂ細胞及びＴ細胞と同様に、これらのＮＫ細胞は、リンパ球系共通前駆（ＣＬＰ、Common Lymphoid Progenitor）細胞に由来し、次いでこれは、造血幹細胞（ＨＳＣ、Haematopoietic Stem Cell）に由来する。しかし、ＮＫ細胞は、特異的細胞表面抗原受容体を欠くためＢ及びＴ細胞とは異なる。このため、ＮＫ細胞は、がん性細胞及び病原体感染性細胞を事前感作なしに殺傷することが可能であり、これによりＮＫ細胞は、自然免疫応答の一部であるとされる。このＮＫ細胞はまた、適応免疫応答に直接影響することにより腫瘍免疫監視においても重要な役割を有する。

ＮＫ細胞を活性化すると、パーフォリン、及びグランザイムを含有する細胞質顆粒の放出が引き起こされる。パーフォリンは重合して、Ｃａ２＋の存在下で標的細胞上に細孔を形成する。グランザイムは、これらの標的細胞内の細孔に入り、ＤＮＡ断片化及びアポトーシスを引き起こし得る。ＮＫ細胞はまた、サイトカインを分泌することができ、これが免疫の適応アームにおいて他の免疫細胞の作用を引き起こす。

病原体感染及びがん細胞に対する免疫応答におけるＮＫ細胞の重要性のため、複数の臨床試験において、養子移植プロトコルによるＮＫ細胞の有効性が試験されている。養子移植では、ドナーの血液から単離したＮＫ細胞をエクスビボで増殖させ、健常で機能性のＮＫ細胞に成熟させた後、レシピエントへ輸注する。しかし、効果的とするために、ＮＫ細胞ドナーをそのＫＩＲ遺伝子型についてスクリーニングすることが重要であり、ここでドナーは、レシピエントに適切なＫＩＲ対立遺伝子多型を有し、標的細胞を認識して破壊可能とする必要がある。いずれにしても、増殖させた産物は、臨床的成功率が予想よりも低く、がん性又は感染性細胞を殺傷する能力が低いことが試験により見出された。したがって、現在の養子移植プロトコルに対する重要な障壁が存在する。

代替的治療法は、内在性ＮＫ細胞の数を増加させることである。１つの方法は、ＮＫ細胞の発生（development）に必須のサイトカインの投与である。ＩＬ－２及びＩＬ－１５の投与は、ＮＫ細胞の発生を増強することが予想された。ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の増殖及び細胞傷害性を増進させ、一方、ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の発生及び増殖を増進させる。しかし、インビボでの試験では、サイトカインは、非常に高用量であっても、ＮＫ細胞の最小限の増殖を刺激して半減期を減少させるのみであることが見出された。さらに、サイトカインを投与すると、免疫応答が不適切に活性化されＮＫ細胞アポトーシスが誘導されるため、全身毒性を生じることが多い。

したがって、従来の方法及び技術を使用すると、大量のＮＫ細胞の産生は、困難であり、高細胞傷害性を有する完全機能性のＮＫ細胞の産生は、より困難である。ＮＫ細胞数を選択的に増加させる利用可能な薬物は現在、存在しない。したがって、治療的及び研究的使用のための大量の機能性ＮＫ細胞をエクスビボ及びインビボの両方で産生する、ＮＫ細胞産生の新規の方法を開発することが求められている。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、がん性、病原体感染性又は損傷した細胞を破壊する免疫系において重要な役割を有する。ＮＫ細胞数又は機能性を強化すると、これらの細胞の殺傷が増加すると予想されている。ＮＫ細胞養子移植及び内在性ＮＫ細胞のサイトカイン増強などの既存の療法は、その有効性の点では非常に成功しているとは言えない。

ＮＫ細胞は、骨髄中のＨＳＣから分化し、リンパ節、脾臓、末梢血、肺及び肝臓を含む、リンパ球系及び非リンパ球系組織にわたって分布する。特定のサイトカイン及び転写因子は、ＨＳＣのＮＫ細胞への発生を促すのに必要とされる。各サイトカイン及び転写因子は、正確な時間及び濃度で存在して、ＨＳＣからＮＫ細胞への分化を推し進めなければならない。しかし、ＮＫ細胞成熟化を支配する、サイトカイン及び転写因子の正確な体系は、未だ完全には理解されていない。

本発明者らは、ＮＫ細胞数を増加させることが可能な薬物を同定するために研究を重ねた。特に、本発明者らは、Ｎｆｉｌ３としても公知の、Ｅ４結合タンパク質４（Ｅ４ｂｐ４、E4 binding protein 4）に着目した。ＨＳＣにおけるＥ４ｂｐ４の過剰発現によりインビトロでのＮＫ細胞産生が非常に増強されるため、Ｅ４ｂｐ４の上方制御は、ＮＫ細胞の産生を増加させる有望な戦略である。しかし、転写因子は、その構造及び機能のため、薬物にするのが困難であり得る。例えば、転写因子は、通常、酵素活性又は補助因子結合部位を欠いている。本発明者らは、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害すると、ＮＫ細胞産生が増加することを初めて示した。さらに詳細には、本発明者らは、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害すると、Ｅ４ｂｐ４発現が増加し、次いで、ＮＫ細胞産生が増加することを見出した。特に、本発明者らは、ＲＥＶ－ＥＲＢアンタゴニストであるＳＲ８２７８により、Ｅ４ｂｐ４発現が増加し、したがってＮＫ細胞産生が増加することを示した。

したがって、本発明は、（ａ）患者から得られた（obtained）試料を含む造血前駆細胞（ＨＰＣ、haematopoietic progenitor cell）を培養するステップと、（ｂ）前記試料をＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物に接触させるステップと、（ｃ）前記細胞をインビトロで増殖させてＮＫ細胞集団を産生するステップとを含む、ＮＫ細胞集団を増殖させるためのエクスビボ方法を提供する。

前記化合物は、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を減少させることによりＥ４ｂｐ４発現を増加させることができる。典型的には、前記化合物は、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢ－βの活性を減少させる。好ましくは、前記化合物は、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びＲＥＶ－ＥＲＢ－βの活性を減少させる。いくつかの実施形態では、前記化合物は、ＲＥＶ－ＥＲＢアンタゴニスト、好ましくは、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びＲＥＶ－ＥＲＢ－βのアンタゴニストである。前記化合物は、低分子、ＰＲＯＴＡＣ試薬、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、double stranded RNA）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、small interfering RNA）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、small hairpin RNA）、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、抗体、リボザイム、ペプチド又はペプチドミメティックから選択され得る。いくつかの好ましい実施形態では、前記化合物は、低分子、例えば、ＳＲ８２７８、ＡＲＮ５１８７、エチル２－（５－メチルフラン－２－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレート、４－（（４－クロロベンジル）（（５－ニトロチオフェン－２－イル）メチル）アミノ）－Ｎ－フェニルピペリジン－１－カルボキサミド、４－（（（１－（４－フルオロフェニル）シクロペンチル）アミノ）メチル）－２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）フェノール、１－（２－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミン又は１－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミンであり、ＳＲ８２７８は、特に好ましい。

ＨＰＣの試料は、骨髄、臍帯血及び／又は末梢血から得ることができる。いくつかの実施形態では、化合物は、試料中のＨＰＣを単離して２日以内に添加する。

本発明は、ＮＫ細胞の少なくとも９０％がＣＤ５６^＋及びＣＤ４５^＋である、本発明の方法により得られる増殖ＮＫ細胞集団をさらに提供する。

本発明はまた、本発明の増殖ＮＫ細胞集団並びに薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む組成物を提供する。

本発明は、患者におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の産生を増加させることによる療法の方法における使用のためのＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物をさらに提供する。典型的に、前記化合物は、本明細書に定義する本発明の化合物である。療法の方法は、がん、感染性疾患（急性又は慢性）、自己免疫疾患又は女性不妊症若しくは妊娠に関連する疾患若しくは障害から選択される疾患又は障害を治療する方法であり得る。治療する感染症は、ウイルス感染症、細菌感染症、プロテスト感染症（protest infection）、真菌感染症及び／又は蠕虫感染症であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の使用のための化合物は、抗体媒介免疫療法と併せて使用される。前記化合物は、抗体媒介免疫療法を施す前、同時、又は後の投与用であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、前記化合物は、ＳＲ８２７８、ＡＲＮ５１８７、エチル２－（５－メチルフラン－２－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレート、４－（（４－クロロベンジル）（（５－ニトロチオフェン－２－イル）メチル）アミノ）－Ｎ－フェニルピペリジン－１－カルボキサミド、４－（（（１－（４－フルオロフェニル）シクロペンチル）アミノ）メチル）－２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）フェノール、１－（２－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミン又は１－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミンであり、ＳＲ８２７８は、特に好ましい。

本発明は、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する、治療有効量の化合物を患者に投与するステップを含む、それを必要とする前記患者におけるＮＫ細胞の数を増加させることによる治療の方法をさらに提供する。前記化合物は、抗体媒介免疫療法と併せて使用され得る。

ＮＫ細胞発生経路である。ＮＫ細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から分化したものである。ＮＫ細胞は、ＨＳＣからリンパ球系共通前駆（ＣＬＰ）細胞、ＮＫ前駆（ＮＫＰ、NK progenitor）細胞、未熟ＮＫ（ｉＮＫ、immature NK）細胞、成熟ＮＫ（ｍＮＫ、mature NK）細胞及び最終的に血流を循環する通常型ＮＫ（ｃＮＫ、conventional NK）細胞を発生させる。経路図の下部は、ＮＫ細胞の発生に必要とされる、サイトカイン及び転写因子である。ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の発生に必要とされる主要なサイトカインのうちの１つである。他は、図に示す遷移に必要とされる転写因子である。 ＮＫ細胞発生アッセイのタイムラインである。ＨＰＣを単離し、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－７及びＳＣＦサイトカインを加えて培養した。次いで２日目に、ＩＬ－１５サイトカインを加えた培養培地中に薬物を加えて又は加えずに、これらをＯＰ９間質細胞上に移した。５日目に培養物の培地を交換し、９日目に細胞を採取及び分析した。 ＮＫ細胞産生条件下でＨＰＣを培養し、２日目に種々の薬物化合物を添加した。９日目にフローサイトメトリーを使用してＮＫ細胞の割合を定量化した。（Ａ）は、成熟マウスＮＫ細胞（ＮＫ１．１^＋ＣＤ３^－）の相対産生量を５、１０及び２０μＭのＤ４４７６（陽性対照）、Remodelin及びＳＲ８２７８の添加について「無薬物」対照と比較して示すグラフである。（Ｂ）は、マウスＮＫ細胞の同定のためのフローサイトメトリーのゲーティング戦略である。（Ｃ）は、ＮＫ細胞の割合を示した代表的フローサイトメトリー結果である。結果は、６反復で１回の実験を平均した。エラーバーは、平均＋ＳＤを表す。アステリスクは、マンホイットニー検定に基づいて、注記した２つの結果による有意差を示す（^＊はＰ≦０．０１）。 ＮＫ細胞産生条件下でＨＰＣを培養し、種々の濃度のＳＲ８２７８を添加した。９日目にフローサイトメトリーを使用してＮＫ細胞の割合を定量化した。（Ａ）は、成熟マウスＮＫ細胞（ＮＫ１．１^＋ＣＤ３^－）の相対産生量を２、５、１０及び２０μＭのＳＲ８２７８の添加について「無薬物」対照と比較して示すグラフである。結果は、生物学的反復及び技術的３反復を有する３回の独立した実験を平均した。エラーバーは、平均＋ＳＤを表す。アステリスクは、マンホイットニー検定に基づいて、注記した２つの結果による有意差を示す（^＊はＰ≦０．０５；^＊＊＊＊はＰ≦０．００１）。（Ｂ）は、ＮＫ細胞の割合を示した代表的（例示的）フローサイトメトリー結果である。 ＮＫ細胞産生条件下で系列陰性細胞（ＨＰＣ）を培養し、０、１、２、３又は４日目に５又は１０μＭのＳＲ８２７８を添加した。９日目に、フローサイトメトリーを使用してＮＫ細胞の割合を定量化した。（Ａ）は、別々の日に５及び１０μＭのＳＲ８２７８を添加した場合の成熟マウスＮＫ細胞（ＮＫ１．１^＋ＣＤ３^－）の相対産生量を「無薬物」対照と比較して示すグラフである。（Ｂ）は、ＮＫ細胞の割合を示した代表的フローサイトメトリー結果である。５μＭのＳＲ８２７８の添加を上部に示し、一方、１０μＭのＳＲ８２７８の添加を下部に示す。（Ｃ）は、別々の日に５及び１０μＭのＳＲ８２７８を添加した場合の生細胞の数を示すグラフである。結果は、各４反復で２回の実験を平均した。エラーバーは、平均＋ＳＤを表す。アステリスクは、マンホイットニー検定に基づいて、注記した２つの結果による有意差を示す（^＊はＰ≦０．０１、^＊＊＊はＰ≦０．０００１及び^＊＊＊＊はＰ≦０．００００１）。 ＮＫ細胞産生条件下でＨＰＣを培養し、種々の濃度のＧＳＫ４１１２を添加した。９日目に、フローサイトメトリーを使用してＮＫ細胞の割合を定量化した。（Ａ）は、成熟マウスＮＫ細胞（ＮＫ１．１^＋ＣＤ３^－）の相対産生量を２、５、１０及び２０μＭのＧＳＫ４１１２の添加について「無薬物」対照と比較して示すグラフである。（Ｂ）は、ＮＫ細胞の割合を示した代表的フローサイトメトリー結果である。結果は、各４反復で２回の実験を平均した。エラーバーは、平均＋ＳＤを表す。アステリスクは、マンホイットニー検定に基づいて、注記した２つの結果による有意差を示す（^＊はＰ≦０．０１及び^＊＊＊はＰ≦０．０００１）。 野生型（ＷＴ、wild type）、Ｅ４ｂｐ４ノックアウト（ＫＯ、knockout）又はヘテロ接合（Ｈｅｔ、heterozygous）マウスから単離したＨＰＣを培養し、５又は１０μＭのＳＲ８２７８を添加した。９日目に、フローサイトメトリーを使用してＮＫ細胞の割合を定量化した。（Ａ）ＷＴ、（Ｂ）Ｈｅｔ及び（Ｃ）Ｅ４ｂｐ４ ＫＯマウスを用いた実験における成熟マウスＮＫ細胞（ＮＫ１．１^＋ＣＤ３^－）の相対産生量を「無薬物」対照と比較して示すグラフである。（Ｄ）は、１０μＭのＳＲ８２７８の添加についてＮＫ細胞の割合を示した代表的フローサイトメトリー結果である。結果は、各４反復で２回の実験を平均した。エラーバーは、平均＋ＳＤを示す。アステリスクは、マンホイットニー検定に基づいて、注記した２つの結果による有意差を示す（^＊はＰ≦０．０１及び^＊＊はＰ≦０．００１）。 ２日目に５μＭのＳＲ８２７８を添加又は添加せずにＨＰＣを培養した。３、４及び５日目に、細胞を採取して、サイトカインの相対発現量をＲＴ－ｑＰＣＲにより定量化した。グラフは、（Ａ）Ｅ４ｂｐ４、（Ｂ）Ｉｄ２及び（Ｃ）Ｅｏｍｅｓの、ハウスキーピング遺伝子であるＨｐｒｔに対して正規化した相対発現量を示す。 ヒトＣＤ３４^＋細胞を培養し、４日目に５μＭのＳＲ８２７８を添加した。１４～１６日目に、ｈＣＤ５６^＋ ｈＣＤ４５^＋（ヒトＮＫ細胞のマーカー）細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して定量化した。（Ａ）は、ｈＣＤ５６^＋ ｈＣＤ４５^＋細胞の割合を種々の条件下で「無薬物」対照と比較して示すグラフである。（Ｂ）は、ヒトＮＫ細胞の同定のためのフローサイトメトリーのゲーティング戦略である。（Ｃ）は、ＮＫ細胞の割合を示した代表的フローサイトメトリー結果である。結果は、各６反復で１回の実験を平均した。エラーバーは、平均＋ＳＤを示す。 （Ａ）は、ＷＴ（上部）及びＲＥＶ－ＥＲＢ－α ＫＯ（下部）マウスの骨髄中のプレＮＫＰ及びｒＮＫＰを同定するためのフローサイトメトリーのゲーティング戦略である。ゲーティングした集団の割合を各フローサイトメトリーグラフ上に示す。（Ｂ）は、ＷＴ及びＲＥＶ－ＥＲＢ－α ＫＯマウスの骨髄（ＢＭ）及び脾臓中のマウスＮＫ細胞を同定するための、ＮＫ細胞の割合を示したフローサイトメトリー結果である。結果は、図３Ｂのゲーティング戦略を使用することにより得た。 （Ａ）は、ＷＴ（上部）並びにＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びＲＥＶ－ＥＲＢ－βダブルＫＯ（下部）マウスの骨髄中のプレＮＫＰ及びｒＮＫＰを同定するためのフローサイトメトリーのゲーティング戦略である。ゲーティングした集団の割合を各フローサイトメトリーグラフ上に示す。（Ｂ）は、ＲＥＶ－ＥＲＢα／βダブルＫＯマウスの骨髄の分析である。ＤＫＯ＝ＲＥＶ－ＥＲＢα及びβ遺伝子の両方を欠失させたマウス、αＨｅｔ／βＨｅｔ＝各ＲＥＶ－ＥＲＢ遺伝子のうちの１つの対立遺伝子のみを欠失させたマウス、並びにβＫＯ＝ＲＥＶ－ＥＲＢβ遺伝子を欠失させたマウスである。各データポイントについてＮ＝２である。ＬＭＰＰ＝リンパ球系－骨髄系多能性前駆細胞、ＣＬＰ＝リンパ球系共通前駆細胞、及びＮＫＰ＝ＮＫ細胞前駆細胞である。ｙ軸は、これらの細胞数が骨髄の系列陰性細胞集団全体における割合として表されることを示す。

ナチュラルキラー細胞
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫系の中で最も高いレベルの細胞傷害活性を示す。ＮＫ細胞は、Ｂ細胞及びＴ細胞に類似しているが、特定の細胞表面抗原受容体を欠いている。代わりに、ＮＫ細胞は、モチーフを認識する、活性化及び阻害受容体を有する。

ＮＫ細胞は、血液並びにリンパ節及び脾臓などの末梢リンパ器官中を循環する。これらは、サイトカインにより、又は標的細胞に遭遇すると活性化された状態となり得る。標的細胞の認識及び除去は、阻害及び活性化シグナルの釣り合いに基づく。活性化シグナルは、リガンドに結合する活性化受容体（ＮＫＧ_２Ｄ、ＮＫｐ_４６、ＮＫｐ_３０）により生成され、これは、がん性細胞、病原体感染性細胞及び損傷した細胞だけでなく、健常な細胞にも存在し得る。一方、阻害シグナルは、ＮＫ細胞上の阻害受容体（ＫＩＲ、ＣＤ_９４／ＮＫＧ_２Ａ）が、通常すべての健常な細胞に存在する主要組織適合抗原（ＭＨＣ、Major Histocompatibility Complex）クラスＩ分子に結合する場合に生成される。標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子は、存在しないか、又は非常に下方制御され、そのため理想的なＮＫ細胞標的となっている。これによりＮＫ細胞が、標的と健常な細胞を識別することが可能となった。ＮＫ細胞が標的細胞を認識及び殺傷するために、活性化シグナル全体は、阻害シグナルよりも大きくなければならない。

ＮＫ細胞は、がん性細胞、病原体感染性細胞及び損傷した細胞を事前感作なしに認識及び殺傷し、そのためＮＫ細胞は、自然免疫応答の一部となっている。例えば、ＮＫ細胞は、ウイルス感染に対する初期応答をもたらし、その後、Ｔ細胞の感染細胞殺傷が生じる。ＮＫ細胞は、標的細胞を数分以内に殺傷することができる。ＮＫ細胞はまた、サイトカインを分泌し、免疫系の他の部分を「兵器化」する。例えば、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞エフェクター機能を増進させ、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ、antibody-directed cellular cytotoxicity）を増強する。

ＮＫ細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）から図１に提示する経路を介して分化する。より詳細には、ＮＫ細胞は、ＨＳＣからリンパ球系共通前駆（ＣＬＰ）細胞、プレＮＫ前駆（ｐｒｅ－ＮＫＰ）細胞、ＮＫ前駆（ＮＫＰ）細胞、未成熟ＮＫ（ｉＮＫ）細胞、成熟ＮＫ（ｍＮＫ）細胞、及び最終的に血流を循環する通常型ＮＫ（ｃＮＫ）細胞を発生させる。この用語は、マウスにおけるＮＫ細胞発生に由来するが、対応する経路は、ヒトＮＫ細胞発生においても生じる。例えば、ＨＳＣは、複数の先駆体の段階（段階１、２及び３）、その後の成熟ＮＫ細胞への発生（段階４及び５）を通じて発生する。一貫性のために、ＨＳＣ、ＣＬＰ、プレＮＫＰ、ＮＫＰ、ｉＮＫ、ｍＮＫ、ｃＮＫ及びＮＫ細胞の表現を本明細書において使用する。しかし、本発明の文脈において、これらの用語は、ヒト命名法の段階１～５と互換性を有する。図１の経路図の下部は、ＮＫ細胞発生に必須の、サイトカイン及び転写因子である。ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の発生に必要とされる主要なサイトカインの１つである。特定の間質細胞などの他の外因子はまた、ＮＫ細胞の発生及び成熟に必要とされる。本発明によれば、造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、ＨＳＣ、ＣＬＰ及びまたＮＫＰなどの多分化能前駆細胞を含有する不均質集団である。ＨＰＣは、発生経路にまだ深く関与していないため、系列陰性細胞と呼ばれる。したがって、本発明の文脈において、ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及びＮＫＰ細胞は、すべてＨＰＣであり、ＨＰＣに言及する場合、これと矛盾する明示的な記述がない限り、ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及び／若しくはＣＬＰ細胞のいずれか、又はこれらの任意の組合せへの言及となる。

免疫応答におけるＮＫ細胞の重要性のために、複数の臨床試験では、ＮＫ細胞の有効性を養子移植プロトコルにおいて試験した。典型的には、これは同種間の移植であり、ＮＫ細胞を健常なドナーから単離し、増殖させる。しかし、標的細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の下方制御は、部分的であり、ドナー及びレシピエント由来のＫＩＲ遺伝子型は、類似していてもよい。このため、レシピエントに注入されるＮＫ細胞は、様々な個人由来であっても、そのＫＩＲがＭＨＣクラスＩ分子を認識する場合、標的細胞に結合しない可能性がある。したがって、ＮＫ細胞ドナーをそのＫＩＲ遺伝子型についてスクリーニングしなければならないことは重要であり、ここでドナーは、標的細胞を認識して破壊することを可能とする、レシピエントに適切なＫＩＲ対立遺伝子多型を有していなければならない。その上、増殖させた産物は、臨床的成功率が予想よりも低く、がん性又は感染性細胞を殺傷する能力が低いことが見出されている。

ＮＫ細胞は、そのマーカー発現、その機能／活性、又はこれらの組合せの点から定義することができる。このような定義は、当分野において標準であり、マーカー発現及び／又はＮＫ細胞活性を評価し得る方法は、公知である。したがって、当業者は、標準的方法及び定義を使用して、細胞をＮＫ細胞として分類することが容易に可能である。

例えば、ｍＮＫ及びｃＮＫ細胞は、表面マーカーであるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）及び／又はＣＤ５６、典型的には、ヒトにおけるＣＤ１６とＣＤ５６の両方、並びにいくつかのマウス系統におけるＮＫ１．１又はＮＫ１．２の発現により認識することができる。ＮＫｐ４６は、ｍＮＫ及びｃＮＫ細胞の別のマーカーであり、ヒト及びいくつかのマウス系統において発現する。したがって、ＮＫｐ４６は、ＣＤ１６及び／若しくはＣＤ５６を（ヒトにおいて）有するか若しくは有しない、又はＮＫ１．１若しくはＮＫ１．２を（マウスにおいて）有するか若しくは有しないＮＫ細胞のマーカーとして使用することができる。本発明によるＮＫ細胞の同定／定義に使用され得るマーカーの他の例としては、Ｌｙ４９、ナチュラル細胞傷害性受容体（ＮＣＲ、natural cytotoxicity receptor）、ＣＤ９４、ＮＫＧ２、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ、killer-cell immunoglobulin-like receptor）及び／若しくは白血球阻害受容体（ＩＬＴ又はＬＩＲ、leukocyte inhibitory receptor）、或いはＣＤ１６及び／若しくはＣＤ５６（ヒトにおいて）又はＮＫ１．１／ＮＫ１．２（マウスにおいて）の組合せを含む、これらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による成熟ＮＫ細胞（即ち、ｍＮＫ及びｃＮＫ細胞）は、ＣＤ５６^＋及びＣＤ４５^＋であり、またＣＤ１６^＋であり得る。本明細書において使用する場合、成熟ヒトＮＫ細胞の用語は、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}（段階４）及びＣＤ５６^ｄｉｍ（段階５）であるＮＫ細胞を包含し、これらは、ともにＣＤ５６^＋である。成熟ＮＫ細胞はまた、ＣＤ３４、並びにリンパ球マーカーであるＣＤ３及び／又はＣＤ１９などのマーカーの非存在により定義することができる。したがって、本発明の成熟ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ３^－及び／若しくはＣＤ１９^－、又はＣＤ５６^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ３^－及びＣＤ１９^－など、これらの任意の組合せであり得る。

加えて又は或いは、ＮＫは、その活性の点から同定／定義することができる。例えば、ＮＫ細胞は、その細胞質内における細胞溶解性顆粒の存在により、αデフェンシンなどの抗菌分子を分泌するその能力、及び／又はＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－γ及びＴＦＧ－βなどのサイトカインを分泌するその能力により同定／定義することができる。

本明細書において他に記述がない限り、ＮＫ細胞に言及する場合、ｉＮＫ、ｍＮＫ及びｃＮＫ細胞への言及を含む。ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及びＮＫＰは、典型的にそれ自体を指す。

増殖ＮＫ細胞集団
本明細書において開示するように、本発明は、ＮＫ細胞の増殖させた集団（本明細書において、増殖ＮＫ細胞集団又はＮＫ細胞集団と互換的に呼ばれる）を生成する方法を提供する。本発明のＮＫ細胞に関する、本明細書における任意の開示はまた、本発明の増殖ＮＫ細胞集団に適用することができる。

したがって、本発明は、増殖ＮＫ細胞集団を提供する。典型的には、本発明の増殖ＮＫ細胞集団は、ｉＮＫ細胞、ｍＮＫ細胞及び／若しくはｃＮＫ細胞、又はこれらの組合せを含む。前記集団は、ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及び／若しくはＮＫＰ、又はこれらの組合せなどのＨＰＣを含み得るが、これらのＨＰＣの大部分が集団においてＮＫ細胞に分化しているため、このような細胞の数は、ＮＫ細胞の数に対して典型的に少ない。前記集団は、他の免疫及び／又は非免疫細胞を含み得る。また、このような任意の細胞の数は、集団に存在するＮＫ細胞の数に対して典型的に少ない。

非限定的な例として、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上、最大１００％の本発明の増殖ＮＫ細胞集団の細胞は、ＮＫ細胞であり得る。典型的には少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の本発明の増殖ＮＫ細胞集団の細胞は、ＮＫ細胞である。

いくつかの実施形態では、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上、最大１００％の本発明の増殖ＮＫ細胞集団の細胞は、成熟ＮＫ細胞（即ち、ｍＮＫ細胞及び／又はｃＮＫ細胞）である。好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及びさらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％又はそれ以上の本発明の増殖ＮＫ細胞集団の細胞は、成熟ＮＫ細胞である。

ＨＰＣ（ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及び／又はＮＫＰを含む）の数は、増殖させたＮＫ細胞集団の細胞の４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満であり得る。典型的には、ＨＰＣ（ＨＳＣ、ＣＬＰ細胞及び／又はＮＫＰを含む）の数は、増殖させたＮＫ細胞集団の細胞の２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満又はそれ以下である。

他の免疫及び／又は非免疫細胞の数は、増殖させたＮＫ細胞集団の細胞の４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満であり得る。典型的には、他の免疫及び／又は非免疫細胞の数は、増殖させたＮＫ細胞集団の２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％、さらにより好ましくは２％未満又はそれ以下である。

本明細書において記載するように、本発明の方法により作製した増殖ＮＫ細胞集団は、従来の養子移植方法により作製したＮＫ細胞集団に対していくつかの利点を提供する。特に、本発明の方法は、従来の方法と比較して、より多数のＮＫ細胞を有する増殖ＮＫ細胞集団の産生を可能とする。さらに、本発明の集団における、より大きい割合のＮＫ細胞は、機能性であり、好ましくは、多数のＮＫ細胞が「疲弊した」従来の方法により得られる集団と比較して、完全に機能性である。

本明細書において使用する場合、用語「疲弊した」は、ＮＫ細胞の文脈において、ＮＫ細胞又は増殖ＮＫ細胞集団が、細胞傷害機能、サイトカイン産生及び／又はＡＤＣＣなど、エフェクター機能のうちの少なくともいくつかを失ったことを意味する。したがって、疲弊したＮＫ細胞又は増殖ＮＫ細胞集団は、生着の障害、細胞傷害機能の障害、サイトカイン産生の変化若しくは障害及び／又はＡＤＣＣの障害を示し得る。例えば、疲弊したＮＫ細胞又は疲弊したＮＫ細胞集団は、そのエフェクター機能のうちの１つの少なくとも５０％の減少を示し得る。例えば、サイトカイン分泌の少なくとも５０％の減少、ＡＤＣＣの少なくとも５０％の減少及び／又は細胞傷害活性の少なくとも５０％の減少を示し得る。これらの値は、本明細書において定義する適切な任意の対照に対して定量化され得る。適切な任意の技術を使用してエフェクター機能を判定し、したがって、それにより定量及び減少させることができる。適した技術は、当分野において公知である。或いは及び／又は加えて、疲弊したＮＫ細胞は、１つ若しくは２つ以上の（本明細書に記載の）阻害受容体の発現の増加及び／又は１つ若しくは２つ以上の（本明細書に記載の）活性化受容体の発現の減少などのマーカー発現の変化を示し得る。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａ及び／又はＴｉｍ３の発現の増加は、ＮＫ細胞疲弊のマーカーとして使用され得る。また、これらのマーカーの発現は、本明細書において定義する適切な任意の対照に対して定量化され得る。

対照的に、用語「機能性」及び「完全に機能性」は、ＮＫ細胞の文脈において、ＮＫ細胞又は増殖ＮＫ細胞集団が、所与の免疫チャレンジに応答する場合、予想されるエフェクター機能のすべてを有することを意味する。したがって、（完全に）機能性のＮＫ細胞又は増殖ＮＫ細胞集団は、ＮＫ細胞が免疫チャレンジに応答して活性化される場合にインビボで観察されるような、細胞傷害機能、サイトカイン産生及び／又はＡＤＣＣを典型的に示し、従来の方法を使用して産生したＮＫ細胞と比較して生着の増強を典型的に示す。或いは及び／又は加えて、（完全）機能性ＮＫ細胞は、１つ若しくは２つ以上の（本明細書に記載の）活性化受容体の発現の増加及び／又は１つ若しくは２つ以上の（本明細書に記載の）阻害受容体の発現の減少などのマーカー発現の変化を示し得る。非限定的な例として、機能性（成熟）ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋及び／又はＣＤ４５^＋、好ましくはＣＤ５６^＋とＣＤ４５^＋の両方であり得る。

非限定的な例として、ＮＫ細胞の細胞傷害性は、「標的細胞」と共インキュベートしたＮＫ細胞における脱顆粒アッセイを使用して判定することができる。脱顆粒アッセイは、ＮＫ細胞集団におけるＣＤ１０７ａの発現の分析を含む。ＣＤ１０７ａの量は、サイトカイン分泌及びＮＫ細胞媒介性の標的細胞の溶解と相関する。ＮＫ細胞はまた、機能性ＮＫ細胞が活性化される場合に分泌される主要なサイトカインである、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の発現について分析することができる。機能性のＮＫ細胞は、対照と比較した場合、ＣＤ１０７ａ並びにＩＦＮ－γを同様に又は高く発現するはずである。

本発明の方法により作製した増殖ＮＫ細胞集団におけるＮＫ細胞数／機能性の任意の増加は、本明細書に記載の対照方法により得られたＮＫ細胞集団のＮＫ細胞数／機能と比較することができる。対照方法は、ＮＫ細胞集団を産生するための当分野において公知の任意の標準的方法であってもよい。例えば、対照方法は、本発明によるＲＥＶ－ＥＲＢ阻害物質を使用する方法ではなく従来の養子移植技術を使用し得る。このような対照／標準方法により産生したＮＫ細胞及びＮＫ細胞集団は、本明細書に記載の対照細胞及び集団として使用され得る。

本発明の増殖ＮＫ細胞集団が、従来法で調製したＮＫ細胞集団と比較して優位に少ない疲弊したＮＫ細胞を含むが、代わりに、より高い割合の完全機能性ＮＫ細胞を含有するため、これにより患者を治療するために細胞をより少量使用することが有利にも可能となる。

本明細書において記載するように、本発明の方法は、大量の「疲弊した」ＮＫ細胞を有する集団を産生する従来の方法と比較してより高い割合の（完全）機能性ＮＫ細胞を有する増殖させたＮＫ細胞集団を産生する。典型的には、本発明の増殖ＮＫ細胞集団において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上、最大１００％の本発明の増殖ＮＫ細胞集団のＮＫ細胞は、（完全）機能性である。典型的には、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％又はそれ以上の本発明の増殖ＮＫ細胞集団のＮＫ細胞は、本明細書の任意の定義（例えば、マーカー及び／又はエフェクター機能の定義）に従って完全機能性である。

本発明の増殖ＮＫ細胞集団は、本明細書に開示の任意の方法により産生することができる。典型的には、本発明の増殖ＮＫ細胞集団は、本明細書に開示のエクスビボ方法により産生する。

Ｅ４ｂｐ４
Ｅ４ｂｐ４（Ｎｆｉｌ３としても公知）は、塩基性ロイシンジッパータンパク質転写因子であり、これはＩＬ－３発現の制御に関与し、概日時計の調整に関与する。ヒトＥ４ｂｐ４遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６４３１８、バージョンＸ６４３１８．１）に示す。図１に示すように、Ｅ４ｂｐ４は、ＣＬＰにおいて発現し、血液幹前駆細胞からのＮＫ細胞の産生において重要である。Ｅ４ｂｐ４遺伝子が欠失したマウスは、機能性ＮＫ細胞を有しないが、正常数のＴ及びＢ細胞を有する。対照的に、インビトロでのＨＳＣにおけるＥ４ｂｐ４の過剰発現により、ＮＫ細胞産生が増加する。したがって、Ｅ４ｂｐ４は、ＨＳＣからのＮＫＰの発生を制御する、系列分化決定因子である（図１）。抹消ｍＮＫ細胞におけるＥ４ｂｐ４の特異的消失が、ＮＫ細胞数又はサイトメガロウイルス感染に対する応答に影響しないため、Ｅ４ｂｐ４のＮＫ細胞における重要な機能は、発生経路の初期段階に特異的である。加えて、Ｅ４ｂｐ４は、Ｉｄ２及びＥｏｍｅｓなど、ＮＫ細胞発生において必須である他の転写因子を調節する。

ＩＬ－７及びＩＬ－１５は、Ｅ４ｂｐ４発現を調節することが示されているが、一般に、外因性又は内因性の刺激がＥ４ｂｐ４にどのように影響するのかについては、ほとんど知られていない。Ｅ４ｂｐ４などの転写因子は、その構造及び機能のため、標的化することが困難であり得る。例えば、これらは通常、酵素活性又は補助因子結合部位を欠いている。しかし、本明細書の実施例において実証するように、本発明者らは、Ｅ４ｂｐ４発現が、ＲＥＶ－ＥＲＢの活性を阻害する化合物を使用して増加し得ることを見出した。さらに、本発明者らは、Ｅ４ｂｐ４発現を増加させるＲＥＶ－ＥＲＢ阻害物質の使用により、ＮＫ細胞数の増加がもたらされることを実証した。理論に束縛されることは望まないが、ＲＥＶ－ＥＲＢは、ポルフィリンヘムに結合し、この特徴によりＲＥＶ－ＥＲＢが新薬の開発につながる標的となると考えられる（下記参照）。まとめると、本発明者らは、ＲＥＶ－ＥＲＢを標的化し、その活性を阻害することにより、Ｅ４ｂｐ４発現を増加させ、これにより、ＮＫ細胞数を増加させることが可能であることを示した。したがって、本発明は、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物、並びにＥ４ｂｐ４発現の増加、及びこれによるＮＫ細胞数の増加におけるその使用に関係する。

Ｅ４ｂｐ４発現の増加
したがって、本発明は、増殖させたＮＫ細胞集団を産生するためのエクスビボ方法、並びにそれを必要とする患者においてＮＫ細胞数を増加させるための治療的方法及び適用を提供する。本明細書において開示するように、前記方法及び適用は、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物の使用を含む。典型的には、前記化合物は、Ｅ４ｂｐ４発現を増加させることにより作用する。

Ｅ４ｂｐ４発現の増加は、対照に対して測定することができる。したがって、ＨＰＣ、増殖させたＮＫ細胞集団の試料、又は本発明により治療する患者から得られた試料におけるＥ４ｂｐ４発現は、対照におけるＥ４ｂｐ４発現と比較し得る。発現は、遺伝子及び／又はタンパク質発現の点から定量化することができ、対照（例えば、ハウスキーピング遺伝子又はタンパク質）の発現と比較することができる。Ｅ４ｂｐ４遺伝子、ｍＲＮＡ転写物及び／若しくはタンパク質の質量、モル量、濃度若しくはモル濃度のような、Ｅ４ｂｐ４遺伝子、ｍＲＮＡ転写物及び／若しくはタンパク質の実際量、又はＨＰＣ、増殖させたＮＫ細胞集団の試料若しくは本発明により治療する患者及び対照から得られた試料中１細胞あたりのｍＲＮＡ分子の数は、評価し、対照から得られた対応する値と比較することができる。或いは、ＨＰＣ、増殖ＮＫ細胞集団の試料、又は本発明により治療する患者から得られた試料におけるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、１つ又は２つ以上の遺伝子及び／又はタンパク質の質量、モル量、濃度又はモル濃度を定量化することなく、対照のＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現と比較することができる。

典型的には、対照は、Ｅ４ｂｐ４発現の増加が影響しない等価な集団又は試料である。非限定的な例として、Ｅ４ｂｐ４発現を増加させるためにＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物により患者を治療する場合、適した対照は、化合物を投与されていない異なる個体、又は化合物を投与する前の同一の個体であり得る。公知の方法を含む、エクスビボでのＮＫ細胞の増殖のための従来の方法は、本発明による対照方法であると考えることができる。

本発明の文脈において、Ｅ４ｂｐ４発現の増加に言及する場合、Ｅ４ｂｐ４発現が、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％増加することを意味すると理解され得る。典型的には、Ｅ４ｂｐ４発現は、対照と比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％又はそれ以上増加する。

Ｅ４ｂｐ４発現の増加に言及する場合、Ｅ４ｂｐ４発現が、対照に対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はそれ以上増加することを意味すると理解され得る。典型的には、Ｅ４ｂｐ４遺伝子発現は、対照と比較して少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍又はそれ以上増加する。典型的には、Ｅ４ｂｐ４タンパク質発現は、対照と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも６倍又はそれ以上増加する。

本発明によるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、定量的及び／又は定性的分析により判定することができる。典型的には、遺伝子発現は、ｍＲＮＡレベルの点から表すことができる。

本発明によるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、Ｅ４ｂｐ４ ｍＲＮＡ転写物及び／又はタンパク質の質量、Ｅ４ｂｐ４遺伝子、ｍＲＮＡ転写物及び／又はタンパク質のモル量、Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の濃度、並びにＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質のモル濃度を包含する。この発現レベルは、適切な任意の単位で示すことができる。例えば、Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の濃度は、ｐｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｍｌ又はμｇ／ｍｌで示すことができる。

本発明によるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、直接的又は間接的に測定することができる。

本発明によるＥ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の相対発現量は、対照に対して、適切な任意の技術を使用して判定することができる。適した標準的技術は、当分野において公知であり、例えば、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及びＲＴ－ｑＰＣＲである。

Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、対照と比較して少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間増加し得る。好ましくは、Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、少なくとも１２～７２時間増加する。典型的には、これは、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害する化合物の最後の投与に対して評価される。

Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、対照と比較して少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回又はそれ以上の培養中のＮＫ細胞先駆体の継代で増加し得る。Ｅ４ｂｐ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルは、無制限に変化し得る。

ＲＥＶ－ＥＲＢ
ＲＥＶ－ＥＲＢタンパク質は、細胞内転写因子の核内受容体ファミリーのメンバーである。ヒトＲＥＶ－ＥＲＢα遺伝子（Ｎｒ１ｄ１）のｍＲＮＡ配列は、配列番号３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１７２４、バージョンＮＭ＿０２１７２４．４）に示す。ヒトＲＥＶ－ＥＲＢβ遺伝子（Ｎｒ１ｄ２）のｍＲＮＡ配列は、配列番号５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ３０７６９３、バージョンＡＢ３０７６９３．１）に示す。ＲＥＶ－ＥＲＢは、概日時計を調節し、軟骨組織の崩壊の調節とも関係づけられている。これは、ＲＥＶ－ＥＲＢαノックアウトマウスでは、対応する野生型マウス系統と比較してＴＨ１７細胞の数が減少するとこれまでに示されてきた。しかし、ＮＫ細胞発生におけるＲＥＶ－ＥＲＢの役割は、これまでに検討されていなかった。

Ｅ４ｂｐ４発現の対照は、Ｅ４ｂｐ４制御領域に結合する多くの転写因子を含む複雑な多成分性機序であり、ＲＥＶ－ＥＲＢは、その１つにすぎない。本発明者らは、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性の阻害が、Ｅ４ｂｐ４発現の顕著な増加を誘発するのに十分であり、次いで、これによりＮＫ細胞の増殖がもたらされて、ＮＫ細胞数の増加が生じることを初めて実証した。本明細書の実施例において実証するように、本発明者らは、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性の阻害によりＮＫ細胞数の増加がもたらされる可能性があり、典型的には、得られるＮＫ細胞が、本明細書に定義するように（完全）機能性であることを初めて実証した。本発明者らは、ＲＥＶ－ＥＲＢ阻害効果が、Ｅ４ｂｐ４依存的に媒介されることをさらに実証した。理論に束縛されることは望まないが、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害すると、Ｅ４ｂｐ４発現が増加し（Ｅ４ｂｐ４発現は、通常、ＲＥＶ－ＥＲＢにより抑制される）、Ｅ４ｂｐ４が、ＮＫ細胞の産生を刺激するように作用する（図１に示すように）と考えられる。特に、本発明者らは、低分子のＳＲ８２７８をＲＥＶ－ＥＲＢのポルフィリンヘム部分に結合させて、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性の阻害及びＮＫ細胞数の増加を生じさせることが可能であることを実証した。

したがって、本発明は、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物、並びにＥ４ｂｐ４発現の増加、及びこれによるＮＫ細胞数の増加におけるその使用に関係する。

ＲＥＶ－ＥＲＢ活性の阻害
本発明は、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物、即ち、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害する化合物の使用に関する。ＲＥＶ－ＲＥＢ活性は、適切な任意の手段により阻害することができる。適した標準的技術は、当分野において公知である。阻害は、例えば、使用する化合物の性質（下記参照）、例えば、任意の直接的又は間接的相互作用における立体的干渉又はＲＥＶ－ＥＲＢの阻害に応じた、適した任意の機序により生じ得る。本発明の文脈において、ＲＥＶ－ＥＲＢ阻害物質（本明細書においてＲＥＶ－ＥＲＢアンタゴニストと互換的に呼ばれる）は、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を部分的又は完全に阻害、減少、抑制又は除去する任意の化合物である。

ＲＥＶ－ＥＲＢ活性の減少は、対照に対して測定することができる。したがって、ＮＫ先駆若しくは前駆細胞、増殖させたＮＫ細胞集団の試料中、又は本発明により治療する患者から得られた試料中のＲＥＶ－ＥＲＢ活性は、対照におけるＲＥＶ－ＥＲＢ活性と比較することができる。活性は、任意の適切な観点、例えば、ＲＥＶ－ＥＲＢのＥ４ｂｐ４遺伝子との結合、又は本明細書に定義するＥ４ｂｐ４発現の観点から定量化することができる。任意の適切な技術又は方法は、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性の定量化に使用することができる。適した技術は、当分野において公知であり、例えば、ルシフェラーゼアッセイを使用してレポーター遺伝子の発現を定量化する。

典型的には、対照は、ＲＥＶ－ＥＲＢ阻害化合物を添加していない、等価な集団又は試料、例えば、化合物を投与していない異なる個体、又は化合物を投与する前の同一の個体から得られた試料である。公知の方法を含む、エクスビボでのＮＫ細胞の増殖のための従来の方法は、本発明による対照方法であると考えることができる。

本発明の文脈において、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性の阻害に言及する場合、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性が、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％減少し、最大で完全に（１００％）ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害することを意味すると理解され得る。典型的には、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性は、対照と比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％又はそれ以上減少する。

ＲＥＶ－ＥＲＢの活性は、定量的及び／又は定性的分析により判定することができ、直接的又は間接的に測定することができる。

対照に対するＲＥＶ－ＥＲＢ活性は、適切な任意の技術を使用して判定することができる。適した標準的技術は、当分野において公知であり、例えば、Ｅ４ｂｐ４発現の定量化、及び／又はルシフェラーゼアッセイによる。

ＲＥＶ－ＥＲＢの活性は、対照と比較して少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間阻害され得る。好ましくは、ＲＥＶ－ＥＲＢの活性は、少なくとも１２～７２時間減少する。典型的には、これは、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害する化合物の最後の投与に対して評価される。

ＲＥＶ－ＥＲＢの活性は、対照と比較して少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回又はそれ以上の細胞の継代で阻害され得る（インビボ、又はエクスビボ若しくはインビトロで培養）。ＲＥＶ－ＥＲＢの活性は、阻害される可能性があり、並びに／又はＥ４ｂｐ４遺伝子及び／若しくはタンパク質の発現レベルは、無制限に変化し得る。

本発明の文脈において、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性の阻害に任意に言及する場合、ＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβの活性を阻害することを意味すると理解され得る。好ましい実施形態では、ＲＥＶ－ＥＲＢαとＲＥＶ－ＥＲＢβの両方の活性が阻害される。したがって、本発明は、ＲＥＶ－ＥＲＢα活性を阻害する化合物（即ち、ＲＥＶ－ＥＲＢαアンタゴニストとも呼ばれる、ＲＥＶ－ＥＲＢα阻害物質）及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβ活性を阻害する化合物（即ち、ＲＥＶ－ＥＲＢβアンタゴニストとも呼ばれる、ＲＥＶ－ＥＲＢβ阻害物質）を含む、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害する化合物に関する。好ましい実施形態では、本発明は、ＲＥＶ－ＥＲＢαとＲＥＶ－ＥＲＢβの両方の活性を阻害する化合物（即ち、ＲＥＶ－ＥＲＢα及びＲＥＶ－ＥＲＢβ阻害物質、ＲＥＶ－ＥＲＢα及びＲＥＶ－ＥＲＢβアンタゴニストとも呼ばれる）に関する。

ＲＥＢ－ＥＲＢアンタゴニスト／阻害物質
本発明の化合物は、ＲＥＶ－ＥＲＢに特異的であり得る。特異的については、化合物が、ＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβに結合し、他のいかなる分子、特に他のいかなるタンパク質に対しても顕著な交差反応性がないことが理解される。例えば、ＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβに特異的な修飾物質は、ヒト好中球エラスターゼとの顕著な交差反応性を示さない。交差反応性は、任意の適した方法により評価することができる。ＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβ阻害物質のＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβ以外の分子との交差反応性は、阻害物質が他の分子に少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％ＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβに結合するときと同程度に強く結合する場合に顕著であると考えられ得る。ＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβに特異的な阻害物質は、ヒト好中球エラスターゼなどの別の分子と９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満のＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβに結合する強度で結合し得る。好ましくは、阻害物質は、他の分子に２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満、２％未満又は１％未満のＲＥＶ－ＥＲＢα及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢβに結合する強度で結合する。

本発明の化合物は、オフターゲット効果を有し得る。オフターゲット効果は、ＲＥＶ－ＥＲＢ以外の標的に対する活性である。典型的には、オフターゲット効果を有する化合物は、非ＲＥＶ－ＥＲＢ標的に対する活性が、ＲＥＶ－ＥＲＢに対する活性と比較して顕著でない場合に、本発明により包含される。オフターゲット効果が顕著であるかどうかは、化合物の対象となる使用に依存し得る。非限定的な例として、オフターゲット効果を中枢神経系にもたらし得る化合物は、本明細書に開示するエクスビボ方法において使用する化合物にとって重要ではないが、本明細書に開示するインビボでの治療適応にとって重要であり得る（オフターゲット効果の規模に応じて）。潜在的な任意のオフターゲット効果の存在及び規模は、当分野において公知の標準的方法を使用して容易に評価することができる。

適した任意の阻害物質、例えば、低分子、ＰＲＯＴＡＣ試薬、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス（一本鎖）ＲＮＡ、ペプチド及びペプチドミメティック、抗体、アプタマー並びにリボザイムは、本発明に従って使用することができる。好ましい阻害物質は、低分子及びＰＲＯＴＡＣ試薬を含む。

低分子
低分子は、本明細書に記載するＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害するために使用することができる。本明細書に定義するように、低分子は、低分子量化合物、典型的には、有機化合物である。典型的には、低分子は、９００Ｄａの最大分子量を有し、細胞膜を通過して急速な拡散を可能とする。いくつかの実施形態では、低分子の最大分子量は、５００Ｄａである。典型的には、低分子は、１ｎｍほどのサイズを有する。

本発明によれば、低分子は、ＲＥＶ－ＥＲＢのポルフィリンヘム部分に結合することによりＲＥＶ－ＥＲＢ活性に阻害効果をもたらすことができる。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物は、ＲＥＶ－ＥＲＢのポルフィリンヘム部分に結合し、これによりＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物である。或いは、低分子は、異なる機序により、例えば、ＲＥＶ－ＥＲＢの非ヘム部分に結合することにより作用し得る。低分子の産生のための標準的技術は、当分野において公知であり、この低分子は、本明細書に記載するＲＥＶ－ＥＲＢ阻害作用について容易に試験することができるものである。

ポルフィリンヘムの構造

好ましい実施形態では、本発明は、本明細書においてＲＥＶ－ＥＲＢ阻害物質としてＳＲ８２７８と呼ばれる、低分子１，２，３，４－テトラヒドロ－２－［［５－（メチルチオ）－２－チエニル］カルボニル］－３－イソキノリンカルボン酸エチルエステルに関する。

ＳＲ８２７８の構造

本発明はまた、ＳＲ８２７８のＲＥＶ－ＥＲＢ阻害機能を保持するＳＲ８２７８の変異体の使用を包含する。

ＲＥＶ－ＥＲＢ活性に阻害作用をもたらす任意の低分子は、本発明によるＲＥＶ－ＥＲＢ阻害物質として使用することができる。このような低分子阻害物質はまた、ＲＥＶ－ＥＲＢに結合し得る。本発明によるＲＥＶ－ＥＲＢ阻害物質として使用することができる他の低分子の例としては、４－［［［１－（２－フルオロフェニル）シクロペンチル］アミノ］メチル］－２－［（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル］フェノール（本明細書においてＡＲＮ５１８７とも呼ばれる）、エチル２－（５－メチルフラン－２－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレート、４－（（４－クロロベンジル）（（５－ニトロチオフェン－２－イル）メチル）アミノ）－Ｎ－フェニルピペリジン－１－カルボキサミド、４－（（（１－（４－フルオロフェニル）シクロペンチル）アミノ）メチル）－２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）フェノール、１－（２－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミン及び１－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミンが挙げられる。

ＡＲＮ５１８７の構造

エチル２－（５－メチルフラン－２－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレートの構造

４－（（４－クロロベンジル）（（５－ニトロチオフェン－２－イル）メチル）アミノ）－Ｎ－フェニルピペリジン－１－カルボキサミドの構造

４－（（（１－（４－フルオロフェニル）シクロペンチル）アミノ）メチル）－２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）フェノールの構造

１－（２－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミンの構造

１－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミンの構造

本発明はまた、ＡＲＮ５１８７、エチル２－（５－メチルフラン－２－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレート、４－（（４－クロロベンジル）（（５－ニトロチオフェン－２－イル）メチル）アミノ）－Ｎ－フェニルピペリジン－１－カルボキサミド、４－（（（１－（４－フルオロフェニル）シクロペンチル）アミノ）メチル）－２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）フェノール、１－（２－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミン又は１－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミンのＲＥＶ－ＥＲＢ阻害機能をそれぞれ保持する、ＡＲＮ５１８７、エチル２－（５－メチルフラン－２－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレート、４－（（４－クロロベンジル）（（５－ニトロチオフェン－２－イル）メチル）アミノ）－Ｎ－フェニルピペリジン－１－カルボキサミド、４－（（（１－（４－フルオロフェニル）シクロペンチル）アミノ）メチル）－２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）フェノール、１－（２－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミン又は１－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミンの変異体の使用を包含する。

ＰＲＯＴＡＣ試薬
タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ又はＰＲＯＴＡＣ試薬とも呼ばれる）は、本明細書に記載するＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害するために使用することができる。ＰＲＯＴＡＣは、標的タンパク質とユビキチンリガーゼを同時に結合させて、標的のユビキチン化及び分解を可能とするヘテロ二機能性低分子である。より詳細には、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、典型的に、標的タンパク質（本発明の場合は、ＲＥＶ－ＥＲＢ）のリガンド及びＥ３リガーゼ認識ドメインのリガンドを含む。このようなＰＲＯＴＡＣの使用により、Ｅ３リガーゼをＰＲＯＴＡＣ結合ＲＥＶ－ＥＲＢに動員して、ユビキチンのＥ３リガーゼ複合体から標的タンパク質（本発明の場合は、ＲＥＶ－ＥＲＢ）への移行を誘導する。ＰＲＯＴＡＣが標的のユビキチン化を十分な程度誘導すると、このＰＲＯＴＡＣはプロテアソームにより認識及び分解される。

非限定的な例として、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、Ｅ３リガーゼのリガンドを本明細書に記載の低分子阻害物質（好ましくはＳＲ８２７８）にリンカーを介してコンジュゲートさせることにより生成することができる。好ましい実施形態では、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、本発明の低分子阻害物質にリンカーを介して連結する、Ｅ３ ＲＩＮＧ Ｃｕｌｌｉｎリガーゼのフォンヒッペル・リンドウタンパク質（ＶＨＬ、von Hippel Lindau）又はＣＲＬ４ Ｅ３ ＲＩＮＧ Ｃｕｌｌｉｎリガーゼ複合体の一部である、セレブロンのリガンドを含む。いくつかの特に好ましい実施形態では、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、ＳＲ８２７８にリンカーを介して連結するＥ３ ＲＩＮＧ Ｃｕｌｌｉｎリガーゼのフォンヒッペル・リンドウタンパク質（ＶＨＬ）のリガンドを含む。他の特に好ましい実施形態では、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、リンカーを介して連結する、セレブロン（ＣＲＬ４ Ｅ３ ＲＩＮＧ Ｃｕｌｌｉｎリガーゼ複合体の一部）及びＳＲ８２７８を含む。

その作用機序のため、ＰＲＯＴＡＣ試薬は、標的タンパク質の任意のリガンドを単純に必要とする。リガンドの機能的薬理学は、リンカー及びＥ３リガーゼリガンドの非存在下では、重要ではない。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＥＶ－ＥＲＢ阻害ＰＲＯＴＡＣ試薬は、ＧＳＫ４１１２（１，１－ジメチルエチルＮ－［（４－クロロフェニル）メチル］－Ｎ－［（５－ニトロ－２－チエニル）メチル］グリシネート、ＳＲ６４５２）などの、低分子ＲＥＶ－ＥＲＢアゴニストをリガンドとして含むことができる。

二本鎖ＲＮＡ
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、本明細書に記載するようにＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害するために使用することができる。ｄｓＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉにおいてＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害するために使用することができる。

公知の技術を使用しＲＥＶ－ＥＲＢの配列の知識に基づいて、ｄｓＲＮＡ分子は、対応するＲＮＡ配列の配列相同性に基づいた標的化によりＲＥＶ－ＥＲＢと拮抗するように設計することができる。このようなｄｓＲＮＡは、典型的に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。このようなｄｓＲＮＡの配列は、ＲＥＶ－ＥＲＢをコードするｍＲＮＡの部分の配列と対応する部分を含む。この部分は、通常、ＲＥＶ－ＥＲＢ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ内における標的部分と１００％相補的であるが、より低いレベルの相補性（例えば、９０％若しくはそれ以上又は９５％若しくはそれ以上）もまた使用することができる。典型的には、％相補性は、近接する核酸残基の長さに対して判定される。本発明のｄｓＲＮＡ分子は、例えば、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個又はそれ以上の核酸残基に対して測定した、ＲＥＶ－ＥＲＢ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ内における標的部分に対する少なくとも８０％の相補性を有することができ、このｄｓＲＮＡ分子は、最大で、その全長に対して測定した、本発明のＲＥＶ－ＥＲＢ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ内における標的部分に対する少なくとも８０％の相補性を有する。

好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、任意の適切な手段によりＮＫ細胞先駆体に送達することができる。適した技術は、当分野において公知であり、ｓｈＲＮＡを送達するためのプラスミド、ウイルス及び細菌ベクターの使用を含む。典型的には、ｓｈＲＮＡは、ウイルスベクター送達システムを使用して送達される。好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

一般に、ｓｈＲＮＡがＮＫ先駆細胞に送達されると、核内で転写及びプロセシングされる。得られたプレｓｈＲＮＡは、核から搬出され、次いで、ダイサーによりプロセシングされ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内にロードされる。センス（パッセンジャー）鎖は、分解される。アンチセンス（ガイド）鎖は、相補的配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを向かわせる。相補性が完全である場合は、ＲＩＳＣは、ｍＲＮＡを切断する。相補性が不完全である場合は、ＲＩＳＣは、ｍＲＮＡの翻訳を抑制する。これらの場合の両方において、ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子サイレンシングを誘導する。

変異体配列は、適切な任意の配列長に対して測定された、本発明のｓｈＲＮＡ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。典型的には、％配列同一性は、近接する核酸又はアミノ酸残基の長さに対して判定される。本発明の変異体配列は、例えば、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個又はそれ以上の核酸又はアミノ酸残基に対して測定した、本発明の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。

例えば、本発明の変異体ｓｈＲＮＡ分子は、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個又はそれ以上の核酸残基に対して測定した、本発明のｓｈＲＮＡ分子と少なくとも８０％の配列同一性を有することができ、この変異体ｓｈＲＮＡ分子は、最大で、変異体ｓｈＲＮＡ分子の全長に対して測定した、本発明のｓｈＲＮＡ分子と少なくとも８０％の配列同一性を有する。

アンチセンスＲＮＡ
アンチセンスＲＮＡとしても公知の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子は、本明細書に記載するようにＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害するために使用することができる。

公知の技術を使用しＲＥＶ－ＥＲＢ遺伝子の配列の知識に基づいて、アンチセンスＲＮＡ分子は、対応するＲＮＡの配列相同性に基づいた標的化によりＲＥＶ－ＥＲＢ遺伝子に拮抗するように設計することができる。このようなアンチセンスの配列は、ＲＥＶ－ＥＲＢ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの部分のそれと対応する部分を含む。この部分は、通常、転写されたｍＲＮＡにおける標的部分と１００％相補的であるが、より低いレベルの相補性（例えば、９０％若しくはそれ以上又は９５％若しくはそれ以上）もまた使用することができる。

アプタマー
アプタマーは、一般に、特定の標的分子に結合する核酸分子である。アプタマーは、完全にインビトロで改変することができ、化学合成により容易に産生され、所望の保管特性を有し、治療上の適用において免疫原性をほとんど又は全く誘発しない。これらの特徴により、このアプタマーは、薬学的及び治療的有用性において特に役立つものとなる。

本明細書において使用する場合、「アプタマー」は、一般に、一本又は二本鎖オリゴヌクレオチド又はこのようなオリゴヌクレオチドの混合物を指し、このオリゴヌクレオチド又は混合物は、標的に特異的に結合することが可能である。オリゴヌクレオチドアプタマーは、本明細書において検討するが、当業者は、等価な結合特性を有する他のアプタマー、例えば、ペプチドアプタマーをまた使用することができることを認識する。

一般には、アプタマーは、長さが少なくとも５個、少なくとも１０個又は少なくとも１５個のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含むことができる。アプタマーは、長さが最大４０個、最大６０個又は最大１００個又はそれ以上のヌクレオチドである配列を含むことができる。例えば、アプタマーは、長さが５～１００個のヌクレオチド、１０～４０個のヌクレオチド、又は１５～４０個のヌクレオチドであってもよい。可能であれば、他の分子又は物質により干渉を誘導しにくいことが多いため、より短い長さのアプタマーが好ましい。

アプタマーは、試験管内選択（ＳＥＬＥＸ、Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）法などの常法を使用して生成することができる。ＳＥＬＥＸは、標的分子に高度に特異的に結合する核酸分子のインビトロでの選択のための方法である。これは、例えば、米国特許第５，６５４，１５１号、米国特許第５，５０３，９７８号、米国特許第５，５６７，５８８号及びＷＯ９６／３８５７９に記載されている。

ＳＥＬＥＸ法は、核酸アプタマー及び特に所望の標的に結合可能な一本鎖核酸をオリゴヌクレオチドのコレクションから選択するステップを含む。一本鎖核酸のコレクション（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらの変異体）を結合に好都合な条件下で標的に接触させ、混合物中で標的に結合した核酸を結合しない核酸から分離し、核酸標的複合体を解離させ、標的に結合した核酸を増幅して所望の結合活性を有する核酸を濃縮したコレクション又はライブラリーを得、次いで、この一連のステップを必要に応じて繰り返して適切な標的に対して特異的な結合親和性を有する核酸（アプタマー）のライブラリーを生成する。

ペプチドミメティック
ペプチドミメティックは、生物学的標的と相互作用する能力を有する天然ペプチド又はタンパク質を模倣し、同一の生物学的作用を生じる化合物である。ペプチドミメティックは、天然ペプチドと関連する安定性及びバイオアベイラビリティに関して、ペプチドに対する利点を有し得る。ペプチドミメティックは、生物学的機能のために設計した親ペプチドの主鎖又は側鎖修飾を有し得る。ペプチドミメティックのクラスの例としては、ペプトイド及びβペプチド、並びにＤアミノ酸を組み込むペプチドを含むが、これらに限定されない。

抗体
抗体は、本明細書に記載するようにＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害するために使用することができる。

本明細書に使用する場合、抗体の用語は、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体、並びにモノクローナル若しくはポリクローナル抗体の抗原結合断片、又はＲＥＶ－ＥＲＢに特異的に結合するペプチドの使用を包含する。抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ又はｄＡｂであってもよい。

変異体配列
少なくとも８０％の配列同一性は、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％及び１００％の配列同一性（本明細書に提示する、ありとあらゆる配列及び／又は本明細書に提示する、ありとあらゆる配列番号に対する）を含む。

多様な任意の配列アラインメント方法は、包括的方法、個別的方法及びハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法等をこれらに限定することなく含む、パーセント同一性を判定するために使用することができる。パーセント同一性を判定するプロトコルは、当業者の範囲内における日常的手順である。包括的方法では、分子の初めから終わりまでの配列を整列させ、それぞれの残基対のスコアを加算することにより、及びギャップペナルティを課すことにより最良のアラインメントを判定する。非限定的な方法としては、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照；及び反復改良、例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Bioｌ. 823-838 (1996)を参照、が挙げられる。個別的方法では、入力したすべての配列に共有される１つ又は２つ以上の保存モチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法としては、例えば、Match-box、例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)を参照；Gibbs sampling、例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131) Science 208-214 (1993)を参照；Align-M、例えば、Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20 (9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照、が挙げられる。したがって、パーセント配列同一性は、従来の方法により判定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。

上記に提供する特定の配列の変異体は、変異体配列と上記に提供する特定の参照配列との間で異なるヌクレオチド又はアミノ酸の数を列挙することにより代替的に定義することができる。したがって、一実施形態では、配列は、５以下、４以下、３以下、２以下のヌクレオチドの位置、例えば、１以下のヌクレオチドの位置で上記に提供する特定の配列と異なるヌクレオチド配列を含む（又はからなる）ことができる。保存的置換が好ましい。

本発明の変異体核酸分子及びペプチドは、典型的に、本発明の対応する分子の活性を依然として保持する。したがって、例えば、本発明の変異体ｓｈＲＮＡ分子は、対応するｓｈＲＮＡ分子の能力を保持してＲＥＶ－ＥＲＢの発現を阻害する。変異体ｓｈＲＮＡ分子は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％までの本発明のｓｈＲＮＡ分子の調節活性を保持し得る。これは、本発明の阻害物質の他の任意の変異体に等しく当てはまる。

本発明の化合物は、標識化（又はタグ化）してもよい。適切な任意の標識を使用することができる。適した標識は、当分野において公知である。

ＮＫ細胞を増殖させる方法
本発明は、ＮＫ細胞集団を増殖させるための方法に関する。この方法は、インビトロ、インビボ又はエクスビボであり得る。前記方法は、（本明細書に記載するように）ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物とともにＨＰＣを含有させるステップ、及び前記細胞を増殖させてＮＫ細胞集団を産生するステップを含む。本発明の方法により、ＮＫ細胞の迅速な増殖が可能となり、その培養に必要とされる時間が低減し、これにより疲弊のリスクが低減し、患者に輸注した場合にＮＫ細胞の細胞傷害性が増強する。

前記方法をインビボで実行した場合、前記方法は、本明細書に記載の治療的方法となる。このような実施形態では、本発明の治療適応及び適用に関する、本明細書におけるすべての開示は、前記方法に適用可能である。

典型的には、本発明の方法は、エクスビボである。したがって、本発明は、（ａ）患者から得られた試料を含むＮＫ先駆細胞を培養するステップと、（ｂ）前記試料をＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物に接触させるステップと、（ｃ）前記細胞をインビトロで増殖させてＮＫ細胞集団を産生するステップとを含むＮＫ細胞集団を増殖させるためのエクスビボ方法を提供する。化合物は、本明細書に記載の本発明の任意のＲＥＶ－ＥＲＢ阻害化合物であり得る。典型的には、前記化合物により、本明細書に記載するようにＲＥＶ－ＥＲＢ活性が減少することによってＥ４ｂｐ４発現が増加する。

患者から得られたＨＰＣを含む試料は、骨髄、臍帯血及び／又は末梢血から得られた試料であり得る。したがって、試料は、臍帯若しくは末梢血試料、又は骨髄試料若しくは生検であり得る。

本発明によれば、ＨＰＣを含む試料は、（本明細書に記載する）十分な数のＨＰＣを含む患者由来の任意の試料であり、したがって、増殖させたＮＫ細胞集団は、前記試料を本発明による化合物に接触させることにより得ることができる。典型的には、試料は、ＨＳＣを含む。好ましくは、本明細書に記載する臍帯若しくは末梢血試料又は骨髄試料若しくは生検など、前記試料は、ＨＳＣについて濃縮されている。

ＨＰＣは、適した支持／間質細胞若しくは細胞層上、又は適した支持／間質細胞若しくは細胞層により培養することができる。任意の適切な間質細胞を使用することができ、ＯＰ９間質細胞及び／又はＥＬ０８－１Ｄ２間質細胞を含むがこれらに限定されない。或いは及び／又は加えて、ＨＰＣは、ＨＰＣの増殖に必要とされる因子並びに／又はＮＫ細胞増殖及び／若しくは分化に必要とされる因子を含む、ＮＫ細胞分化経路における細胞の発生と関連するサイトカイン及び増殖因子の存在下で培養することができる。このような因子の非限定的な例として、ＩＬ－３、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、幹細胞因子（ＳＣＦ、stem cell factor）及び／若しくはＩＬ－１５、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。

いくつかの実施形態では、エクスビボ方法は、典型的には、実質的に一定の培養条件下で、患者から得られた試料中のＨＰＣを培養し、本発明の化合物に接触させ、増殖させてＮＫ細胞集団を形成する単一の段階を含む。典型的には、これは、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及び／又はＩＬ－１５、好ましくはこれらの因子のすべてのような因子とＨＰＣをインキュベートするステップを含む。ＨＰＣはまた、好ましくは、ＥＬ０８－１Ｄ２間質細胞などの、間質細胞／細胞層上、又は間質細胞／細胞層により培養する。

いくつかの実施形態では、エクスビボ方法は、２つの段階を含む。第１の段階は、リンパ球系産生段階であり、ここで患者から得られた試料中のＨＰＣを培養する。典型的には、これは、リンパ球系産生と関連するサイトカイン及び増殖因子、例えば、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－７及び／又はＳＣＦとＨＰＣをインキュベートするステップを含む。この段階は、少なくとも１日、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間又はそれ以上持続し得る。いくつかの好ましい実施形態では、この段階は、２日間持続する。

エクスビボ方法の第２の段階は、ＮＫ細胞増殖の段階である。典型的には、これは、培養したＨＳＣを適した間質（支持）細胞層、例えば、ＯＰ９間質細胞に移すステップ並びにＮＫ細胞発生と関連するサイトカイン及び増殖因子、例えば、ＩＬ－１５により培養するステップを含む。本発明の化合物は、典型的に、この第２の段階の間に、好ましくは、この第２の段階の開始時に添加する。第２の段階は、残りのエクスビボでの培養期間（上記に定義するように）持続する。培養培地は、この第２の段階の間、必要に応じてたびたび交換して、ＮＫ細胞増殖を促進してもよい。

ＨＰＣを含む試料は、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間又はそれ以上エクスビボで培養することができる。典型的には、前記試料は、少なくとも９日間培養して増殖ＮＫ細胞集団を産生する。これらの培養期間は、エクスビボ方法の全培養期間である。即ち、２つの段階がある場合、これらの期間は、全体（段階１に加えて段階２）である。

本発明の化合物は、試料中のＨＰＣを単離して１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内、又はＮＫ細胞先駆体を単離した同日にＨＰＣを含む試料に添加することができる。典型的には、これは、試料が患者から得られた同日である。好ましくは、本発明の化合物は、試料中のＨＰＣを単離して２日以内、さらにより好ましくは、ＨＰＣの単離後２日目に試料に添加する。

本発明の方法は、モジュレートする（１つ又は２つ以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質のＨＰＣにおける発現及び／又は活性を増加又は減少させてＮＫ細胞増殖を促進する）ステップをさらに含むことができる。このモジュレーションは、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害するために使用するものと同一の本発明の化合物を含む、本発明の化合物により誘発することができる。或いは、１つ又は２つ以上の追加の化合物は、１つ又は２つ以上の追加の遺伝子及び／又はタンパク質の発現及び／又は活性をモジュレートするために使用することができる。前記モジュレーションは、直接的又は間接的に生じ得る。間接的モジュレーションは、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害する本発明の化合物により生じる下流効果を包含する。

本発明の方法は、対照に対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はそれ以上のＮＫ細胞数の増加をもたらすことができる。典型的には、ＮＫ細胞の数は、対照と比較して少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍又はそれ以上増加する。

典型的には、本発明のエクスビボ方法は、増殖ＮＫ細胞集団を精製する最終ステップを含む。これにより、本明細書に記載する治療的投与のための純粋な集団が確保される。増殖ＮＫ細胞集団の精製は、適切な任意の手段によってであってもよい。標準的細胞精製方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ、fluorescence-activated cell sorting）及び磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ、magnetic-activated cell sorting）を含む細胞選別は、当分野において公知である。

治療適応
本発明は、患者におけるＮＫ細胞の産生を増加させることによる療法の方法における使用のためのＲＥＶ－ＥＲＢアンタゴニストを提供する。

療法の前記方法における使用のためのＲＥＶ－ＥＲＢアンタゴニストは、本明細書に記載する任意のＲＥＶ－ＥＲＢアンタゴニストであり得る。典型的には、前記方法における使用のためのＲＥＶ－ＥＲＢアンタゴニストにより、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を減少させることによってＥ４ｂｐ４発現が増加する。

典型的には、療法の方法は、（本明細書に記載する）ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物を患者又は対象に投与するステップを含む。

本明細書において使用する場合、用語「ＮＫ細胞の数を増加させる」及び「ＮＫ細胞の産生を増加させる」は、本発明の化合物が、患者におけるＮＫ細胞数の顕著な増加を誘発することを意味すると理解され得る。このＮＫ細胞数の増加は、対照に対して測定することができる（Ｅ４ｂｐ４発現の増加及びＲＥＶ－ＥＲＢ活性の阻害の文脈において本明細書に記載するように）。

ＮＫ細胞数の増加及び／又はＮＫ細胞産生の増加に言及する場合、対照に対する増加倍数の点から定量化することができる。典型的には、本発明の化合物は、対照に対して少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍又はそれ以上の、ＮＫ細胞数を増加させるか、又はＮＫ細胞産生の増加を生じさせることができる。

或いは、ＮＫ細胞数の増加及び／又はＮＫ細胞産生の増加に言及する場合、ＮＫ細胞数が、対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又はそれ以上増加することを意味すると理解され得る。典型的には、ＮＫ細胞数は、対照と比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％又はそれ以上増加する。

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞数の増加及び／又はＮＫ細胞産生の増加は、試料又は患者におけるＮＫ細胞の絶対数、例えば、ＮＫ細胞の割合、例えば、循環するリンパ球集団におけるＮＫ細胞の割合の点で定義することができる。例えば、本発明の化合物は、ＮＫ数の増加をもたらし、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％又はそれ以上のＮＫ細胞の割合を生じることができる。

ＮＫ細胞の数は、定量的及び／又は定性的分析により判定することができ、直接的又は間接的に測定することができる。ＮＫ細胞の数は、対照に対して、適切な任意の技術を使用して判定することができる。適した標準的技術、例えば、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ及びＭＡＣＳは、当分野において公知である。

ＮＫ細胞の数は、対照と比較して少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１カ月又はそれ以上増加し得る。典型的には、これは、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を阻害する化合物の最後の投与に対して評価する。

ＮＫ細胞の数は、患者由来の試料又は（本発明のエクスビボ方法由来の）培養試料中の全ＮＫ細胞数の点から定量化することができる。

本発明の治療的使用及び方法の文脈において、「対象」又は「患者」（これらの用語は本明細書において互換的に使用される）は、ＮＫ細胞数の増加から恩恵を得る任意の動物患者である。典型的な動物患者は、哺乳動物、例えば、霊長類である。好ましくは、患者は、ヒトである。

したがって、本発明は、（本明細書に記載するように）ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する、治療有効量の化合物を前記患者に投与するステップを含む、それを必要とする患者においてＮＫ細胞数を増加させることによる治療の方法を提供する。

加えて、本発明は、医薬の製造における、ＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物の使用を提供する。前記医薬により、患者におけるＮＫ細胞の数が増加する。

本発明の治療的使用又は方法は、治療有効量の本発明の化合物を、単独又は他の治療薬と併せて、患者に投与するステップを含むことができる。

本明細書において使用する場合、用語「治療」又は「治療する」は、治療的又は予防性（preventative）／予防的（prophylactic）手段を包含する。

本発明の化合物はまた、予防療法として使用することができる。本明細書において使用する場合、用語「予防する」は、ＮＫ細胞数を増加させ、及び／又は症状の重症度若しくは強度を減少させることにより治療することができる疾患又は障害と関連する前記症状の発症を予防することを含む。用語「予防する」は、このような疾患又は障害、特に本明細書に記載する感染性疾患に対する防御免疫を誘導又は提供することを含む。免疫は、適切な任意の技術を使用して定量化することができ、この例は、当分野において公知である。

本発明の化合物は、ＮＫ細胞数を増加させることにより治療することができる疾患又は障害を既に有する患者に投与することができる。例えば、患者は、本明細書に記載する感染性疾患又はがんを有するのではないかと疑われることがあり、前記疾患又は障害の症状を示すこともあり又は示さないこともある。このような患者に投与した場合、本発明の化合物により、１つ若しくは２つ以上の症状の重症度が治癒、遅延、減少するか、若しくは改善し、及び／又はこのような治療を行わない場合の予想を超えて対象の生存を延長することができる。

或いは、本発明の化合物は、特定の感染性疾患に最終的に感染するか、又は本明細書に記載する疾患若しくは障害を発症する可能性のある患者に投与して、１つ若しくは２つ以上の症状の重症度が治癒、遅延、減少するか、若しくは改善し、及び／又はこのような治療を行わない場合の予想を超えて対象の生存を延長するか、或いは、感染性疾患の場合、患者を前記疾患の伝染から防ぐことを助けることができる。

本発明の治療及び予防療法は、種々の年齢の多様な種々の対象に適用可能である。ヒトに関しては、療法は、子供（例えば、乳児、５歳未満の小児、年長の小児又は１０代の若者）及び大人に適用可能である。他の動物対象（例えば、霊長類などの哺乳動物）に関しては、療法は、未熟な対象及び成熟した／大人の対象に適用可能である。

本発明は、患者におけるＮＫ細胞の数を増加させることにより有利に治療することができる任意の疾患又は障害の治療に関する。このような疾患及び障害は、がん、感染性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患及び女性不妊症又は妊娠に関連する疾患又は障害を含む。本発明により治療することができる感染性疾患は、ウイルス感染症、及び細菌、原生生物、真菌又は蠕虫病原体を含む他の病原体による感染症を含む。典型的には、前記病原体は、その生活環において少なくとも１つの細胞内相を有する細胞内病原体である。特に所望の感染症は、ウイルス感染症、及び公衆衛生の観点から特に重要な人畜共通感染症を含む。本発明により治療することができるがんは、膀胱がん、血液がん、白血病、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、腎がん、肝がん、肺がん、メラノーマ、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん及び子宮がんを含む。本発明により治療することができる自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症及び肥満によるインスリン抵抗性を含む。本発明において使用する場合、女性不妊症又は妊娠に関連する疾患又は障害の用語は、胎児発育遅延、早期分娩、子宮血管再構築の異常及び妊娠高血圧腎症を含むが、これらに制限されない。

本発明の化合物は、１つ又は２つ以上の追加の治療薬又は治療と併せて使用することができ、これは典型的に、治療する疾患又は障害のための従来の治療から選択することができる。非限定的な例として、本発明の化合物が、肺がんなどのがんの治療における使用のためのものである場合、前記化合物は、放射線療法、化学療法又は手術などの、肺がんのための従来の治療と併せて使用することができる。１つ又は２つ以上の追加の治療薬又は治療と併せて使用する場合、本発明の化合物は、１つ又は２つ以上の追加の治療薬又は治療を施す前、同時、又は後に投与することができる。

いくつかの好ましい実施形態では、本発明の化合物は、抗体媒介免疫療法と併せて使用するためのものである。抗体媒介免疫療法は、抗体を患者へ投与して疾患特異的抗原を標的化するステップを含む。このような抗体は、ＮＫ細胞の特異性及び殺活性を増加させるために使用することができ、ＩｇＧ抗体のＦ_ｃ領域の受容体を発現する。これらのＦ_ｃ受容体の活性化は、ＮＫ細胞活性化を誘導し、活性化したＮＫ細胞によりサイトカインの分泌及び細胞傷害性顆粒の放出を生じ、疾患抗原を発現する細胞の溶解を引き起こす。このような併用療法は、（腫瘍特異的抗原に対する抗体を使用する）がんの治療に特に好ましい。免疫療法において使用するいかなる抗体も、本発明の化合物と併せて使用することができる。このような抗体の非限定的な例として、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性リンパ腫）、抗ガングリオシドＤ２（抗ＧＤ２）ｍＡｂ（神経芽細胞腫、メラノーマ）、抗ヒト上皮増殖因子（抗ＨＥＲ２）ｍＡｂ（乳及び胃がん）、抗上皮増殖因子受容体（抗ＥＧＦＲ）ｍＡｂ（直腸結腸及び頭頸部がん）が挙げられる。

他の態様では、本発明は、（本明細書に記載する）増殖させたＮＫ細胞集団の本明細書に記載する治療的使用又は方法における使用を提供する。本発明の化合物の治療適応に関するありとあらゆる本明細書における開示は、本発明の増殖ＮＫ細胞集団の治療上の適用に等しくかつ独立して適用することができる。非限定的な例として、本発明は、療法の方法における、例えば、がん、感染性疾患、自己免疫疾患又は女性不妊症若しくは妊娠に関連する疾患若しくは障害の治療における使用のための（本明細書に記載する）増殖ＮＫ細胞集団を提供する。別の非限定的な例として、本発明は、治療有効量の増殖ＮＫ細胞集団を患者に投与するステップを含む、それを必要とする前記患者におけるＮＫ細胞数を増加させることによる治療の方法を提供する。

医薬組成物及び製剤
用語「化合物」は、本明細書において用語「治療的／予防的組成物」、「製剤」又は「医薬」と互換的に使用する。

本発明の（上に定義する）化合物又は増殖ＮＫ細胞集団は、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤と組み合わせるか又はそれらに加えて投与することができる。或いは又は加えて、本発明の化合物又は増殖ＮＫ細胞集団は、塩、賦形剤、希釈剤、アジュバント、免疫調節剤及び／又は抗菌化合物のうちの１つ又は２つ以上とさらに組み合わせることができる。

薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸等などの有機酸で形成される酸付加塩を含む。遊離のカルボキシ基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等などの有機塩基に由来し得る。

免疫原性組成物、治療製剤、医薬及び予防製剤の投与は、一般に、従来の経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、又は粘膜経路による。投与は、非経口的注入、例えば、皮下、皮内又は筋肉内注射によってであってもよい。例えば、抗体又は本発明の増殖ＮＫ細胞集団を含む製剤は、静脈内、筋肉内、皮内、又は皮下投与に特に適し得る。低分子ＲＥＶ－ＥＲＢ阻害物質の投与は、静脈内、筋肉内、皮内、若しくは皮下などの注射、又は経口投与によってであり得る（経口バイオアベイラビリティを典型的に示す５００Ｄａ未満の分子量を有する低分子）。

したがって、本発明の免疫原性組成物、治療製剤、医薬及び予防製剤は、液体溶液又は懸濁液として注射剤として調製することができる。注射前の液体の溶液又は懸濁液に適した固体形態は、代替的に調製することができる。調製物はまた、乳化、又はリポソーム若しくはマイクロカプセル中にペプチドで被包することができる。

免疫原性有効成分（本発明の化合物又は増殖させたＮＫ細胞集団など）は、薬学的に許容され、有効成分と適合する賦形剤と混合することが多い。適した賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール等及びこれらの組合せである。加えて、必要に応じて、ワクチンは、湿潤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を増強するアジュバントのような少量の補助物質を含有してもよい。

一般に、担体は、薬学的に許容される担体である。薬学的に許容される担体の非限定的な例として、水、生理食塩水、及びリン酸緩衝食塩水が挙げられる。しかし、いくつかの実施形態では、組成物が本発明の化合物を含む場合、これは、凍結乾燥形態であってもよく、その場合、これは、ＢＳＡなどの安定剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物をチオメルサール又はアジ化ナトリウムなどの保存剤とともに処方して長期保管を容易とすることが望まれ得る。

有効であり得る追加のアジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、complete Freunds adjuvant）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、Incomplete Freunds adjuvant）、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａなどのサポニンの精製抽出分画、ＱＳ－２１などのサポニンの誘導体、ＩＳＣＯＭ／ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどのサポニンをベースとした脂質粒子、ＬＴＫ６３及び／又はＬＴＫ７２のようなE. coli易熱性毒素（ＬＴ、labile toxin）変異株、水酸化アルミニウム、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル－ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥと呼ばれる）、２％のスクアレン／Tween 80エマルション中の、細菌、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出した３つの成分を含有するＲＩＢＩ、Novartis社により開発されたＭＦ５９製剤、並びにGSK Biologicals社（リクサンサール、ベルギー）により開発されたＡＳ０２、ＡＳ０１、ＡＳ０３及びＡＳ０４アジュバント製剤を含むが、これらに制限されない。

緩衝剤の例としては、コハク酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、phosphate buffered saline；ｐＨ６．５及び７．５）を含むが、これらに制限されない。

他の投与方式に適する追加の製剤は、坐薬、及び場合によっては、経口製剤又はエアロゾルとしての散布に適した製剤を含む。坐薬では、従来の結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含むことができ、このような坐薬は、０．５％～１０％、好ましくは１％～２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。

経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常利用する賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態を取る。

本発明の化合物の投与の用量範囲は、所望の治療作用を生じる範囲である。必要とされる用量範囲が、化合物の詳細な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の、性質、程度又は重症度、もしあれば禁忌、及び主治医の判断に依存することが認識される。これらの用量レベルの差異は、最適化のための標準の経験的通例を使用して調整することができる。同様に、本発明の方法、特にエクスビボ方法における使用のための本発明の化合物の用量は、当業者により容易に決定することができ、ＮＫ細胞数の所望の増加を生じ、及び／又はＮＫ細胞の所望の増殖を誘発して、増殖させたＮＫ細胞集団を産生する任意の用量である。非限定的な例として、本発明によるＳＲ８２７８の用量は、約２～約２０μＭ、約２～約１５μＭ、約５～約１５μＭ、約５～約１４μＭ、約４～約１３μＭ、約５～約１２μＭ、約５～約１１μＭ、又は好ましくは約５～約１０μＭの最終濃度を生じ得る。

本発明はまた、（本明細書に記載する）増殖させたＮＫ細胞集団の製剤処方における使用を提供する。本発明の化合物の処方に関する本明細書のありとあらゆる開示は、本発明の増殖ＮＫ細胞集団の治療上の適用に等しくかつ独立して適用することができる。

配列番号のための留意点
配列番号１－Ｅ４ｂｐ４遺伝子配列（Ｘ６４３１８．１）
1 gcccctttct ttctcctcgt cggcccgaga gcaggaacac gataacgaag gaggcccaac
61 ttcattcaat aaggagcctg acggatttat cccagacggt agaacaaaag gaagaatatt
121 gatggatttt aaaccagagt ttttaaagag cttgagaata cggggaaatt aatttgttct
181 cctacacaca tagatagggt aaggttgttt ctgatgcagc tgagaaaaat gcagaccgtc
241 aaaaaggagc aggcgtctct tgatgccagt agcaatgtgg acaagatgat ggtccttaat
301 tctgctttaa cggaagtgtc agaagactcc acaacaggtg aggacgtgct tctcagtgaa
361 ggaagtgtgg ggaagaacaa atcttctgca tgtcggagga aacgggaatt cattcctgat
421 gaaaagaaag atgctatgta ttgggaaaaa aggcggaaaa ataatgaagc tgccaaaaga
481 tctcgtgaga agcgtcgact gaatgacctg gttttagaga acaaactaat tgcactggga
541 gaagaaaacg ccactttaaa agctgagctg ctttcactaa aattaaagtt tggtttaatt
601 agctccacag catatgctca agagattcag aaactcagta attctacagc tgtgtacttt
661 caagattacc agacttccaa atccaatgtg agttcatttg tggacgagca cgaaccctcg
721 atggtgtcaa gtagttgtat ttctgtcatt aaacactctc cacaaagctc gctgtccgat
781 gtttcagaag tgtcctcagt agaacacacg caggagagct ctgtgcaggg aagctgcaga
841 agtcctgaaa acaagttcca gattatcaag caagagccga tggaattaga gagctacaca
901 agggagccaa gagatgaccg aggctcttac acagcgtcca tctatcaaaa ctatatgggg
961 aattctttct ctgggtactc acactctccc ccactactgc aagtcaaccg atcctccagc
1021 aactccccga gaacgtcgga aactgatgat ggtgtggtag gaaagtcatc tgatggagaa
1081 gacgagcaac aggtccccaa gggccccatc cattctccag ttgaactcaa gcatgtgcat
1141 gcaactgtgg ttaaagttcc agaagtgaat tcctctgcct tgccacacaa gctccggatc
1201 aaagccaaag ccatgcagat caaagtagaa gcctttgata atgaatttga ggccacgcaa
1261 aaactttcct cacctattga catgacatct aaaagacatt tcgaactcga aaagcatagt
1321 gccccaagta tggtacattc ttctcttact cctttctcag tgcaagtgac taacattcaa
1381 gattggtctc tcaaatcgga gcactggcat caaaaagaac tgagtggcaa aactcagaat
1441 agtttcaaaa ctggagttgt tgaaatgaaa gacagtggct acaaagtttc tgacccagag
1501 aacttgtatt tgaagcaggg gatagcaaac ttatctgcag aggttgtctc actcaagaga
1561 cttatagcca cacaaccaat ctctgcttca gactctgggt aaattactac tgagtaagag
1621 ctgggcattt agaaagatgt catttgcaat agagcagtcc attttgtatt atgctgaatt
1681 ttcactggac ctgtgatgtc atttcactgt gatgtgcaca tgttgtctgt ttggtgtctt
1741 tttgtgcaca gattatgatg aagattagat tgtgttatca ctctgcctgt gtatagtcag
1801 atagtcatat gcgtaaggct gtatatatta agnttttatt tttgttgttc tattataaag
1861 tgtgtaagtt accagtttca ataaaggatt ggtgacaaac acagaaaaaa aaaaaaaaaa
1921 aaa
配列番号２－Ｅ４ｂｐ４アミノ酸配列（Ｘ６４３１８．１）
MQLRKMQTVKKEQASLDASSNVDKMMVLNSALTEVSEDSTTGEDVLLSEGSVGKNKSSACRRKREFIPDEKKDAMYWEKRRKNNEAAKRSREKRRLNDLVLENKLIALGEENATLKAELLSLKLKFGLISSTAYAQEIQKLSNSTAVYFQDYQTSKSNVSSFVDEHEPSMVSSSCISVIKHSPQSSLSDVSEVSSVEHTQESSVQGSCRSPENKFQIIKQEPMELESYTREPRDDRGSYTASIYQNYMGNSFSGYSHSPPLLQVNRSSSNSPRTSETDDGVVGKSSDGEDEQQVPKGPIHSPVELKHVHATVVKVPEVNSSALPHKLRIKAKAMQIKVEAFDNEFEATQKLSSPIDMTSKRHFELEKHSAPSMVHSSLTPFSVQVTNIQDWSLKSEHWHQKELSGKTQNSFKTGVVEMKDSGYKVSDPENLYLKQGIANLSAEVVSLKRLIATQPISASDSG
配列番号３－ＲＥＶ－ＥＲＢα遺伝子配列（ＮＭ＿０２１７２４．４）
1 gggcacgagg cgctccctgg gatcacatgg tacctgctcc agtgccgcgt gcggcccggg
61 aaccctgggc tgctggcgcc tgcgcagagc cctctgtccc agggaaaggc tcgggcaaaa
121 ggcggctgag attggcagag tgaaatatta ctgccgaggg aacgtagcag ggcacacgtc
181 tcgcctcttt gcgactcggt gccccgtttc tccccatcac ctacttactt cctggttgca
241 acctctcttc ctctgggact tttgcaccgg gagctccaga ttcgccaccc cgcagcgctg
301 cggagccggc aggcagaggc accccgtaca ctgcagagac ccgaccctcc ttgctacctt
361 ctagccagaa ctactgcagg ctgattcccc ctacacactc tctctgctct tcccatgcaa
421 agcagaactc cgttgcctca acgtccaacc cttctgcagg gctgcagtcc ggccacccca
481 agaccttgct gcagggtgct tcggatcctg atcgtgagtc gcggggtcca ctccccgccc
541 ttagccagtg cccagggggc aacagcggcg atcgcaacct ctagtttgag tcaaggtcca
601 gtttgaatga ccgctctcag ctggtgaaga catgacgacc ctggactcca acaacaacac
661 aggtggcgtc atcacctaca ttggctccag tggctcctcc ccaagccgca ccagccctga
721 atccctctat agtgacaact ccaatggcag cttccagtcc ctgacccaag gctgtcccac
781 ctacttccca ccatccccca ctggctccct cacccaagac ccggctcgct cctttgggag
841 cattccaccc agcctgagtg atgacggctc cccttcttcc tcatcttcct cgtcgtcatc
901 ctcctcctcc ttctataatg ggagcccccc tgggagtcta caagtggcca tggaggacag
961 cagccgagtg tcccccagca agagcaccag caacatcacc aagctgaatg gcatggtgtt
1021 actgtgtaaa gtgtgtgggg acgttgcctc gggcttccac tacggtgtgc acgcctgcga
1081 gggctgcaag ggctttttcc gtcggagcat ccagcagaac atccagtaca aaaggtgtct
1141 gaagaatgag aattgctcca tcgtccgcat caatcgcaac cgctgccagc aatgtcgctt
1201 caagaagtgt ctctctgtgg gcatgtctcg agacgctgtg cgttttgggc gcatccccaa
1261 acgagagaag cagcggatgc ttgctgagat gcagagtgcc atgaacctgg ccaacaacca
1321 gttgagcagc cagtgcccgc tggagacttc acccacccag caccccaccc caggccccat
1381 gggcccctcg ccaccccctg ctccggtccc ctcacccctg gtgggcttct cccagtttcc
1441 acaacagctg acgcctccca gatccccaag ccctgagccc acagtggagg atgtgatatc
1501 ccaggtggcc cgggcccatc gagagatctt cacctacgcc catgacaagc tgggcagctc
1561 acctggcaac ttcaatgcca accatgcatc aggtagccct ccagccacca ccccacatcg
1621 ctgggaaaat cagggctgcc cacctgcccc caatgacaac aacaccttgg ctgcccagcg
1681 tcataacgag gccctaaatg gtctgcgcca ggctccctcc tcctaccctc ccacctggcc
1741 tcctggccct gcacaccaca gctgccacca gtccaacagc aacgggcacc gtctatgccc
1801 cacccacgtg tatgcagccc cagaaggcaa ggcacctgcc aacagtcccc ggcagggcaa
1861 ctcaaagaat gttctgctgg catgtcctat gaacatgtac ccgcatggac gcagtgggcg
1921 aacggtgcag gagatctggg aggatttctc catgagcttc acgcccgctg tgcgggaggt
1981 ggtagagttt gccaaacaca tcccgggctt ccgtgacctt tctcagcatg accaagtcac
2041 cctgcttaag gctggcacct ttgaggtgct gatggtgcgc tttgcttcgt tgttcaacgt
2101 gaaggaccag acagtgatgt tcctaagccg caccacctac agcctgcagg agcttggtgc
2161 catgggcatg ggagacctgc tcagtgccat gttcgacttc agcgagaagc tcaactccct
2221 ggcgcttacc gaggaggagc tgggcctctt caccgcggtg gtgcttgtct ctgcagaccg
2281 ctcgggcatg gagaattccg cttcggtgga gcagctccag gagacgctgc tgcgggctct
2341 tcgggctctg gtgctgaaga accggccctt ggagacttcc cgcttcacca agctgctgct
2401 caagctgccg gacctgcgga ccctgaacaa catgcattcc gagaagctgc tgtccttccg
2461 ggtggacgcc cagtgacccg cccggccggc cttctgccgc tgcccccttg tacagaatcg
2521 aactctgcac ttctctctcc tttacgagac gaaaaggaaa agcaaaccag aatcttattt
2581 atattgttat aaaatattcc aagatgagcc tctggccccc tgagccttct tgtaaatacc
2641 tgcctccctc ccccatcacc gaacttcccc tcctccccta tttaaaccac tctgtctccc
2701 ccacaaccct cccctggccc tctgatttgt tctgttcctg tctcaaatcc aatagttcac
2761 agctgagctg gcttcaaaaa aaaaaaaaaa aaa
配列番号４－ＲＥＶ－ＥＲＢαアミノ酸配列（ＮＭ＿０２１７２４．４）
MTTLDSNNNTGGVITYIGSSGSSPSRTSPESLYSDNSNGSFQSLTQGCPTYFPPSPTGSLTQDPARSFGSIPPSLSDDGSPSSSSSSSSSSSSFYNGSPPGSLQVAMEDSSRVSPSKSTSNITKLNGMVLLCKVCGDVASGFHYGVHACEGCKGFFRRSIQQNIQYKRCLKNENCSIVRINRNRCQQCRFKKCLSVGMSRDAVRFGRIPKREKQRMLAEMQSAMNLANNQLSSQCPLETSPTQHPTPGPMGPSPPPAPVPSPLVGFSQFPQQLTPPRSPSPEPTVEDVISQVARAHREIFTYAHDKLGSSPGNFNANHASGSPPATTPHRWENQGCPPAPNDNNTLAAQRHNEALNGLRQAPSSYPPTWPPGPAHHSCHQSNSNGHRLCPTHVYAAPEGKAPANSPRQGNSKNVLLACPMNMYPHGRSGRTVQEIWEDFSMSFTPAVREVVEFAKHIPGFRDLSQHDQVTLLKAGTFEVLMVRFASLFNVKDQTVMFLSRTTYSLQELGAMGMGDLLSAMFDFSEKLNSLALTEEELGLFTAVVLVSADRSGMENSASVEQLQETLLRALRALVLKNRPLETSRFTKLLLKLPDLRTLNNMHSEKLLSFRVDAQ
配列番号５－ＲＥＶ－ＥＲＢβ遺伝子配列（ＡＢ３０７６９３．１）
1 atggaggtga atgcaggagg tgtgattgcc tatatcagtt cttccagctc agcctcaagc
61 cctgcctctt gtcacagtga gggttctgag aatagtttcc agtcctcctc ctcttctgtt
121 ccatcttctc caaatagctc taattctgat accaatggta atcccaagaa tggtgatctc
181 gccaatattg aaggcatctt gaagaatgat cgaatagatt gttctatgaa aacaagcaaa
241 tcgagtgcac ctgggatgac aaaaaatcat agtggtgtga caaaatttag tggcatggtt
301 ctactgtgta aagtctgtgg ggatgtggcg tcaggattcc actatggagt tcatgcttgc
361 gaaggctgta agggtttctt tcggagaagt attcaacaaa acatccagta caagaagtgc
421 ctgaagaatg aaaactgttc tataatgaga atgaatagga acagatgtca gcaatgtcgc
481 ttcaaaaagt gtctgtctgt tggaatgtca agagatgctg ttcggtttgg tcgtattcct
541 aagcgtgaaa aacagaggat gctaattgaa atgcaaagtg caatgaagac catgatgaac
601 agccagttca gtggtcactt gcaaaatgac acattagtag aacatcatga acagacagcc
661 ttgccagccc aggaacagct gcgacccaag ccccaactgg agcaagaaaa catcaaaagc
721 tcttctcctc catcttctga ttttgcaaag gaagaagtga ttggcatggt gaccagagct
781 cacaaggata cctttatgta taatcaagag cagcaagaaa actcagctga gagcatgcag
841 ccccagagag gagaacggat tcccaagaac atggagcaat ataatttaaa tcatgatcat
901 tgcggcaatg ggcttagcag ccattttccc tgtagtgaga gccagcagca tctcaatgga
961 cagttcaaag ggaggaatat aatgcattac ccanatggcc atgccatttg tattgcaaat
1021 ggacattgta tgaacttctc caatgcttat actcaaagag tatgtgatag agttccgata
1081 gatggatttt ctcagaatga gaacaagaat agttacctgt gcaacactgg aggaagaatg
1141 catctggttt gtccaatgag taagtctcca tatgtggatc ctcataaatc aggacatgaa
1201 atctgggaag aattttcgat gagcttcact ccagcagtga aagaagtggt ggaatttgca
1261 aagcgtattc ctgggttcag agatctctct cagcatgacc aggtcaacct tttaaaggct
1321 gggacttttg aggttttaat ggtacggttc gcatcattat ttgatgcaaa ggaacgtact
1381 gtcacctttt taagtggaaa gaaatatagt gtggatgatt tacactcaat gggagcaggg
1441 gatctgctaa actctatgtt tgaatttagt gagaagctaa atgccctcca acttagtgat
1501 gaagagatga gtttgtttac agctgttgtc ctggtatctg cagatcgatc tggaatagaa
1561 aacgtcaact ctgtggaggc tttgcaggaa actctcattc gtgcactaag gaccttaata
1621 atgaaaaacc atccaaatga ggcctctatt tttacaaaac tgcttctaaa gttgccagat
1681 cttcgatctt taaacaacat gcactctgag gagctcttgg cctttaaagt tcacccttaa
配列番号６－ＲＥＶ－ＥＲＢβアミノ酸配列（ＡＢ３０７６９３．１）
MEVNAGGVIAYISSSSSASSPASCHSEGSENSFQSSSSSVPSSPNSSNSDTNGNPKNGDLANIEGILKNDRIDCSMKTSKSSAPGMTKNHSGVTKFSGMVLLCKVCGDVASGFHYGVHACEGCKGFFRRSIQQNIQYKKCLKNENCSIMRMNRNRCQQCRFKKCLSVGMSRDAVRFGRIPKREKQRMLIEMQSAMKTMMNSQFSGHLQNDTLVEHHEQTALPAQEQLRPKPQLEQENIKSSSPPSSDFAKEEVIGMVTRAHKDTFMYNQEQQENSAESMQPQRGERIPKNMEQYNLNHDHCGNGLSSHFPCSESQQHLNGQFKGRNIMHYPXGHAICIANGHCMNFSNAYTQRVCDRVPIDGFSQNENKNSYLCNTGGRMHLVCPMSKSPYVDPHKSGHEIWEEFSMSFTPAVKEVVEFAKRIPGFRDLSQHDQVNLLKAGTFEVLMVRFASLFDAKERTVTFLSGKKYSVDDLHSMGAGDLLNSMFEFSEKLNALQLSDEEMSLFTAVVLVSADRSGIENVNSVEALQETLIRALRTLIMKNHPNEASIFTKLLLKLPDLRSLNNMHSEELLAFKVH
配列番号７－Ｅ４ｂｐ４野生型対立遺伝子の検出のためのフォワードプライマーＡ
CTCTGAGCTTGGCTGATGTG
配列番号８－Ｅ４ｂｐ４の検出のためのリバースプライマー
GCTTCAAGTCTCCACCAAGC
配列番号９－Ｅ４ｂｐ４ヌル対立遺伝子の検出のためのプライマー
CCATGCTCCTGTCTTGATGA

［実施例］
本発明を以下の実施例によりさらに明らかにするが、これは、純粋に本発明の例示であり、制限では決してないことを意図する。

ＲＥＶ－ＥＲＢαアンタゴニストＳＲ８２７８の添加によりＮＫ細胞産生の割合が増加する
はじめに、５、１０及び２０μＭの合計７つの化合物（ＳＲ８２７８、Remodelin、ＧＳＫ３４３、ＵＮＣ０６３８、ＨＫＭＴ－１－００５、ＳＧＣ０９４６及び（Ｒ）－ＰＦＩ－２）を陽性対照としてのＤ４４７６とともにスクリーニングした。ＧＳＫ３４３、ＵＮＣ０６３８、ＨＫＭＴ－１－００５、ＳＧＣ０９４６及び（Ｒ）－ＰＦＩ－２は、メチルトランスフェラーゼ阻害物質である。メチルトランスフェラーゼ阻害物質をＥＺＨ２阻害物質の効果に基づいて試験した。

系列陰性細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）について濃縮されている。ＨＰＣを単離し、合計９日間培養し、２日目に薬物を添加した（図２）。９日目に細胞を採取し、フローサイトメトリーを使用して分析してＮＫ１．１^＋ＣＤ３^－細胞の数を判定した（図２）。ＮＫ１．１^＋及びＣＤ３^－は、２つの細胞表面マーカーであり、これらはマウスＮＫ細胞を定義することができる。ＯＰ９間質細胞は、使用したＯＰ９間質細胞がＧＦＰ陽性であったため、分析からに直ちに外した（図３Ｂ）。各実験において、フローサイトメトリーデータを「無薬物」又は無処置対照に対する増加倍数として分析した。これは、ＮＫ細胞産生の絶対的割合が、実験間で変化するためである。

試験した７つの新規化合物のうち２つの化合物のみが、ＮＫ細胞産生量の有意な増加を示し（図３Ａ）、ここで、他は、有意な増加を示さなかった（データ示さず）。２０μＭのＤ４４７６並びに５μＭのRemodelinを添加すると有意な増加を示したが、１０μＭのＳＲ８２７８ほど著しくはなかった（図３Ａ及び３Ｃ）。１０μＭのＳＲ８２７８を添加すると、ＮＫ細胞産生量が「無薬物」対照と比較して２．４倍を超えて増加した（図３Ａ及び３Ｃ）。しかし、２０μＭのＳＲ８２７８では、化合物は毒性であり、ほとんどの細胞を殺傷し、そのため検出されたＮＫ細胞の数が減少した（図４）。２、５、１０及び２０μＭのＳＲ８２７８を使用してさらなる実験を行い、その活性を確認した。結果は、先のスクリーニングと一致した。１０μＭのＳＲ８２７８では、ＮＫ細胞産生が最も高く、次いで５μＭが高い増加を示した（図４）。

ＳＲ８２７８の添加時間の最適化
ＳＲ８２７８の効果をさらに調査した。特に、ＳＲ８２７８の細胞培養物への添加に最適な時間を検討した。ＮＫ細胞産生条件下でＨＰＣを培養して０、１、２、３及び４日目にＳＲ８２７８を添加した。５及び１０μＭのＳＲ８２７８を使用して実験を行った。５μＭでは、ＳＲ８２７８を添加すると、０日目に１．４倍を超える、最大のＮＫ細胞産生効果を示した（図５Ａ及び５Ｂ）。予想したとおり、１０μＭのＳＲ８２７８を添加すると、ＮＫ細胞産生量が５μＭと比較してより高い増加を示した（図５Ａ及び５Ｂ）。増加は、０、１及び２日目に１．６倍を超えて有意であった（図５Ａ及び５Ｂ）。しかし、２日目の後にＳＲ８２７８を添加しても、「無薬物」対照に対して有意差を示さなかった。

０及び１日目のＳＲ８２７８の添加によりＮＫ細胞の増加率が最も高く示されたとしても、生細胞の数は、「無薬物」対照と比較して著しく少なかった（図５Ｃ）。ＳＲ８２７８を添加して０日目又は１日目にＥ４ｂｐ４発現を増強した場合、細胞を刺激してＣＬＰ又はＮＫＰに分化させなかった可能性がある。ＳＲ８２７８の高過ぎる用量又は早過ぎる添加は、持続不可能である。これらの結果から、２日目は、ＳＲ８２７８をＨＰＣ培養物に添加して、最大のＮＫ細胞産生量をもたらし、かつ高い生細胞数を保つのに最適な時間である。

ＲＥＶ－ＥＲＢアゴニスト、ＧＳＫ４１１２の投与によりＳＲ８２７８に対して正反対の効果が生じる
ＳＲ８２７８のＮＫ細胞増加の効果が、通常Ｅ４ｂｐ４発現を阻害するＲＥＶＥＲＢの阻害に起因することが予想される。したがって、ＲＥＶ－ＥＲＢアゴニストであるＧＳＫ４１１２を試験して、これがＮＫ細胞集団を減少に導くかどうかを確かめた。先に図３に示したのと全く同様にＨＰＣの培養とＧＳＫ４１１２の添加を行った。

ＧＳＫ４１１２（１，１－ジメチルエチルＮ－［（４－クロロフェニル）メチル］－Ｎ－［（５－ニトロ－２－チエニル）メチル］グリシネート、ＳＲ６４５２）の構造

予測したとおり、ＮＫ細胞産生量は、ＧＳＫ４１１２を投与した場合、ほぼ５０％減少した（図６）。これは、ＲＥＶ－ＥＲＢを調節すると、Ｅ４ｂｐ４発現のモジュレーションを介してＮＫ細胞発生が制御され、ＧＳＫ４１１２及びＳＲ８２７８が、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びＥ４ｂｐ４を含むこの経路において作用することを支持する。

ＳＲ８２７８はＥ４ｂｐ４を介してＮＫ細胞に作用する
ＧＳＫ４１１２を用いた実験の後、ＳＲ８２７８が、ＲＥＶ－ＥＲＢ及びＥ４ｂｐ４を含む経路を通じて作用することが予測された。ＳＲ８２７８が、ＮＫ細胞産生を増加させるのにＥ４ｂｐ４を必要とするかどうかを確認するために、野生型（ＷＴ）（Ｅ４ｂｐ４^＋／＋）、Ｅ４ｂｐ４ノックアウト（ＫＯ）（Ｅ４ｂｐ４^－／－）及びヘテロ接合（Ｈｅｔ）（Ｅ４ｂｐ４^＋／－）マウスから単離したＨＰＣについてＳＲ８２７８を試験した。先述のように細胞培養を行い（図３）、ここで、培養して２日目にＳＲ８２７８を添加し、ＮＫ細胞産生量をフローサイトメトリーにより測定した。

データを倍率差で「無薬物」対照に関して示した先の実施例とは異なり、これらのデータは、産生したＮＫ細胞の実際の割合として示す。これは、Ｅ４ｂｐ４ ＫＯマウスを使用した場合、Ｅ４ｂｐ４の非存在がＮＫ細胞発生を停止させるため、「無薬物」対照におけるＮＫ細胞の割合が実質的にゼロであるためである（図７Ｃ及び７Ｄ）。５μＭ及び１０μＭのＳＲ８２７８を、ＷＴマウスから単離した培養物中のＨＰＣに添加した場合、「無薬物」対照と比較して、最大の有意な増加を見ることができる（図７Ａ及び７Ｄ）。Ｈｅｔマウス由来のＨＰＣの培養物の効果は、ＷＴマウスに類似していた（図７Ａ、７Ｂ及び７Ｄ）。一方、ＳＲ８２７８の濃度に関係なく、Ｅ４ｂｐ４ ＫＯマウス由来のＨＰＣの培養物中にＮＫ細胞は存在しなかった（図７Ｃ及び７Ｄ）。

これらのデータにより、ＳＲ８２７８が、Ｅ４ｂｐ４が必須の経路に作用するという仮説が支持される。Ｅ４ｂｐ４の存在は、ＳＲ８２７８がＮＫ細胞産生の増加を成功させるのに必須である。ＳＲ８２７８によりＲＥＶ－ＥＲＢの活性を阻害することができ、ここで、ＲＥＶ－ＥＲＢによりＥ４ｂｐ４発現が通常は阻害される。したがって、ＳＲ８２７８によってＲＥＶ－ＥＲＢが阻害されると、Ｅ４ｂｐ４発現が抑制解除される。Ｅ４ｂｐ４が活性化されると、ＮＫ細胞の発生が促進され、ＮＫ細胞がより産生される（図１）。

ＳＲ８２７８を添加するとＥ４ｂｐ４、Ｉｄ２及びＥｏｍｅｓの発現が増加する
上記実施例に提示するデータが、ＳＲ８２７８がＲＥＶ－ＥＲＢ及びＥ４ｂｐ４を有する経路に作用する可能性があることを示すように、Ｉｄ２及びＥｏｍｅｓなどのＥ４ｂｐ４の転写制御下にある遺伝子が、Ｅ４ｂｐ４発現が上方制御される場合、上方制御されることが予測された。先述のように（図２）ＷＴマウスから単離したＨＰＣを培養したが、細胞を採取し、３、４及び５日目にＲＴ－ｑＰＣＲを使用して分析した。Ｅ４ｂｐ４、Ｉｄ２及びＥｏｍｅｓ遺伝子の相対発現量をハウスキーピング遺伝子であるＨｐｒｔと比較した。４日目にＥ４ｂｐ４、Ｉｄ２及びＥｏｍｅｓ発現は、「無薬物」対照と比較した場合、ＳＲ８２７８で処理した試料においてより高かった（図８）。Ｅ４ｂｐ４発現の増加は５日目に消滅したが、Ｉｄ２発現の増加は維持された（図８Ｂ）。Ｅ４ｂｐ４及びその下流標的の上方制御が数時間のうちに生じ、一定期間、単に高いままである。

したがって、これらのデータは、公知のＥ４ｂｐ４の下流標的（２１）も同時に上方制御されたため、ＳＲ８２７８によりＥ４ｂｐ４転写因子遺伝子の発現が活性化されるという結論を支持する。

ＳＲ８２７８はまたヒトＣＤ３４^＋細胞からのＮＫ細胞発生を増強する
ＳＲ８２７８によりＮＫ細胞産生が増加するという仮説は、それがまたヒトＮＫ細胞の産生について成り立たない場合、いかなる潜在的な治療価値も有しない。したがって、ヒトＨＰＣ由来のヒトＮＫ細胞産生に対するＳＲ８２７８の効果を調査した。ロンドンのAnthony Nolan Research Instituteにおいて協力者から採取した臍帯血から精製したヒトＨＰＣをＣＤ３４^＋集団として得た。ヒトＮＫ細胞発生は、マウスＮＫ細胞の発生と類似の発生経路を経る。マウスＨＰＣ培養物と対照的に、採取前の１４及び１６日間、ＩＬ－３、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＳＣＦ及びＩＬ－１５サイトカイン存在下のＥＬ０８－１Ｄ２間質細胞上で直接ヒトＣＤ３４^＋細胞を培養し、フローサイトメトリーにより分析した。ヒトＮＫ細胞産生を最適化しようとするために、培養して２、４又は６日目に５又は１０μＭのＳＲ８２７８を添加した。

１０μＭのＳＲ８２７８の添加が細胞に対して完全に毒性であったことから、ヒトＣＤ３４^＋細胞が、マウスＨＰＣよりもＳＲ８２７８に対して感受性であることがデータにより示された。しかし、５μＭのＳＲ８２７８の効果は毒性でなく、２日目に５μＭのＳＲ８２７８を添加すると、ＮＫ細胞数の明らかな増加が示された（図９）。１４日目～１６日目にＮＫ細胞の数が、「無薬物」対照において５％から２０％まで指数関数的に増加したため、データは、ＮＫ細胞の割合として示す（図９）。４日目に５μＭのＳＲ８２７８を添加すると、１４日目に細胞を採取した場合、ＮＫ細胞の割合はほぼ３倍となり、５．５３％から１３．７％まで増加した（図９）。一方、１６日目に採取した場合、ＮＫ細胞の割合は２倍となり、２１．８％から４４．３％まで増加した（図９）。

Ｅ４ｂｐ４はＲＥＶ－ＥＲＢαとＲＥＶ－ＥＲＢβの両方により阻害することができる
先の研究は、Ｅ４ｂｐ４発現の阻害におけるＲＥＶ－ＥＲＢ－αの作用に重点をおいた。が、ＲＥＶ－ＥＲＢ相同体であるＲＥＶ－ＥＲＢ－βの役割は、検討されていない。したがって、本検討では、ＮＫ細胞産生におけるＲＥＶ－ＥＲＢ－α遺伝子の欠失の効果を直接調査することに決定した。先の実施例は、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α ＫＯマウスにおいてＥ４ｂｐ４発現が増強し、これによりＮＫ細胞の発生が増強することを示唆する。したがって、ＷＴ（Ｒｅｖ－ｅｒｂ－α^＋／＋）及びＲＥＶ－ＥＲＢ－α ＫＯマウス（Ｒｅｖ－ｅｒｂ－α^－／－）から採取した、骨髄並びに脾細胞から抽出したＨＰＣをフローサイトメトリーにより分析した。ＲＥＶ－ＥＲＢ－αがＮＫ細胞産生の調節の原因である場合、骨髄とまた潜在的に脾臓におけるＮＫＰ及びＮＫ細胞の数が増加するはずである。

しかし、図１０に示すように、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α ＫＯマウスにおいて、ＮＫ及びＮＫＰ細胞の割合は、ＷＴと差がなかった。これらの知見は、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αとＲＥＶ－ＥＲＢ－αの相同体であるＲＥＶ－ＥＲＢ－βの両方が、Ｅ４ｂｐ４発現を阻害している可能性があることを示唆する。ＲＥＶ－ＥＲＢ－αを欠く場合、ＲＥＶＥＲＢ－βは、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αの活性を代償し得る。この仮説を支持して、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びＲＥＶ－ＥＲＢ－βについてのクロマチン免疫沈降実験では、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αとＲＥＶ－ＥＲＢ－βの両方が、Ｅ４ｂｐ４遺伝子座に全く同一の領域で結合することが示された。その上、ＳＲ８２７８は、事実上、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αとＲＥＶ－ＥＲＢ－βの両方を阻害する、二重阻害物質である。したがって、ＳＲ８２７８を投与した場合のＮＫ細胞の増加は、両ＲＥＶ－ＥＲＢの阻害に起因し得る。

これは、図１１Ａに報告したデータにより支持され、このデータは、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αとＲＥＶ－ＥＲＢ－βの両方が欠損したマウスにおいて、ＮＫＰ細胞数が非常に有意に増加したことを実証する。図１１Ｂは、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αとＲＥＶ－ＥＲＢ－βをつなぐ役割を支持する、さらなる証拠を提供する。図１１Ｂは、両ＲＥＶ－ＥＲＢ遺伝子が欠失した変異マウス（ＤＫＯ）において、他の「対照」マウス（ＷＴ、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びＲＥＶ－ＥＲＢ－βのうちの対立遺伝子１つのみが欠失したマウス（αＨｅｔ／βＨｅｔ）、並びにＲＥＶ－ＥＲＢ－βの両方のコピーが欠失したマウス（βＫＯ））と比較してＮＫＰ細胞数が一貫して増加するが、一方、他の前駆細胞は影響されないことを示す。

したがって、本発明者らは、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αとＲＥＶ－ＥＲＢ－βの両方を阻害すると、ＮＫ細胞数が増加する治療可能性がもたらされ、このような阻害は、ＳＲ８２７８などの本発明の化合物を使用して達成することができるという最初の証拠を提供した。

材料及び方法
マウス
野生型マウスであるＥ４ｂｐ４ヘテロ接合マウス（Ｅ４ｂｐ４^＋／－）、Ｅ４ｂｐ４ノックアウトマウス（Ｅ４ｂｐ４^－／－）、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αノックアウトマウス（Ｒｅｖ－ｅｒｂ－α^－／－）、ＲＥＶ－ＥＲＢ－βノックアウトマウス（Ｒｅｖ－ｅｒｂ－β^－／－又はβＫＯ）、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びβダブルノックアウトマウス（Ｒｅｖ－ｅｒｂ－α^－／－β^－／－又はＤＫＯ）並びにＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びβヘテロ接合マウス（Ｒｅｖ－ｅｒｂ－α^＋／－β^＋／－又はαＨｅｔ／βＨｅｔ）を使用した。すべてのマウスはＣ５７ＢＬ／６をバックグラウンドとしており、６～１２週齢であり、年齢及び性別を一致させた。Ｒｂｐｊ^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}マウスはＦＶＢをバックグラウンドとしたものであった。すべての畜産及び実験手順を英国内務省規制（UK Home Office regulations）及び現地のガイドラインに従って行った。野生型対立遺伝子の検出にフォワードプライマー５’CTCTGAGCTTGGCTGATGTG３’（プライマーＡ）及びリバースプライマー５’GCTTCAAGTCTCCACCAAGC３’（プライマーＢ）、又はヌル対立遺伝子の検出に５’CCATGCTCCTGTCTTGATGA３’を用いてＥ４ｂｐ４マウスの遺伝子型を同定した。

細胞及び細胞培養物
２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Fetal Bovine Serum）及びペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ、Penicillin/Streptavidin）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Iscove's Modified Dulbecco's Media）（Sigma Aldrich社）中でＯＰ９－ＧＦＰ間質細胞を培養した。９６ウェルプレート上で行った実験では、ＯＰ９間質細胞を２０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で１日インキュベートした後、ＨＰＣを添加した。２４ウェルプレート上で行った実験では、ＯＰ９間質細胞を４０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で２日間インキュベートした後、ＨＰＣを添加した。５０％のＭｙｅｌｏｃｕｌｔ Ｍ５３００（Stem Cell Technologies社）、７．５％のＦＢＳ、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１μＭのヒドロコルチゾン及び１％のＰ／Ｓを補充したアルファ改変型イーグル最小必須培地（アルファＭＥＭ、Minimum Essential Medium Eagle- Alpha Modification）（Sigma Aldrich社）中でＥＬ０８．１Ｄ２間質細胞を培養した。ヒトＣＤ３４^＋前駆細胞実験では、ＥＬ０８．１Ｄ２を３０００ｒａｄ／３０Ｇｙで照射し、９６ウェルのＥｍｂｒｙｏＭａｘゼラチン（Millipore社）でコートしたプレートに２０，０００細胞／ウェルの濃度で播種した。これらを３２℃、５％ＣＯ_２で一晩培養した後、ＣＤ３４^＋細胞をその上に移した。

マウスＨＰＣの単離
２％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ、fetal calf serum）（STEMCELL Technologies社）を含んだリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で脚骨を挫滅することにより系列陰性ＨＳＣをマウス骨髄から精製し、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）緩衝液（無菌及び濾過したもの、ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡ）を４０ｍｌまで補給し、８００ｇで２分間遠心分離した。ＰＥコンジュゲートカクテル（２０μｌの抗Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、抗マウスＣＤ２（ＲＭ２－５）、抗Ｔｅｒ１１９（ＴＥＲ１１９）及び抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）並びに５μｌの抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）及び抗ＧＲ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）抗体（すべてBioscience社より））中に細胞を再懸濁し、５分間４℃でインキュベートし、遠心分離して抗ＰＥマイクロビーズ中に１５分間４℃で再懸濁した。ＭＡＣＳ緩衝液中で細胞を洗浄し、ＭＡＣＳカラムを通過させた。これにより、ＨＰＣの陰性選択が可能となった。系列除去（lineage depletion）した後、フローサイトメトリーを使用して細胞５０μｌを分析して、純度を調べた。

ＨＰＣ由来のＮＫ細胞のインビトロでの発生
ＨＰＣを播種し、２４ウェルプレート内に１ｍｌの完全サイトカイン培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Dulbecco’s modified eagle medium）（Sigma Aldrich社））、１０％のＦＣＳ、５０μＭのβメルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）（R&D Systems社）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（R&D Systems社）、１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）（R&D Systems社）及び１％のＰ／Ｓ）中５×１０^５ＨＰＣ／ウェルの濃度で２日間、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。次いで、マウスＮＫ細胞分化培地（アルファＭＥＭ（Sigma Aldrich社）に加えて２０％のＦＣＳ、１％のＰ／Ｓ及び３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５）中のＯＰ９細胞上に、ＨＰＣを９６ウェルプレート実験では４５００細胞／ウェル、２４ウェルプレート実験では３×１０^４細胞／ウェルで移した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で７日間培養し、マウスＮＫ細胞分化培地を３又は４日目に交換した。

ヒト臍帯血前駆細胞のインビトロでの発生
ＣＤ３４^＋臍帯血前駆細胞は、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドンのAnthony Nolan Research Instituteにより提供された。これらの細胞を全臍帯血から単離し、保管及び輸送用に液体窒素で凍結保存した。細胞を解凍、計数し、次いで、１０００細胞／ウェルの濃度であらかじめ調製したＥＬ０８．１Ｄ２プレート上のヒトＮＫ細胞分化培地（アルファＭＥＭに加えて２０％のヒトＡＢ血清（Invitrogen社）、５０μＭのβメルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓ）中に５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－３（Peprotech社）、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７（Peprotech社）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＦｌｔ３－Ｌ（Peprotech社）、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ（Peprotech社）及び１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１５（Peprotech社）とともに播種した。ヒトＩＬ－３は、培養して最初の週にのみ必要とすることに留意されたい。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で１４～１６日間培養し、ヒトＮＫ細胞分化培地を７又は１２日目に交換した。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーにより分析する細胞は、４０μｍの細胞濾過器を通過させて凝集塊を除去してＰＢＳ緩衝液で洗浄し、８００ｇで２分間遠心分離して１００μｌの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）緩衝液（ＰＢＳに加えて１％のＢＳＡ）中に適切な蛍光色素コンジュゲート抗体とともに１：３００の希釈率で再懸濁した。細胞を次の抗体で染色し、これらのすべては、抗マウスであり、指定しない限りeBioscience社のものである：２Ｂ４（クローンｍ２Ｂ４（Ｂ６）４５８．１；BioＬegend社）、ＣＤ２（ＲＭ２－５）、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１９（１Ｄ３）、ＣＤ２７（ＬＧ．７Ｆ９）、ＣＤ１２２（ＴＭ－ｂ１）、ＣＤ１２７（Ａ７Ｒ３４）、Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、ｃｋｉｔ（ＡＣＫ２）、Ｆｌｔ３（Ａ２Ｆ１０）、Ｇｒ１（ＲＢ６－８Ｃ５）、ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、Ｓｃａ１（Ｄ７）、Ｔｅｒ１１９（ＴＥＲ１１９）、ＮＫｐ４６（２９Ａ１．４）抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０）、抗ヒトＣＤ２（ＲＰＡ－２．１０）及び抗ヒトＣＤ５６（ＣＭＳＳＢ）。系列カクテルは、Ｂ２２０、ＣＤ２、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＮＫ１．１及びＴｅｒ１１９を含有していた。細胞を暗所において４℃で３０分間染色し、次いで、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心分離してヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を加えた３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再び１：３００の希釈率で再懸濁した。LSRFortessa（商標）細胞分析装置（Becton Dickinson Bioscience社）を使用してフローサイトメトリーを行い、示されているうにＦＡＣＳＡｒｉａ（Becton Dickinson社）を使用して選別し、FlowJoソフトウェアを使用して全データ分析を行った。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
それぞれのＰＣＲ反応では、２００μＭのｄＮＴＰＳ、１μＭのフォワードプライマー（プライマーＡ）、１μＭのリバースプライマー（プライマーＢ又はＣ）及び０．５ＵのＴａｑポリメラーゼを含有していた。ＰＣＲ反応を次の条件に設定した：９４℃で３分間（１サイクル）；９４℃で３０秒間、５９℃で３秒間、７２℃で４５秒間（４０サイクル）；７２℃で３分間（１サイクル）；４℃で保持。

ＤＮＡ電気泳動
５００ｎｇ／ｍｌの臭化エチジウム（Sigma社）を加えたＴＡＥ緩衝液に溶解した１％のアガロース（Sigma社）を使用してＤＮＡ電気泳動を行った。ＰＣＲ反応から得たＤＮＡをゲル電気泳動により分析し、この電気泳動を１００ボルトで約４５分間行った。EC3 Imaging System（Ultra Violet Products Ltd社）を使用してゲルを画像化した。

ＲＮＡ精製
Qiagen RNeasy Micro Kitを使用して製造者（Qiagen社）のプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。８０００ｇで１５秒間遠心分離を行い、素通り画分を廃棄した。簡潔には、３５０μｌのBuffer RLT＋１０％のβメルカプトエタノールを採取した細胞に添加した。３００μｌの７０％エタノールを使用してＲＮＡをさらに沈殿させ、RNeasy MinElute Spin Columnに移し、遠心分離した。次いで、３５０μｌのbuffer RW1をMinElute Spin Columnに添加し、遠心分離した。この後に１０μｌのDNase I（Qiagen社）及び７０μｌのBuffer RDD（Qiagen社）を添加し、室温で１５分間置いた。３５０μｌのBuffer RW1を添加してDNase Iを洗い落とし、遠心分離した。次いで、５００μｌのBuffer RPEをカラムに添加して遠心分離し、その後５００μｌの８０％エタノールを添加して２分間遠心分離した。最後に、１４μｌのRNaseを含まない水を添加してＲＮＡを溶出し、カラムを１分間、フルスピードで回転させた。Nanodropを使用して各試料のＲＮＡの濃度を測定し、すべての試料を同一の使用濃度に希釈した。

逆転写（ＲＮＡのｃＤＮＡへの転換）
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit（Roche社）を使用して逆転写を行った。製造者のプロトコルに従って、１回２０μｌの反応用に鋳型とプライマーの混合物を調製し、ここで、すべての試薬：ＲＮＡ（１μｇ～５μｇ）、２μｌのランダムヘキサマープライマーはキット内に提供されており、反応に１３μｌまで水（ＰＣＲグレード）をつぎ足す。次いで、鋳型とプライマーの混合物を、１０分間６５℃でチューブを加熱してＲＮＡの二次構造物を除去することにより変性させた。この鋳型とプライマーの混合物に、４μｌのTranscriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer、０．５μｌのProtector RNase Inhibitor、２μｌのDeoxynycleotide Mix及び０．５μｌのTranscriptor Reverse Transcriptaseを添加した。試薬を混合し、サーマルブロックサイクラーに入れ、次のように設定した：２５℃で１０分間；５５℃で３０分間；８５℃で５分間及び４℃で保管。

発現した標的化ＲＮＡのリアルタイムｑＰＣＲを使用した定量化

ＲＴ－ｑＰＣＲに使用する条件

１、１：１０、１：１００、１：１０００及び１：１００００に希釈した脾細胞ｃＤＮＡを使用して検量線を作成した。先のステップにおいて生成した２μｌのｃＤＮＡに、５μｌのTaqman master mix（Applied Biosystem社）、Ｈｐｒｔ、Ｎｆｉｌ３、Ｉｄ２又はＥｏｍｅｓのTaqman gene expression assay kit（Applied Biosystem社）０．５μｌ及び２．５μｌのRNaseを含まない水を添加した。使用したプログラムを表１に示し、反応を４７サイクル実行した。

統計分析
Graph Pad Prism 7によりマンホイットニー検定を使用して統計分析を行った。

考察
ＮＫ細胞は、サイトカインを産生し、他の免疫細胞に影響し、並びにがん性、病原体感染性又は損傷した細胞を直接殺傷することが可能なリンパ球である。これらの特性のため、研究者は、がん性又は病原体感染性細胞に対する細胞傷害性を増強するためにＮＫ細胞の数を強化することに関心を持っている。ＮＫ細胞は、骨髄中のＨＳＣから発生し、種々の転写因子及びサイトカインを含む緊密に調節されたプロセスにより制御されている。Ｅ４ｂｐ４は、ＮＫ細胞発生を調節する、最も重要な意味を持つ遺伝子である。Ｅ４ｂｐ４は、ＮＫ細胞発生においてＥ４ｂｐ４ ｍＲＮＡレベルが比較的小規模に増加するだけであるにもかかわらず、ＮＫ細胞産生に対して絶大な効果を有する。Ｅ４ｂｐ４タンパク質の活性を制御するために存在するいかなる手段についても、ほとんど知られていない。Ｅ４ｂｐ４の発現を制御する能力は、ＮＫ細胞の発生及び産生に非常に重要な意味を有する。

本発明は、ＳＲ８２７８を投与すると、ＮＫ細胞産生アッセイにおけるＮＫ細胞の産生が、２倍を超えて増加することを実証した。行ったアッセイでは、ＳＲ８２７８をＨＰＣ培養物に添加する、インビトロでのＮＫ細胞産生のための最適時間は２日目であり、最適用量は１０μＭであった。

次いで、ＳＲ８２７８がＲＥＶ－ＥＲＢを阻害することで知られているため、ＲＥＶ－ＥＲＢのアゴニスト（ＧＳＫ４１１２）を試験したところ、ＳＲ８２７８に対する正反対の効果を有し、ＮＫ細胞産生を減少させることを見出した。これは、ＲＥＶＥＲＢの活性を操作すると、ＮＫ細胞産生をもたらし得るという仮説を強調する。

ＳＲ８２７８機能に対するＥ４ｂｐ４の存在の重要性をさらに検討した。ＨＰＣをＷＴ、Ｅ４ｂｐ４ ＫＯ及びＨｅｔマウスから単離した。Ｅ４ｂｐ４ ＫＯマウスにおけるＥ４ｂｐ４の非存在下では、ＳＲ８２７８は、ＮＫ細胞の産生に対して効果を有しないことが見出された。ＳＲ８２７８がＮＫ細胞産生の増加におけるその活性を発揮するためには、Ｅ４ｂｐ４の少なくとも１つの対立遺伝子が存在しなければならない。

ＳＲ８２７８がＮＫ細胞産生を増加させる作用においてＥ４ｂｐ４が重要な役割を果たすため、Ｉｄ２及びＥｏｍｅｓなどの、Ｅ４ｂｐ４の転写制御下にある遺伝子の発現を試験したところ、同時に下方制御されることを見出した。

ＳＲ８２７８を添加するとまた、インビトロで培養したヒトＨＰＣからのヒトＮＫ細胞の発生が有意に増加することが見出された。

先の実験は、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αのＥ４ｂｐ４発現の阻害における役割を強調した。ＲＥＶ－ＥＲＢ－βの役割を検討するために、ＷＴ及びＲＥＶ－ＥＲＢ－α ＫＯマウスを使用してＮＫＰ及びＮＫ細胞についての染色試験を行った。ＮＫ及びＮＫＰ細胞の割合は、野生型及びＲＥＶ－ＥＲＢ－α ＫＯにおいて類似していることが見出された。したがって、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αがＥ４ｂｐ４を調節する唯一の転写因子であるだけでなく、その相同体であるＲＥＶ－ＥＲＢ－βも同一の役割を有し得る可能性がある。ＲＥＶ－ＥＲＢ－αの非存在下では、ＲＥＶ－ＥＲＢ－βは、これらは高度に相同性であるため、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α活性を代償する。このことは、ＲＥＶ－ＥＲＢ－αとＲＥＶ－ＥＲＢ－βのダブルＫＯマウスにより、対照細胞と比較して、さらにＲＥＶ－ＥＲＢ－α ＫＯ又はＲＥＶ－ＥＲＢ－α^＋／－及びＲＥＶ－ＥＲＢ－β^＋／－（αＨｅｔ／βＨｅｔ）マウスと比較して、ＮＫＰ細胞数が増加することが実証されることを示す、本明細書において報告するデータにより支持される。

外因性の刺激によるＥ４ｂｐ４の発現を制御することは、免疫療法における使用のためのヒトＮＫ細胞の産生において重要な意味を有する。種々のソース由来のＮＫ細胞（例えば、誘導多能性幹細胞及び臍帯血幹細胞）の産生のための従来の方法は、細胞がＮＫ系列に関与するためのサイトカイン及び間質細胞の使用を含むが、Ｅ４ｂｐ４の発現に影響させることにより、プロセスを増強する単純な戦略がもたらされ得る。したがって、Ｅ４ｂｐ４発現の操作は、インビボでＮＫ細胞産生を直接動員することを免疫療法として含む、将来のＮＫ細胞免疫療法製品の生産における潜在的有用性を有する。

Claims (10)

1. ａ）患者から得られた試料を含む造血前駆細胞（ＨＰＣ）を培養するステップと、
   ｂ）前記試料をＲＥＶ－ＥＲＢの作用を阻害する化合物と接触させるステップと、
   ｃ）前記細胞をインビトロで増殖させてＮＫ細胞集団を産生させるステップと
   を含む、ＮＫ細胞集団を増殖させるためのエクスビボ方法。
2. 化合物が、ＲＥＶ－ＥＲＢ活性を減少させることによりＥ４ｂｐ４発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
3. 化合物が、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及び／又はＲＥＶ－ＥＲＢ－β、好ましくはＲＥＶ－ＥＲＢ－βの活性を減少させる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 化合物が、ＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びＲＥＶ－ＥＲＢ－βの活性を減少させる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 化合物が、ＲＥＶ－ＥＲＢアンタゴニスト、好ましくはＲＥＶ－ＥＲＢ－α及びＲＥＶ－ＥＲＢ－βのアンタゴニストである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
6. 化合物が、低分子、ＰＲＯＴＡＣ試薬、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、抗体、リボザイム、ペプチド又はペプチドミメティックから選択される、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 化合物が、低分子である、請求項６に記載の方法。
8. 化合物が、ＳＲ８２７８、ＡＲＮ５１８７、エチル２－（５－メチルフラン－２－カルボニル）－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボキシレート、４－（（４－クロロベンジル）（（５－ニトロチオフェン－２－イル）メチル）アミノ）－Ｎ－フェニルピペリジン－１－カルボキサミド、４－（（（１－（４－フルオロフェニル）シクロペンチル）アミノ）メチル）－２－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）フェノール、１－（２－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミン又は１－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（３－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メチル）ベンジル）シクロペンタン－１－アミン、好ましくはＳＲ８２７８である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. ＨＰＣの試料が、骨髄、臍帯血及び／又は末梢血から得られた試料である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
10. 化合物が、請求項１（ａ）の試料中のＨＰＣを単離して２日以内に添加される、請求項１～９のいずれかに記載の方法。

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