CN1020458C - 偶联到高分子量的聚亚烷基二醇类上的超氧物歧化酶的结合物的制备方法 - Google Patents
偶联到高分子量的聚亚烷基二醇类上的超氧物歧化酶的结合物的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1020458C CN1020458C CN88104857A CN88104857A CN1020458C CN 1020458 C CN1020458 C CN 1020458C CN 88104857 A CN88104857 A CN 88104857A CN 88104857 A CN88104857 A CN 88104857A CN 1020458 C CN1020458 C CN 1020458C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peg
- sod
- polyoxyethylene glycol
- molecular weight
- pag
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
- A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/02—Antidotes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
基本上是水溶的超氧物歧化酶的非致免疫的结合物是由将该酶偶合到聚亚烷基二醇上而制备成的,该聚亚烷基二醇是聚乙二醇或聚乙基-聚亚丙基二醇共聚物,其中所说的二醇具有30,000-1,000,000的平均分子量并且是末端未被取代或被C1-4烷基取代的。
Description
本发明目的在于超氧物歧化酶(SOD)结合物或加合物,在这些化合物中至少有一部份SOD氨基、羧基、或巯基偶联到聚亚烷基二醇(PAG)如聚乙二醇(PEG)或聚亚乙基-聚亚丙基二醇共聚物上,其中PAG的分子量大于20,000,而理想的平均分子量为40,000至1,000,000道尔顿。除了另有说明外,PAG的分子量是用PEG作为标准通过高效筛析液体色谱法(HPLC)确定的。较好的PAG是平均分子量大于40,000至小于200,000,特别好的PAG是平均分子量为50,000-150,000。这些PAG可以是无支链的或有支链的而且可以是未被取代的或被C1-4烷基取代的。
可防止连接到两个SOD分子上的特别有价值的PAG分子是在其分子中的一个末端基团是C1-4烷基醚基团如异丙氧基基团。
以前的工作者已经利用低分子量(通常约为5,000和5000以下)的PEG或甲氧基-PEG连接到超氧物歧化酶(SOD)和其他蛋白质上,以得到表现出不同程度的(a)增加血清耐久性和(b)降低免疫原性的加合物。但是,对于要求充分的达到(a)及(b)的两个目的的带有低分子量的PEG或甲氧基-PEG的蛋白质基团的修饰幅度,常常导致酶活性或生物活性实质上丧失。
超氧物歧化酶是一种承担催化超氧化物基转化为氧和过氧化氢的作用的细胞内酶。提供一种较体内的天然SOD蛋质耐久的产物并延缓由于肾脏所造成的失活是本发明的一个目的。特别重要的是产品在显示低水平免疫原性的同时能保持酶活性。
正如在用小鼠做通常的导入角叉菜胶的瓜浮肿试验中所证明的此种结合物还具有一种抗炎活性。
在本发明中体现的新概念,应用了分子量大于20,000的高分子量PAG链。用于本发明的PAG可以是任何水溶性的烯化氧聚合物,例如聚(环氧乙烷)或环氧乙烷和1,2-环氧丙烷的某些共聚物。PAG可以是线型的或有支链的并可在一个或多个羟基位上被C1-4烷氧基或其他的化学基团所取代。但是,在本发明中用于制备结合物的PAG聚合物的分子量大于20,000而较好是在40,000至200,000分子量的范围。应用分子量大于200,000的聚合物也是可能的,但是由于它们在被切削时易于断裂和它们有较高的粘度所以它们并不是较好的。
本发明的PAG-SOD加合物的分子量(相对于已知分子量的PEG标准)范围约从85,000至约2,000,000道尔顿,而较好是约90,000至1,000,000道尔顿。再者,本发明的PAG-SOD加合物和其他的PAG-加合物通常保持天然蛋白质的大部份酶活性(注:在本说明书中分子量是根据已知分子量的PEG标准决定的,为了校正高效液体色谱法(HPLC),蛋白质当量,即根据已知分子量的蛋白质标准决定的分子量,可以认为是约高5至8倍)。
本发明的结合物是一种超过以前的产品的改进产品,在产品中由于连接的PAG链较少,使活性母分子仅有较少的化学改性,因而保留了较多的母分子原有的特性。因此,正如在本发明中那样,应用较少链的高分子量PAG,加合物保留多数(如果不是大多数的话)的母分子的活性,同时也显示出增加在血流中的耐久性。本发明的加合物的另一个优点是,应用高分子的PAG,可制成由其他工作者所制成的具有同样改性程度的较大的加合物。再者,在某些应用中,较大的PAG加合物是明显地有利的。例如,用本发明的方法应用分子量为30,000-130,000范围的PEG-链制备的而且说明了本发明的原理的本发明的PEG-SOD加合物,在小鼠体内的
血清半衰期约为36小时,比以前的工作者所叙述的PEG-SOD加合物较为大而长。
在PAG-SOD加合中较好是含有每个蛋白质分子上连有1至10个PAG链,而每个蛋白质分子较好是连有2至8个PAG链,而以连有2至6个PAG链最好。
当应用长链时,则达到满意的血清耐久性所需的链的数目可降低。
本发明的SOD制剂通常是由牛,其他动物(如羊、马、猪、狗、兔、鸡)或人类细胞衍生而来的以哺乳动物的含铜和含锌的超氧物歧化酶形式的酶。含其他金属离子如铁或锰的SOD制剂同样是有效的。从微生物的培养物衍生而来具有异系同基因结构的酶也是有效的(在这样的培养物中已克隆和表达了这种结构)。因为,本发明的产物已降低了致免疫性,所以由于在这些微生物培养物中转译的不保真性的结果,SOD还可能是不等同于天然存在的蛋白质。
现在还发现,当SOD制剂含有痕量的非SOD蛋白质时,在重复的非肠道施用时,这种蛋白质会以其他方式使这种制剂在免疫学上不安全,用本发明的方法偶联这种SOD可使这种产品相当地有效,因为这类污染蛋白质会造成显著地缺少致免疫性。
在这种偶联方法中,可使用许多常规的反应。
应用试剂如羰基二咪唑“、氯甲酸对硝基苯酯或双-N-琥珀酰亚胺碳酸盐,通过形成活性的碳酸半酯即PAG-O-CO-X(其中X是一个好的离去基团)来进行的反应的是一种优选的反应。然后在不会破坏其酶活性的条件下,将此活化的PAG即PAG-O-CO-X与蛋白质反应,从而导致占优势的尿烷键合
PAG-O-CO-NH-蛋白质
其连接是通过蛋白质氨基如赖氨酸的ε-氨基而形成的。
举例来说,羰基二咪唑可与PAG以末端羟基反应。在中性pH的水溶
液中抑制反应混合物,并通过透析和/或筛析色谱法将活化的PAG(聚亚烷基二醇-羰基-咪唑)分离出来。
在另一种形式的这类反应中,SOD和活性的PAG的溶液是干冻的。应用筛析色谱法可很方便地将偶联的产物分离出来。并可以应用的其他纯化方法包括离子交换色谱法。
在另外一个偶联反应中,是将聚亚烷基二醇溶于一种惰性有机溶剂中,使反应混合物变为弱碱性并与氰尿酰氯反应。
通过用石油醚沉淀PAG而除去末反应的氰尿酰氯。蒸发残留的溶剂而得到2-PAG-6-氯-1,3,5-三嗪。然后将所得到的活化聚合物在适合的缓冲液如硼酸溶液中与SOD反应。将未反应的活化PAG除去并用色谱法分离产物。因而获得4-羟基-1,3,5-三嗪,在其2-位上连有聚亚烷基二醇基团-PAG-O-,同时在其6-位上则连有SOD的活化赖氨酸基的ε-氨基。
PAG-OH的一个或几个羟基也可转化为羰基,例如与琥珀酸酐或与溴乙酸乙酯和碱反应,或者用碱性高锰酸盐氧化末端-OCH2CH2OH以形成PAG乙酸酯PAG-O-CH2COOH。然后将羧基活化,所用的方法为通常所知的用于修筛蛋白质的方法,例如用碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺反应而形成N-羟基琥珀酰亚胺酯,或者将乙酰肼亚硝化而形成酰基叠氮。然后将活化的PAG在不破坏蛋白质的酶活性的条件下与蛋白质反应,主要是导致通过蛋白质的氨基(如氨基的末端NH2和赖氨酸的ε-氨基)的酰胺键合(PAG…C(=O)NH-蛋白质)。
末端的PAG羟基也可以转化成氨基,如首先与溴化亚硫酰反应形成PAG-Br,接着再用过量的氨进行氨解而形成PAG-NH2。然后应用水溶性碳化二亚胺或伍德瓦德试剂K,通过酰胺键而将氨基-PAG直接偶联到蛋白
质的羧基上。另一方面,可将氨基的功能转化成羧酸的功能,例如通过与琥珀酸酐反应,然后再按前述的方法使之活化并与蛋白质反应。
也可以将PAG末端的-CH2OH用例如二氧化锰氧化而转化成醛基-CH(=O)。然后,应用例如氰基硼氢化物,通过蛋白质的自由氨基,可将这个醛基还原性地烷基化到蛋白质上,从而得到主要是通过仲胺基团的键连而形成PAG-O-CH2CH2-NH-蛋白质桥。
除了蛋白质氨基外,蛋白质羧基和巯基都可用于与PAG偶联。
正如上所述,在选择偶联反应时,只剩下由碳、氧、硫、氮和氢组成的非芳香基团作为PAG与蛋白质之间的桥式联接的一部份是优选的。
被结合的SOD可从反应溶液中分离出来,较好是通过通常使用的冷冻干燥在透析除去外来的离子后进行。如有需要或在必需时,这种结合物可通过离子交换色谱、电泳和/或凝胶过滤来进一步纯化。
用通常的方法通过一种微孔过滤器滤入一无菌小瓶中,任意选择地在用例如氯化钠和/或磷酸钠调节离子浓度成为等渗的溶液之后,而提供了适于注射施药的无菌溶液。
本发明的药物组合物包括本发明的PAG-SOD结合物和可在药物上应用的载体。
较好的药物组合物是无菌注射制剂的形式例如无菌注射水溶液。应用可在药物上应用的上述载体,根据已知的技术可配制成这种水溶液。这种无菌的注射制剂也可以是用无毒性的可于非肠道使用的稀释剂或溶剂配制成的溶液或悬浮液。
当通过适于具体的药物载体的途径施用单位剂量的组合物时,本发明的组合物与有效单位剂量的SOD结合物以有效于引起所需的反应的浓度相结合。例如液体组合物通常含有约每0.25至10ml含有约0.5至40mg结合蛋白,较好是约0.5至5ml(除了静脉内滴注溶液之外),这些溶液还可以是更稀的,如每50-1,000ml较好是每100-500ml滴注溶液含有0.5
至200mg SOD结合蛋白质。片剂、胶囊和栓剂通常每剂量单位含有0.1至25mg,较好是1至10mg结合蛋白质。
正如已确定的产品铜锌协同物质,本发明的SOD结合物在治疗多种炎症病情时是有效的,包括那些其中的合成的抗炎剂例如由于在长期应用时的毒性付作用而具有有限实用性的SOD结合物。
更具体地说,SOD结合物在各种哺乳动物中改善氧气毒性、再灌注损伤,和炎症病情以及减轻它们的影响(例如包括泌尿道和关节的)是非常有效的。这类结合物对于减轻与外伤后的关节炎和类风湿病例如滑囊炎、腱炎和骨关节炎的症状和与其有关的结构变形是有效的。
用下面的实例进一步说明本发明。
实例1
将50g PEG(以Polyox
为商标的联合碳化公司产品或聚环氧乙烷100,000分子量,由根据特性粘度测量确定的、标明分子量为100,000的异丙氧基化的PEG组成,由高效液体色谱法得到的平均值约为50,000)溶于1升无水吡啶中,加入22g琥珀酸酐。将此混合物在60℃搅拌38小时。在低于60℃于真空下除去溶剂并将残留物再溶于500ml水中。用己烷洗涤溶液然后用1000ml氯仿萃取产物。在40℃于真空下除去氯仿并将产品溶于苯中。用石油醚从苯中再沉淀琥珀酰化的PEG两次。
将此琥珀酰化物PEG的水溶液进行筛析分离,应用装备有300,000(蛋白质基准)分子量截膜的Millipore
Minitan
装置以超滤作用除去低分子量的PEG。将筛析分离产物在真空中干燥。用水相筛析高效液体色谱分析显示,用超滤作用的结果琥珀酰化的PEG的平均分子量由50,000增加至约80,000。
然后将由此得到的经筛析分离的琥珀酰化的PEG用N-羟基琥珀酰亚胺活化。将12g琥珀酰化PEG(分子量80,000,0.15mmol)溶于120ml无水二甲基甲酰胺中,再加入300mg(2.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺,同时搅拌,
溶解后,再加入2.4毫摩尔二环己基碳化二亚胺并将此溶液在40℃搅拌30分钟然后在24℃静置5天。再将此混合物通过一玻璃纤维过滤器过滤并在40℃于真空下将滤液蒸发至干。将残留物在温热下溶于200ml无水甲苯中。加入400ml石油醚使N-羟基琥珀酰亚胺基PEG固体沉淀。在真空中在一玻璃纤维过滤器上收集此产物,然后用石油醚将产物从甲苯中再沉淀,随后在真空中干燥。用筛析高效液体色谱法分析显示活化的结果并没有改变产物的分子量。
将含有80mg的牛的Cu、Zn SOD(2.46微摩尔,4400单位/mg,DDI Pharmaceuticals Inc.产品)的39ml 0.1摩尔磷酸钾缓冲液(pH8.0)溶液加到4g无水N-羟基琥珀酰亚胺基PEG衍生物(50微摩尔)中并在24℃溶解该混合物。筛析高效液体色谱分析显示偶联反应可在1.5小时内基本完成。这一点可由未反应的SOD的消失和具有分子量约200,000的高分子量紫外光吸收的加合物峰的出现而明显地看出。
未偶联到SOD上的自由PEG可从PEG-SOD加合物上用离子交换色谱分离出来。含有PEG-SOD的液份可用NaCl通过增加洗脱缓冲液(pH9)的离子浓度来收集。在水中透析PEG-SOD液份以除去缓冲组份,然后用冷冻干燥或真空蒸发来浓缩。
作为一个实例,已叙述了用50毫摩尔NaCl洗脱的典型产物的性质。该加合物含有24mg SOD蛋白质和165mg蛋白结合PEG。应用蛋白质成份的折射率检测(RI)和折射率的校正,通过二缩脲分析来测定蛋白质含量,通过高效液体色谱法测定PEG含量。测定出蛋白结合PEG的平均分子量是72,000。通过蛋白水解作用由加合物分离出来的PEG的这个分子量与表示在加合物中SOD蛋白质(分子量32,000)与PEG的比例是24mg比165mg的这一数据相结合,得出每一个SOD分子上结合3条PEG链的结合比例。用这种方法得到的每一个SOD分子的PEG链的数目得出计算出的加合物分子量是220,000(72,000×3+32,000/8),这一结果与用高效液体
色谱法得出的分子量是一致的。
应用McCord和Fridovich的细胞色素C分析法(J.Biol.Chem.244∶6049-6055∶(1969))测定出上述加合物的SOD活性。PEG-SOD加合物的比活性(约4317单位/mg蛋白质)是天然酶起始物料(4400单位/mg)的98%。因此该产物仍然保留几乎所有的天然酶的或生物学的活性,同时达到了本发明的其他要求。
用成年的雌性瑞士Webster小鼠进行致敏作用/激发试验,以将得自如本实例所叙述的PEG-SOD衍生物与高度纯化的、末改良的SOD原始物料在免疫学的致敏作用潜能(引起过敏反应的活性)方面进行比较。在两周的期间用每剂量0.075mg蛋白质对10只小鼠进行4次皮下注射使之免疫,然后在间隔21天后用同一化合物以每剂量0.04mg蛋白质进行静脉注射使之激发。尽管在第5次静脉激发期间,在接受未改进的SOD试验组中有5只死亡而留下的5只中有3只显示过敏症的病征,但接受同一剂量的PEG-SOD的10支小鼠中没有一只显示过敏症的任何病征。
当应用相同的实验原始方案对每分子SOD约含有6条5000分子量的PEG链的PEG-SOD加合物进行试验,在第5次激发试验期间10只小鼠中有2只死亡而余下的小鼠中有4只显现出过敏症的病征。因此在由本发明制备的PEG-SOD中,每个SOD含有3条分子量为72,000的PEG其致免疫性要比含有6条分子量为5,000的PEG的PEG-SOD加合物为弱。
实例2
按照实例1的方法,将高分子量的PEGs偶联到牛的Cu、Zn SOD上。已经发现在小鼠体内具有5条分子量为100,000的PEG和3条分子量为120,000的PEG的产物其致免疫性要比天然的SOD或具有4条分子量为35,000PEG的产物致免疫性要弱。
实例3
应用成熟雌性瑞士Webster小鼠,将天然SOD的血清耐久性与按实
例1的方法制备的PEG-SODs相比较。将100微克SOD进行静脉注射。按常规的间歇收集血液并用从小鼠SOD中分离PEG-SOD的电泳法来分析血浆的比PEG-SOD活性。一种试验的PEG-SOD加合物含有分子量约为65,000的2条PEG链和另一种含有分子量约为40,000的4条PEG链。在小鼠中天然SOD消失的半衰期为5-10分钟,然而上两者PEG-SOD消失的半衰期大于36小时,而在这些动物血液中的PEG-SOD活性至少9天都可以探测到。
具有分子量约为45,000含有平均25条PEG链的制剂也可表现出半衰期大于36小时。
实例4
一种被标明为100,000分子量(由特性粘度测定的平均分子量)的PEG(联合碳化公司)的水溶液,(但是用高效液体色谱法测得平均分子量约为50,000),用装备有300,000(蛋白质基准)分子量阻截膜的Millipore Minitan装置通过超滤作用来筛析分离。在真空下干燥筛析的产物。用高效液体色谱分析表明,样品经超滤作用后的平均分子量由50,000增加到100,000。在含有3.77g上述筛析分离的PEG的100ml无水乙腈溶液中加入含有1.39g氰尿酰氯的2.8ml无水乙腈溶液。在24℃静置3天后,用等量的乙腈烯释然后过滤使之变清。在30℃于真空中蒸发以除去溶剂并将残留物再溶于120ml无水甲苯中。加入360ml无水己烷使产物沉淀。用石油醚使产物从甲苯中再沉淀一次,并在真空中干燥,而得到活化的氰尿酰氯PEG。经筛析高效液体色谱法显示,活化的结果并没有改变PEG的分子量。
将不同量的得自上述的活化PEG进行试验以便得知偶联到处于1mg/mcl的恒定水平的牛的Cu、Zn SOD上的效率。PEG终浓度范围从5至100mg/ml。在24℃反应24小时后,用高效液体色谱分析该混合物,用紫外光检测PEG-SOD的形成和残余的SOD的量。
表1
PEG∶SOD SOD转化为加 加合物峰值
(W∶W) (M∶M) 合物的百分数 分子量*
5 2 25% -
10 4 29% 90K
20 8 62% 140K
50 20 90% 150K
75 30 95% 200K
100 40 100% 200K
*在TSK PW柱上用高效液体色谱测定,用商业的PEG基准校准。
如表1所示,在PEG对SOD之比(20∶1摩尔比)为50∶1(W/W)时,有90%的SOD转化成具有150,000平均分子量的PEG-SOD。在PEG对SOD有较大比率的情况下,SOD转化为PEG-SOD的量和加合物的分子量两者都有增加。由所得到的加合物的大小表明,在上述这样的条件下应用氰尿酸为偶合剂,有多至两条100,000分子量的PEG可被连接到SOD上。
表1中列出了测定在小鼠体内用PEG-SOD产物(PEG对SOD的比例为10∶1(W∶W)和75∶1(W∶W)的反应的血清耐久性。应用了在上述实例3中所应用的同一方法。得到了两种试验产物的半衰期至少为36小时。
实例5
将10g 100千道尔顿聚乙二醇(100K PEG,联合碳化物公司)冷冻干燥24小时,以除去在样品中存在的任何湿气。将干的100K PEG溶于约45ml的无水乙腈中。然后加入5.12g 1,1-碳酰二咪唑并将反应混合物在
室温下孵育1.5小时,然后在去离子水中骤冷以破坏过量的碳酰二咪唑。将pH保持在7以防止活性PEG的水解。然后将该混合物在4℃在4升蒸馏水中透析1天,应用至少10次更换以除去乙腈和咪唑。经透析后,在去离子水中活化的PEG用在Sephacryl S-400柱上进行色谱法分离,以从低分子量片段中分离出活化的100K-PEG。
在所得到的活化的PEG中加入足够的SOD以产生每摩尔SOD为3摩尔PEG的摩尔比,将92.8mg SOD加到沉淀池(体积=108ml)中。将此混合物冷冻干燥4次以产生所需要的PEG-O-CO-SOD产物。
实例6
在35℃于氮气氛中并于搅拌下,将10g氢化钠缓慢地加到含有30g聚乙二醇的1100ml无水二噁烷熔液中。在25℃再搅拌一小时后,加入15ml溴乙酸乙酯。将此溶液在25℃搅拌30分钟,然后在45℃再搅拌2小时再加入200ml水以终止反应。然后在不断搅拌下再加入400ml石油醚将有机相弃去并用石油醚洗涤粘性的水相。将含有PEG乙基酯的水相稀释至约1升并将温度升至60-70℃进行皂化5小时。最后,进行酸化至pH2使PEG羧基转化成游离酸。用透析法或凝胶过滤法以除去余下的溴乙酸。可将所制备的PEG醚取代以制成用于实例1的琥珀酰化的PEG。
因此,应用9.4g活化的聚乙二醇(分子量为40,000)和7.9mg牛的SOD,就可得到含有平均每分子SOD有3.3条PEG链的加合物。用高效液体色谱测定,产物的分子量约为140,000。在小鼠体内,此加合物的致免疫性大大降低。
应用6.5g分子量为120,000的聚乙二醇和87mg牛SOD,就可得到由高效液体色谱法测定出其分子量约为245,000的加合物。
实例7
已经制定了应用人类SOD的应用方法。将20mg活化的样品即琥珀酰化的PEG放入玻璃试管中。含有3mg/ml人类SOD的0.2摩尔pH8的磷
酸-硼酸缓冲液的溶液100mcl。经混合后,在一支250mcl的微试管中在58mcl的0.01M 1∶1醋酸钠∶醋酸的缓冲液中将每一反应混合物中的样品除去并使之骤停。为了监测反应的进行,将样品在pH8.5用250伏电压电泳15分钟,然后用氮蓝四唑进行染色。
于室温3-3.5小时,用45微升每毫克PEG 0.03摩尔1∶1乙酸盐缓冲液使溶液骤停。加入0.1ml pH8的反应缓冲液和0.9ml 30毫摩尔乙酸盐使pH最后成为6.4。此pH值的降低和1∶10稀释作用停止了进一步的PEG-SOD偶联和水解。30-45分钟后发现没有可以观察到的进一步反应。
虽然注射后的一天在小鼠血清中不再检测到上述具有类似自由SOD的、带有分子量为19,000道尔顿PEG链的PEG-SOD,但是带有分子量为30,000道尔顿的PEG链的制剂却提供了一延长的耐久时间。
Claims (8)
1、制备一种用偶联剂将超氧物歧化酶偶联到聚乙二醇上的、基本上溶于水的非致免疫结合物的方法,其中所说的聚乙二醇具有应用约35,000-120,000分子量的PEG为标准并通过高效液体色谱法(HPLC)确定的平均分子量,而且在聚乙二醇的末端是未被取代的或由C1-4烷基取代的,该方法包括将1摩尔超氧物歧化酶与1-8摩尔其一个末端基团用蛋白质的氨基酸活化的聚乙二醇进行反应。
2、根据权利要求1制备结合物的方法,其中的聚乙二醇是用高效液体色谱法确定具有平均分子量约为35,000-120,000的聚乙二醇。
3、根据权利要求2制备结合物的方法,其中的聚乙二醇是具有平均分子量约为35,000-120,000的聚乙二醇。
4、根据权利要求2制备结合物的方法,其中将2至8个聚乙二醇基团偶联到每一个含铜和锌的超氧物歧化酶分子上。
5、根据权利要求4制备结合物的方法,其中将2至6个聚二醇基团偶联到每一个超氧物歧化酶分子上。
6、根据权利要求1的方法,其中聚乙二醇是异丙氧基聚乙二醇。
7、根据权利要求1制备结合物的方法,其中聚乙二醇的末端基团是通过一个CO连接到超氧物歧化酶赖氨酸的末端氨基上。
8、根据权利要求1的方法,其中的聚乙二醇的末端基团是由被酯化或改变成羧基、氨基、羧酰氨基或醛基的羟基制备的。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8100987A | 1987-08-03 | 1987-08-03 | |
US081.009 | 1987-08-03 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1031088A CN1031088A (zh) | 1989-02-15 |
CN1020458C true CN1020458C (zh) | 1993-05-05 |
Family
ID=22161332
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN88104857A Expired - Fee Related CN1020458C (zh) | 1987-08-03 | 1988-08-02 | 偶联到高分子量的聚亚烷基二醇类上的超氧物歧化酶的结合物的制备方法 |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0377613B1 (zh) |
JP (1) | JP2515389B2 (zh) |
KR (1) | KR920001426B1 (zh) |
CN (1) | CN1020458C (zh) |
AU (1) | AU608901B2 (zh) |
CA (1) | CA1309046C (zh) |
DE (1) | DE3876997T2 (zh) |
DK (1) | DK160842C (zh) |
ES (1) | ES2007536A6 (zh) |
HU (1) | HU203783B (zh) |
IE (1) | IE64284B1 (zh) |
IL (1) | IL87177A (zh) |
NZ (1) | NZ225481A (zh) |
PH (1) | PH27225A (zh) |
RU (1) | RU1776275C (zh) |
WO (1) | WO1989001033A1 (zh) |
ZA (1) | ZA885249B (zh) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0893439B1 (en) * | 1989-04-19 | 2005-07-27 | Enzon, Inc. | A process for forming a modified polypeptide comprising a polypeptide and a polyalkylene oxide |
US5109118A (en) * | 1989-07-06 | 1992-04-28 | Yutaka Mizushima | Modified biologically active proteins |
GB8919661D0 (en) * | 1989-08-31 | 1989-10-11 | Univ Alberta | Superoxide dismutase-catalase conjugates |
US5772996A (en) * | 1990-08-03 | 1998-06-30 | Public Health Laboratory Service Board | Pharmaceutical compositions containing superoxide dismutase from Bacillus Stearothermophilus and Bacillus Caldotenax |
WO1993002701A1 (en) * | 1991-08-05 | 1993-02-18 | Sterling Winthrop Inc. | Buffered formulation of peg-sod |
FR2687681B1 (fr) * | 1992-02-20 | 1995-10-13 | Transgene Sa | Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses. |
US5349001A (en) * | 1993-01-19 | 1994-09-20 | Enzon, Inc. | Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides |
US5516703A (en) * | 1993-08-20 | 1996-05-14 | The University Of Utah | Coating of hydrophobic surfaces to render them protein resistant while permitting covalent attachment of specific ligands |
US6284503B1 (en) | 1993-08-20 | 2001-09-04 | University Of Utah Research Foundation | Composition and method for regulating the adhesion of cells and biomolecules to hydrophobic surfaces |
WO1999067370A1 (en) * | 1998-06-23 | 1999-12-29 | Novozymes A/S | A polypeptide-polymer conjugate |
US6638526B1 (en) | 1998-06-23 | 2003-10-28 | Novozymes A/S | Polypeptides conjugated to copolymers of ethylene oxide and propylene oxide to reduce allergenicity |
JP2002520049A (ja) * | 1998-07-17 | 2002-07-09 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 改良された洗浄性能を有するポリペプチド−ポリマー接合体 |
US8129330B2 (en) | 2002-09-30 | 2012-03-06 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
US20040062748A1 (en) | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
BR0317742A (pt) | 2002-12-26 | 2005-11-22 | Mountain View Pharmaceuticals | Conjugados poliméricos de interferon-beta com potência biológica aumentada |
EP1626983B8 (en) | 2003-05-12 | 2010-12-22 | Affymax, Inc. | Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof |
CN108445106A (zh) * | 2018-04-11 | 2018-08-24 | 南京明捷生物医药检测有限公司 | 一种药物中消泡剂聚丙二醇残留的检测方法 |
CN108864309B (zh) * | 2018-07-26 | 2021-07-13 | 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司 | 重组人sod-生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用 |
CN109112119B (zh) * | 2018-08-28 | 2022-04-26 | 佛山科学技术学院 | 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法 |
CN117551625B (zh) * | 2024-01-12 | 2024-03-08 | 山东爱维德生物科技有限公司 | 一种用于木立芦荟sod胶的聚乙二醇二胺-海藻酸改性sod酶及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL74177A (en) * | 1984-02-03 | 1989-09-10 | Abbott Lab | Stabilized enzyme conjugate composition containing a calcium salt and a polyethylene glycol |
GB8430252D0 (en) * | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
GB8430253D0 (en) * | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
JPH084504B2 (ja) * | 1985-04-26 | 1996-01-24 | 味の素株式会社 | 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ |
-
1988
- 1988-07-19 IE IE220688A patent/IE64284B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-07-20 NZ NZ225481A patent/NZ225481A/en unknown
- 1988-07-20 ZA ZA885249A patent/ZA885249B/xx unknown
- 1988-07-21 IL IL87177A patent/IL87177A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-07-21 ES ES8802307A patent/ES2007536A6/es not_active Expired
- 1988-07-29 KR KR1019890700575A patent/KR920001426B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-07-29 WO PCT/US1988/002530 patent/WO1989001033A1/en active IP Right Grant
- 1988-07-29 EP EP88907489A patent/EP0377613B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-29 DE DE8888907489T patent/DE3876997T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-29 AU AU23268/88A patent/AU608901B2/en not_active Ceased
- 1988-07-29 HU HU885380A patent/HU203783B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-07-29 JP JP63506483A patent/JP2515389B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-29 PH PH37315A patent/PH27225A/en unknown
- 1988-08-02 CN CN88104857A patent/CN1020458C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-03 CA CA000573740A patent/CA1309046C/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-08-10 DK DK392789A patent/DK160842C/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-02-02 RU SU904742978A patent/RU1776275C/ru active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1989001033A1 (en) | 1989-02-09 |
JPH02504341A (ja) | 1990-12-13 |
DK160842C (da) | 1991-10-14 |
HUT52816A (en) | 1990-08-28 |
KR920001426B1 (ko) | 1992-02-13 |
IE882206L (en) | 1989-02-03 |
DE3876997T2 (de) | 1993-04-29 |
AU608901B2 (en) | 1991-04-18 |
DE3876997D1 (de) | 1993-02-04 |
NZ225481A (en) | 1990-11-27 |
RU1776275C (ru) | 1992-11-15 |
DK160842B (da) | 1991-04-22 |
DK392789D0 (da) | 1989-08-10 |
KR890701736A (ko) | 1989-12-21 |
EP0377613B1 (en) | 1992-12-23 |
AU2326888A (en) | 1989-03-01 |
PH27225A (en) | 1993-05-04 |
IL87177A0 (en) | 1988-12-30 |
IL87177A (en) | 1992-08-18 |
JP2515389B2 (ja) | 1996-07-10 |
ZA885249B (en) | 1989-04-26 |
IE64284B1 (en) | 1995-07-26 |
HU203783B (en) | 1991-09-30 |
CA1309046C (en) | 1992-10-20 |
EP0377613A1 (en) | 1990-07-18 |
CN1031088A (zh) | 1989-02-15 |
ES2007536A6 (es) | 1989-06-16 |
DK392789A (da) | 1989-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1020458C (zh) | 偶联到高分子量的聚亚烷基二醇类上的超氧物歧化酶的结合物的制备方法 | |
US5283317A (en) | Intermediates for conjugation of polypeptides with high molecular weight polyalkylene glycols | |
US5006333A (en) | Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols | |
US5334382A (en) | Lyophilized polyethylene oxide modified catalase composition, polypeptide complexes with cyclodextrin and treatment of diseases with the catalase compositions | |
US5532150A (en) | Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances | |
EP3081233B1 (en) | Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins | |
US4179337A (en) | Non-immunogenic polypeptides | |
CN102161984A (zh) | 分离四聚体尿酸氧化酶的方法 | |
US5372942A (en) | Protease K resistant arginine deiminase, its method of preparation and its use as an anti-neoplastic agent | |
EP1725583A2 (en) | Methods for increasing protein polyethylene glycol (peg) conjugation | |
EP0325270A2 (en) | Anticancer conjugates | |
JP3209338B2 (ja) | ポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミナーゼおよびその製造法 | |
JPH06509582A (ja) | Peg−sodの緩衝化製剤 | |
KR100360946B1 (ko) | 재조합인간초-산화물불균화효소(rhSOD)의고분자결합체및이를제조하는방법 | |
JPH02231075A (ja) | デキストラン硫酸修飾スーパーオキシドジスムターゼ | |
KR20030005299A (ko) | 혈장 내의 아스코르베이트의 제거 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C15 | Extension of patent right duration from 15 to 20 years for appl. with date before 31.12.1992 and still valid on 11.12.2001 (patent law change 1993) | ||
OR01 | Other related matters | ||
C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |