HU203783B - Process for producing superoxide-dismutase conjugates - Google Patents

Process for producing superoxide-dismutase conjugates Download PDF

Info

Publication number
HU203783B
HU203783B HU885380A HU538088A HU203783B HU 203783 B HU203783 B HU 203783B HU 885380 A HU885380 A HU 885380A HU 538088 A HU538088 A HU 538088A HU 203783 B HU203783 B HU 203783B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
peg
sod
molecular weight
polyethylene glycol
pag
Prior art date
Application number
HU885380A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT52816A (en
Inventor
Mark Saifer
Ralph Somack
L David Williams
Original Assignee
Ddi Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ddi Pharmaceuticals filed Critical Ddi Pharmaceuticals
Publication of HUT52816A publication Critical patent/HUT52816A/hu
Publication of HU203783B publication Critical patent/HU203783B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

A találmány tárgya új szuperoxid-diszmutáz konjugátumok előállítására szolgáló eljárás. Közelebbről, a találmány olyan szuperoxid-diszmutáz (SÓD) konjugátumok vagy adduktumok előállítására vonatkozik, amelyekben a SÓD amino-, karboxil- vagy szulfhidril-csoportjainak legalább egy része polialkilén- glikollal (PAG), mint például polietilén-glikollal (PEG) vagy polietilén-polipropilén-glikol kopolimerrel van kapcsolva, ahol a PAG molekulatömege nagyobb, mint 20 000, előnyösen az átlagos molekulatömege 40 000 és 1 000 000 dalton közötti. Hacsak másképpen nem jelezzük, a PAG molekulatömegén azt a molekulatömeget értjük, amelyet PEG standard alkalmazásával nagy sebességű, méretkizárásos folyadékkromatográfiával (HPLC) határozunk meg. A PAG átlagos molekulatömege előnyösen nagyobb, mint 40 000 és nem nagyobb, mint 200 000, különösen előnyösen 50 000-150 000. A PAG lehet lineáris vagy elágazó szénláncú, és lehet nem helyettesített vagy 1-4 szénatomos alkil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoportokkal helyettesített. Különösen előnyös, ha két SÓD molekulát olyan PAG molekulák kapcsolnak össze, ahol egy terminális csoportként 1-4 szénatomos alkoxicsoport, mint például izopropoxicsoport van jelen.
A korábbi megoldásokban alkalmazott PEG vagy metoxi-PEG kis molekulatömegű, rendszerint körülbelül 5000 vagy ennél kisebb molekulatömegű, amelyet szuperoxid-diszmutázzal vagy más proteinekkel kapcsoltak olyan adduktumok előállítására, amelyek különböző fokban mutatnak (a) fokozott elnyújtott aktivitást a szérumban, és (b) csökkent immunogenitást Azonban az (a), valamint (b) jellemzők elérése érdekében végzett, a proteincsoportok kis molekulatömegű PEG vagy metoxi-PEG segítségével történő módosításának mértéke gyakran vezet az enzimaktivitás vagy biológiai aktivitás lényeges veszteségéhez.
így például Pyatak és munkatársai (Rés. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29, 113-127, 1980) kimutatták, hogy 7-18 (egyenként 5000 móltömegű) metoxiPEG-lánc kapcsolása a SOD-hoz olyan adduktumot eredményez, amelynek felezési ideje egerekben kb. 25 óra, az enzimaktivitása azonban a natív enzim aktivitásának mindössze 50-60%-a. Kevesebb 5000 móltömegű PEG kapcsolása magasabb enzimaktivitású adduktumot eredményez, azonban ekkor a szérummal szembeni ellenállóképesség csökken (kb. 10 óra).
Yoshimoto és munkatársai (Jpn. J. Cancer Rés. 77, 1264-1270,1986) a L-aszparagináz kapcsán megfigyelt problémákat úgy proóbálták megoldani, hogy egy olyan klór-triazin-származék reagens használatával kevesebb proteincsoportot módosítottak, amely két metoxi-PEGlánccal volt helyettesítve, amely láncoknak a móltömege a mások által használtakénak a nagyságrendjébe esett (5000 vagy kevesebb). A cianur-klorid azonban az állatokra nézve toxikus, és a szakemberek nem szívesen visznek be triazingyűrűt egy olyan adduktumba, amelyet gyógyszergyártás céljára alkalmaznak, mivel ezt a kémiai csoportot immunogénnek tartják. Yabuki és Iwashita a 200 467 számon közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben a metoxi-PEG-et PEG-gel helyettesítette, amelynek molekulatömege megegyezik a mások által alkalmazottal, olyan SOD-kopolimer-adduktumok előállítása céljából, ahol a PEG két vége különböző SÓD molekulákhoz kapcsolódik.
Az ilyen adduktumok felezési ideje a szérumban 4-8 óra. Más szakemberek, példái Lee és Sehon (Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 56, 159-170, 1978), Lee és Sehon (id. 56, 193-206, 1978) és Mueller és munkatársai (id. 68, 312-319, 1982 és id. 68, 320-235, 1982) már korábban használtak olyan móltömegű (6000-20 000) PEG-et, mint Yabuki és Iwashita adduktumok előállítására, amelyek valószínűleg hasonló kopolier szerkezettel rendelkeztek. Wie és munkatársai (Int. Archs. Allergy Appl. Immun, 64, 84-89, 1981) és Lee és munkatársai (id. 64,100-114,1981) PEG-et célzatosan (2000-20 000 móltömegű) metoxi-PEG-get helyettesítették, hogy az esetleges inter- és intramolekuláris kötések kialakulását meggátolják.
A szuperoxid-diszmutáz (SÓD) egy intracelluláris enzim, amely a szuperoxid-gyök oxigénné vagy hidrogénperoxiddá alakításának katalizálásáért felelős. A találmány célja egy olyan tennék előállítása, amely in vivő ellenállóbb, mint a natív SOD-protein, továbbá a vesék által történő inaktiválás késleltetése.
Különösen fontos az, hogy a tennék hosszú ideig megtartsa enzimaktivitását, miközben immunogenitása alacsony.
A találmány célja továbbá olyan konjugátum előállítása, amely gyulladásgátló aktivitással rendelkezik, ahogyan ezt a szokásos kanagénnel indukált mancs-ödéma tesztben bemutatjuk. Ez az aktvivitás különösen alkalmassá teszi a terméket arra, hogy reumás állapotok kezelésére alkalmazzuk.
A találmány szerinti eljárással előállított konjugátumok előnyösebbek a korábban ismerteknél abban, hogy kevesebb PEG-lánc kapcsolásával az eredeti aktív molekula kevesebb kémiai módosításon megy át, így az eredeti molekula jellemzőiből több marad meg. így, mivel a találmány szerinti eljárásban kevesebb nagy molekulatőmegű PEG-láncot kapcsolunk, az adduktum az eredeti molekula aktivitásának nagy részét, hacsak nem az egészét megtartja, miközben fokozott ellenállóképességet mutat a vérben.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható PAG molekulatömege több, mint 20 000. Az alkalmazott PAG bármely vízoldható alkilén- oxid-polimer leheti például poli(etilén-oxid) vagy etilén-oxid és propilén-oxid bizonyos kopolimeijei. A PAG lehet egyenes vagy elágazó szénláncú, és egy vagy több hidroxilcsoportján tartalmazhat 1-4 szénatomos alkoxicsoport- vagy más kémiai csoport-helyettesítőt. Az alkalmazott PAG-polimer molekulatömege nagyobb, mint 20 000, és előnyöen 40 000 és 200 000 közötti. 200 000-nél nagyobb molekulatömegŰ polimerek is alkalmazhatók, ezek azonban nem előnyösek nagyobb viszkozitásuk és a nyíróerőkkel szembeni érzékenységük miatt.
A találmány szerinti eljárással előállított PAGSOD-adduktum molekulatömege (az ismert molekulatömegű PEG-standard alapján mérve) körülbelül 85 000 és 2 000 000 dalton közötti, előnyösen körülbelül 90 000 és 1 000 000 dalton közötti. A találmány
HU 203 783 Β szerinti eljárással előállított PAG-SOD-adduktum és más PAG-adduktumok általában megtartják a natív protein enzimaktivitásának jelentős mértékét. (Megjegyezzük, hogy a jelen leírásban molekulatömegen az ismert molekulatőmegű PEG-standard alapján mért molekulatömeget értjük.)
A találmány szerinti eljárással előállított adduktumok egy másik előnye, hogy nagy molekulatömegű PAG alkalmazásával nagyobb adduktumok állíthatók elő, mint az ismertek. Bizonyos alkalmazási területeken a nagyobb PAG-adduktumok nyilvánvalóan előnyösebbek. így például a találmány szerinti eljárással előállított PEG-SODadduktumok, amelyeket 40 000-130 000 molekulatömegű PEG-láncokkal állítottunk elő, egerekben körülbelül 35-36 óra vagy ennél nagyobb szérumbeli felezési időt mutatnak, amely hosszabb, mint az ismert PEG-SOD-adduktumoké, amelyek felezési ideje maximum 24-28 óra.
A PAG-SOD-adduktumok proteinmolekulánként előnyöen 1-10 kapcsolódó PAG-láncot, előnyösebben 2-8, még előnyösebben 2-6 PAG-láncot tartalmaznak. A kellő szérumbeli ellenállóképesség eléréséhez kevesebb lánc szükséges, ha hosszabb láncokat alkalmazunk.
A találmány szerinti eljárással előállított SOD-készítmények emlős eredetű, borjútól vagy más állattól (például birkától, lótól, sertéstől, kutyától, nyáltól, csirkétől) vagy humán sejtekből származó szuperoxid-diszmutáz enzim réz- és cinktartalmú formáját tartalmazzák. Hozzáférhetők olyan SOD-készítmények is, amelyek más fémionokat, például vasat vagy mangánt tartalmaznak. Alkalmas az olyan enzim is, amely rokonszerkezettel rendelkezik, és amely olyan mikroorganizmus tenyészetből származik, amelyben ilyen szerkezetet klónoztak és kifejeztek Az alkalmazott SÓD lehet olyan protein is, amely nem azonos a természetben előforduló proteinekkel, az ilyen mikrobiológiai tenyészetekben történő transzláció tökéletlensége következtében, mivel a találmány szerinti eljárásban előállított termék csökkent immunogenitással rendelkezik.
Úgy találtuk továbbá, hogy ha a SOD-készítmény nem SOD-proteinek nyomait is tartalmazza, amelyek egyébként az ilyen készítményeket immunológiailag nem teszik biztonságossá az ismételt parenterális adagolásra, a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy az ilyen termék is használható legyen, mivel a szennyező proteinek lényegesen kevésbé immunogénné alakíthatók.
A kapcsolási eljárásban számos szokásos reakció használható.
Egy előnyös reakció során PAG-O-CO-X képletű reaktív karbonsav-félésztert képezünk, ahol X egy könynyen távozó csoportot képvisel, a reakciót karbonil-diimidazol, p-nitro-fenil-kloroformát vagy bisz-N-szukcinimidil-karbonát segítségével hajtjuk végre. Az aktivált PAG-ot, azaz a PAG-O-CO-X képletű vegyületet azután a proteinnel reagáltatjuk, olyan körülmények között, amelyek nem rontják le enzimaktikus aktivitását, és amelynek során elsősorban
PAG-O-CO-NH-protein képletű uretán kapcsolat jön létre, amely a protein aminocsoportjain, mint például lizin epszilon-aminocsoportján keresztül kapcsolódik.
A karbonil-diimidazol például reagáltatható a PAG terminális hidroxilcsoportjaival. A reakcióelegyet vizes oldatban semleges pH-nál lehűtjük, és az aktivált PAG-ot (polialkilén-glikol-karbonil-imidazol) dialízissel és/vagy méretkizárásos kromatográfiával izoláljuk.
A PAG-O-CO-N-CH-I^ és SÓD reakcióját oldatban
CH - CH hajtjukvégre az aktivált PAG fölöslege jelenlétében.
A reakció egyik változatában a SÓD oldatát és az aktivált PAG-ot fagyasztva szárítjuk. A kapcsolt terméket méretkizárásos kromatográfiával egyszerűen izolálhatjuk. Más tisztítási módszert is alkalmazhatunk, így például ioncserélő kromatográfiát.
Egy másik kapcsolási reakcióban a polialkilén-giikolt egy inért szerves oldószerben oldjuk, a reakcióelegyet enyhén alkálikussá tesszük és cianur-kloriddal reagáltatjuk
Az el nem reagált cianur-kloridot úgy távolítjuk el, hogy a PAG-ot petroléterrel kicsapjuk. A maradék oldószert lepároljuk, és így 2-PAG-6-klór-l,35-triazint kapunk. A kapott aktivált polimereket ezután alkalmas pufferben, például borátoldatban SOD-dal reagáltatjuk. Az el nem reagált aktivált PAG-ot eltávolítjuk, és a terméket kromatográfiásan izoláljuk. így 4-hidroxi-l,3,5-triazint kapunk, amelyhez a 2-es helyzetben a PAG-O-képletű polialkilén-glikol-csoport, míg a 6-os helyzetben a SÓD reaktív lizincsoportjának epszilon-aminocsoportja kapcsolódik.
A PAG-OH egy vagy több hidroxilcsoportja szintén karboxilcsoporttá alakítható, például úgy, hogy borostyánkősav-anhidriddel vagy etil-bróm-acetáttal és lúggal reagáltatjuk, vagy a terminális -OCH2CH2OH csoportot alkálifém-permanganáttal oxidáljuk, így PAG-O-CH2-COOH képletű PAG-ecetsav-étereket kapunk. A karboxilcsoportokat ezután valamely, a proteinek módosítására alkalmas ismert módszerrel aktiváljuk, például N-hidroxi-szukcinimid-észter képzésével egy karbodiimid és N-hidroxi-szukcinimid reakciója útján, vagy acil-azld képzésével az acil-hidrazid nitrozálása útján. Az aktivált PAG-ot azután a proteinnel reagáltatjuk olyan körülmények között, amelyek nem rontják le a protein enzimatikus aktivitását, amelynek során elsősorban amidkőtések jönnek létre [PAG-C(-O)NH-protein] a protein aminocsoportjain keresztül (mint például aminoterminális NH2-csoportok, és a lizin epszilon-aminocsoportjai).
A PAG egy terminális hidroxilcsoportja szintén aminocsoporttá alakítható például úgy, hogy először tionilbromiddal reagáltatjuk, majd a kapott PAG-Br terméket ammónia fölöslegével aminolízisnek vetjük alá, így PAG-NH2 képletű terméket kapunk. Az amino-PAG azután amidcsoportokon keresztül közvetlenül kapcsolható a protein karboxilcsoportjaihoz. Kapcsolási reagensként használható például vízoldható karbodiimid vagy Woodward-féle reagens. Az aminocsoportok viszont karboxilcsoporttá alakíthatók például úgy, hogy borostyánkősavanhidriddel reagáltatjuk, amelyet azután aktiválunk és a proteinnel reagáltatunk a fenti módon.
A PAG terminális -CH2OH-csoportjai aldehidcsoportokká alakíthatók például mangán-dioxidos oxidá3
HU 203 783 Β cióval. Az aldehidcsoportok azután reduktív úton alkilezhetők a proteinre ennek aminocsoportjain keresztül, például ciano-bór-hidriddel, így elsősorban a szekunder aminocsoportokon keresztül kialakuló kötések képződnek PAG-OCHíCHíNH-protein hidakat képezve.
A protein aminocsoportjai mellett a protein karboxilés szulfhidril-csoportjai szintén felhasználhatók arra, hogy a polialkilén-glikollal kapcsoljuk.
Amint fent említettük, a kapcsolási reakciók kiválasztásakor azokat részesítjük előnyben, amelyek a PAG és a protein összekapcsolásában kialakuló hídban szénből, oxigénből, kénből, nitrogénből és hidrogénből álló nemaromás csoportokhoz vezetnek.
A SÓD konjugátum a reakcióelegyből izolálható, előnyösen az idegen ionok eltávolítására végzett dialízis után, szokásos liofilizásái módszerekkel. Kívánt esetben a konjugátum tovább tisztítható ioncserélő kromatográfiával, elektroforézissel és/vagy gélszűréssel.
Mikroporózus szűrőn szokásos módszerrel steril fiolákba történő szűréssel, adott esetben az ionerősség izotóniás értékre történő állítása után, amelyet például nátrium-kloriddal és/vagy nátrium-foszfáttal végzünk, steril oldatot kapunk, amely injekciós adagolásra alkalmas.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények a találmány szerinti eljárással előállított PAG-SOD-konjugátumokat tartalmazzák farmakológiailag elfogadható hordozó mellett.
A gyógyszerkészítmények előnyösen steril injekciós készítmények például steril injektálható vizes oldatok. Az oldatok ismert módszerrel készíthetők el, alkalmas farmakológiailag elfogadható hordozók alkalmazásával. A steril injektálható készítmények lehetnek nemtoxikus parenterálisan elfogadható hígítószerrel vagy oldószerrel készült oldatok vagy szuszpenziók is.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények a SOD-konjugátum egy hatásos dózisegységét tartalmazzák olyan koncentrációban, amely a kívánt válasz kiváltására képes, amikor a dózisegységet az illető farmakológiai hordozónak megfelelő úton adagoljuk. így például a folyékony kompozíciók rendszerint 05-40 mg protein-konjugátumot tartalmaznak 0,25-10 ml, előnyösen 0,5-5 ml készítményben, kivéve az intravénás infúziós oldatokat, amelyek hígabbak is lehetnek, így például 05-200 mg SOD-konjugátumot tartalmazhatnak 501000 ml, előnyösen 100-500 ml infúziós oldatban. A tabletták, kapszulák és kúpok rendszerint 0,1-25 mg, előnyösen 1-10 mg protein-konjugátumot tartalmaznak dózisegységenként.
A találmány szerinti eljárással előállítót SOD-konjugátumok, az orgotein készítményekhez (kereskedelmi SOD-készítmények) hasonlóan, különböző gyulladásos állapotok kezelésére hatásosak, így például olyan esetekben, ahol a szintetikus gyulladásgátló szerek kevésbé használhatók, például a hosszú használat miatt kialakuló toxikus mellékhatások következtében.
Közelebbről, a SOD-konjugátumok alkalmazhatók oxigén-toxicitás, újraáramoltatási sérülés és gyulladásos állapotok javítására, és ezek hatásának enyhítésére, pél4 dául különböző emlősöknél a húgyutak esetén. Használhatók baleset utáni ízületi gyulladással kapcsolatos tünetek és szerkezeti elváltozások, továbbá reumás betegségek, mint például bursitis, ínygyulladás és csont-ízületi gyulladás enyhítésére.
A találmányt az alábbi nem korlátozó példákkal illusztráljuk közelebbről.
1. Példa: PEG-SOD-addukt előállítása g PEG-et (Polyox·, Union Carbide gyártmány, vagy polietilén-oxid, amely izopropoxilezett PEG-ből áll, molekulatömege 10Ö 000, belső viszkozitással nyerve, amelyre a HPLC körülbelül 50 000 átlagos értéket ad) feloldunk 1 liter vízmentes piridinben, és hozzáadunk 22 g borostyánkősav-anhidridet Az elegyet 38 óra hosszat 60 ’C hőmérsékleten keverjük. Az oldószert vákuumban 60 ’C alatti hőmérsékleten eltávolítjuk, és a maradékot feloldjuk 500 ml vízben. Az oldatot hexánnal mossuk, majd 1000 ml kloroformmal extraháljuk. A kloroformot vákuumban 40 ’C hőmérsékleten eltávolítjuk, és a maradékot benzolban oldjuk. A szukcinilezett PEGet kétszer kicsapjuk a benzolból petroléterrel.
A kapott szukcinilezett PEG vizes oldatát ultraszűréssel méret szerint frakcionáljuk egy Millipore® Minitan* berendezéssel, amely 300 000 molekulatömeghatár (protein standard) biztosító membránnal van ellátva, a kis molekulatömegű PEG eltávolítására. A méret szerint frakcionált terméket vákuumban megszárítjuk. A méretkizárásos vizes HPLC analízis azt mutatja, hogy a szukcinilezett PEG átlagos molekulatömege a ultraszűrés hatására körülbelül 50 000-ről körülbelül 80 000-re emelkedett. A kapott, méret szerint frakcionált szukcinilezett PEG-et ezután N-hidroxi-szukcinimiddel aktiváljuk. 12 g szukcinilezett PEG-et (molekulatömeg 80 000, 0,15 mmól) feloldunk 120 ml vízmentes dimetil-formamidban, és keverés közben hozzáadunk 300 mg (2,6 mmól) N-hidroxi-szukcinimidet. Oldás után hozzáadunk 2,4 mmól diciklohexil-karbodiimidet, és az oldatot 40 C hőmérsékleten 30 percig keverjük, majd keverés nélkül 24 ’C hőmérsékleten 5 napig állni hagyjuk. Az elegyet ezután egy üvegszál szűrőn leszűrjük, a születet vákuumban 40 ’C hőmérsékleten szárazra pároljuk. A maradékot enyhe melegítés közben 200 ml vízmentes toluolban feloldjuk. Az N-hidroxil-szukcinimidilPEG-et 400 ml petroléterrel kicsapjuk. A terméket vákuumban üvegszál szűrőn összegyűjtjük, majd toluolból petroléterrel újra kicsapjuk, és vákuumban megszárítjuk. A méretkizárásos HPLC azt mutatja, hogy a termék molekulatömege az aktiválás közben nem változik.
mg borjú Cu, Zn-SOD (2,46 pmól, 4400 egység/mg, DDI Phaimaceuticals, Inc. gyártmány) 39 ml 0,1 mól/literes kálium-foszfát-pufferrel készült oldatát (pH-8,0) hozzáadjuk 4 g száraz N-hidroxil-szukcinimidil-PEG-származékhoz (50 pmól), és az elegyet 24 ’C hőmérsékleten feloldjuk A méretkizárásos HPLC analízis azt mutatja, hogy a kapcsolási reakció lényegében véve végbemegy 15 óra alatt, amit az el nem ragált SÓD eltűnése és a nagy molekulatömegű UV-abszorbeáló ad-41
HU 203 783 Β duktumcsúcs megjelenése (körülbelül 200 000 molekulatömeggel) mutat
A SOD-hoz nem kapcsolódott szabad PEG-et ioncserélő kromtográfiával választjuk el a PEG-SOD-adduktumtól. A PEG-SOD-adduktum frakciókat az eluáló puffer ionerősségének nátrium-kloriddal történő emelésével gyűjtjük össze (pH-9). A PEG-SOD-frakciókat vízzel szemben dializáljuk a puffermaradék eltávolítására, majd fagyasztva szárítással vagy vákuum bepárlással koncentráljuk
Egy, az 50 mmól/liter koncentrációjú nátrium-kloriddal eluált termék tulajdonságait a következőkben példaként megadjuk Az adduktum 24 mg SOD-proteint és 165 mg proteinhez kötött PEG-et tartalmaz. A proteintartalmat biuret analízissel és a PEG-tartalmat HPLC analízissel határozzuk meg refraktív index detekcióval (Rí), és korrigáljuk a protein ΕΙ-hez történő hozzájárulására. A proteinhez kötött PEG átlagos molekulatömege 72 000. Az adduktumokból proteolízissel felszabadított PEG mért molekulatömege, amelyet azon adatokkal kombináltunk amelyek azt mutatják hogy a SOD-protein (32 000 molekulatömeg) és a PEG aránya az adduktumban 24:165 mg, azt mutatja, hogy 3 PEG-lánc kapcsolódik 1 molekula SOD-hoz. Az adduktum ezen az alapon számított molekulatömege 220 000 (72 000*3+32 000*8), az eredmény megegyezik a HPLC-vel kapott molekulatömeggel.
A fenti adduktum SÓD aktivitását citokróm-C vizsgálattal határoztuk meg [McCord és Fridovich, J. Bioi. Chem. 244,6049-6055 (1969)]. A PEG-SOD-adduktum fajlagos aktivitása (4317 egység/mg protein) a natív enzim kiindulási anyag specifikus aktivitásának 98%-a (4400 egység/mg). A tennék tehát a natív enzim- vagy biológiai aktivitást lényegében megtartotta, míg kielégít más, előnyös feltételeket is.
A kapott PEG-SOD-származékot immunológiai szenzitizáciős potenciál (anafilaktikus reakciót kiváltó aktivitás) szempontjából összehasonlítottuk a nagy tisztaságú, nem módosított SÓD kiindulási anyaggal felnőtt nőnemű Swiss Webster egereken szenzitizá-ciós tesztben. 10 egeret immunizáltunk két hét alatt adott négy szubkután injekcióval, 0,075 mg proteinnel dózisonként, majd 21 napos intervallumokban intravénásán adagolt 0,04 mg proteinnel provokáltuk. Az ötödik intravénás provokálás után a nem módosított SOD-ot kapott csoportban 5 állat elpusztult, és a többi 5 állat közül háromnál mutatkoztak az anafilaxis jelei. A PEG-SOD-adduktumot kapott 10 állat közül egynél sem mutatkoztak anafilaxis jelei.
Amikor a vizsgálatot olyan PEG-SOD-adduktummal végeztük, amely SOD-molekulánként körülbelül 6 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazott, az ötödik provokálásnál 10 állatból 2 elpusztult, és a maradék állatokból négy mutatta az anafilaxis jeleit Tehát a találmány szerinti eljárással előállított, SOD-molekulánként három 72 000 móltömegű láncot tartalmazó PEG-SOD-adduktum kevésbé volt immunogén, mint a kétszer annyi 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó PEG-SOD-adduktum.
2. Példa: PEG-SOD-addukt előállítása
Az 1. példa szerinti módon nagy molekulatömegű PEG-eket kapcsolunk borjú Cu, Zn-SOD-hoz. Az öt 100 000 móltömegű PEG-láncot és a három 120 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó termék kevésbé immunogén egerekben, mint a natív SOD-, illetve a négy 35 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó termék.
3. Példa: Felezési idő mérése
A natív SÓD és az 1. példa szerinti eljárással előállított PEG-SOD-termékek szérumban való lebomlását vizsgáltuk felnőtt nőnemű Swiss Webster egerekben. 100 pg SOD-ot injektáltunk intravénásán. Vért vettünk szabályos időközönként, és a plazmát vizsgáltuk fajlagos PEG-SOD aktivitásra elektroforetikus módszerrel, amely elkülöníti a PEG-SOD-ot az egér SOD-tól. Egy két, körülbelül 65 000 móltömegű PEG-láncot és egy négy, körülbelül 40 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó PEG-SOD-adduktumok vizsgáltunk. A natív SÓD eltűnésének félideje az egerekben körülbelül 5-10 perc volt, míg a vizsgált PEG-SOD-adduktumok eltűnésének félideje több; mint 36 óra volt, és a PEG- SÓD aktivitást a vérben ezen állatok esetén legalább 9 napig lehetett mérni: Egy másik készítmény, amely átlagosan 2,6, körűibe·» lül 45 000 móltömegű láncot tartalmazott, szintén 36. órát meghaladó felezési időt mutatott.
4. Példa: Kapcsolási reakció cianur-kloriddal s.
Egy PEG-termék (Union Carbide) vizes oldatát;
amelynek belső viszkozitás alapján mért átlagos móltöri mege 100 000, HPLC-vel mért átlagos móltömege viszont 50 000, Millipore Minitan készüléken, amely 300 000 móltömeg (protein standard) határértéket biztosító membránnal volt felszerelve, ultraszűréssel méret szerint frakcionáltunk. A méret szerint frakcionált terméket vákuumban megszárítottuk. A HPLC-vel végzett analízis azt mutatta, hogy a minta átlagos molekulatömege ultraszűrés után 50 000-ről 100 000-re emelkedett. 3,77 g méret szerint frakcionált PEG 100 ml vízmentes acetonitrillel készült oldatához hozzáadtuk 1,39 g cianur-klorid
2,8 ml vízmentes acetonitrillel készült oldatát Az elegyet 3 napig 24 °C hőmérsékleten állni hagytuk, majd azonos térfogatú acetonitrillel hígítottuk, és leszűrtük. Az oldószert vákuumban 30 ’C hőmérsékleten bepároltuk, és a maradékot 120 ml vízmentes toluolban oldottuk. A terméket 360 ml vízmentes hexán adagolásával kicsaptuk. A terméket toluolból még egyszer kicsaptuk petrolétenel, majd vákuumban megszólítottuk, így cianur- kloriddal aktivált PEG-et kaptunk. A méretkizárásos HPLC azt mutatta, hogy a PEG móltömege az aktiválás során nem változott. Különböző mennyiségű, a fenti módon aktivált PEG-et vizsgáltunk arra nézve, hgy mennyire képesek kapcsolni a szarvasmarha iéz-cink-SOD-ot, amelynek állandó koncentrációja 1 mg/ml volt. A végső PEG-koncentráció 5 és 100 mg/ml között volt 24 óra hosszat 24’C hőmérsékleten végzett reakció után az elegyeket HPLC vizsgálatban UV-detekcióval a PEG-SOD képzésére, és a maradék SÓD mennyiségére nézve vizsgáltuk.
HU 203 783 Β
1. Táblázat
PEG:SOD A SOD-adduktummá alakulásának százaléka Adduktum csúcs móltőmeg*
(tömeg: :tömeg) (mól: mól)
5 L7 25%
10 3,3 29% 90K
20 6,6 62% 140K
50 16,7 90% 150K
75 24,0 95% 200K
100 33,3 100% 200K
* Kereskedelmi PEG standarddal kalibrált TSK PW oszlopon meghatározva.
Amint az 1. táblázatból látható, 50:1 PEG:SOD tömegaránynál (16,6:1 mólarány) a SÓD 90%-a alakult PEG-SOD-adduktummá, amelynek átlagos molekulatömege 150 000. Nagyobb PEG’.SOD arányoknál mind a PEG-SOD-dá alakult SÓD mennyisége, mind az adduktum molekulatömege emelkedett. Az adduktum kapott molekulatömege arra utal, hogy ilyen körülmények között, kapcsolószerként cianursavat használva 2-ig terjedő 100 000 móltömegű PEG-lánc kapcsolódhat a SOD-hoz.
10:1 és 75:1 PEG:SOD tömegarányú PEG-SOD-termék szérummal szembeni ellenállását viszgáltuk egéren a 3. példában ismertetett módszerrel. Mindkét termék esetén legalább 36 óra felezési időt kaptunk.
5. Példa: Kapcsolási reakció 1,1-karbonil-diimidazollal g, 100 kilodalton móltömegű polietilén-glikolt (100K PEG, Union Carbide gyártmány) 24 óra hosszat fagyasztva szántottunk a mintában jelen levő nedvesség eltávolítására. A szárított 100K móltömegű PEG-et feloldottuk körülbelül 45 ml vízmentes acetonitrilben. Ezután hozzáadtunk 5,12 g 1,1-karbonil-diimidazolt, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 15 óra hosszat inkubáltuk. Ezután ionmentes vízzel lehűtöttük a karbonil-diimidazol feleslegének elbontására.
Az aktivált PEG hidrolízisének megakadályozására a pH-t 7 értéken tartottuk. Az elegyet ezután 1 napig 4 ’C hőmérsékleten 4 liter desztillált vízzel szemben, legalább 10-szeres cserével dializáltuk, az acetonitril és az imidazol eltávolítására. Dialízis után az aktivált PEG-et Sephacryl S-400 oszlopon kromatografáltuk ionmentes vízzel, az aktivált 100K móltömegű PEG és a kis móltömegű fragmentumok elválasztására.
A kapott aktivált PEG-hez annyi SOD-ot adtunk, hogy a PEG: SÓD mólarány 3 legyen. Az adagolt SÓD mennyisége 92,8 mg (108 ml). Az elegyet négyszer fagyasztva szárítottuk a kívánt PEG-O-CO-SOD- termék kialakítására.
6. Példa: Kapcsolási reakció PEG-éter-karbonsavval g polietílén-glikol 1100 ml vízmentes dioxánnal készült oldatához 35 ’C hőmérsékleten, nitrogénat6 moszférában, keverés közben lassan hozzáadtunk 10 g nátrium-hidridet. A keverést 25 ’C hőmérsékleten még egy óra hosszat fenntartottuk, majd hozzáadtunk 15 ml etil-bróm-acetátot. Az elegyet 25 ’C hőmérsékleten 30 percig, majd 45 ’C hőmérsékleten 2 óra hosszat kevertük, majd a reakciót 200 ml víz adagolásával leállítottuk. Ezután keverés közben hozzáadtunk 400 ml petrolétert. A szerves fázist eldobtuk, és a viszkózus vizes fázist petroléterrel mostuk. APEG-etil- észtert tartalmazó vizes fázist körülbelül 1 literre hígítottuk, és 5 óra hosszat 60-70 ‘C hőmérsékleten melegítve hidrolizáltuk. Végül az elegy pH-2 értékre savanyításával a PEG karboxilcsoportjait felszabadítottuk. A maradék bróm-ecetsavat dialízissel vagy gélszűressel eltávolítottuk. Az így kapott PEG- éter az 1. példában alkalmazott szukcinilezett PEG helyett használható.
így 9,4 g 40 000 móltömegű aktivált polietilén-glikolt és 7,9 mg szarvasmarha SOD-ot alkalmazva olyan adduktumot kaptunk, amely SÓD molekulánként átlagosan 3,3 PEG-láncot tartalmazott. A tennék molekulatömege HPLC-vel meghatározva körülbelül 140 000. Ez az adduktum jelentősen csökkent immunogenitást mutat egerekben.
g, 120 000 móltömegű polietilén-glikol és 87 mg szarvasmarha SÓD alkalmazásával körülbelül 245 000 móltömegű (HPLC-vel meghatározva) terméket kapunk.
7. Példa: Humán SOD-PEG-adduktum előállítása
Az eljárást humán SÓD alkalmazásával végezzük.
mg aktivált, szukcinilezett PEG-et üvegcsőbe helyezünk. Hozzáadunk 100 μΐ 3 mg/ml koncentrációjú humán SOD-ot, 0,2 mól/literes foszfát-borát-pufferben, pH-8. Összekeverés után 2 μΐ-es mintákat vettünk ki, és 58 μΐ 0,01 mól/literes, 1:1 arányú nátriumacetát:ecetsav pufferrel hígítva 250 μΐ-es mikrocsövekbe helyeztük. A reakció lefolyásának ellenőrzésére mintákat pH-8,5-nél, 250 V feszültséggel 15 percig elektroforézisnek, majd nitro-kék-tetrazóliumfestésnek vetettük alá.
Az elegyet 3-35 óra hosszat szobahőmérsékleten tartottunk, majd 45 μΐ, 0,03 mólos 1:1 acetátpuffer/mg PEG segítségével hígítottuk. Az oldat végső pH-ját 0,1 ml
8-as pH-jú reakciópufferrel és 0,9 ml 30 mmól/literes acetáttal 6,4 értékre állítottuk. Ez a pH-csökkentés és az 1:10 arányú hígítás a további PEG-SOD kapcsolást és hidrolízist leállítota. Úgy találtuk, hogy 30-45 perc múlva észlelhető további reakció már nem volt.
A 19 000 dalton PEG-láncot tartalmazó PEG-SODadduktum, valamint a szabad SÓD 1 nappal az injekciózás után nem volt detektálható az egér szérumában, a 30 000 dalton PEG-láncokat tartalmazó készítmény azoban meghosszabbodott ellenállási időt mutatott. A humán SÓD tehát alkalmazható a találmány szerinti eljárásban.
8. Példa: Gyulladáscsökkentő hatás vizsgálata
Egéren végzett, karragénnel indukált mancs-ödéma tesztet végeztünk gyulladásgátló aktivitás meghatározására. 0,03 ml 1,0%-os, sóoldatban oldott karragént injektáltunk szubkután nőnemű Swiss Webster egerek jobb hátsó talpában, majd 30 perccel ezután az állatoknak
HU 203 783 Β szubkután 100 μΐ vizsgált vegyületet adtunk, amelyet szűréssel végzett sterilizálás után sóoldattal hígítottunk. 24 órával a karragén injekció után az állatokat levágtuk, és mindkét hátsó lábukat amputáltuk és megmértük. Az ödémát a kezelt láb (jobb) és a nem kezelt láb (bal) tömegének különbségéből számítottuk. Számítottuk az átlagot, és az ödéma tömegének standard deviációját az összes csoportban, beleértve egy sóoldatos kontrollt is.
Egerenként 30 pg dózisban adagolt addukt, amely átlagosan 2,6, 45 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazott, hatékonyabbnak bizonyult az ödéma csökkenté-sében, mint egy olyan adduktum, amely 3,4 21 000 mól-tömegű PEG-láncot tartalmazott (43% gátlás, szemben a 14%-kal). Egy három 120 000 móltömegű PEG-láncot tartalmzó adduktum 41% ödémagátlást mutatott 10 pg/egér dózisban. A natív szarvasmarha réz-cink-SOD inaktívnak bizonyult ebben a vizsgálatban, míg 300 pg/egér dózisban is, ugyancsak inaktívnak mutatkozott egy 14 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum 100 pg/állat dózisban.
9. Példa: Antigenitási vizsgálat
Antigeniási vizsgálatban egy szilárd fázisú, kompetitív módon kötő enzim immun vizsgálatot (ELISA) végeztünk a szarvasmarha réz-cink-SOD-ot tartalmazó PEG-SOD keresztreaktivitásának vizsgálatára a nagy tisztaságú natív szarvasmarha réz-cink-SOD-dal szembeni nyúl antitestekkel. A találmány szerinti eljárással előállítót konjugátumokhoz kevesebb PEG-lánc volt szükséges ahhoz, hogy a vegyület antigenitását csökkentsék, mint azon vegyületek esetén, amelyeket rövidebb láncokkal, például 5000 móltömegű PEG-láncokkal készítettünk. így például egy átlagosan 2,6, 45 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum és egy négy 35 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum egyharmad, illetve egytized olyan antigén volt, mint a hat 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum. A négy 35 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó adduktum fele olyan antigén volt, mint egy tizennégy 5000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó. A kevesebb, mint 4 PEG-láncot tartalmzó adduktumok közül azok, amelyek 100 000-120 000 móltömegű PEG-láncot tartalmaztak, kevésbé voltak antigének, mint az ugyanolyan számú, rövidebb láncokat tartalmazó adduktumok. így a két 120 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó SOD-adduktum csak ötöd olyan antigén volt, mint a két 35 000 móltömegű PEG-láncot tartalmazó.

Claims (7)

1. Eljárás vízoldható, nem immunogén, olyan polietilén-glikolhoz kapcsolt szuperoxid-diszmutáz konjugátum előállítására, amelynek a terminális csoportjai szabadok vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal vannak helyettesítve, és amely konjugátumban a polietilén-glikol terminális csoportjai karbonilcsoporton keresztül kapcsolódnak a szuperoxid-diszmutáz lizinmaradékainak epszilon-aminocsoportjaihoz, azzal jellemezve, hogy 40 000 és 1 000 Ó00 közötti átlagos molekulatömegű polietilén-glikolt önmagában ismert módon aktiválunk, majd az aktviált terméket szuperoxid-diszmutázzal reagáltatjuk, amelynek során 1 mól szuperoxiddiszmutázra számítva 1-8 mól polietilén-glikolt alkalmazunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 40 000-200 000 átlagos molekulatömegű polietilén-glikolt alkalmazunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 40 000-150 000 átlagos molekulatömegű polietilén-glikolt alkalmazunk.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve^ hogy 1 mól réz-cink-szuperoxid-diszmutázra számítva 2-8 mól polietilén-glikolt alkalmazunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1 mól szuperoxid-diszmutázra számítva 2-6 mól polietilén-glikolt alkalmazunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy helyettesített polietilén-glikolként izopropoxi-polietilén- glikolt alkalmazunk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polietilén-glikol aktiválásához a terminális hidroxilcsoportjaiból észter-, karboxil-, amino-, karboxamido- vagy aldehidcsoportot alakítunk ki.
HU885380A 1987-08-03 1988-07-29 Process for producing superoxide-dismutase conjugates HU203783B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8100987A 1987-08-03 1987-08-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT52816A HUT52816A (en) 1990-08-28
HU203783B true HU203783B (en) 1991-09-30

Family

ID=22161332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU885380A HU203783B (en) 1987-08-03 1988-07-29 Process for producing superoxide-dismutase conjugates

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0377613B1 (hu)
JP (1) JP2515389B2 (hu)
KR (1) KR920001426B1 (hu)
CN (1) CN1020458C (hu)
AU (1) AU608901B2 (hu)
CA (1) CA1309046C (hu)
DE (1) DE3876997T2 (hu)
DK (1) DK160842C (hu)
ES (1) ES2007536A6 (hu)
HU (1) HU203783B (hu)
IE (1) IE64284B1 (hu)
IL (1) IL87177A (hu)
NZ (1) NZ225481A (hu)
PH (1) PH27225A (hu)
RU (1) RU1776275C (hu)
WO (1) WO1989001033A1 (hu)
ZA (1) ZA885249B (hu)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0893439B1 (en) * 1989-04-19 2005-07-27 Enzon, Inc. A process for forming a modified polypeptide comprising a polypeptide and a polyalkylene oxide
US5109118A (en) * 1989-07-06 1992-04-28 Yutaka Mizushima Modified biologically active proteins
GB8919661D0 (en) * 1989-08-31 1989-10-11 Univ Alberta Superoxide dismutase-catalase conjugates
US5772996A (en) * 1990-08-03 1998-06-30 Public Health Laboratory Service Board Pharmaceutical compositions containing superoxide dismutase from Bacillus Stearothermophilus and Bacillus Caldotenax
WO1993002701A1 (en) * 1991-08-05 1993-02-18 Sterling Winthrop Inc. Buffered formulation of peg-sod
FR2687681B1 (fr) * 1992-02-20 1995-10-13 Transgene Sa Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses.
US5349001A (en) * 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5516703A (en) * 1993-08-20 1996-05-14 The University Of Utah Coating of hydrophobic surfaces to render them protein resistant while permitting covalent attachment of specific ligands
US6284503B1 (en) 1993-08-20 2001-09-04 University Of Utah Research Foundation Composition and method for regulating the adhesion of cells and biomolecules to hydrophobic surfaces
WO1999067370A1 (en) * 1998-06-23 1999-12-29 Novozymes A/S A polypeptide-polymer conjugate
US6638526B1 (en) 1998-06-23 2003-10-28 Novozymes A/S Polypeptides conjugated to copolymers of ethylene oxide and propylene oxide to reduce allergenicity
JP2002520049A (ja) * 1998-07-17 2002-07-09 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 改良された洗浄性能を有するポリペプチド−ポリマー接合体
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
BR0317742A (pt) 2002-12-26 2005-11-22 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados poliméricos de interferon-beta com potência biológica aumentada
EP1626983B8 (en) 2003-05-12 2010-12-22 Affymax, Inc. Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof
CN108445106A (zh) * 2018-04-11 2018-08-24 南京明捷生物医药检测有限公司 一种药物中消泡剂聚丙二醇残留的检测方法
CN108864309B (zh) * 2018-07-26 2021-07-13 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司 重组人sod-生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用
CN109112119B (zh) * 2018-08-28 2022-04-26 佛山科学技术学院 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法
CN117551625B (zh) * 2024-01-12 2024-03-08 山东爱维德生物科技有限公司 一种用于木立芦荟sod胶的聚乙二醇二胺-海藻酸改性sod酶及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL74177A (en) * 1984-02-03 1989-09-10 Abbott Lab Stabilized enzyme conjugate composition containing a calcium salt and a polyethylene glycol
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
GB8430253D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
JPH084504B2 (ja) * 1985-04-26 1996-01-24 味の素株式会社 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ

Also Published As

Publication number Publication date
WO1989001033A1 (en) 1989-02-09
JPH02504341A (ja) 1990-12-13
DK160842C (da) 1991-10-14
HUT52816A (en) 1990-08-28
KR920001426B1 (ko) 1992-02-13
IE882206L (en) 1989-02-03
DE3876997T2 (de) 1993-04-29
AU608901B2 (en) 1991-04-18
DE3876997D1 (de) 1993-02-04
NZ225481A (en) 1990-11-27
CN1020458C (zh) 1993-05-05
RU1776275C (ru) 1992-11-15
DK160842B (da) 1991-04-22
DK392789D0 (da) 1989-08-10
KR890701736A (ko) 1989-12-21
EP0377613B1 (en) 1992-12-23
AU2326888A (en) 1989-03-01
PH27225A (en) 1993-05-04
IL87177A0 (en) 1988-12-30
IL87177A (en) 1992-08-18
JP2515389B2 (ja) 1996-07-10
ZA885249B (en) 1989-04-26
IE64284B1 (en) 1995-07-26
CA1309046C (en) 1992-10-20
EP0377613A1 (en) 1990-07-18
CN1031088A (zh) 1989-02-15
ES2007536A6 (es) 1989-06-16
DK392789A (da) 1989-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5468478A (en) Conjugates of superoxide dismutage coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
HU203783B (en) Process for producing superoxide-dismutase conjugates
US5334382A (en) Lyophilized polyethylene oxide modified catalase composition, polypeptide complexes with cyclodextrin and treatment of diseases with the catalase compositions
EP2459226B1 (en) Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
AU698944B2 (en) Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations
US5661020A (en) Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
US10772968B2 (en) Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
CZ137597A3 (cs) Konjugáty BDNF a NT-3 s vodou rozpustným polymerem
KR20120073196A (ko) 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
EP2236521A1 (en) Y-type polyethylene glycol modified g-csf and preparation method and use thereof
ES2395894T3 (es) Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli(óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso
JPS62167800A (ja) オシド単位の酸化およびシツフ塩基の形成により変性されたリボソ−ム不活性化糖タンパク、およびこの糖タンパクを含む生体内持続性免疫毒素
EP1108738B1 (en) Immunostimulating carrier for vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees