KR920001426B1 - 과산화물 분자변위 보효소의 포합체 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

과산화물 분자변위 보효소의 포합체
조작자들은 전에는 저분자량의 메톡시-PEG나 PEG 특히 과산화물 분자변위 보효소(SOD)와 다른 단백질 등에 부착된 5,000이하의 것을 (a) 혈청 안정성을 증가시키거나 (b) 면역성을 감소시키는 정도를 다양하게 보여주는 부가물을 얻기 위하여 사용해 왔다. 그러나 (a)뿐만아니라 (b) 두 목적을 적절히 얻기 위하여 요구되어진 저분자량의 PEG나 메톡시-PEG를 가진 단백 군의 변형의 정도가 효소 활성도나 생물학적 활성도에 실제적인 손실을 낳는다.
SOD는 과산화물 기를 산소와 과산화 수소로서 전환을 촉매시키는데 관여하는 세포내 효소이다. 생체내에서 천연의 SOD 단백질보다 더 안정적인 생산물을 제공하고 신장에 의한 불활성화를 지연시키는 것이 본 발명의 목적이다. 특히 면역성이 낮게 나타나는 동안 생성물이 효소 활성도를 유지하고 있는 것이 중요하다. 예를들어 통상의 카라지난으로 유도하는 손바닥 부종 시험법에서 보여지는 것처럼 이 발명의 특수한 목적은 포합체에 항염 활성도를 부여하기 위한 것이다. 이러한 활성도는 이 생성물에 특히 류머토이드 치료를 가능하게끔 만들어준다.
이 발명에서 구현되는 참신한 개념은 20,000보다 큰 고분자량의 PAG 가닥을 이용하는 것이다. 본 발명에서 사용되는 PAG는 예로 폴리(에틸렌 옥사이드) 즉, 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 어떤 공중합체 같은 알킬렌 옥사이드의 수용성 중합체 일 수 있다. PAG는 선형이거나 분지되어 있는 것일 수 있으며 한개 이상의 하이드록실 위치에서 C1~4-알콜시 군이나 다른 화학군이 치환된 것일 수 있다. 그러나 본 발명에서 포합체의 제조에 사용되는 PAG 중합체의 분자량은 20,000보다 크거나 40,000에서 200,000 분자량의 것이 선호된다. 200,000보다 큰 중합체의 사용이 또한 가능하나 그들은 점도가 크고, 전단 변형에 의해 쉽게 개열되어질 수 있으므로 선호되어지지 않는다.
본 발명의 PAG-SOD 부가물은(기지의 분자량의 PEG 표준물에 비하여) 85,000에서 2,000,000달톤에 해당되는 분자량을 갖고 있고, 90,000에서 1,000,000달톤의 것이 선호된다. 더욱이, 본 발명의 다른 PAG 부가물과 PAG-SOD 부가물은 천연 단백질의 효소활성의 대부분을 가지고 있다.(여기의 분자량은 기지 분자량의 PEG 표준물질을 바탕으로 하고 있음이 주목되어 진다. HPLC검량을 위해 기지의 분자량의 단백질 표준물질을 기본으로 하여진 분자량과 동등한 단백질이 거의 5~8배 더 큰것으로 나타난다).
본 발명의 포합체는 몇개의 PAG 가닥을 부착시킴으로써, 활성 모체분자의 화학적 변형이 적게되도록 하여 원래의 모체 분자의 원래 성질이 더 많이 보존되어지도록 전 생성물을 개량시킨 것이다. 그래서 본 발명에서처럼, 고분자량의 PAG의 몇가닥을 사용함으로써 혈류내에서의 안정성이 증가되어 부가물 대부분의 아니면 실제로 모체분자의 활성이 모두를 함유하게 해준다. 본 발명의 부가물의 또 다른 잇점은 고분자량의 PAG를 사용함으로써 더 큰 부가물이 다른 조작자에 의하여 만들어지는 변형도가 똑같게 만들어 질 수 있다는 것이다. 더욱이, 몇 응용에서처럼 더 큰 PAG 부가물이 확실히 유리하다. 예를들어 본 발명의 방법에 의해, 40,000~130,000 분자량의 PEG 가닥을 사용하여 만들어지는, 그리고 본 발명의 원리를 설명하는 본 발명의 PAG의 몇가닥을 사용함으로써 혈류내에서의 안정성이 증가되어 부가물 대부분의 아니면 실제로 모체분자의 활성이 모두를 함유하게 해준다. 본 발명의 부가물의 또 다른 잇점은 고분자량의 PEG-SOD 부가물은 새앙쥐에서 전의 조작자들에 의해 만들어진 PEG-SOD 부가물보다 36시간 이상의 크고 긴 혈청 반감기를 가지고 있다.
PAG-SOD 부가물은 대개 단백질 분자당 부착되어진 PAG가 1개 내지 10개의 사슬을 갖고 있고 더 많이는 2개 내지 8개가 선호되며 특히 분자량 2개 내지 6개의 PAG고리를 특별히 갖고 있다. 만족한 혈청 안정도를 얻기 위해 필요한 사슬 수는 긴 사슬이 사용될수록 감소된다.
본 발명의 SOD 조제는 특히 소, 다른 동물(예를들어 양,말,돼지,개,토끼,병아리) 또는 인간 세포의 유래된, 효소의 구리와 아연을 함유하고 있는 포유동물의 과산화물 분자변위 보효소형이다. 또한 철이나 망간같은 다른 금속이온을 함유하는 SOD 조제가 가능하다. 또한 이러한 구조가 복제되거나 표현되는 미생물 배양에서 유래되는, 동증의 구조를 가지고 있는 효소가 유용하다. 또한 SOD는 그러한 미생물 배양에서 면역이 정확히 이루어지지 않아 자연적으로 생성되는 단백질과 동일하지 않을 수도 있다. 왜냐하면 본 발명의 생성물의 면역성이 점점 감소되어지기 때문이다.
또한 반복된 경구 투여에 면역학적으로 불안전한 그런 조제를 하는 non-SOD 단백질의 자연물을 SOD조제물이 갖고 있을때, 그런 SOD를 본 발명법으로 연결시켜 생성물을 적절히 유용하게 만들 수 있다. 왜냐하면 불순 단백질은 실제로 더 면역학적이기 때문이다.
연결과정에서 많은 통상의 반응이 사용되어질 수 있다. 선호되는 반응은 카보닐 디이미다졸, 파라-니트로페닐 클로로쪼메이트 또는 비스-N-숙시니미딜카보네이트 같은 것을 사용하여 반응성인 카보네이트 반에스터인 PAG-O-CO-X-를 형성하는 법으로 진행되며 여기에서 X는 좋은 이동군이다. 활성화된 PAG, PAG-O-CO-X는 다음에 리신의 엡실톤-NH2군 같은 단백질 아미노군을 이용하여 부착된 PAG-O-CO-NH-protein인 우레세인 결합을 그 효소 활성을 파괴하지 않는 조건하에서 단백질과 반응하여 주로 만든다.
예를들어 카보닐 디이미다졸은 PAG의 말단 하이드록실군과 반응한다. 반응 혼합물은 수용액으로 중성 pH에서 냉각시킨 후 활성화된 PAG (폴리알킬렌글리콜 카보닐 아미다졸)가 투석과 크기에 따른 배출 크로마토그래피를 양쪽 또는 한쪽을 하여 분리시킬 수 있다.
Figure kpo00001
를 SOD로 반응시키는 것은 과량의 활성 PAG를 사용하여, 용액에서 이루어진다.
이 반응의 변형에서 SOD와 활성화된 PAG의 용액은 동결 건조되어진다. 연결된 생성물은 크기에 따른 배출 크로마토그래피에의해 편리하게 분리된다. 다른 세정 과정은 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 이루어질 수 있다.
교대로 이루어지는 연결 반응에서, 폴리알킬렌글리콜은 불활성 유기 용매에 녹고 혼합물은 약 알칼리성이 되어 시아누릭 클로라이드와 반응한다.
반응되지 않은 시아누릭 클로라이드는 PAG를 페트로리움에테르로 침강시켜서 제거된다. 남아 있는 용매는 증발되어 2-PAG-6-클로로-1,3,5-트리아진을 생성한다. 생성된 활성화 중합체는 다음에 붕산액 같은 적절한 완충액에서 SOD와 반응한다. 미반응된 활성화 PAG는 제거되고 생성물은 크로마토그래피로 제거된다. 그래서 2-위치에서 폴리알킬렌글리콜 기인 PAG-O-를 부착하고 있는 4-하이드록시-1,3,5-트리아진과 6-위치에서는 SOD의 반응성 리진 기의 엡실톤-아미노기를 부착하고 있는것이 얻어진다.
PAG-OH의 한개 이상의 하이드록시 기나 또는 카복실 기로 전환되어질 수 있는데 이것은 숙시닉 안하이드 라이드와 반응시키거나 에틸 브로모 아세테이트와 알칼리로 반응시키거나 PAG 아세틱 에시드 에테르인 PAG-O-CH2-COOH를 형성하기 위해 알칼린 퍼망가네이트로 말단-OCH2CH2OH를 산화시켜서 얻어진다.
카복실 기는 다음에 단백질 변형에 유용한 것으로 흔히 알려진 방법인, 예를들어 카보디이미드와 N-하이드로 숙시니미드를 반응시켜 N-하이드록시 숙시니미드 에스터를 형성하거나 또는 아실 하이드라자이드를 질산화시켜 아실 아자이드를 형성하는 등으로 활성화다. 활성화된 PAG는 다음에 단백질의 효소 활성도를 파괴하지 않는 조건하에서 단백질과 반응하여(아미노기 말단 NH2와 리신의 엡실론 아미노기 같은) 단백질 아미노기를 통해(PAG-C(=O)NH-단백질) 같은 아마이드 결합을 주로 만들게 된다.
말단 PAG 하이드록실 기는 PAG-Br을 형성하기 위하여 티닐 브로마이드로 먼저 반응시킨 후 과량의 암모니아를 사용하여 암모니아 분해를 시켜 아미노기로 전환되어질 수 있다. 아미노-PAG는 다음에 수용성 카르보니이미드나 우드워드 시약 K같은 시약을 사용하여 아마이드 결합으로 곧 연결되어, 단백질 카르복실 기로 된다. 선택적으로 아미노기는 카르복실산 기능단으로 전환되어 진다. 즉 숙시닉 안하이드라이드와 반응하여 위에 서술된 방법으로 단백질과 반응하여 활성화 된다.
PAG말단-CH2OH는 또한 예를들어 MnO2로 산화되는 것처럼 알테하이드기인-CH(=O)로 전환되어질 수 있다. 알데하이드기는 다음에 후자의 유리 아미노기를 통해 단백질에 환원되어 알킬화 되어진다. 즉 시아노보로 하이드라이드와 PAG-OCH2CH2NH-protein 결합을 형성하면서 2차 아민기를 통한 결합을 주로 만들기 위하여이다.
단백질 아미노기외에 단백질 카르복실기와 설프히드릴기는 또한 PAG를 연결되기 위하여 사용되어진다. 위에서 설명되어진 것처럼 연결반응을 선택하는데 있어서 단백질에 PAG를 연결하는 부분으로 탄소, 산소, 황, 질소, 수소 등으로 구성된 비방향족기를 남기는 것들이 선호된다.
연결된 SOD는 통상의 동결 건조법으로 외부의 이온을 제거하기 위하여 투석을 한 후 주로 반응액에서 제거된다. 만약 필요하거나 바람직하다면, 포합체가 이온 교환 크로마토그래피나 전기 영동 및 또는 겔 여과법으로 더욱 정화된다.
염산나트륨 및 또는 인산나트륨으로 등장성으로 이온 강도를 적절히 조정한 후에 멸균병에 통상의 방법으로 미공여과지를 통과시켜 주사로 투여하기 적합한 밀균용액으로 만든다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 PAG-SOD 포합체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균 주사용 수용액 같은 멸균 주사액 조제의 형으로 되어 있다. 용액은 위에 언급된 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하는 기지의 기술에 따라 만들어진다. 멸균으로 주사되어질 수 있게 된 조제는 경구적으로 투여하기에 적절한 비독성 희석제나 용매로 된 용액이나 현탁액 일 수 있다.
본 발명의 조성물은 조성물의 단위량이 적절한 경로로 특별한 약제학적인 담체로 투여되어질 때 바람직한 반응을 일으키기 위한 효과적이 농도에서 효과적인 단위양의 SOD 포합체를 갖고 있다. 예를들어 액체 조성물은 주로 10ml에 대한 0.25당 0.5 내지 40mg의 포합체 단백질을 함유하고 있으며, 특히 대략 0.5 내지 5ml의 것이 선호된다. 그러나 정맥용 점적 용매에서는 더욱 희석된, 점적용액 50~1,000ml 당 0.5 내지 200mg의 SOD 포합체 단백질을 함유하는 것이 사용되고 특히 점적용액 100~500ml 의 것이 선호된다. 정제 캡슐 그리고 좌제는 주로 복용량 단위당 포합체 단백질을 0.1 내지 25mg을 주로 함유하고 있으며 특히 1 내지 10mg의 것이 선호된다.
이미 생성된 오르고테인 같은 본 발명의 SOD 포합체는 다양한 염증치료에 효과적이고 합성 항염제의 용도가 제한되어지게 된다. 용도가 제한되는 것은 작용이 지연되는 동안 독성 부작용이 있기 때문이다. 더 특별하게는 SOD 포합체가 여러 포유동물에서 예를들면 요도나 관절을 포함하는 곳에서 산소독성, 재관류 상처, 염증을 경감시키고 그들의 효과를 완화시키는 데에 효과적이다. 이들은 활앨 낭염, 건염, 골관절염 같은 류마티스성 질환과 외상후의 관절염과 관련된 구조적 기형의 증상을 완화하는데 유용하다.
본 발명은 다음의 예에 더욱 설명되어진다.
본 발명은 과산화물 분자변위 보효소(SOD)의 포합체나 부가물에 관한 것으로 적어도 이것들의 SOD 아미노, 카르복실, 설프히드릴기의 일부분이 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌-폴리프로필렌글리콜 공중합체 같은 폴리알킬렌글리콜(PAG)에 결합되어 있고 여기에서 PAG는 분자량이 20,000보다 크고, 되도록이면 평균 분자량이 40,000에서 1,000,000달톤의 것이 바람직하다. 다른 방법이 지적되어있지 않으면 PAG의 분자량은 PEG를 표준물질로하여 고성능 크기에 의한 배출 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 결정되어진 것이다. 평균 분자량이 40,000보다 크고 200,000보다는 크지않는 PAG가 선호되며 평균 분자량이 500,000~150,000인 PAG가 특히 선호된다. 그런 PAG는 선형이거나 분기된 것일 수 있고 C1~C4-알킬기 등으로 치환되거나 치환되지 않은 것이다. 2개의 SOD 분자의 연결을 막기위하여 특별히 가치있는 것이 PAG 분자이며 이것의 한 말단군이 이소프로폭시기 같은 C1~C4-알킬에테르기이다.
PEG 50g(HPLC가 약 50,000의 평균치를 주는 고유점성 측정에 의해 측정되면 이소프로폭시화된 PEG를 분자량 100,000으로 분류시켜 높은 polyoxR즉 폴리에틸렌 옥사이드 100,000으로 표시된 유니온 카바이드 생성물)을 1ι의 건조된 피라딘에 녹여 22g의 숙신산 안하이드라이드를 가했다. 혼합물은 60℃에서 38시간동안 교반하였다. 용매는 60℃ 이하에서 진공상태에서 제거되었고 잔여물은 500ml의 물에 재용해되었다. 용액은 헥산으로 세척되고 난 후 생성물은 벤젠에 녹였다. 숙신화된 PEG는 페트로리움에테르로 벤젠에서부터 2번재침강 되어졌다.
이 숙신화된 PEG의 수용액은 300,000(단백 표준물질) 분자량의 절단된 막으로 되어있는 밀리포어 R 미니탄 R을 사용하여 초여과시킴으로써 저분자량 PEG를 제거시켜 크기별로 분류되어졌다. 크기로 분류된 생성물은 진공하에서 건조되었다. 수용성, 크기에 의한 축줄 HPLC에 의한 분리는 숙신화된 PEG의 평균 분자량이 초여과의 결과로 약 50,000에서 약 80,000으로 증가됨을 보여주었다. 그렇게 얻어진 크기로 분류된 숙신화된 PEG는 다음에 N-하이드록시숙신이미드로 활성화되어졌다. 숙신화된 PEG(분자량 80,000, 0.15mmoles) 12g은 건조 디메틸포름아마이드 120ml에 녹여지고 N-하이드록시숙신이미드 300mg(2.6mmoles)이 교반되면서 가해졌다. 용해후 2.4mmoes의 디시클로헥실카보디이미드가 가해졌고 40℃에서 용액이 30분 동안 교반되었고 다음에 24℃에서 5일 동안 교반되지 않은 상태로 놓아 두었다. 다음에 혼합물은 유리섬유 여과지로 여과되었고 여과물은 40℃, 진공상태에서 증발되어 건조되었다. 자연물은 건조 톨루엔 200ml에 온화하게 가열되어 용해되었다. N-하이드록시 숙신이미딜 PEG는 400ml의 페트로리움에테르를 가하여 침강되어졌다. 생성물은 유리섬유 여과지에서 진공상태로 모아지고 다음에 페트로리움에테르를 사용하여 톨루엔으로부터 재침강 되어졌다. 다음에 이것은 진공상태에서 건조되어졌다. 크기에 의한 축출 HPLC는 생성물의 분자량이 활성화의 결과로 변화되어지지 않았음을 보여주었다.
0.1M 인산칼륨 완충액(pH8.0) 39ml에서 소의 Cu,Zn SOD(DDI 약제회사에서 2.46 micromoles ; 4400units/mg) 80mg을 함유하는 용액은 건조된 N-하이드록시숙신이미딜 PEG 유도체(50 micromoles) 4g이 가해졌고 혼합물은 24℃에서 용해되었다. 크기에 의한 축출 HPLC 분리는 분자량 200,000의 고분자량의 UV-흡수 부가물 피크의 출현과 반응되지 않은 SOD가 없어지는 것을 보여주는 증거로서, 1.5시간내에 반드시 연결반응이 완성되었다는 것을 보여주었다.
SOD에 연결되지 않은 유리 PEG는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 PEG-SOD 부가물로부터 분리되어졌다. PEG-SOD를 함유하는 분액은 NaCl을 사용하여 추출완충액(pH9)의 이온 강도를 증가시켜 모아졌다. PEG-SOD 분액은 완충액 성분을 제거시키기 위해 수용액에 대해 투석되어졌고 그 후 냉동 건조나 진공 증발에 의해 농축되어졌다.
예를들어, 50mM NaCl로 추출된 전형적인 생성물의 특성이 설명되어 있다. 부가물은 SOD 단백질 24mg과 단백결합된 PEG 165mg을 함유하고 있었다. 단백질 함량은 뷰우렛 분석법으로 측정되어졌고 PEC함량은 굴절률(RI)을 사용하여 단백질에 대한 RI분포를 보정시켜, HPLC를 이용하여 측정되어졌다. 단백질과 결합된 PEG를 위해 측정되어진 평균 분자량은 72,000이었다. 단백분해에 의해 부가물로 부터 유리된 PEG를 위한 이 분자량은, 부가물에서 PEG에 대한 SOD 단백질(32,000 MW)의 비율이 165mg에 대해 24mg이라는 것을 보여주는 자료와 일치되어 SOD 분자당 3가닥의 PEG가 결합되는 비율이 된다. 이 방법으로 얻어진 SOD 분자당 결합된 PEG 가닥의 수는 계산된 부가물의 분자량이 220,000(72,000×3÷32,000/8)임을 보여주는데 이것은 HPLC에 의해 얻어진 분자량과 일치되는 결과이다.
위 부가물의 SOD 활성도는 맥코드와 프리도비크(J. Biol. Chem. 244 : 6049~6055 ; (1969))의 시토크롬-C 분석을 사용하여 측정되어졌다. PEG-SOD 부가물(대략 4317 units/mg)의 비활성도의 천연효소 출발물질(4400 units/mg단백질)의 비활성도의 98%였다. 그래서 여전히 생성물은 거의 모든 천연효소적 또는 생물학적 활성도를 보유하고 있는 반면 다른 발명의 요구를 만족시킨다.
이 예에서 설명되어진 대로 얻어진 PEG-SOD 유도체는, 감작도/도전도 시험법을 사용하여 성인 여성 스위스 웹스터 새앙쥐에서 면역학적 감작도 잠재성(급성 감작증후를 유발하는 활성도)을 위한 매우 정화되고 변형되지 않은 SOD 출발물질과 비교된다. 용량당 0.075mg의 단백질과 2주동안 4번 피하주사되어 면역된 10마리의 쥐가 그 후 21일 간격으로 0.04mg 단백질로 같은 화합룰로 정맥 주사된다. 5번째 정맥주사에 의하여 변형되지 않은 SOD를 투여한 군에서는 5마리가 죽었고 남아있는 5마리중 3마리가 급성 감작증후의 예후를 보인 반면에 같은 용량의 PEG-SOD를 투여 받은 10마리중 어느 한 마리도 급성 감작증후를 보이지 않았다.
SOD 분자당 대략 6가닥의 5000분자량의 PEG를 갖는 PEG-SOD 부가물이 같은 시험법으로 시험되었을 때 10마리중 2마리가 죽고 남아 있는 동물중 4마리가 급성 감작증후를 보였다. 그러므로 본 발명에서 만들어진 SOD 당 72,000분자량의 PEG 3가닥을 함유하고 있는 PEG-SOD는 5,000 분자량 PEG의 여러 가닥의 2배를 갖고 있는 EPG-SOD보다 덜 면역학적이다.
[실시예 2]
예 1의 다음 방법인 고분자량의 PEG가 소의 Cu, Zn SOD와 결합되었다. 분자량 100,000 PEG로된 5가닥과 분자량 120,000 PEG 3가닥으로된 생성물은 분자량 35,000 PEG 4가닥으로된 생성물이나 천연의 SOD보다 새앙쥐에서 덜 면역학적인 것으로 발견 되어졌다.
[실시예 3]
천연의 SOD의 혈청 안정도는 성인 여성 스위스 웹스터 새앙쥐를 사용한 예 1의 방법에 의해 만들어진 PEG-SOD의 그것과 비교되어졌다. 100㎍ SOD는 정맥으로 투여되어졌다. 혈액은 정규적으로 체혈되었고 혈장은 새앙쥐 SOD에서 PEG-SOD를 분리하는 전기영동법으로 특이한 PEG-SOD 활성도를 의해 분석되어졌다. 분석된 1개의 PEG-SOD 부가물은 분자량 65,000의 PEG 2가닥을 함유하였고 다른 것은 분자량 40,000의 PEG 4가닥을 함유하고 있었다. 새앙쥐에서 천연의 SOD가 사라지는 반감기는 5~10분이었고 반면에 이들 PEG-SOD 부가물 두개가 모두 없어지는 반감기는 36시간보다 길었으며 PEG-SOD 활성도는 적어도 9일간 이 동물의 혈액에서 측정되어질 수 있었다. 대략 분자량 45,000의 평균 2.6가닥을 갖는 다른 조제품이 또한 36시간을 넘는 반감기를 만들었다.
[실시예 4]
HPLC에 의해 평균분자량이 대략 50,000으로 측정된 그러나(고유점도에 의해 측정된 평균무게) 분자량 100,000으로 표지된 PEG 수용액(유니온 카바이드)은 분자량 300,000(단백질 표준물질) 분자량의 절단된 막으로 설치된 밀리포어 미니탄 장치를 사용한 초여과법으로 크기별로 분류되어졌다. 크기별로 분류된 생성물은 진공하에서 건조되었다. HPLC에 의한 분석은 견본의 평균 분자량이 초여과후 50,000에서 100,000으로 증가되었음을 보여 주었다. 건조 아세토니트릴 100ml에 이런 크기별로 분류된 PEG 3.77g을 함유하고 있는 용액에 건조된 아세토니트릴 2.8ml에 시아누릭클로라이드 1.39g이 가해졌다. 24℃에서 3일간 함유하고 있는 용액에 건조된 아세토니트라일로 희석된 후 여과되어 정화되어졌다. 용매는 30℃, 진공하에서 증발되어 제거되었고 잔여물은 건조 톨루엔 120ml에 재용해되었다. 생성물은 360ml의 건조 핵산을 가하여 침전되었다. 생성물은 한번 더 톨루엔에서 페트로리움에 테르를 사용하여 재침강되어졌고 진공상태에서 건조되어 시아누릭클로라이드-활성화된 PEG를 만든다. 크기별로 축출된 HPLC는 PEG 분자량이 활성화의 결과로 변하지 않는다는 것을 보여주었다. 위에서 설명되어진 대로 얻어진 활성화된 PEG의 양을 변화시키는 것을 1mg/ml 수준으로 일정하게 존재하는 소의 Cu, Zn SOD에 결합하는 정도가 시험되어졌다. 최후의 PEG 농도는 5에서 100mg/ml로 되었다. 24℃에서 24시간동안 반응시킨 후 혼합물은 PEG-SOD 형성과 잔여 SOD의 양을 UV로 측정하는 HPLC로 분석되어졌다.
[표 1]
Figure kpo00002
표 1에서 보여진대로 SOD에 대한 PEG 비율이 50:1(W/W)(16,6:1분자량 비율)에서, SOD의 90%가 150,000 평균 분자량으로 PEG-SOD로 전환되어졌다. 더 큰 SOD에 대한 PEG의 비율에서 PEG-SOD로 SOD가 전환되었고 부가물의 분자량이 증가하였다. 부가물의 결과된 크기는 분자량 100,000 PEG의 2가닥까지, 연결시약으로 시아누르산을 사용하여 이 조건하에서 SOD에 부착되어질 수 있다는 것을 보여준다.
새앙쥐에서 혈청 안정도는 표 1에 나열된 SOD에 대한 PEG의 비율이 10:1(W:W)과 75:1(W:W)로 반응하는 것에서 PEG-SOD 생성물을 위해 측정되어졌다. 위의 예 3에서 사용되어진 같은 방법이 사용되어졌다. 최소한 36시간의 반감기가 시험되어진 두 생성물을 위해 사용되어졌다.
[실시예 5]
100킬로달톤 폴리에틸렌글리콜(100K PEG : 유니온 카바이드) 10g을 24시간 동결건조시켜 견본에 있는 모든 수분을 제거시켰다. 건조시킨 100K PEG가 건조 아세토니트릴 대략 45ml에 녹여졌다. 다음에, 1,1-카르보닐디이미다졸 5.12g이 가해졌고 다음에 반응혼합물이 실온에서 1.5시간 동안 배양되어졌다. 다음에 탈이온수로 냉각시켜 과량의 카르보닐디이미다졸을 파괴시켰다. 활성화된 PEG의 가수분해를 방지하기 위하여 pH를 7로 유지시켰다. 다음에 혼합물은 이미다졸과 아세토니트릴을 제거시키기 위해 적어도 10회 반복하여 4ℓ의 증류수를 사용하여 4℃ 하루동안 투석되어졌다. 투석후, 활성화된 PEG가 저분자량의 분획물에서 활성화된 100K PEG를 분리시키기 위하여 탈이온수로 세파크릴 S-400컬럼에서 크로마토그래피 되어졌다.
SOD mole당 mole의 PEG가 이 몰랄 비율로 만들게 하기위해 충분한 SOD가 생성된 활성화된 PEG에 가해졌다. SOD 92.8mg이 전 용액(부피=108ml)에 가해졌다. 혼합물은 목적한 PEG-O-CO-SOD 생성물을 만들기 위해 4번 동결 건조시켰다.
[실시예 6]
35℃, 건조 디옥산 1100ml에 폴리에틸렌글리콜 30g을 함유하고 있는 용액으로 질소하에서 소디움 하이드라이드 10g을 교반하면서 천천히 가한다. 25℃에서 몇시간 더 교반시킨 후 15ml의 에틸브로아세테이트가 가해졌다. 용액은 25℃에서 30분간 교반된후 45℃에서 2시간동안, 다음에 반응은 200ml 물을 가하여 반응이 종결되어졌다. 400ml의 페트로리움에테르가 교반되면서 가해졌다. 유기층이 경사되고, 끈적끈적하고 수용성인 층이 페트로리움에테르로 세척되어졌다. PEG 에텔에스테르를 함유하는 수용성 층은 대략 1ι로 희석되어 온도를 60~70℃로 올려 5시간동안 비누화시켰다. 결국 PEG 카르복실기는 pH로 산성화되어 유리 PEG에테르는 예 1에서 사용된 숙신화된 PEG를 위해 치환되어질 수 있다.
그래서 7.9mg의 소의 SOD와 분자량 40,000의 활성화된 폴리에틸렌글리콜 9.4g을 사용하여 SOD 분자당 PEG 평균 3.3가닥을 가지고 있는 부가물이 얻어졌다. HPLC에 의해 측정되어진 대로 생성물의 분자량은 대략 140,000이다. 이 부가물은 새앙쥐에서 면역성이 굉장히 감소되어졌다.
소의 SOD 87mg과 분자량 120,000의 폴리에틸렌글리콜 6.5g을 사용하여, HPLC에 의해 측정된대로 분자량이 대략 245,000인 부가물이 얻어졌다.
[실시예 7]
인간의 SOD로 된 반응이 사용되어졌다. 활성화되고 숙신화된 PEG 200mg견본을 유리관에 넣었다. 0.2몰랄, pH 8의 인산붕산 완충액에 3mg/ml의 인간 SOD용액 100mcl.가 가해졌다. 혼합후 각 반응 혼합물 1mcl 시료가 제거되었고 250μl미세관에서 0.01M의 1:1의 아세테이트 나트륨:초산 완충액 58mcl로 냉각되었다. 반응의 진행을 조절하기 위하여 시료는 pH 8.5에서 15분간 250볼트를 사용하여 전기영동 되어졌다. 다음에 니트로블루 테트라졸리움으로 염색되어졌다.
실온에서 3-3.5 시간 후에 용액은 0.03몰랄의 PEG mg 당 초산염완충액이 1:1인 45μl로 냉각되어졌다. pH 8의 반응 완충액 0.1ml와 0.9ml, 30mM의 초산염을 가하여 마지막 pH를 6.4로 만들었다. 이 pH 용액방울과 1:10 희석은 PEG-SOD 결합과 가수분해가 더 진행되는 것을 막는다. 30~45분 후에 더 반응이 진행되지는 않는 것으로 밝혀졌다.
유리 SOD처럼 19,000달톤의 PEG의 가닥으로 된 PEG-SOD는 투여 후 하루는 새앙쥐 혈청에서 더 이상 측정되지 않았다. 반면에 30,000달톤의 PEG 가닥으로된 것은 지속시간을 연장시켰다. 그래서 인간 SOD는 본 발명의 목적을 위해 사용되어질 수 있다.
[실시예 8]
새앙쥐에서 카라지난으로 유도시킨 손바닥 부종 시험법이 항염활성도를 측정하기 위해 사용되어졌다. 손바닥 부종시험에서, 식염수에 카라지난이 1.0% 함유된 용액 0.03ml가 스위스 웹스터 새앙쥐의 오른쪽 뒷발에 피하주사되었고, 다음에 30분후 동물을 이 이과지 멸균에 의해 식염수로 희석시켜 만든 시험화합물 100를 일회용으로하여 피하주사되었다. 카라지난 투여후 24시간 후 동물들을 죽여서 양뒷다리를 절단시키고 무게를 측정하였다. 부종의 정도는 투여되지 않은 발(왼쪽)의 무게를 뺀 투여된 발(오른쪽)의 무게로 계산되었다. 식염수 조절을 포함하여 각 투여군에 대한 부종 무게의 평균 그리고 표준 편차가 계산되었다.
새앙쥐당 30㎍을 1회용으로하여 분자량 45,000 PEG 2.6가닥으로된 부가물이 분자량 21,000 PEG(각각 43% 저해:14% 저해) 3.4가닥으로된 부가물보다 부종을 가라않히는데 더 효과적이었다. 분자량 120,000 PEG 3가닥으로 만들어진 부가물이 새앙쥐당 10㎍을 일회용하였을때 41%의 부종 저해도를 나타냈다. 동물당 100㎍에서 시험되어질때 5,000 분자량 PEG 14가닥으로된 부가물이 만들어진것처럼 새앙쥐당 300㎍에서 시험되어졌어도 천연의 소의 Cu/Zn SOD가 이 방법으로 불활성화 되었다.
[실시예 9]
항원성 분석법에서처럼, 고체형인 상경적결합효소 면역분석법(ELISA)이 매우 정화된 천연의 소의 Cu, Zn SOD에 대해 토끼의 항체로 조작된 소의 Cu, Zn SOD를 함유하는 PEG-SOD 화합물의 교차반응도를 측정하기 위해 사용되어졌다. 본 발명의 포합체가 더 짧은 가닥 예를들어 분자량 5,000의 PEG로 된 화합물보다 항원성을 감소시키기 위하여 PEG 가닥이 더 적게 되도록 요구하였다. 예를들어 분자량 45,000의 PEG 평균 2.6 가닥으로된 그리고 분자량 35,000의 PEG 4가닥으로된 부가물이 각각 분자량 5,000의 PEG 6가닥으로된 부가물의 항원성의 1/3과 1/10이었다. 분자량 35,000의 PEG 4가닥으로된 부가물은 5,000의 PEG 14가닥을 함유하고 있는 것의 항원성의 반이었다. 4개의 PEG 가닥보다 더 적은 수로 만들어진 부가물 중에는 분자량 100,000-120,000의 범위에서 PEG로된 것들이 더 짧은 가닥의 같은 수효의 부가물보다 덜 항원적이었다. 그래서 분자량 120,000의 PEG 2가닥으로 된 SOD 부가물은 단지 분자량 35,000의 PEG 2가닥으로 된 것의 1/5정도의 항원성을 가지고 있었다.

Claims (11)

  1. 폴리에틸렌글리콜이나 폴리에틸렌 폴리프로필렌글리콜 공중합체 잔기 같은 그 중에 상술한 글리콜이 표준물질을 PEG로 하여 HPLC로 측정하였을때 평균 분자량이 40,000~1,000,000인 것으로 말단이 C1-4-알킬로 치환된 것이나 비치환된 것인 폴리알킬렌글리콜에 연결 시약으로 연결된 과산화물 분자변위 보효소(superoxide dismutase)의 수용성인 비면역원성 포합체(conjugate).
  2. 제1항에 있어서, HPLC에 의해 측정된 평균 분자량이 40,000~200,000인 폴리에틸렌글리콜인 폴리알킬렌글리콜로된 포합체.
  3. 제2항에 있어서, 평균 분자량이 50,000~150,000인 폴리에틸렌글리콜인 폴리알킬렌글리콜로된 포합체.
  4. 제3항에 있어서, 2개에서 8개의 폴리에틸렌글리콜기가 구리 및 아연-함유 과산화물 분자변위 보효소 분자에 각각 연결되어 있는 포합체.
  5. 제4항에 있어서, 2개 내지 6개의 폴리에틸렌글리콜기가 각각의 과산화물 분자변위 보효소 분자에 연결되어 있는 포합체.
  6. 제5항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜이 이소프로폭시 폴리에틸렌글리콜린 포합체.
  7. 제1항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜의 말단기가 과산화물 분자변위 보효소 리신의 말단 아미노기에 CO결합으로 부착되어 있는 포합체.
  8. 과산화물 분자변위 보효소의 치료효과를 나타내기에 효과적인 량의 유효한 제1항의 포합체를 함유하고 있는 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 항염효과에 유효한 양의 포합체를 함유하고 있는 약제학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 산소독성을 경감는데 효과적인 양의 포합체를 함유하는 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 재관류 상처를 방지하는데 효과적인 양의 포합체를 함유하는 약제학적 조성물.
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