CN102038726A - 当归-川芎超临界co2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法 - Google Patents
当归-川芎超临界co2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，包括如下步骤：a)以“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物为原材料，用有机溶剂萃取，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位；b)以步骤a)的“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位作为上柱液，用洗脱剂经大孔吸附树脂进行洗脱，收集含药洗脱液，回收洗脱剂，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位。本发明提供的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位具有含有效成分量高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及传统中草药领域，具体涉及“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，以及由该方法制得的有机酸部位。本发明也涉及由该有机酸部位经冷冻干燥得到的冻干物。本发明还涉及所述有机酸部位或所述冻干物在制备抗心肌缺血、抗血栓、降血脂和改善动脉粥样硬化药物中的应用。
背景技术
当归为伞形科植物当归Angelica sinerisis(Oliv.)Diels的干燥根。当归归肝、心、脾经，药性甘、辛、温，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的作用。用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，闭经痛经，虚寒腹痛，肠燥便秘，风湿痹痛，跌打损伤，痈疽疮疡。当归是传统中药，临床应用广泛，有效部位及药理作用明确。近年来，国内外学者采用了植物化学、分子生物学、生物化学、药理学等技术，开展了当归的化学成分及药理学研究，取得长足进展，为当归的应用提供了依据。
川芎为伞形科植物Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，具有行气活血、祛风止痛的功效。为活血化瘀常用中药。其化学成分的研究，国内外报道较多。川芎主要成分的药理学研究表明总生物碱为川芎的主要有效部位。
当归、川芎同属伞形科，具有相似的治疗作用和相近的化学成分，临床上作为药对，经常配伍使用。其配伍使用，能增加有效成分的提出，更能有效地发挥药物功效，并减低、制约药物本身的毒性及副作用，符合中医药的七情配伍理论，临床发挥协同作用。含当归、川芎配伍的使用在《中华人民共和国药典》(2005年版一部)收载的中成药组方达52次，属于频率最高的组合。
“当归-川芎”药对则主要通过其有苯酞类、有机酸类、生物碱类等化学成分多环节、多途径地作用于机体而发挥协同效应，尤其是阿魏酸等有机酸成分具有抗氧化和清除自由基，抗血栓作用，降血脂和改善动脉粥样硬化作用，抗菌、抗病毒作用，调节免疫，抑制肝贮脂细胞(HSC)增殖和合成胶原作用，抗心肌缺血作用及抗肝损伤作用，成为国内、外学者关注的热点。
目前，文献中的报道仅局限于对当归或川芎单味药中有机酸及阿魏酸的研究，对“当归-川芎”药对中有机酸及阿魏酸的相关研究文献报道较少。而且，前期研究表明：混合提取所得的提取物其含量高于单独提取(详见：本课题组之前的学位论文，许玫.复方当归有效部位的研究[D].上海医药工业研究院学位论文，2007：58-59)，为“当归-川芎”药对的混合超临界提供依据。文献表明：具有丙二醛(MDA)生成抑制活性与抗心肌缺血、抗血栓、降血脂和改善动脉粥样硬化方面的活性有着密切的联系，详见文献报道(郑玉云，张朝，郭晓华，等.超氧化物歧化酶和丙二醛在几种心血管疾病中的变化[J].包头医学院学报，2002，18(3)：175-176.；王浩，李儒汉.冠心病患者血液脂质过氧化有关酶变化的临床意义[J].中华心血管病杂志，1992，20(2)：104-105.；苏耀勋，罗显田，容石婵，等.心血管病患者SOD和MDA变化及其意义探讨[J].海军医高专学报，1995，17(3)：233-234.)。
发明内容
为了得到一种具有丙二醛(MDA)生成抑制活性、并且总有机酸、阿魏酸含量较高的“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位，提高现有技术有机酸部位中总有机酸和阿魏酸的含量，使“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位的提取物适合于各种剂型的应用，本发明人对其进行了深入研究，用超临界CO2法提取其中的有机酸部位，并用大孔吸附树脂富集有机酸部位，制备得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位及其冻干物。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，包括如下步骤：
a)以“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物为原材料，用有机溶剂萃取，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位；
b)以步骤a)的“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位作为上柱液，用洗脱剂经大孔吸附树脂进行洗脱，收集含药洗脱液，回收洗脱剂，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位。
根据本发明，步骤a)中所述的“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物的制备工艺已申请专利(具体请参见CN200710045681.3)。该提取物用有机溶剂萃取，目的是去除小极性部分，以得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中的有机酸部位。
以上所述的用于萃取“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物的有机溶剂可以包括石油醚、环己烷或乙醚，优选石油醚，其中石油醚沸程可以是30-60℃或60-90℃。
根据本发明，步骤b)中所述大孔吸附树脂可以选自AB-8或DA201。
根据本发明，步骤b)中所述洗脱剂为乙醇。
根据本发明，步骤b)中所述上柱液的浓度为：总有机酸含量为32％-48％(质量百分比)。
根据本发明，步骤b)中所述上柱液中阿魏酸质量浓度为200-360mg/mL。
根据本发明，步骤b)中所述上柱液的pH值为3.5-5.5。
根据本发明，步骤b)中所述上柱液的上柱流速为2-3BV/h，所述洗脱剂的洗脱流速为0.5-1.5BV/h。
根据本发明，步骤b)中所述上柱液的洗脱剂的浓度为35％-85％(体积百分比)。
第二方面，本发明提供一种根据以上所述制备方法得到的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位。
所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位采用电位滴定法测得其总有机酸含量为总重量的58％-72％。
所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位采用高效液相色谱法测定的阿魏酸含量为总重量的30％以上。
第三方面，本发明提供一种“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物，该冻干物由以上所述的纯化的有机酸部位冷冻干燥后得到。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据权利要求以上所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位或“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位冻干物和药学上可接受的辅料。
根据不同需要，所述药物组合物可以制备成片剂、胶囊、颗粒剂、粉针或注射剂。
第五方面，本发明提供所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位或“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位冻干物在制备抗心肌缺血、抗血栓、降血脂和改善动脉粥样硬化药物中的应用。
因此，本发明以总有机酸、阿魏酸的含量为指标，综合比较了多种树脂对“当归-川芎”药对的有机酸部位的吸附性能，遴选出适宜的乙醇洗脱溶液及洗脱体积，采用正交试验优化影响树脂吸附的重要因素，确定了大孔吸附树脂分离纯化“当归-川芎”超临界混合提取物的有机酸部位的工艺流程，并测定了由上述方法得到的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位冻干物的MDA生成抑制活性，为进一步研究其相关药理活性提供了必要的前提。
附图说明
图1为“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。在本发明中，提取物中的含量的测定：有机酸采用电位滴定法，阿魏酸有机酸采用HPLC法(方法参见：许玫.复方当归有效部位的研究[D].上海医药工业研究院学位论文，2007：48-50.)，MDA生成抑制活性采用小鼠服药后的含药血清体外抑制肝MDA生成法。
“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物的制备步骤：详见专利申请CN200710045681.3，作为进一步研究的样品。
以“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物为原材料，加有机溶剂例如石油醚、环己烷或乙醚萃取以去除小极性部分，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位；将其进行大孔吸附树脂分离纯化考察，采用大孔吸附树脂按最佳条件进行洗脱，收集洗脱液，较低温度下回收洗脱剂，得到纯化的有机酸部位。将上述有机酸部位冷冻干燥，即得“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物。
实施例1：
取“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物，加石油醚(沸程30～60℃)萃取以去除小极性部分，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位，调节上柱液pH值3.5，测得其中总有机酸含量为32％，阿魏酸质量浓度为200mg/mL；将其上柱大孔吸附树脂AB-8、以上柱流速2BV/h上样、以乙醇的体积浓度35％、洗脱流速0.5BV/h洗脱，收集含药洗脱液，较低温度下回收乙醇，得到纯化的有机酸部位，电位滴定法测得其总有机酸含量为：58％，其中，高效液相色谱法测定阿魏酸占30％。
实施例2：
将实施例1得到的纯化的有机酸部位冷冻干燥，即得“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物。
实施例3：
取“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物，加石油醚(沸程60～90℃)萃取以去除小极性部分，剩余“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位，调节上柱液PH值5.5，测得其中总有机酸含量为48％，阿魏酸质量浓度为360mg/mL；将其上柱大孔吸附树脂DA201、以上柱流速3BV/h上样、以乙醇的体积浓度85％、洗脱流速1.5BV/h洗脱，收集含药洗脱液，较低温度下回收有机溶剂，得到纯化的有机酸部位，电位滴定法测得其总有机酸含量为：72％，其中，高效液相色谱法测定阿魏酸占35％。
实施例4：
将实施例3得到的纯化的有机酸部位冷冻干燥，即得“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物。
实施例5：
取“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物，加环己烷萃取以去除小极性部分，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位，调节上柱液pH值4.2，测得其中总有机酸含量为38％，阿魏酸质量浓度为260mg/mL；将其上柱大孔吸附树脂AB-8、以上柱流速2.5BV/h上样、以乙醇的体积浓度50％、洗脱流速1.0BV/h洗脱，收集含药洗脱液，较低温度下回收乙醇，得到纯化的有机酸部位，电位滴定法测得其总有机酸含量为：62％，其中，高效液相色谱法测定阿魏酸占32％。
实施例6：
将实施例5得到的纯化的有机酸部位冷冻干燥，即得“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物。
实施例7：
取“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位的提取物，加无水乙醚萃取以去除小极性部分，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位，调节上柱液pH值4.8，测得其中总有机酸含量为40％，阿魏酸质量浓度为320mg/mL；将其上柱大孔吸附树脂AB-8、以上柱流速2.5BV/h上样、以乙醇的体积浓度70％、洗脱流速1.0BV/h洗脱，收集含药洗脱液，较低温度下回收乙醇，得到纯化的有机酸部位，电位滴定法测得其总有机酸含量为：68％，其中，高效液相色谱法测定阿魏酸占32％。
实施例8：
将实施例7得到的纯化的有机酸部位冷冻干燥，即得“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物。
实施例9：
取禁食10h的小鼠，脱颈椎处死后，快速取肝脏，用4℃生理盐水冲液血迹后，称重，用4℃生理盐水制成5％的肝匀浆。取0.6mL肝匀浆加50μL待测样品，混匀后，于37℃水浴中放置1.5h，取出后，快速加0.6mL 20％三的三氯醋酸终止反应。混匀，3500r·min-1离心，取上清液1.0mL，加1mL 0.67％硫代巴比妥酸，95℃水浴加热10min，冷却后于532nm处测得吸光值，以四乙氧基丙烷为标准品，折算每克肝组织中丙二醛(MDA)的生成量。
小鼠随机分成若干组，每组动物数10只，禁食10h后，按0.3mL·10g-1体重ig等生药量(20g生药·1kg-1)的不同方法所得的提取物，给药后45min摘眼球取血，分取血清50μL，混匀后，于37℃水浴中放置1.5h，取出后，快速加0.6mL 20％三的三氯醋酸终止反应。混匀，3500r·min-1离心，取上清液1.0mL，加1mL 0.67％硫代巴比妥酸，95℃水浴加热10min，冷却后于532nm处测得吸光值，以四乙氧基丙烷为标准品，折算每g肝组织中丙二醛(MDA)的生成量，并以生理盐水组鼠为对照，计算MDA生成抑制活性。
结果如下：
结论：由上表可以得知，相比现有技术得到的“当归-川芎”提取物，本发明超临界CO2提取-大孔树脂富集纯化法得到的“当归-川芎”提取物中有机酸含量和活性成分阿魏酸含量均明显提高。本发明方法得到的“当归-川芎”提取物对MDA生成抑制活性也比现有技术得到的提取物明显提高。
实施例10：
对实施例1所得的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物进行HPLC分析，其中8.140min的峰为阿魏酸，标准品比对及面积归一化法测定阿魏酸占35％以上(见附图1)，并按实施例9对阿魏酸测定其MDA生成抑制活性为45.51±6.49，比超临界提-大孔树脂富集纯化法略差，说明超临界提-大孔树脂富集纯化法所得的有机酸中的其他有机酸对此也有药效贡献，说明各有机酸之间存在协同作用。
实施例11：
“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的一种制剂——片剂
上述组分均过100目筛备用。按上述各物料用量称量，混匀、直接压片或制粒干燥后压片、包衣、质检即得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的片剂。
实施例12：
“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的一种制剂——胶囊剂
上述组分均过100目筛备用。按上述各物料用量称量，混匀、直接或制粒干燥后装入胶囊、质检即得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位的冻干物的胶囊剂。
实施例13：
“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的一种制剂——注射剂
取“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位2g，加注射用水1000m1加热溶解，搅拌均匀，调pH4-5，粗滤，测含量，配全量，再用超滤技术处理，灌封，灭菌即得。
实施例14：
“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物的一种制剂——片剂
上述组分均过100目筛备用。按上述各物料用量称量，混匀、直接压片或制粒干燥后压片、包衣、质检即得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物片剂。
实施例15：
“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物的一种制剂——胶囊剂
上述组分均过100目筛备用。按上述各物料用量称量，混匀、直接或制粒干燥后装入胶囊、质检即得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物的胶囊剂。
实施例16：
“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物的一种制剂——注射剂
取“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物2g，加注射用水1000ml加热溶解，搅拌均匀，调pH4-5，粗滤，测含量，配全量，再用超滤技术处理，灌封，灭菌即得。
Claims (19)
1.“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，包括如下步骤：
a)以“当归-川芎”超临界CO2总有机酸部位为原材料，用有机溶剂萃取，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位；
b)以步骤a)的“当归-川芎”超临界CO2提取物中有机酸部位作为上柱液，用洗脱剂经大孔吸附树脂进行洗脱，收集含药洗脱液，回收洗脱剂，得到“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位。
2.根据权利要求1所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述的有机溶剂为石油醚、环己烷或无水乙醚。
3.根据权利要求2所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述的有机溶剂为石油醚。
4.根据权利要求3所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，所述石油醚沸程选自30-60℃或60-90℃。
5.根据权利要求1所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述大孔吸附树脂选自AB-8或DA201。
6.根据权利要求1所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述洗脱剂为乙醇。
7.根据权利要求1所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述上柱液的浓度为：总有机酸含量为总重量的32-48重量％。
8.根据权利要求1所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述上柱液中阿魏酸质量浓度为200-360mg/mL。
9.根据权利要求1所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述上柱液的pH值为3.5-5.5。
10.根据权利要求1所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述上柱液的流速为2-3BV/h。
11.根据权利要求10所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述洗脱剂的流速为0.5-1.5BV/h。
12.根据权利要求1所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述洗脱剂的浓度为35-85体积％。
13.根据权利要求1-12任何一项制备方法得到的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位。
14.根据权利要求13所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位，其特征在于，采用电位滴定法测得其总有机酸含量为总重量的58％-72％。
15.根据权利要求13所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位，其特征在于，采用高效液相色谱法测定的阿魏酸含量为总重量的30％以上。
16.“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位的冻干物，其特征在于，其由权利要求13所述的纯化的有机酸部位冷冻干燥后得到。
17.药物组合物，其包含根据权利要求13所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位或根据权利要求16所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位冻干物。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊、颗粒剂、粉针或注射剂。
19.权利要求13所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位或权利要求16所述的“当归-川芎”超临界CO2提取物中纯化的有机酸部位冻干物在制备抗心肌缺血、抗血栓、降血脂和改善动脉粥样硬化药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110504 |