CN102028946A - 红豆杉免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种红豆杉免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗，其特征在于所述红豆杉免疫佐剂由下列质量比的组分组成：曼迪亚红豆杉提取物0.001～100%，载体0～99.999%。可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗抗原用量，以红豆杉提取物为佐剂使用的疫苗抗原用量，仅是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少，同样可以达到理想的免疫保护效果，其安全性高、副作用小，用红豆杉提取物为佐剂的流感疫苗，制备方法简便，疫苗质量容易控制。

Description

红豆杉免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗

技术领域

    本发明涉及一种红豆杉免疫佐剂，还涉及含有该红豆杉免疫佐剂的流感疫苗，属于生物技术领域。

技术背景

曼迪亚红豆杉（Taxus madia）属于红豆杉中的一个天然杂交品种，其母本为东北红豆杉（T.cuspidata），父本为欧洲红豆杉（T.bauata），在美国、加拿大生长已有近100年的历史。我国20世纪90年代中期从加拿大引种，进行人工繁殖，在四川、广西、山东和云南等地栽培。

红豆杉（Taxus mairei）是第四纪冰川时期孑遗植物，世界珍稀濒危物种，在全世界共有十一种，目前我国共有四个种和一个变种，即云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种）。

曼迪亚红豆杉为人工栽培的常绿灌木，生物量十分巨大，生长时间短，主根不明显，侧根发达，枝叶茂盛，萌发力强，能耐－25℃的低温，生长快。中国大部分地区均可栽种。曼迪亚红豆杉通过人工选育已发展到10多个品系，其中，Taxus media是美国FDA批准可以用作提取“紫杉醇”的红豆杉之一，年生长实测40～50cm，最高可60～70cm，5年生可产原料1.5kg以上，次年萌生新枝叶，生物量还大于头年采收量。目前主要作为提炼“紫杉醇”的原料使用。

佐剂是一类能增强抗原免疫原性，提高疫苗效果的物质，正因为有了佐剂技术，使国产疫苗在价格上具有明显优势。在流感疫苗中使用佐剂不仅可以增强免疫原性，还可以降低抗原用量。特别在应对大流行流感时，使用佐剂降低抗原用量进而扩大接种人群数量的特性显得尤为重要。在大流行流感疫苗研究中应用到的佐剂主要有：铝佐剂(氧化铝、氢氧化铝、磷酸铝)、MF59(是一种水包油的乳剂,包含1%鲨烯, 0. 5%Tween80和0. 5%三油酸聚山梨脂的水包油乳液)、LTK63和新型佐剂等。

目前上市流感疫苗使用的佐剂主要是铝佐剂和MF59。但事实上铝佐剂对蛋白亚单位疫苗诱导抗体产生的能力较弱，不能有效地诱导免疫应答，在一些情况下还可产生与超敏反应有关的IgE。而MF59作为佐剂使用在增强免疫原性的同时，也增强了反应原性，如在接种部位红、肿、热、痛等症状增加。此外，由于安全性，副作用等问题，LTK63和新型佐剂等其他物质，包括壳聚糖、ISCOMs等，作为流感疫苗佐剂也还只限于研究阶段。因此，随着各种新发流感在世界的爆发和对人感染性的增强,，加快新型流感疫苗的研究，寻求更高安全性和免疫原性的佐剂，仍然是流感疫苗发展的一个需要。

佐剂发挥作用是由于能增强抗原的免疫原性，提高疫苗效果，因此佐剂一般可在多种疫苗中进行使用，如目前的铝佐剂。所以佐剂的研究不仅对流感，而且对其它感染性疾病的防治也有很高的价值。

流行性感冒（简称流感）是指由流感病毒引起，具有高度传染性的急性呼吸道传染病。流感发病快，传染性强，发病率高，主要通过空气飞沫传播。流感的流行没有明显的季节性,只是冬末春初发病率稍高一点，而且几乎每年都会发生,或者局部爆发,或者大规模流行，甚至造成世界规模的大流行，严重危害了人类的健康和生命，给社会造成了沉重的负担。到目前为止，接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳方法。由于流感病毒变异很快，通常每年的流行类型都有所不同，生产企业一般都在世界卫生组织（WHO）指导下选择流感病毒毒株进行疫苗生产，每年接种最新的流感疫苗才能达到预防的效果。一旦流感病毒变异造成大规模流行或者世界性流行，疫苗需求量会大量增加，但由于目前流感疫苗生产工艺的限制，短时间内不可能提供足量疫苗，所以，应用免疫佐剂，减少疫苗用量并提高其效果就显得非常重要。

经系统查阅文献和专利，目前未发现关于红豆杉提取物具有免疫佐剂作用的报道。

发明内容

为解决目前免疫佐剂单一，副作用难以避免，疫苗生产供应量有限，难以应付感染性疾病暴发时疫苗需求量大，疫苗起效时间慢等问题，本发明提供一种能提高疫苗免疫效果，同时带来巨大的经济效益和社会效益的红豆杉免疫佐剂。

本发明的另一个目的在于提供一种含有红豆杉免疫佐剂的流感疫苗。

本发明提供的红豆杉免疫佐剂是由下列质量比的组分组成的：

曼迪亚红豆杉提取物    0.001～100%

载体                  0～99.999%。

所述载体由下列质量比的组分组成：

乳化剂                                   20～70%

助乳化剂                                20～70%

油相                                        1～50%

水相                                    1～30%。

所述乳化剂为常规的Tween80或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3∶2～2∶3的常规Tween80与Span80的混合物，或者为质量混合比为1∶1的常规聚氧乙烯蓖麻油与Span80的混合物。

所述助乳化剂为常规的1，2-丙二醇或聚乙二醇400中的一种。

所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。

所述水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。

本发明提供的红豆杉免疫佐剂，优选下列质量比：

曼迪亚红豆杉提取物    0.1～100%

载体                  0～99.9%。

本发明提供的一种含有红豆杉免疫佐剂的流感疫苗的组成是：红豆杉免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为76～183409，其中，所述红豆杉免疫佐剂由下列质量比的组分组成：

曼迪亚红豆杉提取物     0.001～100%

载体                   0～99.999%。

所述曼迪亚红豆杉提取物是用乙醇或水作为溶剂，经现有技术的常规方法提取得到的，具体是：

乙醇提取：将干燥的曼迪亚红豆杉枝叶粉碎成粉，置于容器内，用乙醇冷浸或温浸提取，或者加热回流提取，过滤，取滤液，回收滤液中的乙醇，浓缩滤液得浸膏；其中，每次提取时，乙醇的质量浓度为60～95％，乙醇加入量是曼迪亚红豆杉粉质量的2～10倍，冷浸是在室温下浸泡1～10天，温浸是在40～60℃温度下浸泡1～2小时，提取次数为1～3次；加热回流提取是在20～40℃温度下，回流提取1～3次，每次20分钟～4小时；

水提取：将干燥的曼迪亚红豆杉枝叶粉碎成粉，置于容器内，用蒸馏水冷浸或温浸提取，或者加热煎煮提取，过滤，取滤液，浓缩滤液得浸膏；其中，每次提取时，蒸馏水的加入量是曼迪亚红豆杉粉质量的2～10倍，冷浸是在室温下浸泡1～10天，温浸是在40～60℃温度下浸泡1～2小时，提取次数为1～3次；加热煎煮提取是：每次加热煮沸20分钟～4小时，提取次数为1～3次。

另外，所述曼迪亚红豆杉提取物还可采用现有技术的除水提取、乙醇提取以外的其它常规溶剂提取而得到的提取物，如采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯等为溶剂进行的提取。

本发明提供的红豆杉免疫佐剂与传统氢氧化铝佐剂相比，具有以下优点：

1）曼迪亚红豆杉提取物制备方法简单、经济、环保。

2）曼迪亚红豆杉是一种天然植物，经引种驯化后已经作为紫杉醇提取的原料使用。曼迪亚红豆杉提取物作为免疫佐剂的应用，以流行性感冒（简称流感）病毒疫苗为例得到了应用性的实验结果，其安全性高、副作用小。例如用含曼迪亚红豆杉提取物的流感疫苗肌肉注射小鼠，4小时内观察小鼠活动性无明显减弱，未见全身不良反应。而用含氢氧化铝佐剂流感疫苗注射，可观察到小鼠活动性明显减弱，注射局部肿胀明显。

3）用曼迪亚红豆杉提取物为佐剂的流感疫苗，制备方法简便，疫苗质量容易控制；而以氢氧化铝为佐剂制备流感疫苗，制备和存储过程中，影响因素较多，对于疫苗的质量较难控制。

4）用曼迪亚红豆杉提取物作为流感疫苗佐剂，可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗抗原用量。例如通过以曼迪亚红豆杉提取物为佐剂的流感疫苗和以氢氧化铝为佐剂的流感疫苗免疫小鼠发现，以曼迪亚红豆杉提取物为佐剂使用的疫苗抗原用量仅是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少，同样可以达到理想的免疫保护效果。

附图说明

图1为不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化；

图2为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价；

图3为不同接种组在接种后7天内的体重增长情况；

图4为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但并不以此来限定本发明。

本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所用设备或仪器均是常规的。   

实施例1

曼迪亚红豆杉乙醇提取物的制备：取干燥曼迪亚红豆杉枝叶50g，粉碎成粉，置于容器内，用4倍即200 ml质量浓度为70％的乙醇，按常规进行加热回流提取，其中，每次加热温度为50℃，回流时间为60分钟，提取次数为2次，过滤后，对滤液进行减压回收乙醇后，余下滤液经浓缩干燥后，得浸膏。

实施例2

曼迪亚红豆杉水提取物的制备：取干燥曼迪亚红豆杉枝叶50g，粉碎成粉，置于容器内，用8倍即400 ml蒸馏水按常规进行加热煎煮提取，其中，每次煎煮时间为4小时，提取次数为3次，过滤，合并滤液后，对滤液进行浓缩干燥，得浸膏。

实施例3  

纳米乳剂载体的制备：

1）按下列质量比备料：0.475g注射用水, 1g肉豆蔻酸异丙酯（IPM）, 1g 1，2-丙二醇, 1g Tween80；

2）向混合搅拌瓶内加入1g Tween80，1g 1，2-丙二醇，在转速为200转/分钟，室温条件下，持续搅拌1～10分钟，混匀后加入1g肉豆蔻酸异丙酯，混合均匀得混合物；

3）在上述2）的混合物中滴入0.475g注射用水，同时在转速为200转/分钟，室温下，搅拌混合物至液体为透明，得到纳米乳剂；

4）对3）制得的纳米乳剂进行如下检测：1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为19.205～24.896nm，合格；2.经3000rpm，15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经4℃放置50天，纳米乳剂体系无变化，合格。

实施例4 

1）称取实施例1的曼迪亚红豆杉浸膏3.5mg，溶于100ul无水乙醇中，制成曼迪亚红豆杉浸膏溶液，备用；

2）将上述1）制备的曼迪亚红豆杉浸膏溶液与375μl的H3N2流感病毒裂解疫苗（血凝素含量为43.67μg/ml）混合，得475μl含曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗；

3）称取肉豆蔻酸异丙酯1g、1，2-丙二醇1g、Tween80 1g于搅拌瓶中，转速维持在200转/分钟，室温搅拌1～10分钟，至充分混匀，得混合溶液；

4）在上述3）的混合溶液中缓慢滴入2）制备的含曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗475μl，同时维持转速在100转/分钟，搅拌至溶液为淡棕色透明，得到以曼迪亚红豆杉浸膏、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。其中：曼迪亚红豆杉浸膏的质量比为0.117%，载体质量比为99.883%；曼迪亚红豆杉浸膏纳米佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为：183409。

用实施例4制备的曼迪亚红豆杉浸膏纳米乳剂流感病毒疫苗肌肉注射标准体重昆明种雌性小鼠，每只小鼠200μl。此200μl注射疫苗中流感疫苗血凝素含量为0.94μg，曼迪亚红豆杉浸膏0.2mg。同时设立注射等量的生理盐水空白对照组、等血凝素含量的Al(OH)₃佐剂流感疫苗的佐剂对照组、等血凝素含量的单独流感疫苗对照组。间隔3周，免疫2次。于首次免疫后第一周开始，每隔7天采尾血，分离血清测定血凝抑制抗体效价。所测结果显示红豆杉浸膏纳米乳剂型佐剂疫苗组血凝抑制抗体效价水平整体明显高于铝佐剂组及单独疫苗组，具体结果见图1。

实施例5     

1）称取实施例2的曼迪亚红豆杉浸膏7.6mg，溶于200μl无水乙醇中，得曼迪亚红豆杉浸膏溶液，备用；

2）将1）的曼迪亚红豆杉浸膏溶液与3.2ml市购的H3N2流感病毒裂解疫苗（血凝素含量43.67μg/ml）混合均匀，得3.4ml含曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗；

3）取1.1g聚氧乙烯蓖麻油,1.6g Span80, 6g 1，2-丙二醇，3g肉豆蔻酸异丙酯放于搅拌瓶中，转速维持在200转/分钟，室温搅拌10分钟，至充分混匀，得混合溶液；

4）在3）的混合溶液中缓慢滴入2）的含曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗3.4ml，同时维持转速在200转/分钟，搅拌至溶液为黄棕色半透明，得到以曼迪亚红豆杉浸膏、纳米乳剂载体为佐剂的流感病毒疫苗，其中：曼迪亚红豆杉浸膏的质量比为0.065%，载体质量比为99.935%；曼迪亚红豆杉浸膏与流感疫苗血凝素的质量比为：83779。

实施例6 

1）制备下列不同的佐剂或溶液：

    a）取实施例2的曼迪亚红豆杉浸膏0.2 mg，溶于20ul无水乙醇，然后与120μl生理盐水混合，得140μl曼迪亚红豆杉浸膏溶液，备用；

b）取浓度为15.98 mg/ml的氢氧化铝12.5 μl，其中含AL(OH)₃ 0.2mg，加入生理盐水至体积为140 μl，备用；

    c）140 μl生理盐水，备用；

    d）200 μl生理盐水，备用；

2）制备下列不同的疫苗：

取血凝素含量为43.67 μg/ml的市购H3N2流感病毒裂解疫苗60μl，分别和上述a、b、c不同溶液混合，分别得到含有曼迪亚红豆杉浸膏免疫佐剂的流感疫苗样品A、含有AL(OH)₃佐剂的流感疫苗样品B、单独的流感疫苗样品C、不加疫苗仅为生理盐水空白对照样品D。所配置的上述A、B、C、D四个样品均制备五份，体积均为200 μl，备用；其中含有曼迪亚红豆杉浸膏的流感疫苗样品A中：曼迪亚红豆杉浸膏的质量比为100%，载体质量比为0 %；曼迪亚红豆杉浸膏免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为76。

3）免疫接种及检测：

用上述2）所配的A、B、C、D四个不同的样品分别免疫标准体重雌性昆明小鼠，每组5只，每只肌肉注射200μl，间隔3周，免疫2次。于加免后2周取尾血，分离血清测定血凝抑制效价，所测结果显示红豆杉浸膏佐剂组血凝抑制抗体效价水平明显高于铝佐剂组及单独疫苗组，具体结果见附图2。并于第一天接种前和接种后第8天对各组小鼠进行体重测量，对7天内各组平均增长的体重进行计算，所测结果显示红豆杉浸膏佐剂组较之铝佐剂组及单独疫苗组小鼠体重增长受影响最低，并与空白对照组相比，小鼠体重增长幅度反而较大，可能是由于红豆杉浸膏本身具有一定的补益作用，具体结果见附图3。

    实施例7  

A、取实施例1的曼迪亚红豆杉浸膏0.3 mg，溶于40μl无水乙醇，再与130μl生理盐水混合，然后加入市购的H3N2流感裂解疫苗30μl至终体积为200 μl，H3N2流感裂解疫苗的血凝素含量为1.31μg，得含有曼迪亚红豆杉浸膏的流感病毒疫苗，备用；其中：曼迪亚红豆杉浸膏的质量比为100%，载体质量比为0 %；曼迪亚红豆杉浸膏佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为：229。

B、取H3N2流感裂解疫苗60 μl，其中含血凝素2.62μg，与140 μl生理盐水混合至终体积为200 μl，作为单独疫苗对照组，备用；

C、取浓度为15.98 mg/ml的氢氧化铝佐剂12.5 μl，其中含0.2mg AL(OH)₃，与含血凝素2.62μg的流感疫苗60 μl混合，然后加入生理盐水至终体积200 μl，作为AL(0H)₃佐剂疫苗对照组，备用：

D、生理盐水200 μl，为空白对照组，备用；

F、免疫接种及抗体检测：

将上述配好的A、B、C、D四个样品分别免疫标准体重昆明雌性小鼠，肌肉注射，每只200 μl，每组5只，间隔3周，免疫2次，于加免后2周进行尾部采血，分离血清，检测血凝抑制抗体效价，所测结果显示，即使红豆杉浸膏佐剂疫苗组HA（1.31ug）含量减半的情况下产生的血凝抑制抗体效价水平也明显高于HA含量为2.62ug的铝佐剂组及单独疫苗组，说明红豆杉浸膏佐剂能明显降低疫苗抗原用量，具体结果见附图4。

Claims (8)

1.一种红豆杉免疫佐剂，其特征在于由下列质量比的组分组成：

曼迪亚红豆杉提取物    0.001～100%

载体                  0～99.999%。

2.如权利要求1所述的红豆杉免疫佐剂，其特征在于所述载体由下列质量比的组分组成：

乳化剂                         20～70%

助乳化剂                       20～70%

油相                               1～50%

水相                            1～30%。

3.如权利要求2所述的红豆杉免疫佐剂，其特征在于所述乳化剂为常规的Tween80或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3∶2～2∶3的常规Tween80与Span80的混合物，或者为质量混合比为1∶1的常规聚氧乙烯蓖麻油与Span80的混合物。

4.如权利要求2所述的红豆杉免疫佐剂，其特征在于所述助乳化剂为常规的1，2-丙二醇或聚乙二醇400中的一种。

5.如权利要求2所述的红豆杉免疫佐剂，其特征在于所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。

6.如权利要求2所述的红豆杉免疫佐剂，其特征在于所述水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。

7.一种含有如权利要求1所述红豆杉免疫佐剂的流感疫苗，其特征在于：红豆杉免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为76～183409，其中，所述红豆杉免疫佐剂由下列质量比的组分组成：

曼迪亚红豆杉提取物     0.001～100%

载体                   0～99.999%。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述曼迪亚红豆杉提取物是用乙醇或水作为溶剂，经现有技术的常规方法提取得到的，具体是：

乙醇提取：将干燥的曼迪亚红豆杉枝叶粉碎成粉，置于容器内，用乙醇冷浸或温浸提取，或者加热回流提取，过滤，取滤液，回收滤液中的乙醇，浓缩滤液得浸膏；其中，每次提取时，乙醇的质量浓度为60～95％，乙醇加入量是曼迪亚红豆杉粉质量的2～10倍，冷浸是在室温下浸泡1～10天，温浸是在40～60℃温度下浸泡1～2小时，提取次数为1～3次；加热回流提取是在20～40℃温度下，回流提取1～3次，每次20分钟～4小时；

水提取：将干燥的曼迪亚红豆杉枝叶粉碎成粉，置于容器内，用蒸馏水冷浸或温浸提取，或者加热煎煮提取，过滤，取滤液，浓缩滤液得浸膏；其中，每次提取时，蒸馏水的加入量是曼迪亚红豆杉粉质量的2～10倍，冷浸是在室温下浸泡1～10天，温浸是在40～60℃温度下浸泡1～2小时，提取次数为1～3次；加热煎煮提取是：每次加热煮沸20分钟～4小时，提取次数为1～3次。

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