CN102018992A - 一种聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法 - Google Patents

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一种聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，包括如下步骤：(1)将聚多糖衍生物配制成浓度为0.02～0.1g/mL的单体水溶液；所述的聚多糖衍生物为两种不同的天然多糖经化学改性后分别得到的可交联的大分子单体A和大分子单体B的组合。(2)将上述单体水溶液预冷至0～4℃，加入催化剂后迅速将反应液置于冷冻系统中冷却结晶并进行原位聚合，反应完成后在室温下融化冰晶，冰晶融化后形成孔隙，即得到海绵状的聚多糖基组织工程大孔支架。本发明制得的大孔型组织工程支架具有高孔隙率和良好孔道贯通性的特点。

Description

一种聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法
(一)技术领域
本发明属于组织工程与生物材料技术领域，涉及一种基于聚多糖衍生物的组织工程大孔支架的制备方法。
(二)背景技术
支架是组织工程方法修复或再生缺损组织器官的关键要素之一。作为在体内、外培养细胞的临时载体，不但要具有一定的机械强度、良好的生物相容性和可控的降解速率，而且要能够提供细胞和新生组织器官生长的合理三维空间结构。
目前，将生物可降解材料加工成多孔支架的主要成型技术有纤维黏结法、固体占位致孔法、气体发泡、相分离/冷冻干燥法等，这些方法各有利弊。纤维黏结法虽然能制备出高孔隙率且连通性好的支架，但存在有机溶剂残留问题。固体占位致孔法是一种简单易行的方法，通过选择不同粒径的致孔剂和使用量来有效控制孔尺寸和孔隙率，但是致孔剂(如蔗糖、NaCl晶体)需要通过加热、溶解的方法去除，而且容易形成盲孔，孔的通透性还有待改善。气体发泡法最大的优点在于不需要有机溶剂和高温，但所使用的高压气体如CO2容易使支架内部生成封闭的孔，成形工艺也比较复杂。冷冻干燥法在低温下操作，有利于生物活性分子的引入和控制释放。由于要将体系溶液用液氮剧冷或迅速降低到很低的温度，制备的支架比较脆弱，孔径偏小。组织工程支架是否具有合适孔径分布的开放孔结构和高孔隙率是非常重要的，因为这直接关系到细胞能否生长到支架内部以及支架外的营养物质和细胞代谢物的交换。因此，开发一种新的具有高孔隙率和良好孔道贯通性的大孔型组织工程支架的制备方法，具有重要的意义。
(三)发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种基于聚多糖衍生物的组织工程大孔支架的制备方法，该大孔型组织工程支架具有高孔隙率和良好孔道贯通性。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)将聚多糖衍生物配制成浓度为0.02～0.1g/mL的单体水溶液；所述的聚多糖衍生物为两种不同的天然多糖经化学改性后分别得到的可交联的大分子单体A和大分子单体B的组合。
(2)将上述单体水溶液预冷至0～4℃，加入催化剂后迅速将反应液置于冷冻系统中冷却结晶并进行原位聚合，反应完成后在室温下融化冰晶，冰晶融化后形成孔隙，即得到海绵状的聚多糖基组织工程大孔支架。
进一步，本发明所述的经化学改性的可交联的聚多糖衍生物大分子单体A优选为经化学改性的葡聚糖衍生物，即对葡聚糖进行化学改性后的产物；所述的经化学改性的可交联的聚多糖衍生物大分子单体B优选为经化学改性的透明质酸衍生物，即对透明质酸进行化学改性后的产物。
更进一步，所述的经化学改性的可交联的聚多糖衍生物大分子单体A优选为甲基丙烯酰基修饰的葡聚糖衍生物，即以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)或甲基丙烯酸酐(MA)对葡聚糖(Dextran)进行改性得到的产物，记为Dex-MA；甲基丙烯酰基的取代度(DS，即每100个多糖结构单元含有甲基丙烯酰基的数目)为1％～30％。
更进一步，所述的经化学改性的可交联的聚多糖衍生物大分子单体B优选为甲基丙烯酰基修饰的透明质酸衍生物，即以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)或甲基丙烯酸酐(MA)对透明质酸(HA)进行改性得到的产物，记为HA-MA；甲基丙烯酰基的取代度优选1％～35％。
本发明适用的葡聚糖的分子量范围为10～500kDa。
本发明适用的透明质酸的分子量范围为100～1000kDa。
本发明中，所述的两种单体的比例依透明质酸衍生物的含量而定，由于透明质酸粘度大，其衍生物在单体水溶液中的浓度优选为0.005～0.03g/mL。
所述的步骤(2)中，所述的催化剂要针对不同的聚合物单体进行选择，常为相应聚合反应的引发剂和/或加速剂，针对本发明所具体使用的聚多糖衍生物单体，催化剂可选用下列组合之一：过硫酸铵(APS)/四甲基乙二胺(TEMED)，过硫酸钾/三乙醇胺；本发明优选过硫酸铵/四甲基乙二胺作为催化剂。进一步，催化剂与聚多糖衍生物的投料质量比为0.01～0.1∶1。
所述的步骤(2)中，反应液可以选择在-30～-5℃冷冻系统中冷却结晶和原位聚合反应。
在步骤(2)反应结束后，可进行如下处理：依次用水或低浓度乙醇水溶液、0.05M NaOH水溶液或pH 8的磷酸盐缓冲液、大量的去离子水进行冲洗，以除去残留的催化剂和未反应的单体，确保细胞支架的生物相容性。
用本发明提供的制备方法得到聚多糖基组织工程支架形态为海绵状，孔径范围10～200μm，孔隙率大于80％，孔道连通性好，渗透率范围1×10-11～3×10-9m2。吸水速度快，5秒钟内即可达到溶胀平衡。单位体积含水率高达95％以上。该支架适用于脂肪组织、皮肤、血管、心脏瓣膜等软组织细胞或干细胞的离体培养。
本发明提供的组织工程支架的制备方法具有如下特点：
(1)利用葡聚糖和透明质酸的化学改性衍生物作为聚合物单体，透明质酸为细胞外基质的组要成分，生物相容性良好，有利于细胞的增值和分化。经化学改性后的透明质酸与葡聚糖交联可弥补透明质酸支架机械强度差的缺点，并且不需要另外加入交联剂便可形成支架的三维网络结构。
(2)利用溶剂水的结晶融化来致孔，不会造成大多数常规方法带来的有机溶剂残留问题，且通过改变冷冻温度和单体浓度可以有效地控制孔径大小和孔隙率。
(3)单体溶液在模具中发生原位聚合反应形成支架，因此可以通过设计各种不同构造的模具来制备与缺损组织器官外形相匹配的支架载体。
(四)具体实施方式：
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
将0.1g葡聚糖衍生物Dex-MA(分子量40kDa，取代度10％)，0.05g透明质酸衍生物HA-MA(分子量750kDa，取代度20％)溶于5ml去离子水中，搅拌均匀后冷却至0℃，迅速加入6mg APS和3mg TEMED，将所得混合液装入内径10mm、长100mm的玻璃层析柱内，密封后，在-15℃恒温冷却系统中进行冷却结晶致孔。反应过夜后取出，在室温下融化冰晶，得到葡聚糖和透明质酸复合的大孔组织工程支架，其孔隙率为98％，孔径范围10～200μm，平均孔径约为80μm，孔隙率87％，孔道连通性好，渗透率范围2.3×10-10m2。吸水速度快，5秒钟内即可达到溶胀平衡。单位体积含水率高达95.0％，图1为支架冷冻干燥后的SEM图。
实施例2
将0.15g葡聚糖衍生物Dex-MA(分子量70kDa，取代度16％)，0.1g透明质酸衍生物HA-MA(分子量1000kDa，取代度25％)溶于5ml去离子水中，搅拌均匀后冷却至2℃，迅速加入1.5mg APS和1mg TEMED将所得混合液装入内径10mm、长100mm的玻璃层析柱内，密封后，在-15℃恒温冷却系统中进行冷却结晶致孔。反应过夜后取出，在室温下融化冰晶，得到葡聚糖和透明质酸复合的大孔组织工程支架，其孔隙率为95％，孔径范围10～120μm，平均孔径约为60μm，孔隙率82％，孔道连通性好，渗透率范围1×10-11m2。吸水速度快，5秒钟内即可达到溶胀平衡，单位体积含水率高达97.2％。图2为支架冷冻干燥后的SEM图。
实施例3
将0.15g葡聚糖衍生物Dex-MA(分子量10kDa，取代度30％)，0.05g透明质酸衍生物HA-MA(分子量1000kDa，取代度30％)溶于5ml去离子水中，搅拌均匀后冷却至0℃，迅速加入14mg APS和6mg TEMED将所得混合液装入内径10mm、长100mm的玻璃层析柱内，密封后，在-12℃恒温冷却系统中进行冷却结晶致孔。反应过夜后取出，在室温下融化冰晶，得到葡聚糖和透明质酸复合的大孔组织工程支架，其孔隙率为93％，孔径范围10～140μm平均孔径约为65μm，孔隙率85％，孔道连通性好，渗透率2×10-10m2。吸水速度快，5秒钟内即可达到溶胀平衡。单位体积含水率高达96.3％。图3为支架临界点干燥后的SEM图。
实施例4
将0.25g葡聚糖衍生物Dex-MA(分子量500kDa，取代度8％)，0.15g透明质酸衍生物HA-MA(分子量100kDa，取代度13％)溶于5ml去离子水中，搅拌均匀后冷却至4℃，迅速加入8mg APS和4mg TEMED将所得混合液装入内径10mm、长100mm的玻璃层析柱内，密封后，在-20℃恒温冷却系统中进行冷却结晶致孔。反应过夜后取出，在室温下融化冰晶，得到葡聚糖和透明质酸复合的大孔组织工程支架，其孔隙率为88％，孔径范围10～110μm平均孔径约为40μm，孔隙率89％，孔道连通性好，渗透率3×10-9m2。吸水速度快，5秒钟内即可达到溶胀平衡，单位体积含水率高达95.5％。图4为支架临界点干燥后的SEM图。

Claims (8)

1.一种聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)将聚多糖衍生物配制成浓度为0.02～0.1g/mL的单体水溶液；所述的聚多糖衍生物为两种不同的天然多糖经化学改性后分别得到的可交联的大分子单体A和大分子单体B的组合；
(2)将上述单体水溶液预冷至0～4℃，加入催化剂后迅速将反应液置于冷冻系统中冷却结晶并进行原位聚合，反应完成后在室温下融化冰晶，冰晶融化后形成孔隙，即得到海绵状的聚多糖基组织工程大孔支架。
2.如权利要求1所述的聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，其特征在于：所述的大分子单体A为经化学改性的葡聚糖衍生物；所述的大分子单体B为经化学改性的透明质酸衍生物。
3.如权利要求2所述的聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，其特征在于：所述的大分子单体A为甲基丙烯酰基修饰的葡聚糖衍生物，甲基丙烯酰基的取代度为1％～30％；所述的大分子单体B为甲基丙烯酰基修饰的透明质酸衍生物，甲基丙烯酰基的取代度为1％～35％。
4.如权利要求2或3所述的聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，其特征在于：葡聚糖的分子量范围为10～500kDa；透明质酸的分子量范围为100～1000kDa。
5.如权利要求2或3所述的聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，其特征在于所述的单体水溶液中，大分子单体B的浓度在0.005～0.03g/mL。
6.如权利要求2或3所述的聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的催化剂为下列组合之一：过硫酸铵/四甲基乙二胺，过硫酸钾/三乙醇胺。
7.如权利要求6所述的聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的催化剂与聚多糖衍生物的投料质量比为0.01～0.1∶1。
8.如权利要求1～3之一所述的聚多糖基组织工程大孔支架的制备方法，其特征在于步骤(2)中的反应液在-30～-5℃范围内冷却结晶并进行原位聚合反应。
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