CN102014866A - 美容性治疗皮肤老化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在个体中对皮肤老化进行美容性预防或治疗的方法，包括对所述个体施用美容活性量的齿龈成纤维细胞来源的产品。

Description

美容性治疗皮肤老化的方法
本发明要求享受2008年3月31日提交的美国临时申请序列号61/040,891的权益，该申请通过引用并入本文中。
在皮肤老化中，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)之合成与其被基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)之降解的平衡发生失衡。这种失衡导致细胞外基质的过度降解，而这是皮肤老化的一个特征(Cauchard&Hornebeck(2004)Vivant 5)。皮肤老化涉及皱纹数量的增加以及加深，这是真皮中的大分子(如胶原蛋白和弹性蛋白)降解的直接结果。
在真皮中，氧自由基促进时间性老化(chronological aging)和光诱导之老化中发生的MMP过度产生。此外，在暴露于日光的皮肤区域(如面部皮肤)中，还会产生UV射线的其它有害效果，特别是不完全的胶原蛋白合成、皮肤色素沉着和日光性弹性组织变性(其表现为皮肤弹性网络(cutaneous elastic lattice)降解)。并且，体外研究已经表明，接受UV射线处理的皮肤成纤维细胞会过量产生MMP(Brennan等(2003)Photochem.Photobiol.78：43-48)。
胶原酶1和3(MMP-1和MMP-13)与MT1-MMP(MMP-14)降解胶原蛋白，而明胶酶A和B(MMP-2和MMP-9)降解弹性蛋白。其它金属蛋白酶如溶基质蛋白酶1(MMP-3)既参与胶原蛋白降解也参与弹性蛋白降解。
真皮成纤维细胞已经用于皮肤老化治疗的领域(Weiss等(2007)Dermatol Surg.33：263-8)。在深皱纹处注射自体真皮成纤维细胞(两千万个细胞/ml)的215名受试者中可以观察到胶原网络增加。注射一年后，在80％的受试者中，皱纹的改善仍明显可见。
齿龈成纤维细胞为间充质细胞，其能够在齿龈的软结缔组织内部迁移、粘附和增殖，从而保持齿龈组织的完整，所述齿龈组织暴露于诸多侵害，如机械压力、细菌感染或pH和温度变化。在Gogly等(1997)Clin.OralInvest.1：147-152；Gogly等(1998)Biochem.Pharmacal.56：1447-1454以及Ejeil等(2003)J.Periodontol.74：188-195中对齿龈成纤维细胞有详细的描述。
取决于环境条件，齿龈成纤维细胞能够调节其表型，并通过增殖、迁移、合成基质组分或基质相关酶来进行响应。
齿龈成纤维细胞合成胶原蛋白(如I、III、V、VI、VII、XII型)、弹性纤维(耐酸纤维、伸展纤维(elaunin)和弹性蛋白)、蛋白聚糖和糖胺聚糖(如饰胶蛋白聚糖(decorin)、双糖链蛋白聚糖)和糖蛋白(如纤连蛋白、肌腱蛋白(tenascin))。同时，齿龈成纤维细胞合成能够降解大分子化合物的酶(基质金属蛋白酶；MMP)和抑制MMP活性形式的酶(金属蛋白酶抑制剂；TIMP)。因此，齿龈成纤维细胞是细胞外基质重建的重要参与者。
发明内容
本发明源自于本发明人出乎意料的发现，即齿龈成纤维细胞比真皮成纤维细胞更适于抑制由UV处理的真皮成纤维细胞产生的MMP活性。
因此，本发明涉及在个体中对皮肤老化进行美容性预防或治疗的方法，其包括向所述个体施用美容活性量的齿龈成纤维细胞来源的产品。
本发明还涉及齿龈成纤维细胞来源的产品，其用于预防或治疗(特别是美容性预防或治疗)个体中的皮肤老化。
附图说明
图1表示在如下培养基中MMP-9的量(纵轴，pg/100,000个细胞)：未处理的人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast，hDF)；7.5焦耳/cm2UV-A处理的人真皮成纤维细胞(hDFi1)；人齿龈成纤维细胞条件培养基中的hDFi1(cmhGF)；人真皮成纤维细胞条件培养基中的hDFi1(cmhDF)；15焦耳/cm2UV-A处理的人真皮成纤维细胞(hDFi2)；人齿龈成纤维细胞条件培养基中的hDFi2(cmhGF)；以及人真皮成纤维细胞条件培养基中的hDFi2(cmhDF)。
图2表示在如下培养基中TIMP-1(纵轴，pg/ml/100,000个细胞)的浓度：人真皮成纤维细胞条件培养基(cmhDF)，以7.5焦耳/cm2(hDFi1)或15焦耳/cm2(hDFi2)UV-A处理的人真皮成纤维细胞的培养基，或人齿龈成纤维细胞条件培养基(cmhGF)。
图3表示在如下培养基中MMP-9/TIMP-1复合物的浓度(纵轴，pg/ml/100,000个细胞)的浓度：未处理的人真皮成纤维细胞(hDF)；7.5焦耳/cm2UV-A处理的人真皮成纤维细胞(hDFi1)；人齿龈成纤维细胞条件培养基中的hDFi1(cmhGF)；人真皮成纤维细胞条件培养基中的hDFi1(cmhDF)；15焦耳/cm2UV-A处理的人真皮成纤维细胞(hDFi2)；人齿龈成纤维细胞条件培养基中的hDFi2(cmhGF)；以及人真皮成纤维细胞条件培养基中的hDFi2(cmhDF)。
发明详述
本文中，“皮肤老化”涉及由于长期因素(如机械、氧化和/或光照胁迫)造成的皮肤组分降解所引起的皮肤缺陷。
特别地，皮肤老化可以是时间性老化和/或光老化的结果。“时间性老化”涉及年龄引起的皮肤缺陷。“光老化”涉及由于皮肤暴露于光(特别是UV射线，更特别地是UV-A射线)造成的皮肤缺陷。
特别地，皮肤缺陷可以是皱纹或皮肤弹性丧失。所降解的皮肤组分可以是弹性蛋白和/或胶原蛋白。本发明的方法可用于提高真皮内这两种组分的合成。
优选地，本发明的方法用于预防或治疗面部皮肤老化。
优选地，所述个体是哺乳动物，更优选地是人。
用于获取、培养和保存齿龈成纤维细胞的方法对于本领域技术人员是公知的，特别是在Naveau等(2006)J.Periodontol.77：238-47和Gogly等(2007)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.27：1984-90中有所描述。
有利地，齿龈成纤维细胞容易取样和培养。此外，齿龈成纤维细胞扩增速率高。
优选地，本发明方法中使用的齿龈成纤维细胞为自体的，即它们取自将要施用齿龈成纤维细胞来源之产品的个体。
有利地，齿龈成纤维细胞提供了几乎无限来源的自体成纤维细胞。此外，在老化的皮肤中，通常仍可获得能进行培养的自体齿龈成纤维细胞，但是，相比之下，能进行培养的自体真皮成纤维细胞的来源很少。
然而，齿龈成纤维细胞也可以是同种异体的，即取自同一物种的另一个体，或者是异种的，即取自另一物种的另一个体。
本文中，“齿龈成纤维细胞来源的产品”涉及能够从齿龈成纤维细胞本身获得的任何产品，或者含有齿龈成纤维细胞分泌物的任何产品。例如，优选地，齿龈成纤维细胞来源的产品选自齿龈成纤维细胞全细胞、齿龈成纤维细胞培养物、齿龈成纤维细胞提取物和齿龈成纤维细胞条件培养基。
齿龈成纤维细胞提取物可以通过现有技术中已知的任何细胞破碎方法获得。
齿龈成纤维细胞条件培养基涉及齿龈成纤维细胞接触过的任何培养基，例如液体细胞培养基，特别是接触足以使齿龈成纤维细胞在培养基中进行分泌的时间。
齿龈成纤维细胞来源之产品的施用(优选在临近待处理之皮肤区域的部位)可以通过现有技术中已知的任何方法进行。但是，优选局部或通过皮内注射施用齿龈成纤维细胞来源的产品。这样的施用途径是本领域技术人员公知的，在Weiss等(2007)Dermatol.Surg.33：263-8中有清楚的描述。
优选地，本发明的方法包括下列步骤：
-从个体中获取齿龈成纤维细胞；
-培养所述齿龈成纤维细胞；
-从所培养的齿龈成纤维细胞获得齿龈成纤维细胞来源的产品；
-将所述齿龈成纤维细胞来源的产品施用于个体。
所有引用的参考文献都通过引用并入本文中。
实施例
方法
1.细胞培养
从健康患者(20-30岁)的齿龈和真皮外植体中获得5种人齿龈成纤维细胞(hGF)和3种真皮成纤维细胞(hDF)培养物。建立原代外植体培养物，使用第3～5代。
制备hGF或hDF条件培养基
从铺满hGF和hDF培养物的75cm2培养瓶中弃去培养基(DMEM/FCS)。然后，加入24ml DMEM，24小时后回收。继而，将条件培养基冻存备用。
细胞的制备
将来自两个铺满的25cm2培养瓶中的hDF接种到3个12孔培养板中。当细胞铺满后(每孔150,000个细胞)，两个培养板分别用7.5和15焦耳/cm2的UVA照射，第3个板用作对照，以检查未经照射时不存在MMP-9。
照射后，更换培养基。对于每个培养瓶，加入下列培养基：
-向4个孔中仅加入DMEM(每孔1ml)
-向4个孔中加入hGF条件培养基(每孔1ml)
-向4个孔中加入hDF条件培养基(每孔1ml)
24小时后收集培养基，分装并保存在-80℃，以备进一步的蛋白质分泌物分析。将细胞固定于孔中，用GIEMSA染色。
2.MMP-9和TIMP-1分泌分析
明胶酶谱分析(MMP-9)
对20μl培养基进行明胶酶谱分析。为了利于鉴定MMP类型，将10μl pro-MMP-9(92kDa)和10μl pro-MMP-2(72kDa)(10ng)(BC058和BC057；ABCys)在同一凝胶上跑胶。此外，将与APMA(2mM)于37℃一起孵育1小时的10μl pro-MMP-9平行跑胶，以指示MMP-9的位置。
点印迹(MMP-9和TIMP-1)
将10μl培养基施加到硝酸纤维素膜上。然后，用1/500稀释的抗MMP-9(游离形式)和抗TIMP-1(分别为IM37和IM32；Calbiochem)的小鼠单克隆第一抗体处理膜。用TBS/Tween(50mM Tris，150mM NaCl，0.1％Tween 20，pH 7.5)清洗后，将过氧化物酶标记的山羊抗小鼠第二抗体(1/1000，DC08L；Calbiochem)与膜一起孵育1小时。利用KodakBiomax MR胶片使免疫反应蛋白显影。使用Image J软件(Image J；http:/rsb.info.nih.gov/ij/index.html)对印迹的尺寸(表面面积)和灰度进行分析。通过与10pg MMP-9或TIMP-1标准品(分别为PF140和PF019；Calbiochem)进行比较来确定浓度。
利用ELISA(DMP900和DTM100；R&D Systems)进行游离MMP-9和TIMP-1的补充定量分析。
使用配对Student’s t-检验进行不同实验之间的统计学分析。
3.MMP-9/TIMP-1复合物测定
使用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)(DY1449；R&D Systems)对总的人MMP-9/TIMP-1复合物进行定量。
结果
1.来自人齿龈成纤维细胞的条件培养基抑制来自UV照射之人真皮成纤维细胞的MMP-9。
图1显示人真皮成纤维细胞(hDF)不产生MMP-9，而经过7.5焦耳/cm2(hDFi1)或15焦耳/cm2(hDFi2)UV-A的照射时除外。人齿龈成纤维细胞条件培养基(cmhGF)使UV处理的真皮成纤维细胞的MMP-9产生减少了50％，而人真皮成纤维细胞条件培养基(cmhDF)仅使MMP-9产生减少了15％。
2.人齿龈成纤维细胞比人真皮成纤维细胞产生更多的TIMP-1(MMP-9组织抑制因子)。
图2显示，无论照射与否，hGF条件培养基都比hDF条件培养基含有的TIMP-1至少多3倍。
3.在人齿龈成纤维细胞存在下，MMP-9/TIMP-1复合物的量增加。
图3显示，在cmhGF存在下TIMP-1/MMP-9复合物的量是cmhDF存在下的两倍。

Claims (9)

1.在个体中对皮肤老化进行美容性预防或治疗的方法，其包括对所述个体施用美容活性量的齿龈成纤维细胞来源的产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中皮肤老化是时间性老化和/或光老化的结果。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其用于美容性预防或治疗皱纹或皮肤弹性丧失。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其用于预防或治疗面部皮肤老化。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其用于增加真皮中弹性蛋白和/或胶原蛋白的合成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述齿龈成纤维细胞来源的产品局部施用或通过真皮内注射施用。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述齿龈成纤维细胞来源的产品选自齿龈成纤维细胞全细胞、齿龈成纤维细胞培养物、齿龈成纤维细胞提取物和齿龈成纤维细胞条件培养基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述齿龈成纤维细胞来源的产品从取自所述个体的齿龈成纤维细胞中获取。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其包括：
-从所述个体中获取齿龈成纤维细胞；
-培养所述齿龈成纤维细胞；
-从所培养的齿龈成纤维细胞获得齿龈成纤维细胞来源的产品；
-将所述齿龈成纤维细胞来源的产品施用于所述个体。
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