JP2017014277A - 皮膚の老化の美容的処置法 - Google Patents
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Abstract
【課題】個体における皮膚の老化の予防又は処置、特に美容的予防又は処置における使用のための歯肉線維芽細胞由来産生物の提供。【解決手段】歯肉線維芽細胞自体から得られるか又は歯肉線維芽細胞分泌物を含む任意の産生物。【選択図】なし
Description
本発明は、参照により本明細書中に援用される、2008年3月31日出願の米国仮出願第61/040,891号の利益を主張する。
皮膚の老化では、細胞外マトリックス(ECM)の合成と、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)によるその分解との間のバランスに不均衡が生じる。不均衡は、細胞外マトリックスの過剰な分解、皮膚の老化の特徴をもたらす(Cauchard & Hornebec(2004)Vivant 5)。皮膚の老化は、皺の数と深さの増加、真皮の巨大分子(例えば、コラーゲン及びエラスチン)の分解の直接の結果に関連している。
真皮では、実年齢及び光誘導の加齢を引き起こすMMP過剰生産は、酸化されたフリーラジカルによって刺激される。その上、太陽に晒された皮膚領域、例えば、顔の皮膚においては、UV線の他の有害効果が生じ、特に、不完全なコラーゲン合成、皮膚色素沈着、及び太陽弾性線維症(皮膚の弾性格子の崩壊として示される)が挙げられる。さらに、インビトロの試験によって、MMPがUV線処理を受けた皮膚線維芽細胞によって過剰生産される(Brennan et al.(2003)Photochem.Photobiol.78:43−48)。
コラゲナーゼ1及び3(MMP−1及びMMP−13)、並びにMT1−MMP(MMP−14)はコラーゲンを分解し、ゼラチナーゼA及びB(MMP−2及びMMP−9)はエラスチンを分解する。他のメタロプロテイナーゼ、例えば、ストロメライシン1(MMP−3)はコラーゲンとエラスチン分解の両方に関与する。
真皮線維芽細胞は、皮膚の老化の処置の骨組みに使用されてきた(Weiss et al.(2007)Dermatol Surg.33:263−8)。コラーゲン格子の増加は、深い皺に自己の真皮線維芽細胞(2,000万個/ml)を注射された215の対象において観察された。皺の改善は、注射後の1年で、対象の80%でなおも明確に見ることができた。
歯肉線維芽細胞は、歯肉の軟結合組織内で移動、接着及び増殖し、機械的ストレス、細菌感染、又はpH及び温度変化などの多数の攻撃に晒される歯肉組織の完全性を維持することができる間葉細胞である。歯肉線維芽細胞は、特に、Gogly et al.,(1997)Clin.Oral Invest.1:147−152;Gogly et al.(1998)Biochem.Pharmacol.56:1447−1454;and Ejeil et al.(2003)J.Periodontol.74:188−195に記載されている。
環境条件に依存して、歯肉線維芽細胞は、それらの表現型を変化させ、増殖、移動、マトリックス成分及びマトリックス関連酵素の合成に応答することができる。
歯肉線維芽細胞は、コラーゲン(例えば、I、III、V、VI、VII、XII型)、弾性線維(オキシタラン、エラウニン及びエラスチン)、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカン(例えば、デコリン、バイグリカン)、及び糖タンパク質(例えば、フィブロネクチン、テネイシン)を合成する。同時に、歯肉線維芽細胞は、巨大分子成分(マトリックスメタロプロテイナーゼ;MMP)を分解され得る酵素、さらにMMPの活性型を阻害する酵素(メタロプロテイナーゼの阻害剤;TIMP)を合成する。このようにして、歯肉線維芽細胞は細胞外マトリックスリモデリングの重要な作用因子である。
本発明は、本発明者らによって、歯肉線維芽細胞が、UV処理された皮膚線維芽細胞を起源とするMMP活性を阻害するための皮膚線維芽細胞よりも適しているという予期せぬ見解から生じている。
したがって、本発明は、個体における皮膚の老化の美容的予防及び処置のための方法であって、美容的に活性な量の歯肉線維芽細胞由来産生物を該個体に投与することを含む方法に関する。
また、本発明は、個体における皮膚の老化の予防又は処置、特に美容的予防又は処置における使用のための歯肉線維芽細胞由来産生物に関する。
本明細書中で意図するとき、「皮膚の老化」は、慢性的因子、例えば、機械的、酸化的、及び/又は光ストレスにより、皮膚成分の崩壊の結果として生じる皮膚欠陥に関する。
特に、皮膚の老化は、実年齢及び/又は光による老化の結果であり得る。「実年齢」とは、加齢の結果として生じる皮膚欠陥を指す。「光による老化」とは、光、特にUV線、より具体的にはUV−A線への皮膚被曝の結果として生じる皮膚欠陥を指す。
皮膚欠陥は、顕著には皺又は皮膚弾力性の欠損であり得る。崩壊した皮膚成分は、本発明に係る方法が真皮内での合成の増大に有用であるエラスチン及び/又はコラーゲンであり得る。
好ましくは、本発明の方法は、顔の皮膚の老化の予防又は処置のためである。
好ましくは、個体は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
歯肉線維芽細胞を採取し、培養し、保存する手法は当業者に周知であり、特に、Naveau et al.(2006)J.Periodontol.77:238−47 and in Gogly et al.(2007)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.27:1984−90に記載されている。
好都合には、歯肉線維芽細胞は容易にサンプリングされ、培養される。さらに、歯肉線維芽細胞は高い増殖率を有する。
好ましくは、本発明に係る方法に使用される歯肉線維芽細胞は自家性であり、即ち、それらが個体から採取され、歯肉線維芽細胞由来産生物がその個体に投与されることを意図する。
好都合には、歯肉線維芽細胞は、ほとんど制限のない供給源自己線維芽細胞を提供する。さらに、加齢した皮膚の場合、培養成分自家性歯肉線維芽細胞は、通常、なおも利用可能であり、一方、対照的に、培養成分自家性皮膚線維芽細胞の供給源は多くない。
しかしながら、歯肉線維芽細胞はまた、同じ種の別の個体から採取される同種であってもよく、又は別の種の別の個体から採取される異種であってもよい。
本明細書中で意図されるとき、「歯肉線維芽細胞由来産生物」とは、歯肉線維芽細胞自体から得られるか又は歯肉線維芽細胞分泌物を含む任意の産生物を指す。例えば、歯肉線維芽細胞由来産生物は、歯肉線維芽細胞の細胞全体、歯肉線維芽細胞培養物、歯肉線維芽細胞抽出物、及び歯肉線維芽細胞培養上清からなる群から選択されることが好ましい。
歯肉線維芽細胞抽出物は、当該技術分野において知られている任意の細胞フラグメンテーション法によって得ることができる。
歯肉線維芽細胞の培養上清は、液体細胞培地などの任意の培地を指し、特に歯肉線維芽細胞が培地中に分泌するのに十分な時間、歯肉線維芽細胞によって接触されている。
好ましくは処置されるべき皮膚近傍の部位への歯肉線維芽細胞由来産生物の投与は、当該技術分野において知られている任意の方法によって行なうことができる。しかしながら、歯肉線維芽細胞由来産生物は、局所的又は皮内注射によって投与されることが好ましい。このような投与経路は当業者に十分に知られ、顕著には、Weiss et al.(2007)Dermatol Surg.33:263−8)に記載されている。
好ましくは、本発明に係る方法は、以下:
−個体から歯肉線維芽細胞を採取し;
−歯肉線維芽細胞を培養し;
−培養歯肉線維芽細胞から歯肉線維芽細胞由来産物を得て;
−歯肉線維芽細胞由来産物を個体に投与する
工程を含む。
−個体から歯肉線維芽細胞を採取し;
−歯肉線維芽細胞を培養し;
−培養歯肉線維芽細胞から歯肉線維芽細胞由来産物を得て;
−歯肉線維芽細胞由来産物を個体に投与する
工程を含む。
引用された引用文献全ては、参照により本明細書中に援用される。
方法
1.細胞培養
5つのヒト歯肉線維芽細胞(hGF)及び3つの皮膚線維芽細胞(hDF)培養物を、健常な患者(20〜30歳)の歯肉及び皮膚外植片から得た。初代外植片培養物を確立し、3〜5経代を使用した。
1.細胞培養
5つのヒト歯肉線維芽細胞(hGF)及び3つの皮膚線維芽細胞(hDF)培養物を、健常な患者(20〜30歳)の歯肉及び皮膚外植片から得た。初代外植片培養物を確立し、3〜5経代を使用した。
hGF又はhDR培養上清の調製
コンフルエントなhGF及びhDF培養物の75cm2フラスコから培地(DMEM/FCS)を捨てた。次に、24mlのDMEMを添加し、24時間後に回収した。その後、培養上清を使用するまで凍結した。
コンフルエントなhGF及びhDF培養物の75cm2フラスコから培地(DMEM/FCS)を捨てた。次に、24mlのDMEMを添加し、24時間後に回収した。その後、培養上清を使用するまで凍結した。
細胞調製
3つの12ウェルプレートを、コンフルエントの2つの25cm2フラスコからのhDFで播種した。濃度(150,000細胞/ウェル)が到達した場合、2プレートをそれぞれ7.5及び15ジュール/cm2でUVA照射し、3番目のプレートを対照として使用し、照射なしでのMMP−9の不存在についてチェックした。
3つの12ウェルプレートを、コンフルエントの2つの25cm2フラスコからのhDFで播種した。濃度(150,000細胞/ウェル)が到達した場合、2プレートをそれぞれ7.5及び15ジュール/cm2でUVA照射し、3番目のプレートを対照として使用し、照射なしでのMMP−9の不存在についてチェックした。
培地を照射後に交換した。各フラスコについて、以下の培地:
−4ウェルに対してのみDMEM(1ml/ウェル)
−4ウェルに対してhGF培養上清(1ml/ウェル)
−4ウェルに対してhDF培養上清(1ml/ウェル)
を添加した。
−4ウェルに対してのみDMEM(1ml/ウェル)
−4ウェルに対してhGF培養上清(1ml/ウェル)
−4ウェルに対してhDF培養上清(1ml/ウェル)
を添加した。
次に、24時間後に培地を回収し、分注し、さらにタンパク質選択分析のために−80℃で保存した。細胞をウェル中で固定し、GIEMSA染色した。
2.MMP−9及びTIMP−1分泌分析
ゼラチンザイモグラフィー(MMP−9)
ゼラチンザイモグラフィーを、20μlの培地で行なった。10μlのプロMMP−9(92kDa)及び10μlのプロMMP−2(72kDa)(10ng)(BC058及びBC057;ABCys)を、MMP型の同定を促進するために同一ゲル上で行なった。さらに、37℃で1時間、APMA(2mM)とともにインキュベートした10μlのプロMMP−9を、MMP−9位置を視覚化するために並行して行なった。
ゼラチンザイモグラフィー(MMP−9)
ゼラチンザイモグラフィーを、20μlの培地で行なった。10μlのプロMMP−9(92kDa)及び10μlのプロMMP−2(72kDa)(10ng)(BC058及びBC057;ABCys)を、MMP型の同定を促進するために同一ゲル上で行なった。さらに、37℃で1時間、APMA(2mM)とともにインキュベートした10μlのプロMMP−9を、MMP−9位置を視覚化するために並行して行なった。
ドットブロッティング(MMP−9及びTIMP−1)
10μlの培地をニトロセルロースメンブレンに適用した。次に、メンブレンを、一次抗MMP−9(遊離型)及び抗TIMP−1(それぞれIM37及びIM32;Calbiochem)モノクローナルマウス抗体(1/500希釈)で処理した。TBS/Tween(50mM Tris、150mM NaCl、0.1%Tween20、pH7.5)中で洗浄後、メンブレンを、ペルオキシダーゼ標識された抗マウス二次抗体(1/1000、DC08L;Calbiochem)とともに1時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質をKodak Biomax MRフィルム上で視覚化した。ブロットの大きさ(表面積)及びグレイ強度を、Image Jソフトウェア(Image J;http:/rsb. info. nih.gov/ij/index. html)を用いて分析した。濃度を、10pg MMP−9又はTIMP−1標準(それぞれPF140及びPF019;Calbiochem)との比較によって決定した。
10μlの培地をニトロセルロースメンブレンに適用した。次に、メンブレンを、一次抗MMP−9(遊離型)及び抗TIMP−1(それぞれIM37及びIM32;Calbiochem)モノクローナルマウス抗体(1/500希釈)で処理した。TBS/Tween(50mM Tris、150mM NaCl、0.1%Tween20、pH7.5)中で洗浄後、メンブレンを、ペルオキシダーゼ標識された抗マウス二次抗体(1/1000、DC08L;Calbiochem)とともに1時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質をKodak Biomax MRフィルム上で視覚化した。ブロットの大きさ(表面積)及びグレイ強度を、Image Jソフトウェア(Image J;http:/rsb. info. nih.gov/ij/index. html)を用いて分析した。濃度を、10pg MMP−9又はTIMP−1標準(それぞれPF140及びPF019;Calbiochem)との比較によって決定した。
遊離MMP−9及びTIMP−1の相補定量的分析を、ELISAによって行った(DMP900及びDTM100;R&D Systems)。
種々の実験間の統計分析を、対応のあるステューデントt−検定を用いて行なった。
3.MMP−9/TIMP−1複合体確定
全ヒトMMP−9/TIMP−1複合体を、酵素免疫測定吸着法キット(ELISA)(DY1449;R&D Systems)を用いて定量した。
全ヒトMMP−9/TIMP−1複合体を、酵素免疫測定吸着法キット(ELISA)(DY1449;R&D Systems)を用いて定量した。
結果
1.ヒト歯肉線維芽細胞由来の培養上清は、UV照射されたヒト皮膚線維芽細胞からのMMP−9を阻害する。
図1は、ヒト皮膚線維芽細胞(hDF)が7.5ジュール/cm2(hDFi1)又は15ジュール/cm2(hDFi2)による照射後を除いて、MMP−9を産生しないことを示す。ヒト歯肉線維芽細胞の培養上清(cmhGF)は、UV処理された皮膚線維芽細胞によるMMP−9産生を50%まで減少させ、一方、ヒト皮膚線維芽細胞の培養上清(cmhDF)は、たった15%によってMMP−9産生を減少させた。
1.ヒト歯肉線維芽細胞由来の培養上清は、UV照射されたヒト皮膚線維芽細胞からのMMP−9を阻害する。
図1は、ヒト皮膚線維芽細胞(hDF)が7.5ジュール/cm2(hDFi1)又は15ジュール/cm2(hDFi2)による照射後を除いて、MMP−9を産生しないことを示す。ヒト歯肉線維芽細胞の培養上清(cmhGF)は、UV処理された皮膚線維芽細胞によるMMP−9産生を50%まで減少させ、一方、ヒト皮膚線維芽細胞の培養上清(cmhDF)は、たった15%によってMMP−9産生を減少させた。
2.ヒト歯肉線維芽細胞はヒト皮膚線維芽細胞よりも多くのTIMP−1(MMP−9組織阻害因子)を産生する
図2は、培養上清は、照射された場合又は照射されない場合でhDFよりも少なくとも3倍を超えるTIMP−1を含んでいることを示す。
図2は、培養上清は、照射された場合又は照射されない場合でhDFよりも少なくとも3倍を超えるTIMP−1を含んでいることを示す。
3.ヒト歯肉線維芽細胞の存在下でのMMP−9/TIMP−1複合体の量の増加
図3は、TIMP−1/MMP−9複合体の量がcmhDF存在下と比較して、cmhGFの存在下で重要であることを示す。
図3は、TIMP−1/MMP−9複合体の量がcmhDF存在下と比較して、cmhGFの存在下で重要であることを示す。
Claims (9)
- 個体における皮膚の老化の美容的予防又は処置のための方法であって、美容的に活性な量の歯肉線維芽細胞由来産生物を前記個体に投与することを含む方法。
- 皮膚の老化が実年齢及び/又は光による老化の結果である、請求項1に記載の方法。
- 皺又は肌の弾力性喪失を美容的に予防し又は処置するための請求項1又は2に記載の方法。
- 顔の皮膚の老化を予防し又は処置するための請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 真皮内でエラスチン及び/又はコラーゲン合成を増加させるための請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、前記個体に局所的に又は皮内注射によって投与される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、歯肉線維芽細胞全体、歯肉線維芽細胞培養物、歯肉線維芽細胞抽出物、及び歯肉線維芽細胞培養上清からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記歯肉線維芽細胞由来産生物が、前記個体から採取された歯肉線維芽細胞から得られる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- −個体から歯肉線維芽細胞を採取し;
−歯肉線維芽細胞を培養し;
−培養歯肉線維芽細胞から歯肉線維芽細胞由来産生物を得て;
−歯肉線維芽細胞由来産生物を個体に投与する
ことを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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