CN102004091B - 荧光图像产生方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光图像产生方法、荧光图像产生设备及荧光图像产生程序。提供了产生与生物样品相关的图像的方法和设备。基于第一荧光材料的荧光在生物样品上聚焦生物样品，并且，基于第二荧光材料的荧光捕获图像。还提供一种计算机可读存储装置，存储使数据处理单元工作的指令。

Description

荧光图像产生方法和设备
相关申请的参考 
本申请要求2009年8月31日向日本专利局提交的日本优先专利申请JP 2009-200890的优先权，其全部内容结合于此以供参考。 
技术领域
本申请涉及荧光图像产生方法、荧光图像产生设备和荧光图像产生程序，例如，适合用于观察组织切片领域。 
背景技术
通常，在病理学领域，在生物样品使用之前将其固定至底基(例如，载玻片)并且以预定方式对生物样品染色。 
在病理诊断中，首先用通过在组织切片上执行苏木素-伊红(HE)染色或在分泌物细胞上执行巴氏染色而形成的样品从形态学的角度来确定恶性肿瘤的存在。如果发现恶性肿瘤或具有恶性肿瘤的可疑位置，然后用通过在组织切片或分泌物细胞上执行荧光染色而形成的样品，从分子生物学角度来确定恶性肿瘤的存在、类型和阶段。 
在这种样品储存较长的时间后，通常，出现质量变差和生物样品变色，并且，生物样品在显微镜下的可见度也降低。因为有时在 除了产生样品的机构(例如医院)以外的实验室中诊断这种样品，所以通常用邮件发送生物样品，这花费一定的时间。 
考虑到这种情况，提出一种用于以图像数据的形式储存生物样品的设备(例如，见日本未审查的专利申请No.2003-222801)。 
顺便说一句，在获得放大至预定比例的整个生物样品的图像的情况中，难以对成像表面形成完整图像，因此，通常使用这样的技术：对生物样品切片并且将切片部分的放大部分连接在一起。因为此技术包括相对于样品的每个部分移动镜台以在样品上聚焦的步骤，所以花费更长的时间来连接各部分的放大部分。 
发明内容
然而，在连接样品部分(执行了荧光染色)的放大图像的情况中，由于花费更长的时间来连接各部分的放大部分，所以，不仅使标记到靶的荧光材料的变色加速，而且使生物样品负担过大。 
另一方面，不将执行了荧光染色的样品作为图像，因为其在未激发状态是透明和无色的，因此，难以基于图像的对比度在图像上聚焦。 
因此，期望提供荧光图像获取方法、荧光图像获取设备和荧光图像获取程序，其能够在图像上聚焦，而不会使标记到靶的荧光材料的变色加速或者不会使生物样品负担过大。 
在一个实施方式中，提供一种产生与生物样品相关的图像的方法。该方法包括基于第一荧光材料的荧光在生物样品上聚焦，其中，用第一荧光材料和第二荧光材料对生物样品染色；并且，基于第二荧光材料的荧光捕获图像，其中，第一和第二荧光材料具有不同的激发波长。 
在一个实施方式中，在暗场成像模式下产生图像。 
在一个实施方式中，在暗场成像模式和明场成像模式下产生图像。 
在一个实施方式中，将图像捕获为完整图像。 
在一个实施方式中，将图像捕获为部分图像。 
在一个实施方式中，将图像捕获为多个部分图像，所述多个部分图像被连接以形成图像。 
在一个实施方式中，由包括对聚焦和捕获的控制的数据处理单元控制图像产生。 
在一个实施方式中，在聚焦之后，由数据处理单元驱动激发光源，以启动图像捕获。 
在一个实施方式中，在预定位置聚焦生物样品的一部分。 
在一个实施方式中，在可变位置聚焦生物样品的一部分。 
在另一实施方式中，提供一种产生与生物样品相关的图像的设备。该设备包括：基部单元，被配置为容纳用具有不同激发波长的第一荧光材料和第二荧光材料染色的生物样品；第一光源，被配置为照射生物样品从而允许基于第一荧光材料的荧光聚焦生物样品；以及第二光源，被配置为照射生物样品从而允许基于第二荧光材料的荧光捕获图像。 
在一个实施方式中，该设备进一步包括数据处理单元，被配置为用于控制图像产生，包括与基部单元、第一光源和第二光源通信。 
在一个实施方式中，数据处理单元停止驱动第一光源，并开始驱动第二光源，以启动图像捕获。 
在另一实施方式中，提供了计算机可读存储装置，用于储存指令使数据处理单元工作，从而基于第一荧光材料的荧光而在生物样品上聚焦，其中，用第一荧光材料和第二荧光材料对生物样品染色；并基于第二荧光材料的荧光捕获与生物样品相关的图像，其中，第一和第二荧光材料具有不同的激发波长。 
在又一实施方式中，提供一种产生与生物样品相关的图像的方法。该方法包括以第一激发波长照射生物样品；在生物样品上聚焦；以第二激发波长照射生物样品；并捕获与生物样品相关的图像。 
在又一实施方式中，提供一种产生与生物样品相关的图像的设备。该设备包括第一光源，被配置为以第一激发波长照射生物样品从而允许对生物样品进行聚焦；和第二光源，被配置为以第二激发波长照射生物样品从而允许捕获图像。 
根据一个实施方式，当获取聚焦对象的暗场图像时，使用用于将被标记至用于复染色的对照(其含量超过靶)的荧光材料的激发光照射样品部分，并且，当获取记录对象的暗场图像时，使用用于将被标记至靶的荧光材料的激发光照射样品部分。 
因此，可以使用将被标记至用于复染色的对照(其含量超过靶)的荧光材料的样品部分的图像来调节焦距，而不会使将被标记至靶的荧光材料发光。结果，能够调节焦距，而不会使将被标记至靶的荧光材料的变色加速或者不会使生物样品负担过多。 
这里描述了其它特征和优点，并且，从以下详细描述和附图，这些特征和优点将是显而易见的。 
附图说明
图1示意性地示出了生物样品图像获取设备的构成； 
图2示意性地示出了荧光图像； 
图3是示出了数据处理单元的构成的框图； 
图4是示出了执行明场成像模式的中央处理器(CPU)的功能构成的框图； 
图5是示出了明场完整图像的照片； 
图6是用于说明生物样品的成像区域的分配的示意图； 
图7是示出了执行暗场成像模式的中央处理器(CPU)的功能构成的框图； 
图8是示出了对照标记的暗场部分图像的照片； 
图9A和图9B是示出了用作聚焦对象的图像的实例的示意图； 
图10是示出了对照标记和荧光标记的暗场部分图像的照片； 
图11是示出了暗场图像获取过程的流程图； 
图12示意性地示出了根据另一实施方式的对照标记激发光源的配置； 
图13示意性地示出了根据又一实施方式的对照标记激发光源的另一配置。 
具体实施方式
将在下面参照根据一个实施方式的附图更详细地说明本申请。 
1.实施方式 
1-1.生物样品图像获取设备的构成 
1-2.显微镜的构成 
1-3.数据处理单元的构成 
1-4.明场成像模式的具体处理 
1-5.暗场成像模式的具体处理 
1-6.暗场成像模式中的图像获取处理 
1-7.效果 
2.其它实施方式 
1.实施方式 
1-1.生物样品图像获取设备的构成 
图1示出了根据一个实施方式的生物样品图像获取设备1。生物样品图像获取设备1包括显微镜10和数据处理单元20。 
1-2.显微镜的构成 
显微镜10包括镜台(下面也称为可移动镜台)31，其可在平行于和垂直于载片SG(例如，载玻片)放置于其上的平面(在下面也称为载片放置平面)的所有方向(x轴、y轴和z轴方向)上移动。在载片放置平面上设置载片支架32。 
当设置载片SG时，将载片支架32移动至被指定为设置位置(在下面也称为载片设置位置)的位置。在载片设置位置，将包含在载片容器(未示出)中的载片SG移出，并用载片设置机构(未示出)将其设置在载片支架32中。 
通过预定的固定技术将包括诸如血液的结缔组织、上皮组织或这二者的组织切片或分泌细胞作为生物样品SPL固定至包含在载片容器(未示出)中的载片SG，如果必须的话进行染色。 
染色不仅包括以苏木素-伊红(HE)染色、吉姆萨染色和巴式染色为代表的典型的染色技术，而且包括以荧光原地杂化(FISH)和酶抗体技术为代表的荧光染色技术。 
除了施加至探针的荧光标志(下面也称为荧光标记)以外，荧光染色技术通常使用另一种与探针上的荧光标记进行对比的荧光标志(在下面也称为对照标记)。 
对照标记的激发波长不同于与荧光标记的激发波长。例如，该激发波长可以是大约365nm，并且，通常使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。通过DAPI，与荧光标记的靶对比的靶(在下面也称为对照靶)是细胞核。 
当获取生物样品SPL的图像时，将载片支架32移动至被指定为用于显微检查的位置(在下面也称为显微位置)。在此情况中，执行明场成像模式或暗场成像模式。 
在明场成像模式的情况中，从明场光源41发出照明光，到达生物样品SPL。照明光由反射镜42反射，通过明场滤光片43作为可见光照射在显微位置中的生物样品SPL上，然后到达物镜44。 
物镜44的放大率低至能够形成整个生物样品SPL的图像(下面也称为明场完整图像)，或者高至能够仅形成部分生物样品SPL的图像(在下面也称为明场部分图像)。 
在用物镜44和成像透镜45放大图像之后，显微镜10将通过成像装置46的成像表面上的照明光而获得的生物样品SPL的图像形成为明场完整图像或明场部分图像。 
如上所述，将显微镜10被配置为在明场成像模式中获得生物样品SPL的完整的或部分的明场图像(明场完整图像或明场部分图像)。 
在图1中，在物镜44和成像透镜45之间的光路上具有分色镜54和发射滤光片(emission filter)55。然而，在明场成像模式的情况中，从光路移开分色镜54和发射滤光片55，使得通过明场滤光片43进入的可见光不被分色镜和滤光片吸收或反射。 
另一方面，在暗场成像模式的情况中，激发探针上的荧光标记和对照标记的光(在下面也称为激发光)从激发光源51发出。当发出激发光时的物镜44的放大率高至能够形成生物样品SPL的荧光图像的一部分(下面也称为暗场部分图像)。 
准直透镜52使得从激发光源51发出的激发光成为平行光束，并且，激发滤光片53消除除了激发光以外的光。透过激发滤光片53的激发光被分色镜54反射，然后由物镜44在显微位置上聚焦。 
当探针结合至显微位置的生物样品SPL的靶和对照靶时，施加至探针的荧光标记和对照标记由激发光产生荧光。荧光经由物镜44透过分色镜54，并在除了荧光材料的荧光以外的光被发射滤光片55吸收之后到达成像透镜45。 
显微镜10用物镜44和成像透镜45放大通过荧光标记和对照标记的荧光而获得的图像，并在成像装置46的成像表面上形成放大的图像作为暗场部分图像。 
如上所述，将显微镜10被配置用于在暗场成像模式下获得样品部分的荧光图像(暗场部分图像)。 
虽然图1示出了激发滤光片53和分色镜54之间的光路上的分色镜63，但是分色镜63透射透过激发滤光片53的激发光。 
图2示出了生物样品SPL的荧光图像的一个实例(暗场部分图像)。使用由Abbott Loboratories生产的被称为PathVysionHER-2DNA探针试剂盒的试剂，通过FISH技术染色乳腺组织来获得图2所示的图像。 
图2中的箭头所指示的点代表荧光标记，具体是施加至用于编码HER2蛋白质的HER2/neu基因的探针的荧光标记。图2中的具有阴影的集中区域代表形成与HE染色的组织的外形基本上一致的外形的对照标记。 
虽然试剂包括用于第17染色体的着丝点区域中的α随体DNA序列的探针和用于HER2/neu基因的探针的荧光标记，但是，为了方便起见，在图2中省略了所述荧光标记。 
除了上述构成外，显微镜10还包括被配置为发出激发对照标记而不激发荧光标记的激发光(在下面也称为对照标记专用激发光)的光源(下面也称为对照标记激发光源)61。 
当获取生物样品SPL的暗场部分图像时，在聚焦过程中从对照标记激发光源61发出对照标记专用激发光。 
从对照标记激发光源61发出的对照标记专用激发光由准直透镜62变为平行光束，由分色镜63和分色镜54反射，然后由物镜44在显微位置上聚焦。 
当探针结合至在显微位置的生物样品SPL的对照靶时，施加至探针的对照标记通过对照标记专用激发光产生荧光。荧光经由物镜44透过分色镜54，并在除了荧光材料的荧光以外的光被发射滤光片55吸收之后到达成像透镜45。 
显微镜10用物镜44和成像透镜45放大通过对照标记的荧光而获得的图像，并在成像装置46的成像表面上形成放大的图像作为暗场部分图像。 
数据处理单元20基于暗场部分图像控制可移动镜台31，使得聚焦相应的样品部分。此外，当聚焦样品部分后，数据处理单元20使激发光源51代替对照标记激发光源61发出激发光，并储存用激发光获得的暗场部分图像。 
如上所述，生物样品图像获取设备1被配置为用对照标记专用激发光获得暗场部分图像，作为聚焦对象的暗场部分图像，并用激发光获得暗场部分图像，作为记录对象的暗场部分图像。 
1-3.数据处理单元的构成 
下面说明数据处理单元20的构成。如图3所示，数据处理单元20包括中央处理器(CPU)71，其执行各种控制和各种类型的连接至CPU 71的硬件。 
具体地，只读存储器(ROM)72、用作CPU 71的工作存储器的随机存取存储器(RAM)73、输入与用户操作相应的命令的操作输入单元74、接口75、显示单元76和存储单元77经由总线78与CPU 71连接。 
ROM 72存储用于执行各种处理的计算机程序。接口75与显微镜10(可移动镜台31的驱动系统，光源41、51、61，成像装置46，物镜44和发射滤光片55)连接。 
可使用液晶显示器、电致发光(EL)显示器或等离子体显示器作为显示单元76。可使用诸如硬盘(HD)的磁盘、半导体存储器或光盘作为存储单元77。或者，可使用便携存储器，例如，通用串行总线(USB)存储器和闪存(CF)存储器。 
CPU 71从存储在ROM 72中的多个计算机程序中加载与由操作输入单元74提供的命令相应的计算机程序至RAM 73，并根据加载的程序控制显示单元76和存储单元77。 
CPU 71还被配置为根据加载的程序经由接口75控制显微镜10的每个单元。 
1-4.明场成像模式的具体处理 
当CPU 71从操作输入单元24接收明场成像模式的执行命令时，CPU 71将与成像模式相应的计算机程序加载至RAM 23。 
在此情况中，根据与明场成像模式相应的计算机程序，CPU 71用作载片设置控制单元81、明场图像获取单元82和数据记录单元83，如图4所示。 
当载片设置控制单元81接收成像模式的执行命令或应该更换明场图像获取单元82或载片的通知时，载片设置控制单元81驱动可移动镜台31并将载片支架32定位在载片设置位置。 
在将载片支架32定位在载片设置位置的情况下，载片设置控制单元81在预定的等待期间之后再次驱动可移动镜台31，以将载片支架32从载片设置位置移动至显微位置。在等待期间，如参照图1所描述的，由载片设置机构将包含在载片容器中的载片SG设置在载片支架32中。 
例如，在将载片支架32定位在显微位置的时间点，明场图像获取单元82将低倍率的物镜44设置在分色镜54和成像透镜45之间的光轴上，并驱动明场光源41。 
然后，明场图像获取单元82基于由成像装置46形成的明场完整图像的对比度在生物样品SPL上聚焦，从而获得，例如，如图5所示的明场完整图像。 
当获得明场完整图像后，明场图像获取单元82将高倍率的预定的物镜44设置在光路上的预定位置，而不是将低倍率物镜44设置在光路上的预定位置。 
然后，明场图像获取单元82从明场完整图像检测生物样品SPL的轮廓。施加至轮廓的检测的是，例如，执行二值化处理以将生物样品SPL与其它区域区分开以及然后执行提取生物样品SPL的外形的提取处理的技术。 
在从明场完整图像检测生物样品SPL的轮廓时，明场图像获取单元82确定应在其中获取部分图像的区域(下面也称为成像区域)的大小，并且对生物样品SPL分配成像区域AR，如图6所示。 
至少基于物镜44的放大率和成像装置46的成像表面的大小来确定成像区域AR，并且，在包括生物样品SPL的一部分轮廓或包括在轮廓内的条件下对其进行分配。虽然在图6中成像区域AR彼此不重叠，但是相邻的区域可以部分彼此重叠。 
在将成像区域AR分配给明场完整图像中的生物样品SPL之后，明场图像获取单元82顺序地移动可移动镜台31，使得生物样品SPL的各个部分变成成像区域AR，并获得与成像区域AR相应的每个部分的明场部分图像。 
然后，明场图像获取单元82连接明场部分图像，从而形成连接图像(下面也称为明场部分连接图像)。明场图像获取单元82被配置为在此时对载片设置控制单元81发出应该更换载片的通知。 
当明场部分连接图像由明场图像获取单元82形成时，数据记录单元83产生关于在产生明场部分连接图像的过程中获得的明场部分图像和明场完整图像、以及该明场部分连接图像的数据(在下面也称为明场图像数据)，并在存储单元77中存储该数据。 
此时，数据记录单元83产生关于由明场图像获取单元82分配至明场完整图像中的生物样品SPL的成像区域AR的数据(在下面也称为成像区域分配数据)，并将该数据与明场图像数据关联。 
数据记录单元83还被配置为将关于生物样品SPL的数据(在下面也称为样品数据)与明场图像数据关联。 
样品数据包括，例如，诸如检查对象的姓名、性别和年龄的信息、收集生物样品SPL的日期等。其它附加信息可通过从操作输入单元74的输入获得，或通过扫描载玻片SG上的条形码的读取单元获得。 
1-5.暗场成像模式的具体处理 
当CPU 71从操作输入单元24接收暗场成像模式的执行命令时，CPU 71将与成像模式相应的计算机程序加载至RAM 23。 
在此情况中，根据与暗场成像模式相应的计算机程序，CPU 71用作载片设置控制单元81、暗场图像获取单元92和数据记录单元93，如图7所示，其中，对图4所示的相同组成部分应用相同的参考数字。 
例如，在将载片支架32定位在显微位置的时间点，暗场图像获取单元92将高倍率物镜44设置在分色镜54和成像透镜45之间的光轴上。 
此时，暗场图像获取单元92还获得关于提供至载片支架32的生物样品SPL的样品数据，并在存储单元77中对样品数据进行检索，样品数据包括，例如，与所获得的样品数据中的相匹配的对象的姓名和收集日期。 
在未在存储单元77中发现样品数据的情况中，暗场图像获取单元92通过，例如，显示单元76发出该情况的通知。 
另一方面，当在存储单元77中发现样品数据时，暗场图像获取单元92从存储单元77读取与样品数据相关的成像区域分配数据。然后，在此时间点，与在明场成像模式中对生物样品SPL分配成像区域的状态相同，暗场图像获取单元92对提供至载片支架32的生物样品SPL分配成像区域AR(图6)。 
因此，即使未激发生物样品SPL中的荧光材料时，也仅将与固定至载片支架32的载玻片SG上的生物样品SPL相应的部分作为分配对象正确地分配。 
在对生物样品SPL分配成像区域AR之后，暗场图像获取单元92以预定顺序将分配有成像区域AR的每个样品部分选择为成像对象，并获得被选择为成像对象的样品部分的图像(暗场部分图像)。 
下面具体地说明获得被选择为成像对象的单个样品部分的图像(暗场部分图像)的方式。也就是说，在x轴方向上或在y轴方向上移动可移动镜台31使得要成像的生物样品SPL的样品部分包括在成像区域中之后，暗场图像获取单元92驱动对照标记激发光源61，以用对照标记专用激发光照射生物样品SPL。 
结果，成像装置46从由对照标记专用激发光激发的对照标记中在要成像的样品部分形成对照标记的暗场图像(暗场部分图像)。图8示出了对照标记的暗场部分图像的一个实例。 
暗场图像获取单元92从成像装置46获得暗场部分图像的一部分，并基于该部分的对比度在成像对象的样品部分上聚焦。因此，与基于整个暗场部分图像的对比度聚焦的情况相比，聚焦时间减少。 
用作聚焦对象的暗场部分图像的部分可以是，例如，由如图9A所示的具有预定间隔的线限定的，或者由如图9B所示的中心像素和围绕中心像素的一组像素限定的。 
一旦完成成像对象的样品部分的聚焦，暗场图像获取单元92就停止驱动对照标记激发光源61，并开始驱动激发光源51。结果，成像装置46在由对照标记激发光激发的整个对照标记和整个荧光标记中，例如，如图10所示的在成像对象的样品部分中，形成对照标记和荧光标记的暗场图像(暗场部分图像)。 
暗场图像获取单元92从成像装置46获得整个暗场部分图像作为记录对象的暗场部分图像。 
如上所述，暗场图像获取单元92用上述获取技术以预定顺序获得记录对象的每个样品部分的暗场部分图像。 
当获得记录对象的所有样品部分的暗场部分图像时，暗场图像获取单元92通过将暗场部分图像彼此连接来产生连接图像(在下面也称为暗场部分连接图像)。此时，暗场图像获取单元92通知载片设置控制单元81应该更换载片。 
当暗场图像获取单元92获得记录对象的所有样品部分的暗场部分图像时，数据记录单元93产生关于暗场部分图像和在产生图像的过程中获得的暗场部分连接图像的数据(在下面也称为暗场图像数据)。 
然后，数据记录单元93将暗场图像数据与明场图像数据相关联地存储在存储单元77中，所述明场图像数据与在产生暗场图像数据的过程中由暗场图像获取单元92读取的成像区域分配数据相关联。 
1-6.暗场成像模式中的图像获取过程 
下面参照图11所示的流程图说明暗场图像获取过程。 
在接收到成像模式的执行命令时，CPU 71启动暗场图像获取过程，进入步骤SP1，将载片支架32定位在载片设置位置，然后进入步骤SP2。 
在步骤SP2，在预定等待期间之后，CPU 71将载片支架32从载片设置位置定位在显微位置，并进入步骤SP3。在步骤SP3，CPU71将高倍率物镜44设置在分色镜54和成像透镜45之间的光轴上，然后进入步骤SP4。 
在步骤SP4，与在明场成像模式中对生物样品SPL分配成像区域的状态相同，CPU 71对提供至载片支架32的生物样品SPL分配成像区域AR(图6)，并进入步骤SP5。 
在步骤SP5，CPU 71将一个分配有成像区域AR的样品部分选择为成像对象，并进入步骤SP6。在步骤SP6，CPU 71驱动对照标记激发光源61，基于成像对象的样品部分的对照标记的暗场图像(暗场部分图像)的一部分的对比度在成像对象的样品部分上聚焦，并进入步骤SP7。 
在步骤SP7，CPU 71停止驱动对照标记激发光源61，并同时开始驱动激发光源51，然后进入步骤SP8。在步骤SP8，CPU 71将成像对象的样品部分的对照标记和荧光标记的暗场图像获得为记录对象的暗场部分图像，并进入步骤SP9。 
在步骤SP9，CPU 71停止驱动激发光源51，并进入步骤SP10。在步骤SP10，CPU 71判断是否获得了分配有成像区域AR的所有 样品部分的暗场部分图像，并且，当仍有其暗场部分图像尚未获得的任何样品部分时，返回至步骤SP5。 
另一方面，当获得所有样品部分的暗场部分图像时，CPU 71进入步骤SP11，通过连接暗场部分图像来产生暗场部分连接图像，并进入步骤SP12。 
在步骤SP12，CPU 71产生关于在步骤SP11获得的暗场部分连接图像和在连接之前的暗场部分图像的暗场图像数据，并与相应的明场图像数据相关联地在存储单元77中存储暗场图像数据，并进入步骤SP13。 
在步骤SP13，CPU 71判断载片容器中是否剩有任何载玻片SG，并且，如果剩有任何载玻片，那么CPU 71返回至步骤SP1以重复上述过程。另一方面，如果载片容器中未剩有载玻片SG，那么CPU 71终止暗场图像获取过程。 
1-7.效果 
通过上述构成，在获得暗场部分图像的情况中，生物样品图像获取设备1驱动对照标记激发光源61，以用对照标记专用激发光照射成像对象的样品部分。然后，生物样品图像获取设备1基于由对照标记专用激发光激发的样品部分的对照标记的暗场图像的对比度在生物样品的部分上聚焦。 
一旦完成成像对象的样品部分的聚焦，生物样品图像获取设备1驱动激发光源51，而不是驱动对照标记激发光源61，以用激发光照射成像对象的样品部分。然后，生物样品图像获取设备1获得由激发光激发的样品部分中的荧光标记和对照标记的暗场图像，作为待记录的暗场部分图像。 
因为对照标记靶向细胞核，所以其包括在生物样品SPL中的量比靶向特定基因的荧光标记的量大得多，并且，对照标记产生模糊地总体代表生物样品的光。 
因此，生物样品图像获取设备1能以高精度在生物样品SPL的每个样品部分上聚焦，而不用使荧光标记发光，结果，获得待记录的每个样品部分的暗场部分图像。 
顺便说一句，通常用汞灯、氙灯或金属卤化物灯作为激发光源51。部分是因为这些灯的波长范围是稳定的，调节激发滤光片53和发射滤光片55的透射率，使得荧光标记表现得比对照标记更亮。 
因此，为了用激发光源51观察对照标记，与观察荧光标记的情况相比，使激发光源51的照射强度更高。结果，在此情况中，荧光标记和对照标记的变色加速，而且生物样品SPL负担过大。 
另一方面，为了用滤光片从由激发光源51发出的激发光中仅提取激发对照标记的光，当聚焦暗场部分图像时和当获得暗场部分图像时，更换滤光片。结果，在此情况中，设备的尺寸由于滤光片数量的增加而增加。此外，在此情况中花费更长的时间来获得暗场部分图像，因此，此方法是不现实的。 
相反，生物样品图像获取设备1从对照标记激发光源61发出对照标记专用激发光。因此，与用激发光源51观察对照标记的情况相比，生物样品图像获取设备1能够更快地获得暗场部分图像，而不会使荧光标记和对照标记的变色加速。 
通过上述构成，生物样品图像获取设备1通过使用由对照标记专用激发光激发的对照标记的暗场图像，能够调节焦距，而不会使标记至靶的荧光材料的变色加速或使生物样品负担过大。 
2.其它实施方式 
在上述实施方式中，用对照标记专用激发光照射生物样品SPL的面向物镜44的样品表面。然而，可用对照标记专用激发光照射面向物镜44的样品表面的相反侧上的样品表面。 
图12示出了与图1的组成部分相应的组成部分具有相同的参考数字和符号的实例。在图12所示的实例中，在暗场成像模式的情况中，将对照标记激发光源61代替明场光源41设置在预定的光源位置(在此处，通常设置明场光源41)。此外，将准直透镜62设置在光源和反射镜42之间的光路上，并且从光路移除明场滤光片43。准直透镜62将从对照标记激发光源61发出的对照标记专用激发光变为平行光束，并经由反射镜42引导至面向物镜44的样品表面的相反侧上的样品表面。在图12所示的实例中，省略了图1所示的分色镜63。 
图13示出了另一与图1的组成部分相应的组成部分具有相同的参考数字和符号的实例。在图13所示的实例中，设置对照标记激发光源61和准直透镜62，使得对照标记专用激发光直接倾斜地落在面向物镜44的样品表面的相反侧的样品表面上。与图12所示的实例类似，在图13所示的实例中也省略了图1所示的分色镜63。此外，图13所示的实例具有优点，因为可用对照标记专用激发光直接照射生物样品SPL，不用像图12所示的实例一样移动任何滤光片或透镜。 
在上述实施方式中，对照标记的暗场部分图像的一部分(图8)用作与样品部分相应的聚焦对象。虽然该部分固定至分配有成像区域AR的每个样品部分，但是也可以是可变的。 
通常，在生物样品SPL中(尤其是在组织切片中)，细胞不是均匀存在的，而是具有细胞集中的区域和细胞稀疏的区域。在集中区域，与稀疏区域相比，真正作为靶的荧光标记更有可能存在，并且，与集中区域相应的对照标记的暗场部分图像的光强度也更高。也就是说，对照标记的暗场部分图像的集中区域是明显的区域(用于聚焦的区域)。 
当第一次从成像装置46读取与要获得的样品部分相应的对照标记的暗场部分图像时，读出所有暗场部分图像，并且，确定读出的暗场部分图像的一部分以用于聚焦。 
此确定技术确定用于以密度的降序在比暗场部分图像小的搜索区域(例如，16×16像素或8×8像素)中聚焦的部分的预定数量。该密度可由，例如，具有不低于搜索区域的阈值的强度的像素的数量或者搜索区域的强度柱状图的峰度(线性度)来衡量。 
虽然强度柱状图表示基于像素的搜索区域的强度值的分布，但是，使假设表现分布区域的变化相同的分布标准化是优选的。这是因为可在相同的单元衡量分配有成像区域AR的样品部分的暗场部分图像。 
以此方式，在分配有成像区域AR的每个样品部分中，可聚焦荧光标记在其中非常可能存在的部分。 
在上述实施方式中，将其中采用细胞核用于对照的DAPI用作对照标记。然而，对照标记并不限于DAPI。例如，可使用靶向细胞组织(或对于细胞组织来说是独特的分子)的对照标记，或者，可使用靶向细胞质(或对于细胞质来说是独特的分子)的对照标记。自然地，可使用靶向其它物质另一对照标记。 
虽然在上述实施方式中使用一种类型的对照标记，但是可使用两种以上类型的对照标记。在这种情况中，提供关于各个对照标记的专用激发光源，或者，提供激发各个对照标记但是不激发靶中的荧光材料的单个激发光源，从而，可获得与上述实施方式相同的效果。 
在上述实施方式中，在生物样品SPL中用基因作为靶。然而，生物样品SPL中的靶不限于基因。例如，可用各种分子(包括诸如细胞膜通道的蛋白质分子、糖蛋白分子和糖链分子)作为靶。 
在上述实施方式中为了调节焦距，在固定的物镜44的光轴的方向上在z轴方向(光轴方向)上移动可移动镜台31。替代地，可移动镜台31可以是固定的，并且，可在z轴方向(光轴方向)上与可移动镜台31相反地移动物镜44。 
应该理解，对这里描述的目前优选的实施方式的各种变化和修改，对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。可在不偏离本发明的实质和范围且不减少其预期的优点的前提下，进行这种变化和修改。因此，这种变化和修改已由所附权利要求覆盖。 

Claims (19)

1.一种产生与生物样品相关的图像的方法，所述方法包括：
基于第一荧光材料的荧光在所述生物样品上聚焦，其中，用所述第一荧光材料和第二荧光材料对所述生物样品染色；并且，
基于所述第二荧光材料的荧光捕获图像，其中，所述第一和第二荧光材料具有不同的激发波长；
其中，在暗场成像模式下产生所述图像；以及
其中，将一个分配有成像区域的样品部分选择为成像对象，驱动对应于所述第一荧光材料的光源，基于成像对象的样品部分的所述第一荧光材料的暗场图像的一部分的对比度，在所述成像对象的样品部分上聚焦。
2.根据权利要求1所述的产生与生物样品相关的图像的方法，其中，将所述图像捕获为完整图像。
3.根据权利要求1所述的产生与生物样品相关的图像的方法，其中，将所述图像捕获为部分图像。
4.根据权利要求1所述的产生与生物样品相关的图像的方法，其中，将所述图像捕获为多个部分图像，所述多个部分图像被连接以形成所述图像。
5.根据权利要求1所述的产生与生物样品相关的图像的方法，其中，由包括聚焦和捕获的控制的数据处理单元控制图像产生。
6.根据权利要求5所述的产生与生物样品相关的图像的方法，其中，在聚焦之后，由所述数据处理单元驱动激发光源以启动图像捕获。
7.根据权利要求1所述的产生与生物样品相关的图像的方法，其中，在预定位置聚焦所述生物样品的一部分。
8.根据权利要求1所述的产生与生物样品相关的图像的方法，其中，在可变位置聚焦所述生物样品的一部分。
9.一种产生与生物样品相关的图像的设备，所述设备包括：
基部单元，被配置为容纳用具有不同激发波长的第一荧光材料和第二荧光材料染色的生物样品；
第一光源，被配置为照射所述生物样品从而允许基于所述第一荧光材料的荧光聚焦所述生物样品；以及
第二光源，被配置为照射所述生物样品从而允许基于所述第二荧光材料的荧光捕获所述图像；
其中，所述设备在暗场成像模式下产生所述图像；
所述设备还包括：
暗场图像获取单元，被配置为将一个分配有成像区域的样品部分选择为成像对象，驱动对应于所述第一荧光材料的光源，基于成像对象的样品部分的所述第一荧光材料的暗场图像的一部分的对比度，在所述成像对象的样品部分上聚焦。
10.根据权利要求9所述的产生与生物样品相关的图像的设备，其中，在暗场成像模式下产生所述图像。
11.根据权利要求9所述的产生与生物样品相关的图像的设备，其中，将所述图像捕获为完整图像。
12.根据权利要求9所述的产生与生物样品相关的图像的设备，其中，将所述图像捕获为部分图像。
13.根据权利要求9所述的产生与生物样品相关的图像的设备，其中，将所述图像捕获为多个部分图像，所述多个部分图像被连接以形成所述图像。
14.根据权利要求9所述的产生与生物样品相关的图像的设备，其中，所述设备还包括数据处理单元，该数据处理单元被配置用于控制图像产生，包括与所述基部单元、所述第一光源和所述第二光源通信。
15.根据权利要求14所述的产生与生物样品相关的图像的设备，其中，所述数据处理单元停止驱动所述第一光源，并开始驱动所述第二光源，以启动图像捕获。
16.根据权利要求9所述的产生与生物样品相关的图像的设备，其中，在预定位置聚焦所述生物样品的一部分。
17.根据权利要求9所述的产生与生物样品相关的图像的设备，其中，在可变位置聚焦所述生物样品的一部分。
18.一种产生与生物样品相关的图像的方法，所述方法包括：
用第一荧光材料和第二荧光材料对所述生物样品染色；
以第一激发波长照射所述生物样品；
在所述生物样品上聚焦；
以第二激发波长照射所述生物样品；以及
捕获与所述生物样品相关的图像；
其中，所述第一激发波长和所述第二激发波长分别为所述第一荧光材料和第二荧光材料的激发波长；
其中，在暗场成像模式下产生所述图像；以及
其中，将一个分配有成像区域的样品部分选择为成像对象，驱动用于发射所述第一激发波长的光源，基于成像对象的样品部分的所述第一荧光材料的暗场图像的一部分的对比度，在所述成像对象的样品部分上聚焦。
19.一种产生与生物样品相关的图像的设备，所述设备包括：
第一光源，被配置为以第一激发波长照射所述生物样品从而允许所述生物样品的聚焦；以及
第二光源，被配置为以第二激发波长照射所述生物样品从而允许所述图像的捕获；
其中，所述第一激发波长和所述第二激发波长分别为对所述生物样品染色的所述第一荧光材料和第二荧光材料的激发波长；
其中，所述设备在暗场成像模式下产生所述图像；
所述设备还包括：
暗场图像获取单元，被配置为将一个分配有成像区域的样品部分选择为成像对象，驱动对应于所述第一荧光材料的光源，基于成像对象的样品部分的所述第一荧光材料的暗场图像的一部分的对比度，在所述成像对象的样品部分上聚焦。
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