JP2009014868A - スタビライザおよび生体観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】透明板部材を接触させて試料の観察範囲における動的挙動を抑制するとともに、透明板部材と対物レンズとの接触による破損を防止することができ、対物レンズの焦点位置を試料の表面に精度よく一致させる。
【解決手段】試料Ａに接触して当該試料Ａの動的挙動を抑制するスタビライザ１であって、観察範囲内の試料Ａに密着させられる接触面１８ａを有する光学的に透明な透明板部材１８と、該透明板部材１８に、接触面１８ａに対して、該透明板部材１８の厚さ方向に所定の距離だけ離れた位置１８ｂに配置されたマーカとを備えるスタビライザ１を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生体を生きたまま（in vivo）観察するためのスタビライザおよび生体観察装置に関するものである。

従来、生体を生きたまま顕微鏡で観察する場合に、生体の呼吸や拍動等の振動によって観察像がぶれてしまい、鮮明な観察像による観察を行うことができないという不都合があった。これを解決するために、観察時に生体を押さえつけて固定するスタビライザを有する観察装置が考案されている（例えば、特許文献１参照。）。
この観察装置においては、観察範囲内に配される生体の表面にスタビライザの透明板部材を密着させてその挙動を抑制し、生体から発せられる光を透明板部材を介して対物レンズにより集光することで、鮮明な観察像を得ることとしている。

特開２００５−３３８６３１号公報

しかしながら、生体の表面に透明板部材を密着させた状態で、対物レンズの焦点位置を生体の表面に合わせる場合には以下の不都合がある。すなわち、透明板部材が透明であるために、対物レンズにより取得した観察像上では、その位置を認識し難く、合焦位置を探しながら対物レンズを透明板部材に近接させていくと、対物レンズの作動距離が短い場合には、対物レンズが透明板部材に接触して破損してしまう不都合がある。特に、スタビライザが生体の体内に挿入されて臓器等を押さえつけている場合には、対物レンズと透明板部材との位置関係を外部から監視することができず、上記不都合が発生する可能性が高い。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、透明板部材を接触させて試料の観察範囲における動的挙動を抑制するとともに、透明板部材と対物レンズとの接触による破損を防止することができ、対物レンズの焦点位置を試料の表面に精度よく一致させることができるスタビライザおよび生体観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料に接触して当該試料の動的挙動を抑制するスタビライザであって、試料の観察範囲に密着させられる接触面を有する光学的に透明な透明板部材と、該透明板部材に、前記接触面に対して、該透明板部材の厚さ方向に所定の距離だけ離れた位置に配置されたマーカとを備えるスタビライザを提供する。

本発明によれば、透明板部材を試料の表面に密着させて押圧することにより、試料の観察範囲における動的挙動を抑制することができる。この場合に、試料の表面の観察範囲に対物レンズの焦点を合わせるには、まず、マーカに対して焦点を合わせ、その後、透明板部材の厚さ方向に所定距離だけ焦点を移動させる。これにより、対物レンズの焦点位置を簡易に接触面に一致させ、該接触面に接触している試料の表面に焦点を合わせることができる。

この場合において、マーカを透明板部材に設けることにより、透明板部材を試料の表面に密着させる前に、対物レンズの焦点位置をマーカに一致させた後、厚さ方向に所定距離だけ移動させ、その状態を維持しながら透明板部材を試料の表面に密着させるだけで、焦点位置を試料の表面に一致させることができる。これにより、スタビライザを試料の奥部に挿入した状態での対物レンズと透明板部材との位置関係を確認しながら合焦調整作業を行う必要がなく、対物レンズと透明板部材との接触による破損等の問題の発生を未然に防止することができる。

また、マーカを接触面から透明板部材の厚さ方向に離れた位置に設けることにより、透明板部材の接触面に焦点位置が一致させられた観察状態では、対物レンズの焦点位置がマーカからずれることになり、試料の鮮明な観察像にマーカの像が鮮明なまま重なってしまうことを防止することができる。これにより、試料の鮮明な像を観察することができる。

上記発明においては、前記マーカが、前記透明板部材の接触面とは反対側の面に設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズの焦点位置をマーカに一致させた後、透明板部材の厚さ寸法分だけ移動させることにより、容易に、透明板部材の接触面に対物レンズの焦点位置を一致させることができる。

また、本発明は、試料に接触して当該試料の動的挙動を抑制するスタビライザであって、試料の観察範囲に密着させられる接触面を有する光学的に透明な透明板部材と、該透明板部材の接触面に設けられ、観察時に検出する光とは異なる波長域の光を発するマーカとを備えるスタビライザを提供する。

本発明によれば、透明板部材を試料の表面に密着させて押圧することにより、試料の観察範囲における動的挙動を抑制することができる。この場合に、試料の表面の観察範囲に対物レンズの焦点を合わせるには、マーカに対して焦点を合わせる。マーカを透明板部材の接触面に設けることにより、透明板部材を試料の表面に密着させる前に、対物レンズの焦点位置をマーカに一致させ、その状態を維持しながら透明板部材を試料の表面に密着させるだけで、焦点位置を試料の表面に一致させることができる。
これにより、スタビライザを試料の奥部に挿入した状態での対物レンズと透明板部材との位置関係を確認しながら合焦調整作業を行う必要がなく、対物レンズと透明板部材との接触による破損等の問題の発生を未然に防止することができる。

また、マーカが観察時に検出される光とは異なる波長域の光を発するので、マーカへの焦点位置合わせ時には、観察時とは異なる波長域の光でマーカを可視化し、観察時には、他の波長域の光を用いてマーカを不可視化することができる。これにより、試料の鮮明な観察像にマーカの像が鮮明なまま重なってしまうことを防止することができる。したがって、試料の鮮明な像を観察することができる。

また、本発明は、試料に接触して当該試料の動的挙動を抑制するスタビライザであって、試料の観察範囲を含みそれよりも広い領域に密着させられる接触面を有する光学的に透明な透明板部材と、該透明板部材の接触面の縁部近傍に設けられたマーカとを備えるスタビライザを提供する。

本発明によれば、透明板部材の接触面が試料の観察範囲より広い領域に密着させられるので、マーカを接触面の縁部近傍に配置することで、マーカを観察範囲外に配置することが可能となる。したがって、観察前においては、対物レンズを介してマーカを観察することで、対物レンズの焦点位置を透明板部材の接触面に一致させ、観察時には、マーカを含まない領域を観察範囲とすることで、試料の鮮明な像に、マーカの像が重なることを防止することができる。すなわち、観察時に使用される波長域の光で視覚可能なマーカであっても、試料の像に重なって観察されてしまうことを防止することができる。

また、本発明は、試料からの光を集光する対物レンズを備える観察光学系と、上記いずれかのスタビライザとを備える生体観察装置を提供する。
本発明によれば、観察光学系の対物レンズの焦点位置を、スタビライザに設けられたマーカに一致させることにより、対物レンズとスタビライザとの相対位置関係を精度よく決定し、その状態で、試料の表面に透明板部材の接触面を接触させることにより、対物レンズの焦点位置を試料の表面に精度よく一致させることができる。これにより、試料から発せられる光を対物レンズによって集光し、動的挙動が抑制されてブレのない試料の鮮明な観察像を取得することができる。

また、本発明は、試料からの光を集光する対物レンズを備える観察光学系と、上記スタビライザと、該スタビライザを、前記マーカが観察範囲外に配置される位置と、前記マーカが観察範囲内に配置される位置との間で、前記対物レンズの光軸に直交する方向に移動させるスタビライザ可動部とを備える生体観察装置を提供する。

本発明によれば、スタビライザ可動部の作動により、対物レンズに対してスタビライザを、マーカが観察範囲内に配置される位置に移動させてマーカに焦点位置合わせを行い、その後、スタビライザ可動部の作動により、マーカが観察範囲外に配置される位置にスタビライザを移動させて、対物レンズの焦点位置を焦点面に保持することができる。したがって、試料の鮮明な像に、マーカの像が重なって観察されてしまうことを防止することができる。

本発明によれば、透明板部材を接触させて試料の観察範囲における動的挙動を抑制するとともに、透明板部材と対物レンズとの接触による破損を防止することができ、対物レンズの焦点位置を試料の表面に精度よく一致させることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るスタビライザ１および生体観察装置２について、図１〜図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るスタビライザ１は、図１に示されるように、生体観察装置２に備えられている。

本実施形態に係る生体観察装置２は、実験小動物等の試料Ａを載置するステージ３と、該ステージ３上の試料Ａからの反射光あるいは蛍光等の光を集光して観察像を取得する観察光学系４と、該観察光学系４の視野範囲内の試料Ａの動的挙動を抑制するスタビライザ１とを備えている。
ステージ３は、試料Ａを搭載し、ダイヤル３ａの操作によって、水平２方向（Ｘ，Ｙ方向）に移動させることができるようになっている。

観察光学系４は、白色光源５と、白色光源５からの白色光から励起光を抽出する励起フィルタ６と、励起光を試料Ａに照射し、試料Ａから戻る蛍光を集光する対物レンズ７と、対物レンズ７により集光された光を結像させる結像ユニット８と、該結像ユニット８の焦点位置に撮像面を配置したＣＣＤカメラのような撮像素子９と、該撮像素子９により取得された試料Ａの観察像を表示するモニタ１０とを備えている。

励起フィルタ６およびバリアフィルタは挿脱可能に設けられ、励起光を照射することによる蛍光観察と、白色光を照射することによる明視野観察とを切り替えることができるようになっている。
観察光学系４は、ベース１１から鉛直方向に延びる支柱１２に、昇降機構１３により上下動可能に設けられている。

前記結像ユニット８には、結像レンズ１４と、結像レンズ１４により集光される光から励起光を分岐して、蛍光を透過させるダイクロイックミラー１５と、蛍光に含まれる励起光を遮断するバリアフィルタ１６とが備えられている。ダイクロイックミラー１５は、明視野観察時には図示しないハーフミラーに交換させられるようになっている。
図中符号１７はミラーである。

本実施形態に係るスタビライザ１は、図２に示されるように、観察光学系４の視野範囲（観察範囲）Ｂの外側に配置される略円環状の先端部１ａと、該先端部１ａを支持するアーム部１ｂと、該アーム部１ｂを観察光学系４に対して光軸Ｃに沿うＺ方向に移動させるＺステージ１ｃ（図１参照。）とを備えている。

前記先端部１ａの中央開口部１ｄには、観察光学系４の視野範囲Ｂ内において試料Ａに接触させられる所定厚さ寸法のカバーガラス１８が備えられている。該カバーガラス１８の試料Ａに接触させられる接触面１８ａとは反対側の表面１８ｂには、クロス線からなるマーカ１９が設けられている。マーカ１９は、明視野観察により観察可能な非水溶性無蛍光の色素であり、例えば、金属（金、白金等）により構成されている。マーカ１９は十分に細く、例えば、０．５ｍｍ以下の線により描画されている。

Ｚステージ１ｃは、ダイヤル１ｅの操作により、スタビライザ１の先端部１ａおよびアーム部１ｂを対物レンズ７の光軸Ｃに沿うＺ方向に移動させることができるようになっている。
スタビライザ１のアーム部１ｂはＺステージ１ｃに、例えば、雄アリ２０と雌アリ２１とを係合させることにより光軸Ｃに直交する方向に着脱可能に取り付けられている。

このように構成された本実施形態に係るスタビライザ１および生体観察装置２の作用について説明する
本実施形態に係る生体観察装置２を用いて、実験小動物等の臓器等の試料Ａを生きたまま観察するには、まず、励起フィルタ６およびバリアフィルタ１６を光路上から取り外し、ダイクロイックミラー１５をハーフミラーに切り替える。次いで、白色光源５から白色光を出射させ、対物レンズ７の先端から白色光を照射して、モニタ１０に表示された画像を観察する。

この状態で、Ｚステージ１ｃのダイヤル１ｅを操作することにより、対物レンズ７の焦点位置がマーカ１９に一致してピントのあった鮮明なマーカ１９の画像がモニタ１０に表示されるように調節する。これにより、図４（ａ）に示されるように、対物レンズ７の焦点位置が、カバーガラス１８の接触面１８ａとは反対側の表面１８ｂに一致する。

そして、この状態から、さらにダイヤル１ｅを操作して、スタビライザ１の先端部１ａのカバーガラス１８の厚さ寸法分だけ、対物レンズ７に近接させる。これにより、図４（ｂ）に示されるように、対物レンズ７の焦点位置が、カバーガラス１８の接触面１８ａに一致する。このとき、対物レンズ７の焦点位置は、マーカ１９から光軸Ｃ方向にカバーガラス１８の厚さ寸法分だけずれることになる。

次に、図３に示されるように、麻酔により睡眠状態とした実験小動物等の外皮を切開して臓器等の試料Ａを露出させた状態で、ステージ３上に固定する。そして、励起フィルタ６およびバリアフィルタ１６を光路上に挿入し、ハーフミラーをダイクロイックミラー１５に切り替える。

この状態で、白色光源５から白色光を出射させつつ、昇降機構１３を作動させて、試料Ａの上方から、スタビライザ１および対物レンズ７をそれらの相対位置関係を固定したままの状態で一体的に下降させていき、図４（ｃ）に示されるように、スタビライザ１の先端部に設けられたカバーガラス１８の接触面１８ａを試料Ａに接触させる。

対物レンズ７の焦点位置は、カバーガラス１８の接触面１８ａに一致しているので、接触面１８ａが試料Ａの表面に接触した瞬間に、対物レンズ７の焦点位置が試料Ａの表面上に一致し、試料Ａの表面の画像がモニタ１０上に表示されるようになる。
そして、スタビライザ１により試料Ａの表面を所定の押圧力で押圧することにより、観察範囲Ｂ内に配される試料Ａの表面の動的な挙動が抑制され、試料Ａをほぼ静止させた状態で観察することが可能となる。

また、このとき、上述したように、対物レンズ７の焦点位置はマーカ１９からカバーガラス１８の厚さ寸法分だけずれているので、マーカ１９の像は試料Ａの観察の邪魔にならない程度にボケている。したがって、モニタ１０上には試料Ａの表面のほぼ静止した画像のみが鮮明に表示される。

このように、本実施形態に係るスタビライザ１および生体観察装置２によれば、スタビライザ１のカバーガラス１８に設けたマーカ１９により、スタビライザ１を試料Ａに接触させる前に対物レンズ７の焦点位置をカバーガラス１８の接触面１８ａに簡易に精度よく一致させることができる。スタビライザ１の先端部１ａを生体の切開部に挿入する前に、対物レンズ７との相対位置関係を調節するので、目視確認し易く、対物レンズ７とカバーガラス１８とが接触することによるいずれかの部品の破損を防止することができる。

なお、本実施形態に係るスタビライザ１および生体観察装置２においては、明視野観察において視覚可能なマーカ１９を例示したが、これに代えて、蛍光観察時に使用しない紫外や赤外の波長域の励起光を照射して蛍光を発生する色素を焼き付けることにより構成したマーカ１９を採用してもよい。

例えば、７６８ｎｍの励起光で、８０７ｎｍの蛍光を発生する材料によりマーカ１９を構成し、蛍光観察に使用する励起光の波長を４８８ｎｍ、蛍光の波長を５１０ｎｍに設定してもよい。この場合、観察時には、励起フィルタ６として、青色に励起するフィルタを用い、ダイクロイックミラー１５としては青色光を反射し緑色光を透過するものを採用し、緑色光を透過するバリアフィルタ１６を採用することにすればよい。また、ピント調節時には、赤外に励起する励起フィルタ６、７８０ｎｍ以下の波長の光を反射し、７８０ｎｍより長い波長の光を透過するダイクロイックミラー１５および７８０ｎｍより長い波長の光を透過するバリアフィルタ１６を用いることにすればよい。

この場合には、観察中に微弱な蛍光が発せられる可能性もあるが、視認もしくは撮影できる強度の励起は起こらないし、撮像素子９として超高感度カメラを用いていても、バリアフィルタ１６によって除去できるので撮影されることはない。
また、マーカ１９としてクロス線からなるものを例示したが、これに代えて、任意の形態のものを採用することができる。また、波長を異ならせる場合には、カバーガラス１８の接触面１８ａから光軸方向に所定距離だけ離れた位置にマーカ１９を設ける必要がなく、接触面１８ａに設けることとしてもよい。

さらに、試料Ａの観察と同じ観察方法で視覚可能な材料によりマーカ１９を構成する場合には、図５に示されるように、カバーガラス１８の接触面１８ａの縁部にマーカ１９を配置することとしてもよい。この場合、対物レンズ７の視野範囲Ｂに対してスタビライザ１を光軸Ｃに直交する方向に、例えば、距離ｄだけ移動させることにより、視野範囲Ｂ内にマーカ１９を出し入れすることができる。

したがって、試料Ａの観察前のピント調節時には、スタビライザ１を第１の位置に配置してマーカ１９を対物レンズ７の視野範囲Ｂ内に配置し、上記と同様にして、対物レンズ７の焦点位置をマーカ１９の設けられている接触面１８ａに一致させ、試料Ａの観察時には、スタビライザ１を第２の位置にスライドしてマーカ１９を対物レンズ７の視野範囲Ｂ外に配置することができる。これにより、観察時にマーカ１９が視野範囲Ｂ内に配置されないので、マーカ１９の像が試料Ａの像に重なることなく、試料Ａの鮮明な像のみを観察することができる。

この場合に、マーカ１９の観察によるピント調節時と、試料Ａの観察時の両方において、同一の励起光と蛍光を利用するので、励起フィルタ６、ダイクロイックミラー１５およびバリアフィルタ１６の切替が不要となり、さらに簡易に構成することができるという利点がある。

スタビライザ１を対物レンズ７の光軸Ｃに直交する方向に距離ｄだけ移動させる方法としては、例えば、図６および図７に示されるように、Ｚステージ１ｃにスタビライザ１を取り付ける取付部に、雄アリ２０と雌アリ２１とからなる取付構造を設け、雌アリ２１側にボールプランジャ２２、雄アリ２０側に距離ｄだけ離れた２つの溝２３，２４を設けることとすればよい。これにより、スタビライザ１を取り付けた雄アリ２０をＺステージ１ｃに固定された雌アリ２１に対してスライドさせると、２箇所の溝２３，２４に対応する位置でボールプランジャ２２によりスライド動作が一時的に係止されるので、それらの位置でピント調節と観察とを行うようにすればよい。

また、ここでは、対物レンズ７に対してスタビライザ１を光軸Ｃに直交する方向に移動させる場合について説明したが、スタビライザ１を固定して対物レンズ７を光軸Ｃに直交する方向に移動させてもよい。しかしながら、収差等を考慮すると、スタビライザ１をずらす方がより好ましい。

観察時に、マーカ１９が視野範囲Ｂ外に配置されるので、使用する波長帯域を自由に選択することができる。また、観察時の波長が制限されないので、多重染色をする場合等に特に有効である。

また、この場合には、マーカ１９は接触面１８ａに設けられていることが、ピント調節時と観察時とで、対物レンズ７とスタビライザ１との相対移動を低減できるので、最も好ましいが、これに限定されるものではない。接触面１８ａとは反対側の表面１８ｂに設けられていてもよいし、スタビライザ１のカバーガラス１８の周囲の先端部１ｂを構成するフレーム部分の一部または全面に設けられていてもよい。

次に、上述したピント調節動作を自動化する場合について説明する。
上記において、Ｚステージ１ｃをダイヤル１ｅによって手動操作していたものに代えて、ダイヤル１ｅ部分にモータ２５を設け、撮像素子９により取得された画像を処理してモータ２５を制御する制御部２６を設けることにすればよい。

制御部２６は、例えば、図１０に示されるように、撮像素子９によりマーカ１９の画像を取得し（ステップＳ１）、取得された画像において、所定値より大きい輝度値を有する画素からなる領域を抽出し（ステップＳ２）、その外側１０％の領域における輝度値の変化の傾きを算出する（ステップＳ３）。これは、例えば、図９（ａ）に示されるように、ピントが合わずにコントラストが低い場合に、所定の閾値Ｐを越える境界線に隣接する閾値Ｐより小さい輝度値を有する領域の輝度値の変化の傾きｋ１，ｋ２が小さく、図９（ｂ）に示されるように、ピントがあってコントラストが高い場合に、輝度値の変化の傾きｋ１，ｋ２が大きくなることを利用している。

そして、傾きが閾値以上か否かを判定する（ステップＳ４）。ここでは、例えば、傾きｋ１，ｋ２の平均値を閾値Ｐと比較する。そして、閾値より小さい場合には、ピントが合っていないものとして、モータ２５を駆動させることにより、スタビライザ１を対物レンズ７の光軸方向に微動させ（ステップＳ５）、閾値以上の場合には、ピントが合ったものとして処理を終了する。
これにより、さらに簡易に、カバーガラス１８の接触面１８ａへの対物レンズ７の焦点位置の調整を行うことができる。

本発明の一実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。 図１の生体観察装置に備えられるスタビライザの先端部を示す平面図である。 図２のスタビライザの先端部と対物レンズとの関係を説明する部分的な縦断面図である。 試料の表面への対物レンズの焦点位置の調整作業を説明する図であり、（ａ）対物レンズの焦点位置をマーカに一致させた状態、（ｂ）接触面に一致させた状態、（ｃ）試料の表面に一致させた状態をそれぞれ示す部分的な縦断面図である。 マーカの変形例を示す平面図である。 スタビライザ可動部の構造例を示す縦断面図である。 図６の雌アリに係合する雄アリの一例を示す斜視図である。 ピント調節作業を自動化するための本実施形態の生体観察装置の変形例を示す全体構成図である。 ピント調節の自動的な判定の一例を示す図であり、（ａ）ピントが合っていない状態、（ｂ）ピントが合った状態をそれぞれ示す図である。 自動的なピント調節作業を説明するフローチャートである。

符号の説明

Ａ 試料
Ｂ 視野範囲（観察範囲）
Ｃ 光軸
１ スタビライザ
１ａ 先端部
２ 生体観察装置
４ 観察光学系
７ 対物レンズ
１８ カバーガラス（透明板部材）
１８ａ 接触面
１８ｂ 反対側の表面
１９ マーカ
２０ 雄アリ（スタビライザ可動部）
２１ 雌アリ（スタビライザ可動部）

Claims (6)

1. 試料に接触して当該試料の動的挙動を抑制するスタビライザであって、
   観察範囲内の試料に密着させられる接触面を有する光学的に透明な透明板部材と、
   該透明板部材に、前記接触面に対して、該透明板部材の厚さ方向に所定の距離だけ離れた位置に配置されたマーカとを備えるスタビライザ。
2. 前記マーカが、前記透明板部材の接触面とは反対側の面に設けられている請求項１に記載のスタビライザ。
3. 試料に接触して当該試料の動的挙動を抑制するスタビライザであって、
   試料の観察範囲に密着させられる接触面を有する光学的に透明な透明板部材と、
   該透明板部材の接触面に設けられ、観察時に検出する光とは異なる波長域の光を発するマーカとを備えるスタビライザ。
4. 試料に接触して当該試料の動的挙動を抑制するスタビライザであって、
   試料の観察範囲を含みそれよりも広い領域に密着させられる接触面を有する光学的に透明な透明板部材と、
   該透明板部材の接触面の縁部近傍に設けられたマーカとを備えるスタビライザ。
5. 試料からの光を集光する対物レンズを備える観察光学系と、
   請求項１から請求項４のいずれかに記載のスタビライザとを備える生体観察装置。
6. 試料からの光を集光する対物レンズを備える観察光学系と、
   請求項４に記載のスタビライザと、
   該スタビライザを、前記マーカが観察範囲外に配置される位置と、前記マーカが観察範囲内に配置される位置との間で、前記対物レンズの光軸に直交する方向に移動させるスタビライザ可動部とを備える生体観察装置。

Images