CN102002462A - 利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从杜仲中分离内生菌，再经过微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法。内生菌为XP-8，中国典型微生物保藏中心保藏，编号为CCTCCM209291；制备方法包括液体种子的制备、发酵、产物的分离、提取、纯化等步骤，具有简便、快速、成本低等特点。

Description

利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法 

技术领域

该发明涉及松脂醇二葡萄糖苷的制备方法，具体是一种利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法。 

背景技术

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是中国传统的名贵中药，其降血压功能持续、稳定、无副作用，是其他化学降压药无法比拟的。已有研究证明，杜仲中主要降压成分是松脂醇二葡萄糖苷(PDG)。获取杜仲中功能性成分的传统方法是利用杜仲的皮、叶进行提取。这种方法受到材料来源的限制，无法满足市场需求，而且会破坏杜仲资源，不利于可持续发展。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种从杜仲中分离一株内生菌，再经过微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法。与传统方法相比，用微生物发酵法生产植物有效成分具有简便、快速、成本低等特点。 

从杜仲中分离到的一株内生菌为拟茎点菌属XP-8(Phomopsis sp.XP-8)，于2009年12月1日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M209291。 

内生菌XP-8的制备方法如下： 

(1)取新鲜的杜仲树皮，切成约0.5cm×0.5cm大小的小块，先在70％酒精中浸泡1min，然后用3％次氯酸钠(有效氯)溶液处理2min，无菌水清洗两次，接种于PDA培养基平板上，25℃下培养； 

(2)培养3-5d，待平板上菌丝萌发时，用划线或稀释等分离方法，挑取形态不同的菌落，转入到PDA斜面培养基上，在25℃条件下培养。经过分离、筛选、纯化的反复过程，直至得到纯化的典型菌落； 

(3)纯化后的菌种移至PDA培养基的斜面上培养后，4℃保存。 

一种利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法包括以下步骤： 

(1)液体种子的制备：取2cm²活化好的内生菌XP-8菌种接入种子培养基中，装液量为100ml/250ml三角瓶，在28℃，180r/min条件下摇床培养120h； 

(2)液体发酵：以10％(V/V)的接种量将上述培养好的液体种子接入发酵培养基中，发酵培养基在发酵罐中的装量为发酵罐体积的40％～70％，控制发酵罐的搅拌转速为160～180r/min，发酵液温度控制为28℃，培养168～240h； 

(3)产物的分离：发酵结束后，取发酵液，在5000r/min下离心10min；取上清液，加入2倍于发酵液体积的95％乙醇溶液，静置24h；然后在5000r/min下离心10min；取上清液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下减压浓缩10～20倍，高速离心13000r/min，10min，取上清液； 

(4)产物的提取：选用树脂S-8对(3)中所得上清液进行吸附，吸附时，发酵液中松脂醇二葡萄糖苷的浓度为0.195mg/ml，温度为20℃，pH值为9，控制流速1BV/h，溶液处理量20BV；然后，再用洗脱液进行洗脱，洗脱条件是：以30％的乙醇水溶液为洗脱液，控制洗脱液流速1BV/h，洗脱液用量为6BV；收集全部洗脱液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下蒸发出所有乙醇，所得液体即为松脂醇二葡萄糖苷的粗提液，整个纯化过程对发酵液中松脂二葡萄糖苷的收集率为89.8％； 

(5)产物的纯化：将(4)中所得松脂醇二葡萄糖苷粗提液用孔径为0.45μm的水性醋酸纤维微孔滤膜过滤，取滤液在制备液相色谱仪上进行纯化，收集出峰时间在4.46-4.47min处的组分，即为松脂醇二葡萄糖苷溶液。蒸发挥干溶液中溶剂，所得粉末，即为松脂醇二葡萄糖苷的纯品； 

上述制备过程中，所用培养基分别为： 

内生菌XP-8菌种保藏培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，自然p H(约7.2)； 

种子培养基：采用察氏培养基，组成为蔗糖30.0g，NaNO₃ 2.0g，K₂HPO₄1.0g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然p H(约7.89)； 

发酵培养基：蔗糖47.5g，NaNO₃ 3.0g，K₂HPO₄ 2.83g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然pH(约7.89)； 

上述制备过程中，产物纯化所用制备液相色谱纯化的条件为：检测波长228nm，柱温25℃，流动相的流速为12ml/min，进样量4ml/次，流动相为32％甲醇水 溶液。 

所述松脂醇二葡萄糖苷应用于医药和食品加工以及化学分析与检测等领域。 

附图说明

图1菌株XP-8的形态特征；(A和B分别为菌种XP-8在PDA平板生长5d和15d的菌落形态，C为菌株在燕麦片琼脂培养基上生长7d时产生的甲型分生孢子)； 

图2菌株XP-8的rDNA ITS区PCR扩增结果；M：DNA Marker DL2000；1：菌株XP-8.； 

图3菌株XP-8的rDNAITS区的基因序列； 

图4基于菌株XP-8ITS区基因序列构建的系统发育树；注：节间数字代表bootstrap支持值；XP-8为供试菌株；其中P.代表Phomopsis；D.代表Diaporthe； 

图5温度对菌落生长速度的影响； 

图6pH值对菌落生长的影响； 

图7碳源对菌落生长的影响； 

图8氮源对菌落生长的影响； 

图9温度对S-8吸附PDG的影响； 

图10不同温度下S-8吸附等温线； 

图11不同温度下S-8静态吸附动力学曲线； 

图12S-8吸附PDG过程液膜扩散速率； 

图13S-8吸附PDG过程颗粒内扩散速率； 

图14pH对S-8吸附PDG的影响； 

图15不同流速下PDG在树脂上的动态吸附曲线； 

图16洗脱剂乙醇浓度对洗脱的影响。 

具体实施方式

以下通过具体实施方式和试验例进一步的说明。 

1.菌种的分离、纯化与鉴定 

1.1材料与方法 

菌种XP-8的制备：取新鲜的杜仲树皮，切成约0.5cm×0.5cm大小的小块， 先在70％酒精中浸泡1min，然后用3％次氯酸钠(有效氯)溶液处理2min，无菌水清洗两次，接种于PDA培养基平板上，25℃下培养。培养3-5d，待平板上菌丝萌发时，用划线或稀释等分离方法，挑取形态不同的菌落，转入到PDA斜面培养基上，在25℃条件下培养。经过分离、筛选、纯化的反复过程，直至得到纯化的典型菌落。纯化后的菌种移至PDA培养基的斜面上培养后，4℃保存。 

菌种的形态学观察：将活化后的菌种XP-8接于PDA培养基中，于28℃恒温培养15d，每天观察其菌落形态特征；同时将菌株XP-8点接于燕麦片琼脂培养基中央，于22℃培养，待长出黑色载孢体后，挑取载孢体切开后制片，在Motic BA 400数码成像光学显微镜下获取菌株的显微形态，使用软件Motic 3.1Preview Software对图像进行分析。 

菌种的ITS区序列分析：用BioFlux公司Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取XP-8的总DNA，用TaKaRa公司的Fungi Identification PCR Kit(D317)进行ITS区全序列PCR扩增，由北京奥科生物科技有限责任公司对PCR扩增的特异性产物进行测序。 

序列分析与系统树的构建：将测序获得的ITS序列在GenBank中进行BLAST比较搜索，下载同源性序列，用ClustalX 1.8(Thompson et al.1997)进行序列比对(alignment)，用MEGA4.02Neighbor-Joining法(NJ)构建系统发育树，并进行1000次Bootstrap检验。(许超德和李绍兰2004)。 

1.2结果与分析 

试验以丝状真菌为主要分离目标，经过分离、筛选、纯化的反复过程，得到了18株菌落特征各不相同的真菌菌株。用HPLC对分离到的18株杜仲内生菌进行产PDG的能力鉴定，通过检测发现有3株菌能产生PDG(表1)。其中菌株XP-8产PDG的能力最强，产量为11.65mg/L，远远高于其他两株菌的PDG产量。 

表1PDG产生菌的菌落形态和PDG的产量 

将菌种XP-8接种于PDA平板后，菌株在28℃下培养5d后长满平板，菌落紧贴培养基，菌丝白色，呈环形匍匐生长(图1A)。继续培养至15d，菌落上长出肉眼可见的黑色小点，菌丝呈从卷毛状，中央浓厚，呈乳白色，外围菌丝较稀疏，略带黄色，基质呈灰黄色(图1B)。 

株接种于燕麦片琼脂培养基上，在22℃培养7d后长出黑色载孢体。挑取载孢体切开后制片观察，发现一种类型的孢子，单孢，无色，长椭圆形，(5.5～7.2)20μm×(1.8～2.5)μm(图1C)，未发现其他形态的孢子。 

通过PCR扩增及序列分析，获得了菌株XP-8的rDNA ITS区的基因片段(图2)和序列(图3)。结果发现，内生菌XP-8的rDNA ITS区基因序列长度为456bp，与Phomopsis sp.VegaE3-78(EF687934)在一个分支中，与此菌株的进化距离最近，序列同源性达96.2％。可以认为，内生菌XP-8与Phomopsis sp.VegaE3-78(EF687934)同属于一个属，即拟茎点霉属(图4)。内生菌XP-8于2009年12月9号送入中国典型微生物保藏中心进行保藏，入编号为CCTCC M209291。 

2.菌种的生长特性 

2.1材料与方法 

温度条件：用无菌打孔器切取10个直径5mm的菌丝圆片移植于察氏培养基平板的中央，分别置于5、10、15、20、25、28、30、35、37、40℃的恒温恒湿培养箱中，培养4d后测量菌落直径，计算菌落直径延伸速度，每个处理重复3次。菌落直径延伸速度计算公式为：菌落直径延伸速度(cm/d)＝菌落直径(cm)/生长天数(d)。 

pH值、碳源、氮源条件：用打孔器打取3个直径5mm的菌丝圆片分别移植于不同pH值的察氏培养基平板、不同碳源培养基平板和不同氮源培养基平板的中央，于28℃下恒温培养4d后测量菌落直径，计算菌落直径延伸速度，每个处理重复3次。 

2.2结果与分析 

温度：菌株XP-8在20～35℃的温度范围内均能较好地生长，在28℃下的菌落 扩展速度最快；低于5℃或高于40℃，菌落均不生长(图5)。长期置于5℃的菌株，置于室温时能很快恢复生长，生活力不受影响；但是，将置于40℃培养的菌株重新置于适宜温度(28℃)下，仍不能生长。 

培养基pH：菌株XP-8在pH值3～12的范围内均能生长，pH值为5时生长最快；菌落在弱酸环境下的生长速度明显大于中性和碱性条件(图6)。 

碳源种类：菌株XP-8不能利用单糖中的苹果酸(四碳糖)，对葡萄糖(六碳糖)的利用能力大于木糖(五碳糖)；对二碳糖中的麦芽糖利用能力最强；对可溶性淀粉的利用能力弱于除苹果酸外的其他多糖(图7)。 

氮源种类：以硝酸钠为唯一氮源时，菌落的生长速度最快；以天门冬氨酸为唯一氮源时，菌落不生长；以甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸为氮源时，菌落均能较好地生长(图8)。 

3.发酵生产 

菌种保藏用斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，自然p H(约7.2)； 

种子培养基：采用察氏培养基，组成为蔗糖30.0g，NaNO3 2.0g，K2HPO41.0g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然p H(约7.89)； 

发酵培养基：蔗糖47.5g，NaNO3 3.0g，K2HPO4 2.83g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然pH(约7.89)； 

发酵生产： 

(1)液体种子的制备：取2cm²活化好的内生菌XP-8菌种接入种子培养基中，装液量为100ml/250ml三角瓶，在28℃、180r/min条件下摇床培养120h； 

(2)液体发酵：以10％(V/V)的接种量将上述培养好的液体种子接入发酵培养基中，发酵培养基在发酵罐中的装量为发酵罐体积的40％～70％，控制发酵罐的搅拌转速为160～180r/min，发酵液温度控制为28℃，培养168～240h； 

松脂醇二葡萄糖苷的含量检测：发酵结束后，用超声波细胞破碎仪对摇瓶中菌体进行破碎，每瓶破碎30min。取破碎液在14000r/min下，离心10min。取上清液，加入2倍体积的95％的乙醇，醇沉过夜。取醇沉液在5000r/min下，离心10min，取上清液减压蒸馏，除去乙醇。用0.45μm的微孔滤膜过滤后用高效液相色谱 (HPLC)进行分析。HPLC的检测条件为：检测波长228nm，柱温25℃，流速1mL/min，进样量10μL。流动相为26％甲醇。 

4.产物的分离提取 

4.1材料与方法 

4.1.1材料 

大孔吸附树脂AB-8、S-8、NKA-2、NKA-9均购于南开大学树脂厂；无水乙醇等均为分析纯；LC-2010A高效液相色谱仪，SCL-10A紫外检测器(日本岛津)；R-201旋转蒸发仪(上海申顺科技仪器公司)；HWY211恒温振荡器(上海智城分析仪有限公司)；赛多利斯电子分析天平等。 

4.1.2发酵液预处理及测定方法 

发酵液预处理：发酵液→离心去除菌体(5000r/min，10min)→取全部上清液醇沉(加入2倍体积的95％乙醇溶液，醇沉24h)→离心(5000r/min，10min)→取上清液→减压浓缩→高速离心(13000r/min，10min)→取上清液(其中松脂醇二葡萄糖的含量为0.195mg/ml)。 

样品中PDG的检测：用0.45μm的微孔滤膜过滤后用高效液相色谱(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)进行分析。HPLC的检测条件为：检测波长228nm，柱温25℃，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为26％甲醇。 

4.1.3静态吸附 

吸附解吸的测定方法：称取0.5g树脂置150mL具塞磨口锥形瓶中，加入PDG浓度为780mg/L的发酵液20mL。恒温振荡(100r/min，20℃)6h(预实验表明已基本平衡)，测定溶液中PDG的剩余浓度。将吸附平衡的树脂滤出放入磨口塞三角瓶中，加入90％乙醇洗脱剂，于20℃振摇6h，测定洗脱液中的PDG浓度。吸附量(mg/g)、吸附率和解吸率按下式计算： 

式中：C₀、C₁、C₂分别为起始溶液浓度、剩余溶液浓度、洗脱液浓度(mg/mL)；V₁、V₂ 分别为吸附溶液体积和洗脱溶液体积(mL)；m为树脂质量(g)。 

等温线的测定：准确称取0.5g树脂6份于150mL锥形瓶中，分别加入浓度为130、260、390、520、650、780mg/mL的PDG发酵液20mL，控制摇床转速为100r/min，温度分别在293K、303K、313K下吸附6h，取其上层清液测定浓度。 

动力学曲线的测定：于150mL锥形瓶中加入0.5g树脂和20mLPDG发酵液(浓度780mg/mL)，控制摇床转速为100r/min，温度分别在293K、303K、313K下吸附6h，每40min取样分析，考察温度对吸附的影响。 

温度对静态吸附的影响：准确称取0.5g树脂于150mL锥形瓶中，加入浓度为780mg/mL的PDG发酵液20mL，置于转速为100r/min的摇床上，温度分别在293K、303K、313K下吸附6h，取其上层清液测定浓度。 

4.1.4动态吸附试验 

上柱液pH对动态吸附的影响：调节上柱液pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11、12，在相同条件下通过树脂柱，充分吸附达平衡，通过测定吸附前后发酵液中PDG的浓度，计算每克树脂吸附PDG的量。 

不同流速下的动态吸附曲线：在最佳温度、pH条件下，上柱液以不同流速条件通过树脂，每2BV收集最后1ml流出液，测定PDG浓度，做动态吸附曲线，考察流速对吸附性能的影响，确定最佳吸附工艺条件。 

乙醇浓度对动态洗脱的影响：常用洗脱液包括甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。出于安全考虑，本研究采用乙醇水溶液做洗脱液。依次用体积分数分别为30％、40％、50％的乙醇水溶液各8BV洗脱，收集洗脱液，检测PDG浓度，确定洗脱液浓度。 

4.2结果与分析 

4.2.1静态吸附 

在相同条件下，测得各树脂的静态吸附结果见表1。由表1可知S-8树脂对PDG的吸附量高于其他树脂，因此选用S-8树脂富集纯化发酵液中PDG。 

树脂S-8在20℃条件下对PDG的吸附量高于30℃和40℃(图9)，说明该吸附过程是放热反应，在一定范围内，温度越低越利于吸附过程的进行。 

树脂的吸附曲线随PDG浓度的增加而逐渐趋于平缓(图10)。在低浓度范围内，S-8树脂的等温吸附曲线是凸的(对吸附量纵坐标方向)，表明树脂与PDG有较强的亲和力，是优惠型吸附。当PDG的浓度较低时，树脂对其吸附量仍保持较高的水平，从而保证了PDG具有较高的回收率。 

表14种树脂的物理结构参数及对PDG的吸附性能 

吸附剂在液相中进行吸附时，实质上是溶剂与被吸附组分对吸附剂的“竞争”，当溶剂的吸附作用可以忽略时，则吸附体系可按单组分吸附来处理。固体吸附剂对溶液中有关组分的吸附常见的吸附等温线有二种类型：一种是单分子层吸附等温线，称为Langmuir方程： 

$\frac{C}{Q_e}=\frac{1}{K_L*Q_m}+\frac{C_e}{Q_m}---\left(4\right)$

一种是指数型的吸附等温线，也称为Freundlich方程式： 

Qe＝K_FCeⁿ    (5) 

其线性化形式为lnQe＝nlnCe+lnK_F(6)。式中：Qe为平衡吸附量(mg/g)，Ce为平衡浓度(mg/L)，Qm为饱和吸附量(mg/g)，K_L为结合常数(L/mg)；K_F、n为等温吸附特征常数，K_L可以评价吸附量的大小，n则可描述等温线的变化趋势。将图10中的相关数据用Langmuir方程和Freundlich线性方程拟合，分别得到相应各回归方程及其参数(见表2)。 

表2吸附等温线拟合方程及方程系数 

从表2的线性回归结果可以看出PDG在S-8树脂上的吸附过程更符合Langmuir方程(相关系数均达到0.99以上)，可以较好地拟合PDG在S-8树脂上的吸附规律。根据Langmuir等温吸附模型的假定，可初步推测S-8大孔树脂对PDG的吸附过程可用呈单分子吸附模型进行描述。Freundlich模型的等温吸附特征常数n值介于0.1～0.5之间，为“优惠吸附”，说明黄姜色素在该树脂上的吸附容易实现。 

由表2可以看出，在20℃～40℃范围内，KL、KF和Qm均随着温度的升高而减少，说明了在一定的温度范围内升低温有利于吸附，该吸附过程放热。较高KL的结合常数值则预示着较强的吸附力的存在。 

不同温度下静态吸附动力学曲线如图11所示，200min以前吸附速率较快，随着吸附时间的延长，吸附速率开始下降，当时间达到240min时，吸附基本达到平衡。可见S-8树脂对PDG具有良好的吸附动力学特性，可以较快的达到吸附平衡，更适于工业化生产。 

一般认为吸附过程包括3个阶段，即液膜扩散、颗粒内扩散及吸附反应，整个吸附过程可能一步或多步控制。一般来说吸附反应较快，不会成为吸附的控制步骤，主要的控制步骤为液膜扩散或颗粒内扩散。分别由液膜扩散和颗粒内扩散方程对时间的线性关系可判定吸附过程的控制步骤。 

液膜扩散方程：-ln(1-F)＝K_mt    (6) 

颗粒内扩散方程：Q_t＝K_pt^0.5+C    (7) 

公式(6)中，F＝Q_t/Q_e，其中Q_t为t时刻树脂吸附松脂醇二葡萄糖苷的量，Q_e为树脂对松脂醇二葡萄糖苷的平衡吸附量，K_m为方程常数。公式(7)中Q_t为t时刻时树脂对松脂醇二葡萄糖苷的吸附量，Q_e为平衡时树脂对松脂醇二葡萄糖苷的吸附量，C为常数，K_p为方程常数。 

将图11的实验数据按式(6)进行处理，以-ln(1-F)对t作图，如图12所示。从图12可见，在S-8树脂吸附初始阶段(t＜200min)，-ln(1-F)对t呈直线关系，可知在初始阶段液膜扩散为主要的吸附速率控制步骤，但在吸附全过程-ln(1-F)对t并不呈直线关系，可能是受颗粒扩散的影响。 

将图12的实验数据以Q_t对t^0.5作图，得图13。从图13看出，当吸附时间大于200min时Q_t对t^0.5呈较好的线性关系，吸附速率主要由颗粒扩散控制，当吸附时间小于200min时Q_t对t^0.5线性关系不好，是因为受到液膜扩散的影响。 

通过上述分析可知，在树脂与溶液最初接触时，PDG的扩散受到颗粒周围液膜两侧浓度差的限制，而此时树脂颗粒中的扩散速率相对来说大得多，表现为液 膜扩散控制，随着吸附过程的进行，树脂颗粒中的浓度梯度逐渐减小，开始表现为颗粒扩散控制。因此，PDG在S-8树脂上的吸附表现为液膜扩散和颗粒扩散共同控制。液膜扩散和颗粒内扩散分别是吸附初期和吸附后期的主要速率控制步骤。 

4.2.2动态吸附试验结果 

上柱液pH对动态吸附的影响：从图14可以看出，当发酵液pH为9时，树脂S-8对PDG的吸附量最大，这可能是因为PDG在弱碱性条件下比较稳定。 

流速对树脂动态吸附的影响：在温度20℃、pH值为9的条件下，分别采用不同流速进行动态吸附，结果见图15。以1BV/h的效果最好，这主要是由于流速慢，有利于PDG在树脂床中充分进行扩散。确定最佳流速为1BV/h。 

乙醇浓度对树脂动态洗脱的影响：图16表明用40％乙醇进行洗脱时，2BV就可将95％的PDG洗脱下来，用30％的乙醇6BV可将95.6％的PDG洗脱下来。但是随着乙醇浓度的增高，洗脱液中杂质增多，为了得到尽可能纯的PDG，选用30％的乙醇6BV进行洗脱。 

综上所述，S-8树脂对发酵液中降压成分PDG(上柱液浓度为195mg/L)进行分离富集的适宜工艺条件为，吸附：20℃，pH值为9，流速1BV/h，溶液处理量16BV；洗脱：洗脱液为30％的乙醇水溶液，用量为6BV。整个纯化过程对发酵液中松脂二葡萄糖苷的收集率为89.8％ 

5.产物的纯化：将所得松脂醇二葡萄糖苷粗提液用孔径为0.45μm的水性醋酸纤维微孔滤膜过滤，取滤液在制备液相色谱仪上进行纯化，收集出峰时间在4.46-4.47min处的组分，即为松脂醇二葡萄糖苷溶液。蒸发挥干溶液中溶剂，所得粉末，即为松脂醇二葡萄糖苷的纯品。 

6.产品特性 

经液质联用检测，所得样品的分子量与杜仲中松PDG分子量相同。经过制备液相处理后，可以得到纯度大于95％的分析纯产品。 

序列表 

SEQUENCE LISTING 

<110>西北农林科技大学 

<120>利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法 

<130>23421 

<160>1 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>456 

<212>DNA 

<213>菌株XP-8的rDNA ITS区的基因序列 

<400>1 

gcttaagttc agcgggtatt cctacctgat ccgaggtcaa attttcagaa gttggccccc    60 

tggagacagg gagcagcccg ggccttccag agcgagatat aactactacg ctcggggtcc    120 

tggcgagctc gccactgaat ttcagggcct gctcctctcg gagcagtgcc ccatcaccaa    180 

gccaggcgcg ataattgaaa tgacgctcga acaggcatga atcagcgaat accagggggc    240 

gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg caattcacat tacttatcgc    300 

atttcgctgc gttctggggc actgccagaa ccaagagatc cgttgttgaa agttttgatt    360 

catttatgtt tgttactcag agatccacta tagaaacaag agtttacctg gccgccggcg    420 

tgctgctccc cgtctccggg gggctcatat ctcaga    456 

Claims (4)

1.内生菌XP-8，中国典型微生物保藏中心保藏，编号为CCTCC M209291。

2.如权利要求1所述的内生菌XP-8，其特征在于：其制备方法如下：

(1)取新鲜的杜仲树皮，切成约0.5cm×0.5cm大小的小块，先在70％酒精中浸泡1min，然后用3％次氯酸钠(有效氯)溶液处理2min，无菌水清洗两次，接种于PDA培养基平板上，25℃下培养；

(2)培养3-5d，待平板上菌丝萌发时，用划线或稀释等分离方法，挑取形态不同的菌落，转入到PDA斜面培养基上，在25℃条件下培养。经过分离、筛选、纯化的反复过程，直至得到纯化的典型菌落；

(3)纯化后的菌种移至PDA培养基的斜面上培养后，4℃保存。

3.一种利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

(1)液体种子的制备：取2cm²活化好的内生菌XP-8菌种接入种子培养基中，装液量为100ml/250ml三角瓶，在28℃、180r/min条件下摇床培养120h；

(2)液体发酵：以10％(V/V)的接种量将上述培养好的液体种子接入发酵培养基中，发酵培养基在发酵罐中的装量为发酵罐体积的40％～70％，控制发酵罐的搅拌转速为160～180r/min，发酵液温度控制为28℃，培养168～240h；

(3)产物的分离：发酵结束后，取发酵液，在5000r/min下离心10min；取上清液，加入2倍于发酵液体积的95％乙醇溶液，静置24h；然后在5000r/min下离心10min；取上清液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下减压浓缩10～20倍，高速离心13000r/min，10min，取上清液；

(4)产物的提取：选用树脂S-8对(3)中所得上清液进行吸附，吸附时，发酵液中松脂醇二葡萄糖苷的浓度为0.195mg/ml，温度为20℃，pH值为9，控制流速1BV/h，溶液处理量20BV；然后，再用洗脱液进行洗脱，洗脱条件是：以30％的乙醇水溶液为洗脱液，控制洗脱液流速1BV/h，洗脱液用量为6BV；收集全部洗脱液，在40℃、真空度0.05～0.09MPa的真空度下蒸发出所有乙醇，所得液体即为松脂醇二葡萄糖苷的粗提液，整个纯化过程对发酵液中松脂二葡萄糖苷的收集率为89.8％；

(5)产物的纯化：将(4)中所得松脂醇二葡萄糖苷粗提液用孔径为0.45μm的水性醋酸纤维微孔滤膜过滤，取滤液在制备液相色谱仪上进行纯化，收集出峰时间在4.46-4.47min处的组分，即为松脂醇二葡萄糖苷溶液。蒸发挥干溶液中溶剂，所得粉末，即为松脂醇二葡萄糖苷的纯品；

上述制备过程中，所用培养基分别为：

内生菌XP-8菌种保藏培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，自然p H(约7.2)；

种子培养基：采用察氏培养基，组成为蔗糖30.0g，NaNO₃2.0g，K₂HPO₄1.0g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然pH(约7.89)；

发酵培养基：蔗糖47.5g，NaNO₃3.0g，K₂HPO₄2.83g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O(100g/L)2滴，蒸馏水1000mL，自然pH(约7.89)；

上述制备过程中，产物纯化所用制备液相色谱纯化的条件为：检测波长228nm，柱温25℃，流动相的流速为12ml/min，进样量4ml/次，流动相为32％甲醇水溶液。

4.如权利要求3所述的一种利用内生菌和微生物发酵法制备松脂醇二葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述松脂醇二葡萄糖苷应用于医药和食品加工以及化学分析与检测等领域。

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