CN101985635B - 高效表达山羊生长激素gh的乳腺特异性表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高效表达山羊生长激素GH的乳腺特异性表达载体，属于生物工程技术领域。GH的cDNA序列见SEQ ID NO.1。生长激素既可以促进乳腺导管形成，也可以促进山羊的乳腺上皮细胞的增殖，从而增加产奶量。将本发明构建的乳腺特异性表达载体pcGH采用脂质体法，导入体外培养的人乳腺癌细胞Bcap-37中，在转染后收集细胞培养上清；采用ELISA的方法检测细胞培养上清中的GH含量。结果显示与未转染pcGH的空白组细胞相比，转染pcGH组细胞GH表达量显著提高。表明pcGH载体可已在乳腺细胞上成功表达GH，为下一步生产转gh基因奶山羊奠定坚实的基础。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种高效表达山羊生长激素GH的乳腺特异性表达载体，属于生物技术领域，具体地讲涉及促进乳腺导管发育、提高奶产量的生长激素GH。
二、背景技术
羊奶是我国奶业的重要组成部分，羊奶脂肪颗粒体积小，蛋白质、矿物质、维生素和生物活性物质含量丰富。羊奶和牛奶相比，脂肪颗粒大小只有牛奶中的1/3，羊奶中脂肪颗粒大小均匀，不饱和脂肪酸含量高，且呈良好的乳化状态，羊奶乳蛋白中含量高，蛋白质结构与母乳相同，蛋白凝块细而软，更利于人体吸收，我国虽是奶山羊饲养大国，但奶产量低，难以满足市场需求。
研究表明，羊奶产量和泌乳期的乳腺上皮细胞的数量和泌乳能力密切相关。生长激素是一种由垂体前叶腺分泌产生的一种蛋白质激素，能够直接或间接刺激细胞分裂，促进细胞增殖。对乳腺组织来说，生长激素最明显的作用就是促进乳腺导管形成，与乳腺基质细胞上的生长激素受体结合促进山羊的乳腺上皮细胞的增殖，维持乳腺上皮细胞数量，延长泌乳期。Knight CH等发现在泌乳的奶山羊乳腺中，生长激素表现出维持乳腺上皮细胞数量的功能。Capuco等研究也发现，生长激素能够通过乳腺导管促进乳腺细胞的增殖，进而延长泌乳维持期。皮下或肌肉注射生长激素可以延长泌乳期，增加奶产量，且奶成分基本没有变化。近年来，分子细胞生物学的研究表明生长激素是主要通过细胞中的信号转导蛋白影响细胞的增殖和分化的。Thomas MJ研究表明，在体外生长激素能够激活Stat1、Stat3、Stat5的表达，Bromberg J等研究等激素的信号通路发现，Stat蛋白对乳腺的增殖和分化中具有重要的作用，Iavni lovitch E等进一步证实，妊娠期和泌乳期乳腺细胞的增殖和发育和Stat5密切相关，MarionBoutinaud等对泌乳期的萨能奶山羊研究发现，GH能够增加转录激活因子Stat1、Stat5影响乳腺细胞的增殖。这些研究表明，GH在增加奶产量方面具有重要的作用，是增加奶产量的候选基因之一。通过常规育种方法费时费力，利用转基因技术，将生长激素在泌乳期持续表达，促进乳的分泌、维持泌乳期乳腺上皮细胞的数量，延长泌乳期，可以很快增加羊奶产量，适应市场需要。
本研究从萨能奶山羊中克隆得到一个与乳腺导管发育和乳腺上皮细胞增殖相关的基因gh，通过构建乳腺特异性表达载体pcGH，研究gh基因在体外人乳腺癌细胞Bcap-37上的表达情况，为进一步生产转gh基因奶山羊提供试验材料。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的在于公开一个山羊生长激素基因gh促进泌乳功能的基因工程应用，构建乳腺特异性表达载体pcGH，山羊乳腺细胞通过脂质体转染的方法，检测转染后GH的表达量，证实载体的有效性，为后期生产转基因奶山羊提供了理论依据，打下了坚实的基础。
技术方案
高效表达山羊生长激素(GH)的乳腺特异性表达载体pcGH的构建，其特征是gh基因具有如SEQ ID N0.1所示的序列，其构建方法包括：
1)萨能奶山羊生长激素gh的克隆
参照Genbank登陆号：Y00767山羊生长激素gh基因的cDNA序列设计一对扩增生长激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoR I限制性酶切位点，下游引物上引入SalI限制性酶切位点：
上游引物ZP3：5’-TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA-3’
下游引物ZP4：5’-TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG-3’
以萨能奶山羊肝脏组织的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后进行PCR扩增；PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，65℃30sec，72℃40sec，30个循环，72℃10min，4℃10min；将PCR产物连接到pMD19-T载体上，送交上海生工测序。测序后获得具有完整编码区的萨能奶山羊生长激素gh基因的cDNA序列SEQ ID NO.1；
2)萨能奶山羊β-乳球蛋白5端和3端的克隆
参照已发表的山羊的β-乳球蛋白序列Genbank登陆号：Z33881，设计一对扩增β-乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位点，在下游引物上引入EcoRI限制性酶切位点，引物序列如下：
上游引物ZP1：5’-ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG-3’
下游引物ZP2：5’-TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG-3’
设计一对扩增β-乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分别引入SalI限制性酶切位点，引物序列如下：
上游引物ZP5：5’-TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT-3’
下游引物ZP6：5’-ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT-3’
以萨能奶山羊肝脏组织提取的DNA为模板，用合成的ZP1、ZP2引物PCR扩增β-乳球蛋白5端，PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，61℃30sec，72℃150sec，30个循环，72℃10min，4℃10min；将PCR产物连接到pMD19-T载体上，测序后获得具有萨能奶山羊β-乳球蛋白5端的DNA序列SEQ ID NO.2；
用合成的ZP5、ZP6引物扩增β-乳球蛋白3端，PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃30sec，67℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃10min，4℃10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，测序后获得具有萨能奶山羊β-乳球蛋白3端的DNA序列SEQ ID N0.3；
3)乳腺特异性表达载体的构建
将SEQ ID NO.1序列、SEQ ID NO.2和序列SEQ ID N0.3序列克隆至骨架载体pIRES2-EGFP上，获得乳腺特异性表达载体pcGH。
有益效果
生长激素基因可以提高哺乳动物的泌乳持续性。体外转染人乳腺癌细胞Bcap-37结果显示，从48小时到第72小时，转染组(只转染乳腺特异性表达载体pcGH)GH表达量均高于对照组(正常培养的人乳腺癌细胞Bcap-37未转染载体pcGH)。其中在第48小时转染组的GH表达量136.48ng/mL极显著高于对照组的GH表达量29.33ng/mL。转染组GH的表达增加量约是对照组的4.5倍。
本发明的gh可作为目的基因导入哺乳动物，促进哺乳动物的乳腺发育，提高泌乳性能，以进行动物品种改良，所编码的蛋白质具有促进泌乳功能。
携带有本发明gh的乳腺特异性表达载体可通过使用脂质体、电转等常规生物学方法转化萨能奶山羊细胞，并将成功转化细胞经核移植生产转gh基因奶山羊。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。所述是对本发明的解释而不是限定。
四、附图说明
图1：乳腺特异性表达载体pcGH的质粒图谱
图2：GH基因的克隆图片
图3：β-乳球蛋白5端基因的克隆图片
图4：β-乳球蛋白3端基因的克隆图片
图5：pcGH质粒Xho I、EcoRI、Sal I酶切验证图片
图6：人乳腺癌细胞Bcap-37细胞转染质粒pcGH后ELISA测定GH表达量
五、具体实施方式
本发明首先扩增目的基因山羊的gh和山羊的β-乳球蛋白5端及3端基因，然后以乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP为基础构建乳腺特异性表达载体pcGH，最后通过脂质体转染的方法，转染人乳腺癌细胞Bcap-37，并且提取蛋白通过ELISA方法，检测转染后的表达效果。
具体涉及的材料和试剂如下：
羊脑垂体，来自于无感染病史的萨能奶山羊，将组织于液氮中保存(购自南京溧水种山羊养殖基地)，pIRES2-EGFP载体(购自Clontech)；人乳腺癌细胞Bcap-37(南京凯基生物公司；货号KG035；名称：人乳腺癌细胞Bcap-37)，载体pMD19-T，JM109菌株(购自大连宝生物，Takara)。
试剂Trizol、MLV-反转录酶购自promega公司，rTaq酶、pMD19-T载体、Agarose Gel DNA Purification Kit、内切酶Xho I、EcoRI、Sal I等均购自TAKARA公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，质粒纯化试剂盒Wizard PureFection Plasmid DNA Purification system购自Promega公司；
脂质体Lipofectamine 2000，胎牛血清购自Invitrogen公司；DMEM培养基(货号：C12430)购自Gibco公司；青链双抗(购自碧云天)；胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松(购自南京生兴生物有限公司)；鼠抗羊生长激素ELISA试剂盒(购自R&D)，其他试剂均为国产或进口分析纯级。
1载体pcGH的构建
1.1山羊生长激素(GH)的克隆
参照已发表的山羊生长激素gh基因的cDNA序列(Genbank登陆号：Y00767)设计一对扩增生长激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoRI限制性酶切位点，下游引物上引入SalI限制性酶切位点：
上游引物ZP3：5’-TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA-3，
下游引物ZP4：5’-TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG-3’
以上引物由上海生工公司合成。
PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，65℃30sec，72℃40sec，30个循环，72℃10min，4℃10min；反应结束后，取20uL，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后，连接到pMD19-T载体上，获得质粒pMD19-T-GH，经菌落PCR及酶切验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。所克隆的生长激素序列与已经在Genebank上发表的序列的同源性为99％，仅在301处有一个碱基T突变成C，进一步分析表明这个点突变并不引起氨基酸的突变，和Genebank上已发表的山羊序列表达相同的生长激素蛋白。
1.2山羊β-乳球蛋白5端及3端的克隆
山羊的β-乳球蛋白是山羊的主要乳清蛋白，该蛋白仅在乳腺中特异性表达，通过对绵羊的β-乳球蛋白基因研究发现，β-乳球蛋白上游-406bp的表达载体就可启动外源基因在转基因小鼠的乳腺组织特异性表达，用绵羊的β-乳球蛋白5端作为调控元件构建的表达载体，已经将人的α-1-抗胰蛋白酶、凝血酶III等在山羊乳腺中特异性表达。山羊的β-乳球蛋白和绵羊的β-乳球蛋白的5’端调控区同源性高达99％，利用山羊的β-乳球蛋白为调控元件也可以指导外源基因在乳腺中特异性表达，成勇等利用山羊的β-乳球蛋白5端为调控元件，成功在小鼠的乳腺中表达了人乳铁蛋白。因此，山羊的β-乳球蛋白可以作为启动外源基因表达在山羊乳腺中特异性表达的启动元件。
本试验以萨能奶山羊的肝脏为材料，用液氮研磨山羊的肝脏组织，根据天根基因组提取试剂盒提取基因组。
参照已发表的山羊的β-乳球蛋白序列Genbank登陆号：Z33881，设计一对扩增β-乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位点，在下游引物上引入EcoRI限制性酶切位点。引物序列如下：
上游引物ZP 1：5’-ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG-3’
下游引物ZP2：5’-TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG-3’
设计一对扩增β-乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分别引入SalI限制性酶切位点。引物序列如下：
上游引物ZP5：5’-TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT-3’
下游引物ZP6：5’-ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT-3’
以上引物由上海生工公司合成。
以萨能奶山羊肝脏组织提取的DNA为模板，用合成的ZP1、ZP2引物PCR扩增β-乳球蛋白5端，PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，61℃30sec，72℃150sec，30个循环，72℃10min，4℃10min；将PCR产物连接到pMD19-T载体上，获得质粒pMD19-T-BLG5，经菌落PCR及酶切验证后，送交上海生工测序。
用合成的ZP5、ZP6引物扩增β-乳球蛋白3端，PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃30sec，67℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃10min，4℃10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，获得质粒pMD19-T-BLG3，经菌落PCR及酶切验证后，送交上海生工测序。
所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。结果表明：该序列与已发表的山羊β-乳球蛋白序列的5端和3端调控区的同源性为99％，通过www.gene-regulation.com/pub/programs.html在线分析表明，该序列包含β-乳球蛋白的外显子1及信号肽序列，在序列的420bp处存在乳腺因子(MGF)，在1946bp处存在有GR(糖皮质结合受体)，在678bp及2050bp处存在MPBF(乳蛋白结合因子)等乳腺特异性表达调控元件；Whitelaw等(2000)发现在β-乳球蛋白3端polyA加尾信号前(-95bp--985bp)存在MAR序列，该序列的存在能够提高外源基因的基础表达水平。本试验的克隆β-乳球蛋白3端的序列与已发表的山羊的β-乳球蛋白3端的同源性高达99％，可以减少插入位点对生长激素表达水平的影响。基于以上分析表明成功构建生长激素表达载体构建成功，为下一步生产高产转基因奶羊奠定了基础。
1.3乳腺特异性表达载体pcGH的构建
1.3.1载体pIRES2-BLG5的构建
将质粒pIRES2-EGFP和步骤1.2中获得到pMD19-T-BLG5载体，同时用限制性核酸内切酶Xho I、EcoRI，分别回收5.3kb和2.2kb左右的片段，连接，获得质粒pIRES2-BLG5，转化JM109感受态菌株，菌落PCR筛选验证阳性克隆，获得2284bp的片段，目的条带大小和预期一致，说明β-乳球蛋白5端已连接到骨架载体上。
1.3.2载体pIRES2-BLG5-GH的构建
将上一步1.3.1获得的质粒pIRES2-BLG5和步骤1.1中获得到pMD19-T-GH，用限制性核酸内切酶EcoRI和Sal I酶切双酶切，分别回收7.5kb和654bp左右的片段。连接，获得质粒pIRES2-BLG5-GH，转化JM109感受态菌株，菌落PCR筛选验证阳性克隆，目的条带大小和预期一致，说明生长激素已连接上。
1.3.3载体pcGH的构建
将上一步1.3.2获得的质粒和步骤1.2中获得到pMD19-T-BLG3载体，分别用Sal I单酶切。酶切后，分别回收8.0kb和1.8bp左右片段，连接获得乳腺特异性表达载体pcGH，转化JM109感受态菌株，菌落PCR筛选验证阳性克隆，和限制性核酸内切酶鉴定，目的条带大小和预期一致，表明成功构建乳腺特异性表达载体pcGH。
2乳腺特异性表达载体pcGH的提取及纯化
将乳腺特异性表达载体pcGH用0MIGA无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化质粒，具体操作步骤见说明书，提取的质粒保存于-20℃，准备细胞转染。
3人乳腺癌细胞Bcap-37的培养
从液氮中取出人乳腺癌细胞Bcap-37，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全溶解。将细胞冻存液移入细胞培养瓶，加入约4mL培养液，放入37℃，5％的C02培养。用体积分数10％胎牛血清、链霉素100ug/mL，青霉素100U/mL的DMEM培养基进行培养。转染前1d，待细胞铺满培养皿底的70％～80％时，改用无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞2次，饥饿24小时后转染。
4转染人乳腺癌细胞Bcap-37
外源基因通过脂质体法转染进入细胞，通常48h后才能表达，选取48h、60h、72h测定外源基因的表达情况，具体试验方案如下：
待细胞铺满培养皿底的70％～80％时，将其接种到六个12孔板中培养，当细胞铺满皿底80～90％时，改用无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞2次，换用无血无抗的DMEM培养基培养，24小时后用于转染。转染前用无血无抗的培养基洗剂一次，转染步骤按Lipofectamine 2000说明书进行转染。细胞培养6h后弃去混合液，用体积分数10％胎牛血清、链霉素100ug/mL，青霉素100U/mL、氢化可的松5ug/mL，胰岛素10ug/mL，转铁蛋白5ug/mL的DMEM培养基进行培养，转染后分别测定48h、60h、72h的表达量。
5转染人乳腺癌细胞Bcap-37后GH的检测
分别于48h、60h、72h收集细胞上清液，用鼠抗羊生长激素ELISA试剂盒检测细胞上清液中生长激素GH的含量，操作步骤按说明书进行。结果显示，从48小时到第72小时，转染组(只转染乳腺特异性表达载体pcGH)GH表达量均高于对照组(正常培养的人乳腺癌细胞Bcap-37未转染载体pcGH)。其中在第48小时转染组的GH表达量136.48ng/mL极显著高于对照组的GH表达量29.33ng/mL。转染组GH的表达增加量约是对照组的4.5倍。以上结果表明：本专利构建的乳腺特异性表达载体pcGH可以在乳腺上皮细胞上高效的表达生长激素基因。
Claims (1)
1.一种高效表达山羊生长激素GH的乳腺特异性表达载体，其gh基因序列如SEQID NO.1所示的序列，其构建方法包括：
1)萨能奶山羊生长激素gh的克隆
参照Genbank登陆号：Y00767山羊生长激素gh基因的cDNA序列设计一对扩增生长激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoRI限制性酶切位点，下游引物上引入SalI限制性酶切位点：
上游引物ZP3：5’-TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA-3’
下游引物ZP4：5’-TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG-3’
以萨能奶山羊肝脏组织的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后进行PCR扩增；PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，65℃30sec，72℃40sec，30个循环，72℃10min，4℃10min；将PCR产物连接到pMD19-T载体上，送交上海生工测序，测序后获得具有完整编码区的萨能奶山羊生长激素gh基因的cDNA序列SEQ ID NO.1；
2)萨能奶山羊β-乳球蛋白5端和3端的克隆
参照已发表的山羊的β-乳球蛋白序列Genbank登陆号：Z33881，设计一对扩增β-乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位点，在下游引物上引入EcoRI限制性酶切位点，引物序列如下：
上游引物ZP1：5’-ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG-3’
下游引物ZP2：5’-TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG-3’
设计一对扩增β-乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分别引入SalI限制性酶切位点，引物序列如下：
上游引物ZP5：5’-TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT-3’
下游引物ZP6：5’-ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT-3’
以萨能奶山羊肝脏组织提取的DNA为模板，用合成的ZP1、ZP2引物PCR扩增β-乳球蛋白5端，PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，61℃30sec，72℃150sec，30个循环，72℃10min，4℃10min；将PCR产物连接到pMD19-T载体上，测序后获得具有萨能奶山羊β-乳球蛋白5端的DNA序列SEQ ID NO.2；
用合成的ZP5、ZP6引物扩增β-乳球蛋白3端，PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃30sec，67℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃10min，4℃10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，测序后获得具有萨能奶山羊β-乳球蛋白3端的DNA序列SEQ ID NO.3；
3)乳腺特异性表达载体的构建
将SEQ ID NO.1序列、SEQ ID NO.2和序列SEQ ID NO.3序列克隆至骨架载体pIRES2-EGFP上，获得乳腺特异性表达载体pcGH。
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| 于永生，等.表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建.《生物技术通讯》.2009,第20卷(第4期),523－525. * |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120613 Termination date: 20131116 |