CN101979592B - 固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

一种生物技术领域的固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列。所述的序列具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列的多肽，该多肽由547个氨基酸组成，分子量为59.292kDa。该序列克隆和表达的方法：从固氮鱼腥藻中提取总DNA，对其基因进行克隆与测序；重组质粒的筛选鉴定；鉴定重组菌表达产物的相对分子质量和表达量，确定目的蛋白；通过对ALS酶催化的以丙酮酸为底物的反应后产物3-羟基-2-丁酮含量多少的测定ALS酶的活性。本发明对于ALS酶编码基因ilvB的克隆和异源表达，对进一步理解除草剂与靶分子的作用方式具有重要的指导作用。

Description

固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的基因序列，具体是一种固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因(ilvB)的核苷酸序列。

背景技术

植物氨基酸合成中的关键酶一直是新型除草剂研发中重要的靶标酶，在除草剂的研究和应用领域中，通过抑制氨基酸生物合成中关键酶的活性而发生作用的除草剂占很大比重，而靶标乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂是目前开发最活跃的领域之一。ALS抑制剂具备生物活性高、杀草谱广的优点，由于其作用靶标ALS酶不涉及人和动物，因此该种除草剂对人和动物具有很高的安全性。

乙酰乳酸合酶(acetolactate synthetase，ALS)，也称乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacidsynthetase，AHAS)，是支链氨基酸合成中的一个关键酶(Gaston S，Ribas-Carbo M，BusquetsS，et al.Changes in mitochondrial electron partitioning in response to herbicides inhibitingbranched-chain amino acid biosynthesis in soybean[J].Plant Physiology，2003，133：1351-1359.)。在缬氨酸和亮氨酸的合成中催化二分子丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在异亮氨酸的合成中催化一分子丙酮酸与一分子丁酮酸生成2-乙醛基-2-羟基丁酸和二氧化碳(DugglebyR G，Pang S S.Acetohydroxyacid synthase[J].Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2000，33：1-36.)。ALS酶活性受到抑制，将造成支链氨基酸合成受阻，进而影响蛋白质合成及植物生长(Grandpmo J A，Peter J M.Inhibitors of branched-chain amino acid biosynthesis aspotential antitaberculossis methyl[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，1998，42：475-482.)。

固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)作为我国农田中藏量丰富的优质资源，在生物固氮、固碳、减排作用上具有极大的潜力和应用价值。它能固定大气中的游离氮并能合成各种氮化物，固氮量达10-51N kg/ha，其藻体沉入土壤后被作物根系吸收，能改善土壤肥力和结构，不污染土壤、水与环境，其特有的藻促生长素能促进作物茁壮生长(Vaishampagan A.，Sinha R.P.，Hader D.P.，and Dey T.Cyanobacterial bio-fertilizers in rice agriculture.Botanical Review，2001，67：453-460.)。近年来，固氮蓝藻的卓越生态功能和其在精细化学品、清洁能源以及作为模式生物等方面的广泛用途而倍受国内外学者的青睐。由于固氮蓝藻具有与高等植物相似的光合系统及其靶标ALS酶，ALS抑制剂类除草剂在防除杂草的同时，必定对环境中，尤其是水环境中的固氮蓝藻产生影响。但ALS抑制剂除草剂如何作用于固氮蓝藻靶标ALS酶，其致毒分子机理怎样至今尚未清楚。

作为ALS抑制剂类除草剂的作用位点，ALS及其基因一直是近年来国内外研究的热点。ALS基因是一个十分保守的基因，这就决定着ALS功能的重要性和不可替代性，在生物的进化过程中作用突出。自在E.coli中被发现以来，目前已报道来源于50多个不同生物的ALS基因。其中酵母ALS基因的克隆、原核表达、纯化和部分氨基酸的功能得到了系统的研究；烟草的ALS基因在E.coli中得以成功表达。但至今对固氮蓝藻ALS基因的克隆、表达和功能的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列。本发明公开固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)基因组中一种编码ALS酶的基因ilvB的核苷酸序列及其蛋白质序列，提供该基因的克隆和异源表达的方法，建立ALS外源表达体系，并对该基因进行了初步功能分析和表达蛋白的活性测定，对于新型除草剂的分子药物设计、酶抑制农药残留速测以及固氮蓝藻抗性种质资源研究等方面具有重要的指导作用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的一种分离出的DNA分子，该分子编码具有固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶蛋白质活性的核苷酸序列，所述的序列具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽，该多肽由547个氨基酸组成，分子量为59.292kDa；所述的序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还涉及如上述的固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列，其克隆和表达的方法，包括以下步骤：

①从固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)中提取总DNA，对其基因进行克隆与测序；

步骤①中所述的克隆与测序是指：设计引物，进行PCR反应体系、程序条件，通过PCR获取ALS编码基因ilvB，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收后与pMD18-T Simple vector连接，得到重组质粒，而后热击转化感受态E.coli DH5a，在含有Amp的LB平板上挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提质粒进行PCR和酶切验证、测序。

②设计去终止子下游引物，采用T7表达系统对固氮鱼腥藻ALS基因进行外源表达，重组质粒的筛选鉴定；

步骤②中所述的筛选鉴定，选用载体pET-28a(+)，对重组子pMD18-ALS进行EcoR I、Xho I双酶切，胶回收后，通过T4DNA连接酶连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)，进行重组质粒的筛选鉴定。

③通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，鉴定重组菌表达产物的相对分子质量和表达量，确定目的蛋白。

步骤③中所述的确定目的蛋白，其方法如下：

a.将鉴定为阳性的重组菌按1∶100比例接种于5ml培养液(含100μg/mL卡那霉素)中，37℃振摇培养过夜，再取培养物200μl接种于盛有20mlLB培养液(含100μg/mL卡那霉素)的三角瓶中，振摇培养约2.5h至OD600约为0.6时，以IPTG进行ALS的诱导表达，并通过不同的浓度和时间的诱导确定优化表达的条件，最终通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测推断加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L、培养时间5h时蛋白表达量最高；

b.以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测鉴定重组菌表达产物的相对分子质量和表达量，确定目的蛋白：

将诱导表达的重组菌收集、离心、洗涤后，重悬于PBS中进行反复冻融破碎，共约8次，期间加入微量溶菌酶至终浓度约为5mg/ml，对破碎后的细胞混合液离心(10,000r/min，10min，4℃)，然后取上清液。在上清液中按每100mL液体加入31.3g硫酸铵晶体的比例进行蛋白质的盐析。0℃下盐析2小时后，进行离心(10,000r/min，30min，4℃)，然后弃去上清液，留在离心管底部的即为ALS酶，加入适量酶溶解液搅拌溶解后黑暗下冰水浴中保存备用。

步骤b中所述的离心所得沉淀即为包涵体，取少量包涵体作SDS一PAGE分析，观察重组蛋白的产量及破碎前后量的变化。同时以镍柱亲和层析进行重组蛋白包涵体的纯化。

④通过对ALS酶催化的以丙酮酸为底物的反应后产物3-羟基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone，Acetoin)含量多少的测定ALS酶的活性；

步骤④中所述的测定ALS酶的活性，包括步骤如下：

a.在离心管中加入0.5mL酶液和0.5mL酶反应液。空白组加入0.5mL100mmol/L磷酸缓冲液和0.5mL酶反应液；

b.摇匀后将各组试管同时放入37℃水浴中，水浴1h后加入0.1mL的3mol/L硫酸，作用是终止反应；

c.将试管转入60℃水浴脱羧15min，然后加入0.5mL0.5％肌酸和0.5mL5％甲萘酚(溶于2.5mol/L的NaOH溶液中)，作用是与产物Acetoin发生显色反应，保留在60℃水浴中显色15min；

d.显色结束后将混合液移入比色皿，静置30min后以对照为空白用722型光栅分光光度计在525nm波长处比色。结果用nmol3-羟基-2-丁酮/mg(蛋白质)/h表示。

经本发明外源表达的固氮雨腥藻ALS酶比活力为134.60。

本发明目前乙酰乳酸合酶基因已公布的鱼腥藻属菌有Anabaena sp.PCC7120等，通过在所克隆的固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)乙酰乳酸合酶基因两端分别加上EcoR I、Xho I限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pMD18-T Simple Vector和pET28(a)+连接并转化大肠杆菌克隆和表达宿主菌，实现了ALS基因的克隆和外源表达。

本发明实现在大肠杆菌中的重组表达，可为深入研究固氮蓝藻ALS酶的结构和功能部位，探索除草剂与靶分子的作用方式，在新型除草剂的分子药物设计、酶抑制农药残留速测以及农作物抗性种质资源研究等方面具有重要的指导作用。

本发明所涉及的固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供，并已在《Jianying Shen，Antonio DiTommaso，Mingquan Shen，Wei Lu，and ZhengmingLi；Molecular basis for differential metabolic responses to monosulfuron in threenitrogen-fixing cyanobacteria，Weed Science，2009，57：178-188》等中公开。

本发明中所涉及的pMD18-T Simple Vector载体和菌株DH5α基因工程菌已在《陈秋晨，王琳，陈再兴，王岩，孟繁浩，张岐山；大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达，中国生化药物杂志，2008，30(3)：171～177》中公开，相关菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如宝生物工程(大连)有限公司，公司地址：辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号。

本发明中所涉及的带有T7RNA聚合酶基因的菌株大肠杆菌BL21(DE3)已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48(7)：963～969》中公开，相关菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号 航星商务楼1号楼606室。

附图说明

图1ALS基因PCR扩增的琼脂糖电泳结果

M：DNA标准分子量SM0197；1、2、3：PCR温度梯度依次为48.6℃、49.4℃、50.6℃的产物样品编号

图2重组质粒pMD18-ALS的双酶切鉴定

M：DNA标准分子量SM0197；N：空载体pMD18-T Simple Vector；1、2、3、4、5、6、7：重组子挑选质粒提取样品编号

图3固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)与Anabaena sp.PCC7120的ALS酶编码序列相似性比较

图4重组菌表达优化条件及表达产物的检测

M：蛋白质标准分子量；N：无ALS基因导入的pET28(a)+转化菌；0：未经诱导的重组菌产物；1、2、3、4、5：分别以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L IPTG诱导的表达产物

图5表达蛋白纯化咪唑浓度选择及检测

M：蛋白质标准分子量；L：样品加入后穿透部分收集电泳条带；0、1、2、3、4、5：咪唑洗脱浓度分别为0、25、50、100、200、250mmol/L时蛋白纯化效果

图6咪唑洗脱浓度为100mmol/L时蛋白纯化效果

M：蛋白质标准分子量；1、2、3、4、5、3C：依时间顺序的洗脱收集体积(3C为3的重复点样)

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecularcloning：A laboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例依据NCBI GenBank中已登录的ALS基因序列，以“Primer Premier 5.0”软件设计引物，提取蓝藻总DNA，对ALS编码基因PCR扩增。采用pMD18-T Simple Vector载体和DH5α基因工程菌进行目的片段的克隆与测序，使用序列分析软件DNAMAN对所得序列进行比较分析。以pET28(a)+载体和BL21(DE3)对ALS进行外源表达，建立ALS酶外源表达体系。对重组子pMD18-ALS进行双酶切，通过T4DNA连接酶连接后转入带有T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)，进行重组质粒pET-ALS的筛选鉴定。以IPTG进行ALS的诱导表达，并通过不同的浓度和时间的诱导确定优化表达的条件。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测鉴定重组菌表达产物的相对分子质量和表达量，确定目的蛋白。以镍柱亲和层析进行重组蛋白包涵体的纯化。

实施例1

固氮鱼腥藻ALS基因的克隆测序

(1)蓝藻总DNA的提取。操作步骤如下：收集藻液于1.5ml离心管中，离心8000rpm，5min。加入STE液，小心混匀后于室温下放置10min，再次离心8000rpm，5min。弃上清，加入裂解液，通过反复冻融藻液呈蓝色状。加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml，37C水浴放置30min。加入SDS至终浓度1％，37C水浴10min。加入等体积的苯酚，氯仿：异戊醇抽提，37C水浴中放置5-10min，离心12000rpm，10min，4℃(取上清液0.5ml于另一离心管，重复此步骤，直到溶液呈现很淡的红色)。加入1/3体积的乙酸铵，2倍体积的异丙醇，混合均匀，-20℃放置15min。12000rpm，20min，4℃离心，去上清液，加入400μL70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm，10min离心，重复上述步骤一次。干燥沉淀，加入30～50μL TE融解。

(2)引物设计及PCR扩增。依据NCBI GenBank中已登录的Anabaena sp.PCC7120ALS基因序列以及保守序列的比对，以“Primer Premier 5.0”软件设计引物，进行ALS基因PCR扩增(杭州博日科技TC-96型基因扩增仪)：

上游引物5’ccggaattcatgaatacagcagaactgttag 3’Tm：69.7

下游引物5’ccgctcgagctaaacagaacaacttaac 3’Tm：67.5

PCR反应体系：11管×

Buffer 32μL，MgCl₂32μL，dNTP 6.4μL，引物各6.4μL，DNA聚合酶3.2μL，ddH₂O 204μL

扩增程序：94℃ 3min；94℃ 45s，49℃ 1min，72℃ 2min；72℃ 10min；4℃保存。

如图1所示，PCR产物1％琼脂糖电泳，切胶回收后清晰无杂带(北京六一仪器厂，DYY-6C型电泳仪，DYCP-31DN型电泳槽)。将回收后的PCR产物与TaKaRa公司pMD18-T SimpleVector载体连接，以备转化E.coli DH5α感受态细胞。

(3)基因连接与转化。感受态细胞的制备方法：挑取大肠杆菌菌液，37℃，振荡培养5h；吸取上述菌液1ml至Ep管，冰上放置10min，8000rpm离心4min弃上清，倒置离心管控干液体；加入1ml预冷CaCl₂溶液重悬于冰上30min；8000rpm离心4min，加入60μLCaCl₂溶液，重悬于冰上。

热击法转化pMD18-ALS：加入5μL DNA样品，摇匀，冰浴30min；42℃，水浴90s；放置于冰上3min。加入800μL LB培养基，37℃，摇床放置1h。

重组子的挑选与鉴定：取100μL菌液涂于含有X-Gal和氨苄青霉素的LB平板，37℃培养15h，挑取白色菌落，振荡过夜培养，提取质粒，经酶切和PCR检测成功后送于上海生工测序，如图2所示。EcoR I和Xhol I对重组质粒pMD18-ALS双酶切，反应体系如下：二种酶各0.5μL，Buffer 1μL，质粒DNA 4μL，ddH₂O 4μL。反应时间3h。

(4)基因的测序分析。测序所得基因序列全长1644bp，可编码547个氨基酸组成的蛋白质序列。使用序列分析软件DNAMAN对所得序列进行比较分析，固氮鱼腥藻(Anabaenaazotica)与Anabaena sp.PCC7120的ALS酶编码基因具有很高的同源性，高达89.54％，这一结果也说明了在固氮蓝藻中ALS编码序列具有相对高的保守性，如图3所示。

实施例2

固氮鱼腥藻ALS酶外源表达载体pET-ALS的构建

设计去终止子下游引物序列：

5’ccgctcgagaacagaacaacttaactcac 3’

再次扩增ALS基因，经测序分析终止子序列TAG已去除，大量提取重组克隆质粒，以EcoRI和Xho I对重组质粒pMD18-ALS双酶切，切胶回收目的基因片段。同时振荡培养含pET28(a)+空载体宿主菌，提取质粒双酶切，切胶回收大片段条带。

通过T4DNA连接酶将上述回收片段连接。连接体系10μL：DNA 5μL，载体3μL，Buffer1.5μL，酶0.5μL。

连接后转入带有T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)，进行重组质粒pET-ALS的筛选鉴定。感受态细胞制备以及转化方法同实施例1。

实施例3

固氮鱼腥藻ALS酶外源诱导表达

以IPTG进行ALS的诱导表达，并通过不同的浓度和时间的诱导确定优化表达的条件。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测鉴定重组菌表达产物的相对分子质量和表达量，确定目的蛋白。SDS-PAGE操作按常规分子学实验手册进行。

将鉴定为阳性的重组菌按1∶100比例接种于5ml培养液(含100μg/mL卡那霉素)中，37℃振摇培养过夜；取培养物200μL接种于盛有20mlLB培养液(含100μg/mL卡那霉素)的三角瓶中，200rpm振摇培养约3h至OD ₆₀₀约为0.6时，加入IPTG使终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L，37℃诱导表达5h，以确定IPTG的最佳诱导浓度；在已确定的最适浓度下，于37℃分别诱导表达1h、3h、5h以确定最佳诱导时间。

分别取各实验组诱导表达菌液1ml，12000rpm离心1min，弃上清，于沉淀中加入50μL，8mol/L尿素充分悬浮，室温静置0.5h，加等体积的2*SDS-PAGE上样缓冲液混匀，水浴煮沸3min，进行SDS-PAGE分析，参照蛋白分子质量标准条带判定结果，进行重组蛋白相对表达量的测定(北京六一仪器厂，DYY-6C型电泳仪，DYCZ-24D型电泳槽)。同时设未诱导表达的该重组菌菌液为对照确定重组菌诱导表达优化条件。经分析，外源条带大小在59KDa左右，目的蛋白经诱导后已大量表达，并且当IPTG终浓度0.6mmol/L时表达量最高，如图4所示，。

实施例4

外源重组表达ALS酶的活性测定

通过反复冻融破碎细胞获取包涵体以及含有可溶性表达蛋白的上清液。

收集诱导表达的重组菌全菌液，4℃，7500rpm离心10min，弃上清。分别用去离子水和冰冷的1*PBS(pH7.4)洗涤菌体沉淀各一次，每次4℃，7500rpm离心10min，弃上清。按5mlPBS/100ml原菌液量重悬菌体沉淀，反复冻融破碎细胞，4℃，7500rpm离心10min，即得上清液和包涵体沉淀。用细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0、10mmol/L EDTA、50mmol/LNaCl、0.5％Triton-X 100)洗涤所得包涵体2到3次，去离子水洗涤1到2次，之后将其置于一20℃冻存备用；100mL液体加入31.3g硫酸铵晶体的比例对上清液中的蛋白质进行盐析。

同时取少量包涵体和盐析上清液蛋白作SDS一PAGE分析，观察重组蛋白的产量及破碎前后量的变化，得出在上清液中ALS蛋白含量较多。因表达载体pET-28(a)+表达产物含有组氨酸标签蛋白，对于重组蛋白包涵体的纯化可用镍柱亲和层析进行。本发明采用镍亲和层析试剂盒(上海生工BSP079，柱料为柱料为Ni-NTA His·Bind Resins)变性条件下纯化包涵体，具体洗脱步骤按操作手册进行。经SDS-PAGE电泳图片检测，发现咪唑浓度为100mmo1/L时洗脱纯化效果最好，如图5所示，因此取咪唑浓度为100mmo1/L时收集的5管再次点样检测，如图6所示，。

通过考马斯亮蓝测定上清液中蛋白质浓度(日本岛津UV 2401型紫外分光光度计)。通过对ALS酶催化的以丙酮酸为底物的反应后产物3-羟基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone，Acetoin)含量多少的测定来反映ALS酶的活性大小，步骤如下：

在试管中分别加入0.1mL不同浓度的待测药剂溶液，再加入0.5mL酶液和0.5mL酶反应液。空白组加入0.5mL100mmol/L磷酸缓冲液和0.5mL酶反应液。摇匀后将各组试管同时放入37℃水浴中，水浴1h后加入0.1mL的3mol/L硫酸，作用是终止反应。将试管转入60℃水浴脱羧15min，然后加入0.5mL0.5％肌酸和0.5mL5％甲萘酚(溶于2.5mol/L的NaOH溶液中)，作用是与产物Acetoin发生显色反应，保留在60℃水浴中显色15min。显色结束后将混合液移入比色皿，静置30min后以对照为空白用722型光栅分光光度计在525nm波长处比色。结果用nmol3-羟基-2-丁酮/mg(蛋白质)/h表示。

比活力计算公式：

比活力＝AcetoinOD值×k/蛋白质含量(mg)/1hour

其中k表示Acetoin标准曲线的斜率。

经计算，以上实施例外源表达的固氮雨腥藻ALS酶比活力为134.60，与固氮鱼腥藻离体ALS酶活力110.0相比，略有增加，进一步证实了以上实施例外源表达ALS酶的可行性及其在分子药物设计、酶抑制农药残留速测等方面的应用前景。

Claims (2)

1.一种固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因，其特征在于，所述的固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的固氮鱼腥藻乙酰乳酸合酶基因，其特征在于：所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

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