CN101974497A

CN101974497A - 一种超氧化物岐化酶的制备方法

Info

Publication number: CN101974497A
Application number: CN2010105488314A
Authority: CN
Inventors: 周国富; 郭锋利; 许晓东
Original assignee: JIANGSU BANG'AN NEW MATERIALS TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU TAILI SANJIA NANO TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2011-02-16

Abstract

本发明涉及广泛存在于生物体内的金属酶的制备方法，尤其是一种超氧化物岐化酶的制备方法。包括种子培养、紫红曲发酵、菌体破碎、粗酶获得及酶精制，具体为：菌体的培养，然后高通氧诱导酶表达，均质机破除菌体，70%硫酸铵沉淀，SephdexG-25胶盐，得到超氧化物岐化酶产品。本产品相对于目前技术来说具有酶表达量及回收率高，节省能源，降低成本。

Description

一种超氧化物岐化酶的制备方法

技术领域

本发明涉及广泛存在于生物体内的金属酶的制备方法，尤其是一种超氧化物岐化酶的制备方法。

背景技术

超氧化物歧化酶( superoxide dismutase , 简称SOD) ，是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基，己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂，SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能,在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。因此对于SOD的需求量也越来越大。

到现在为止，人们已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物等生物体内分离得到SOD，因此现在工业上人们提取SOD的来源也比较广泛，包括了动物，植物和多种微生物。由于微生物容易培养，来源不受限制，因此相在人们更青睐于利用微生物制备SOD。但细菌酶在基因表达后缺乏真核生物的修饰步骤，因此在实践中应用没有真核生物来源的SOD对人类健康生活效果明显。

发明内容

本发明应用一种丝状真菌作为SOD的生产菌，在菌生长达到平台期后，加大通氧量面诱导SOD大量表达。具体过程如下：

一种超氧化物岐化酶的制备方法，包括种子培养、紫红曲发酵、菌体破碎、粗酶获得及酶精制，具体为：菌体的培养，然后高通氧诱导酶表达，均质机破除菌体，70%硫酸铵沉淀， Sephdex G-25胶盐，制得超氧化物岐化酶。

所述种子培养采用丝状真菌，菌种保藏号为CGMCC 3.5833。

所述紫红曲发酵-为在28℃条件下培养紫红曲，菌体生长到达平台期后，加大通氧量30-50% 2-4小时，使酶表达，然后收集，得到培养菌液

所述培养菌液过滤后，经均质机破除菌体，加入pH 5.5-6.5的0.05 mol/L的Tris缓冲液，于4-10度快速振荡10分钟，让酶液完全与残余菌体分离溶解于缓冲液中，过滤去除菌体，上清液加入硫酸铵使最终浓度达到70%，搅拌2小时使酶沉淀，离心，得到粗酶。

所述粗酶经 Sephdex G-25柱层析，分步收集，得超氧化物歧化酶。

所述超氧化物歧化酶用奈氏试剂检测脱盐的SOD酶液，用NBT光化还原法测定SOD活性。

奈氏试剂的配制：

将10g碘化汞和7g碘化钾溶于10ml水中，另将24.4g氢氧化钾溶于内有70ml水的100ml容量瓶中，并冷却至室温。将上述碘化汞和碘化钾溶液慢慢注入容量瓶中，边加边摇动。加水至刻度，摇匀，放置2天后使用。试剂应保存在棕色玻璃瓶中，置暗处。

硫酸铵测定：

配制已知浓度标准硫酸铵溶液；以此系列硫酸铵溶液中加入奈氏试剂在420nm处比色，绘制标准曲线，以此为基础，得出待测液中硫酸铵含量。

NBT光化还原法测定SOD活性

在盛有3 mL反应混合液的试管中，加入适量SOD 酶液，混匀后放在试管架上。5500 光照度下照光15 min 后，取出试管，采用UV2755B 紫外分光光度计迅速测定OD₅₆₀值。以不加酶液(用相同体积的缓冲液代替)的反应液试管照光为最大还原管，不照光的作空白管。SOD 活性计算, 以能抑制NBT光还原反应50%的酶量为1 个酶活单位(U) ，酶活性以U/mg蛋白表示，按公式SOD活性=[(OD_max - OD₅₆₀) /OD_max]/[(50 %) ×3 mL反应混合液中加入的蛋白质的量(mg) ]计算酶活。

本发明相对于目前技术来说具有酶表达量及回收率高，节省能源，降低成本。

附图说明：

图1 是紫红曲生产制备SOD工艺路线图

具体实施方式：

为了更好的说明该专利，下面结合实施案例，对本发明作详细说明。

实施例1：

（1）种子培养：

配制种子培养基（葡萄糖30 g、豆粉20 g、甘油70 g、蛋白栋2 g、NaNO₃ 2 g、MgSO₄ 1 g、水1000 mL）300 mL，置于1000 mL三角瓶中，在1.1kg/cm²压力下灭菌30 分钟, 然后按10%（v/v）接种pH3-5的吐温洗下的紫红曲（Monascus purpureus Went. ，菌种保藏号为：CGMCC 3.5833）斜面的培养物菌悬液。于28°摇瓶200转/分钟培养3-4天。

（2）紫红曲发酵：

发酵培养基为以下成份比例组成：马铃薯浸取液 1000 mL、葡萄糖20 g，自然pH。取去马铃薯200 克，切成小块，加水1.0升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0升。

取上述培养基3 L放入5 L发酵罐，在1.1kg/cm²压力下灭菌30 分钟。把上述培养种子液按10%（v/v）接种，搅拌速度为300 rpm，通氧量为2升/分钟，培养3天后，将通氧量提高30%，达到2.6升/分钟，再培养2小时。

（3）菌体破碎：

终止发酵，所得到培养菌液经过四层沙布过滤收集到菌体，经均质机破除菌体，加入pH 5.5的0.05 M的Tris缓冲液，于4°快速振荡10分钟，让酶液完全与残余菌体分离溶解于缓冲液中。

（4）粗酶获得：

过滤去除菌体，上清液加入硫酸铵使终浓度达到70%，搅拌2小时使酶沉淀，离心，得到粗酶。

（5）酶精制：

上述得到粗酶溶解于最少量的0.05mol/L Tris缓冲液（pH 5.5）中，经 Sephdex G-25柱层析，分步收集，用奈氏试剂检测脱盐的SOD酶液中硫酸铵含量，用NBT光化还原法测定SOD活性。得到的酶喷雾干燥，得到酶蛋白质10.2 g，测得酶比活为1250Ｕ/g。

Claims

1.一种超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是：包括种子培养、紫红曲发酵、菌体破碎、粗酶获得及酶精制，具体为：菌体的培养，然后高通氧诱导酶表达，均质机破除菌体，70%硫酸铵沉淀，Sephdex G-25胶盐，制得超氧化物岐化酶。

2.根据权利要求1所述的超氧化物岐化酶的制备方法，所述种子培养采用丝状真菌，菌种保藏号为CGMCC 3.5833。

3.根据权利要求1所述的超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是：所述紫红曲发酵-为在28℃条件下培养紫红曲，菌体生长到达平台期后，加大通氧量30-50% 2-4小时，使酶表达，然后收集，得到培养菌液。

4.根据权利要求3所述的超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是：所述培养菌液过滤后，经均质机破除菌体，加入pH 5.5-6.5的0.05mol/L的Tris缓冲液，于4-10°快速振荡10分钟，让酶液完全与残余菌体分离溶解于缓冲液中，过滤去除菌体，上清液加入硫酸铵使最终浓度达到70%，搅拌2小时使酶沉淀，离心，得到粗酶。

5.根据权利要求4所述的超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是：所述粗酶经 Sephdex G-25柱层析，分步收集，得超氧化物歧化酶。

6.根据权利要求5所述的超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是：所述超氧化物歧化酶用奈氏试剂检测脱盐的SOD酶液，用NBT光化还原法测定SOD活性。