CN101974152A

CN101974152A - 一种类脂-阳离子聚合物及其制备方法

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Publication number: CN101974152A
Application number: CN2010102943806A
Authority: CN
Inventors: 张娜; 孙晓利; 刘春喜; 李鹏; 刘永军
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2030-09-28
Also published as: CN101974152B

Abstract

本发明公开了一种类脂-阳离子聚合物，结构式如下：其中，结构中m，n均为正整数，m＝60～120，n＝80～250。本发明的类脂-阳离子聚合物可以作为运载核酸的载体，在基因治疗中，将其与核酸结合，制备成载基因纳米复合物，然后导入细胞中。本发明合成的载基因纳米复合物，是利用类脂-阳离子聚合物骨架上剩余氨基基团与DNA或RNA可自发形成聚离子复合物胶束制备而成，DNA或RNA和聚阳离子形成内核，内核由脂质材料包覆，外层由亲水性的聚合物PEG包被，这种核-壳结构使得载基因纳米复合物具有高度的胶体稳定性，并可减少其与血浆成分的相互作用。

Description

一种类脂-阳离子聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种类脂-阳离子聚合物及其制备方法。

背景技术

基因治疗是通过适当的载体将目的基因导入患者特定组织细胞(靶细胞)内进行适当的表达，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗的目的。然而DNA转染效率通常较低且基因表达短暂，穿透细胞能力弱，很难有效地转入细胞核，能被质粒转导的肿瘤细胞数量和比例小。另外，它极易被组织清除，难以全身转运。因此需要基因载体携带基因进入靶细胞，并降低其被降解的几率，以提高基因表达效率。

基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。阳离子脂质体是最早研究的非病毒基因载体，可自然降解，无免疫原性，体外转染效率较高，多种阳离子脂质与DNA形成脂质复合体能诱导各种真核细胞的转染，目前已有多种商品化阳离子脂质体转染试剂问世；但是其体内应用效果不甚理想，如存在一定的细胞毒性和血浆不稳定性等问题。与阳离子脂质体相比，阳离子聚合物具有更大的可行性进行结构修饰和改造。然而，阳离子多聚物多为非生物可降解材料，尤其在反复给药后这些材料会积聚于体内可能会引发毒性反应，且基因转染效率比较低。

聚赖氨酸(PLL)是最早用于基因导入的阳离子聚合物之一，具有氨基酸重复单元的多肽，生物可降解，长期使用无免疫原性。聚乙二醇(PEG)是常用的亲水性修饰分子，具备高亲水、低毒性、细胞通透性高及无免疫原性特点。

类脂成分能介导载体和内吞体膜之间融合，导致内吞体膜不稳定从而释放基因载体，使其具备内吞体逃逸功能。

发明内容

针对上述现有技术，本发明在PEG-b-PLL基础上，合成了一种具有较好生物相容性、可作为在基因治疗过程中运载核酸物质的载体的类脂-阳离子聚合物，其同时具备阳离子聚合物和阳离子脂质的优势，可用于递送核酸物质，且可以轻易地结合入细胞后得以代谢降解。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种类脂-阳离子聚合物，结构式如下：

其中，结构中m，n均为正整数，m＝60～120，n＝80～250。

所述脂质(Lipid)的接枝修饰率在5％～70％之间。

所述脂质(Lipid)为天然或合成的磷脂、脂肪酸或脂肪酸衍生物。

所述的天然或合成的磷脂为末端带功能团羧基的磷脂。

所述末端带功能团羧基的磷脂优选以下之一：戊二酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-GA)，二油酰磷脂酰乙醇胺戊二酰(钠盐)(DOPE-GA)，1-肉豆蔻酰，2-(14-羧基化肉豆蔻酰)磷脂酰胆碱(DMPC-COOH)，十六烷基壬二酸单酰甘油磷酸胆碱(COOH)PC)，棕榈酰戊二酰甘油磷酸胆碱(PGPC)。

一种类脂-阳离子聚合物的制备方法，步骤如下：

(1)取10-50重量份的脂质溶于3-15重量份的DMF中，然后加入4-30重量份的NHS和5-50重量份的DCC，于20-50℃下反应2-48h；

(2)取50-300重量份的PEG-b-PLL，溶于1-10重量份的DMF中，然后滴加至步骤(1)中的反应液中，反应24-96h；

(3)将步骤(2)所得反应液置于冰浴中冷却1-5h，过滤除去白色沉淀；

(4)将步骤(3)所得滤液置于透析袋内透析24-72h，过滤，滤液冷冻干燥，即得类脂-阳离子聚合物。

本发明的类脂-阳离子聚合物可以作为运载核酸的载体，在基因治疗中，将其与核酸结合，制备成载基因纳米复合物，然后导入细胞中。

所述载基因纳米复合物的制备方法为：将核酸(DNA或RNA)和类脂-阳离子聚合物混合涡旋5-30s，后静置室温孵育10-40min，即得载基因纳米复合物；其中，核酸和类脂-阳离子聚合物的质量比为(1∶0.1)-(1∶500)。

本发明合成的载基因纳米复合物，是利用类脂-阳离子聚合物骨架上剩余氨基基团与DNA或RNA可自发形成聚离子复合物胶束(polyion complex micelles，PIC)制备而成，DNA或RNA和聚阳离子形成内核，内核由脂质材料包覆，外层由亲水性的聚合物PEG包被，这种核-壳结构使得载基因纳米复合物具有高度的胶体稳定性，并可减少其与血浆成分的相互作用。

本发明制备的载基因纳米复合物具有以下优势：

(1)处于粒子表面的PEG链可伸向水中，使粒子间产生足够大的斥力以克服范德华引力作用，使得载基因纳米复合物具有很好的稳定性而不易于聚集，同时还阻止血浆蛋白的非特异性吸附，避免被体内RES的识别、捕获，进而提高基因药物的体内稳定性以及延长药物的血液循环时间。

(2)类脂-阳离子聚合物材料本身带正电荷特性，与DNA或RNA可自组装形成纳米粒，制备工艺简单，且不需使用有机溶剂。

(3)脂质材料能够增强纳米粒体系与内吞体膜的融合，穿透溶酶体或内涵体膜，增强基因转染效率。

本发明制备的类脂-阳离子聚合物以及载基因纳米复合物在基因治疗时，克服了现有技术中存在的外源基因易被降解、基因转染效率低等缺陷，取得了非常好的效果，具备突出的实质性特点和显著的进步。

附图说明

图1为DOPE-g-PLL-b-PEG核磁谱图；

图2为DOPE-g-PLL-b-PEG红外谱图；

图3为载基因纳米复合物的透射电镜照片；

图4为载基因纳米复合物的体外肿瘤细胞HeLa细胞和HepG2细胞中转染的荧光倒置显微镜照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1制备类脂-阳离子聚合物

方法为：

(1)称取10mg DOPE-GA溶于6ml无水DMF中，加入5mg NHS和8mg DCC，于40℃下反应24h。

(2)称取50mg PEG-b-PLL，溶于3ml DMF中，然后滴加至上述反应体系中，反应72h后，将反应液置于冰浴中冷却4h，过滤除去白色沉淀。

(3)将滤液置于Mw8000-14000透析袋内透析48h，过滤，滤液冷冻干燥，即得类脂-阳离子聚合物DOPE-g-PLL-b-PEG。

所述PEG-b-PLL的制备方法如下：(其它实施例同实施例1)

将H₂N-PEG与ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸酐(Lys(z)-NCA)溶解在DMF中，通入干燥的氩气、搅拌、30℃反应72h。反应溶液滴入到过量的无水乙醚中，离心得到产物。真空干燥得到聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)-聚乙二醇(PZLL-b-PEG)。

将PZLL-b-PEG溶解到三氟乙酸中，加入氢溴酸的冰醋酸溶液，0℃氩气保护下反应。在过量无水乙醚中沉淀，DMF溶解，洗涤3次后，沉淀得到产物PEG-b-PLL。其分子量范围PEG为2000-5000道尔顿，PLL分子量范围10000-30000道尔顿。

对目标产物进行结构验证：其核磁谱图如图1所示，红外谱图如图2所示。其中，PEG(-CH₂CH₂O-)上氢的化学位移为δ＝3.64，PLL上对应氢的化学位移δ＝4.018，δ＝1.26-1.69，DOPE上氢的化学位移δ＝0.873，δ＝5.016，δ＝5.332。

实施例2制备类脂-阳离子聚合物

方法为：

(1)称取50mg DOPE-GA溶于10ml无水DMF中，按30mg NHS和40mg DCC，于40℃下反应12h。

(2)称300mg的PEG-b-PLL，溶于10ml DMF中，然后滴加至上述反应体系中，反应96h，反应液置于冰浴中冷却5h，过滤除去白色沉淀。

实施例3制备类脂-阳离子聚合物

方法为：

(1)称取40mg DPPE-GA溶于10ml无水DMF中，加入20mg NHS和20mg DCC，于30℃下反应24h。

(2)称取100mg PEG-b-PLL，溶于5ml DMF中，然后滴加至上述反应体系中，反应48h，将反应液置于冰浴中冷却2h，过滤除去白色沉淀。

(3)将滤液置于Mw8000-14000透析袋内透析48h，过滤，滤液冷冻干燥，即得类脂-阳离子聚合物DPPE-g-PLL-b-PEG。

实施例4制备类脂-阳离子聚合物

(1)称取50mg DMPC-COOH溶于10ml无水DMF中，按40mg NHS和50mg DCC，于40℃下反应12h。

(2)称200mg的PEG-b-PLL，溶于8ml DMF中，然后滴加至上述反应体系中，反应72h，反应液置于冰浴中冷却3h，过滤除去白色沉淀。

(3)将滤液置于Mw8000-14000透析袋内透析48h，过滤，滤液冷冻干燥，即得类脂-阳离子聚合物DMPC-g-PLL-b-PEG。

实施例5制备类脂-阳离子聚合物

称取10mg(COOH)PC溶于6ml无水DMF中，加入5mg NHS和8mg DCC，于40℃下反应24h。

(3)将滤液置于Mw8000-14000透析袋内透析48h，过滤，滤液冷冻干燥，即得类脂-阳离子聚合物PC-g-PLL-b-PEG。

实施例6制备类脂-阳离子聚合物

方法为：

(1)称取20mg脂肪酸溶于8ml无水DMF中，加入10mg NHS和12mg DCC，于30℃下反应12h。

(2)称取80mg PEG-b-PLL，溶于5ml DMF中，然后滴加至上述反应体系中，反应48h，将反应液置于冰浴中冷却2h，过滤除去白色沉淀。

(3)将滤液置于Mw8000-14000透析袋内透析72h，过滤，滤液冷冻干燥，即得类脂-阳离子聚合物。

实施例7采用实施例1的DOPE-g-PLL-b-PEG制备载基因纳米复合物

方法为：将DNA溶液(TE稀释至50μg/ml)在一定流速下滴加至等体积实施例1中制备得到的DOPE-g-PLL-b-PEG溶液(150mM NaCl溶液稀释至1mg/ml)中，涡旋混合均匀，室温放置孵育30min，得载基因纳米复合物。

实施例8采用实施例7中的载基因纳米复合物进行理化性质的研究

取少量实施例4中制备的载基因纳米复合物混悬液滴至铺有碳膜的铜网上，静置1min，用滤纸吸干混悬液，再滴加质量浓度为2％磷钨酸负染20s，自然干燥后，置于透射电子显微镜下观察复合物的形态。

另取复合物适量，Zetasizer3000激光粒度分析仪测定，动态光散射软件数据处理，记录平均粒径、多分散性指数。再取纳米复合物适量，适当稀释后测定Zeta电位。

透射电镜下观察纳米复合物形态为球形或类球形(如图3所示)，分布均匀，无聚集粘联现象。粒径为147.4±2.8nm，zeta电位为15.8±5.5mV。

实施例9采用实施例7中的载基因纳米复合物的抗核酸酶解能力考察

将含有1μg DNA的载基因纳米复合物分别加入0.1U/μg DNA酶终浓度的DNase I，同时取1μg裸DNA加入相同浓度的DNase I作为阳性对照。在260nm处测其吸光度值的变化。

结果表明，裸DNA在核酸酶存在的条件下，10min时开始明显降解，而纳米复合物则能有效保护DNA免受核酸酶的降解。

实施例10采用实施例7中的载基因纳米复合物进行细胞毒性试验

采用MTT法测定载基因纳米复合物的细胞活性。将HeLa和HepG2细胞接种于96孔培养板中，密度约为8×10³个/孔，过夜，分别加入由不含血清的DMEM培养基稀释不同质量比的纳米复合物200μl，以PEI/DNA作为阳性对照，同时设空白对照和阴性对照孔，每组设定三个复孔，孵育48h，每孔加入5mg/ml MTT溶液(pH 7.4)20μl，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加DMSO 150μl，振荡10min。整个试验平行操作三次。用酶标仪在570nm处测定其吸光度，按下式计算细胞存活率。

结果表明，与阳离子聚合物PEI相比，在所考察浓度范围内，载基因复合物细胞平均存活率均在80～120％之间，纳米复合物基本无毒，细胞存活率较高，显著高于PEI(p＜0.05)。

实施例11采用实施例7中的载基因纳米复合物进行体外细胞转染试验

采用HepG2和HeLa细胞系评价载基因纳米复合物的细胞转染能力。转染前48h，在24孔培养板上接种细胞数为1×10⁵个/孔，转染时细胞约达到70％融合。用PBS冲洗细胞2次，每孔中加入无血清的培养基稀释的载基因纳米复合物80μl(含有质粒2μg)。于37℃，5％CO₂孵箱中培养4h，移去介质，用PBS冲洗细胞2次，加入含有10％胎牛血清的培养基1ml培养48h，使进入细胞内的基因得以表达，利用倒置荧光显微镜观察。同时采用裸DNA作为阴性对照，用PEI/DNA复合物作为阳性对照，操作按试剂盒说明书进行，转染试验平行进行三次。

体外转染试验结果如图4所示，与绿色荧光蛋白基因(pEGFP)相比，纳米复合物在HepG2细胞和HeLa细胞中的转染效果显著提高。与阳离子聚合物PEI相比，载基因纳米聚合物率显示出与PEI相当的绿色荧光蛋白表达量，从而证明达到了良好的转染效果。

Claims

1.一种类脂-阳离子聚合物，其特征在于：结构式如下：

其中，结构中m，n均为正整数，m＝60～120，n＝80～250。

2.根据权利要求1所述的一种类脂-阳离子聚合物，其特征在于：所述脂质的接枝修饰率在5％～70％之间。

3.根据权利要求1所述的一种类脂-阳离子聚合物，其特征在于：所述脂质为天然或合成的磷脂、脂肪酸或脂肪酸衍生物。

4.根据权利要求3所述的一种类脂-阳离子聚合物，其特征在于：所述的天然或合成的磷脂为末端带功能团羧基的磷脂。

5.根据权利要求4所述的一种类脂-阳离子聚合物，其特征在于：所述末端带功能团羧基的磷脂为以下之一：戊二酰磷脂酰乙醇胺，二油酰磷脂酰乙醇胺戊二酰(钠盐)，1-肉豆蔻酰，2-(14-羧基化肉豆蔻酰)磷脂酰胆碱，十六烷基壬二酸单酰甘油磷酸胆碱，棕榈酰戊二酰甘油磷酸胆碱。

6.权利要求1-5之一所述的一种类脂-阳离子聚合物的制备方法，其特征在于：步骤如下：

7.一种载基因纳米复合物，其特征在于：是核酸分子与类脂-阳离子聚合物复合而成的复合物。

8.权利要求7所述的载基因纳米复合物的制备方法，其特征在于：将核酸和类脂-阳离子聚合物混合涡旋5-30s，后静置室温孵育10-40min，即得载基因纳米复合物；其中，核酸和类脂-阳离子聚合物的质量比为(1∶0.1)-(1∶500)。