CN101952416A - 共同培养脐带血衍生细胞与月经血干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供获得经扩增的表现CD34的人类脐带血细胞的方法。该方法包括在适于促进脐带血细胞扩增的共同培养条件下以足量月经血细胞接种足量脐带血细胞，且在支持脐带血细胞的至少两次或两次以上群体倍增的培养条件下共同培养脐带血细胞与月经血细胞。还提供使经扩增人类脐带血细胞生长以产生以下任一的方法：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。该经扩增细胞可表现CD34、SSEA-4及HLA-Ⅱ。还提供经扩增细胞的组合物。

Description

共同培养脐带血衍生细胞与月经血干细胞的方法
技术领域
本申请主张2007年10月31日申请的名称为“Methods for Co-CulturingCord Blood Derived Cells with Menstrual Stem Cells”的美国临时专利申请第61/001456号的优先权，该美国临时专利申请的全文以引用的方式而被并入本文中。
本发明总的来说是关于人类细胞培养以及通过共同培养来增强经分离的细胞群体的方法。更特别的，本发明涉及关于共同培养脐带血衍生细胞和月经血干细胞以获得经扩增的表达CD34的脐带血衍生细胞的改良细胞群体。
背景技术
脐带血为具有治疗人体多种病症的能力的干细胞的公认来源。脐带血为包括含有CD34细胞的单核细胞的造血祖细胞的丰富来源。家族可决定收集脐带血，因为在儿童或家族成员有医学需要的情况之下，具有经储存的干细胞的丰富来源存在潜在益处。
脐带血(cord blood，也称为umbilical cord blood)为分娩时保留于脐带及胎盘中的血液。此血液为干细胞的丰富来源，可将其收集、处理且低温保藏以用于潜在的未来用途。脐带血干细胞为有益的，因为其具有高植入率，较能耐受组织失配，具有较低比率的严重移植物抗宿主疾病(在干细胞移植中的主要并发症)，且极少被潜伏性病毒污染。
可以脐带血治疗的人类缺乏症的数目在过去十年中已显著增长。例如，已使用脐带血细胞来治疗各种形式的癌症、与骨髓衰竭(bone marrow failure)相关的症候群、血液病症、代谢病症、免疫缺乏病症及其它疾病病况中的至少70种形式。举例而言，已使用脐带血细胞来治疗以下疾病：急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、慢性骨髓白血病(CML)、青少年骨髓单核细胞性白血病(JMML)、噬血细胞淋巴组织细胞增生症(Hemophagocytic lymphohistiocytosis)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin′s lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、郎格罕细胞(Langerhan′scell)组织细胞增生症、淋巴瘤样肉芽肿病、骨髓发育不良症候群(MDS)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、无巨核细胞小土血小板减少症(Amegarakyocytic thrombocytopenia)、自体免疫嗜中性球减少症(严重)、先天性红细胞生成不良性贫血、周期性嗜中性球减少症、戴布二氏(Diamond-Blackfan)贫血、埃文氏症候群(Evan′s syndrome)、范可尼贫血(Fanconi anemia)、格兰茨曼疾病(Glanzman’s disease)、青少年皮肌炎、科斯特曼症候群(Kostmann’s Syndrome)、红血球发育不全、斯沃奇曼症候群(Schwachman syndrome)、严重再生不全性贫血、先天性含铁胚血球贫血、桡骨缺失性血小板减少症(TAR症候群)、先天性角化不全、镰状细胞性贫血(血色素SS)、HbSC疾病、镰状β-地中海贫血、严重α-地中海贫血(胎儿水肿)、严重β-地中海贫血(库利氏贫血(Cooley’s anomia))、中间型β-地中海贫血、E-β地中海贫血、E-β+地中海贫血、肾上腺脑白质营春不良、高雪氏病(Gaucher’s disease)(婴儿)、异染性脑白质营养不良、克拉贝疾病(Krabbedisease)(球状细胞脑白质营养不良)、贡特尔疾病(Gunther disease)、哈布二氏症候群(Hermansky-Pudlak syndrome)、胡尔勒症候群(Hurler syndrome)、胡-射二氏症候群(Hurler-Scheie syndrome)、亨特症候群(Hunter syndrome)、山菲立普症候群(Sanfilippo syndrome)、马拉二氏症候群(Maroteaux-Lamysyndrome)、Ⅱ型、Ⅲ型黏脂质症(Mucolipidosis)、α甘露糖症(Alphamannosidosis)、A型及B型纽匹二氏症候群(Neumann Pick Syndrome)、山朵夫症候群(Sandoff Syndrome)、泰萨二氏疾病(Tay Sachs Disease)、巴滕疾病(Batten disease)(遗传性神经原腊球脂褐质化)、雷-纳二氏疾病(Lesch-Nyhan disease)、共济失调性毛细血管扩张症(Ataxia telangeotasia)、慢性肉芽肿病、迪乔治症候群(DiGeorge syndrome)、IKKγ缺乏症、免疫调节异常多内分泌病x染色体相关(Immune dysregulation polyendocrineopathyX-linked)、Ⅱ型黏脂质症、先天但.骨髓粒细胞缺乏症(Myelokathesis)、X染色体相关的免疫缺乏、严重联合免疫缺乏、腺普去胶腌缺乏症、维-奥二氏症候群、X染色体相关的无γ球蛋白血症、X染色体相关的淋巴增生性疾病、欧曼症候群(Omenn’s syndrome)、网状细胞发育异常(Reticular dysplasia)、胸腺发育异常(Thymic dysplasia)、白血球黏着性缺乏症及骨石化病。
存在关于脐带血细胞收集及在人类病症治疗中的用途的限制。首先，脐带血细胞仅可在出生之后立即收集。此对脐带血的可收集次数造成显著限制。其次，以含有有限量的干细胞的小体积收集脐带血。某些病症需要输注或移植大量干细胞。少量可收集的脐带血细胞使得将此等细胞用于需要大量细胞的疗法并不可行。
正进行研究来发展进步以克服脐带血细胞的限制。已开发了组合多个脐带血单位或在移植之前在单一脐带血单位中扩增干细胞的技术。开发此等技术以解决因具有过少干细胞群体而无法治疗病症的问题。即使存在发展，也证明脐带血干细胞在细胞培养物中难以扩增。丰富但受限的干细胞来源对病症治疗而言仍具有限制。
已开发活体外检定系统以对红血球、粒细胞、单核细胞-巨噬细胞及巨核细胞骨髓细胞系的多潜能祖细胞及系受限祖细胞定量。当在合适半固体基质中培养时，称为群落形成细胞(CFC)的个别祖细胞增殖以形成离散细胞族或群落。藉由将细胞悬浮液置于半固体培养基(诸如补充有营养素及细胞活素的甲基纤维素或胶原蛋白)中、接着培育来进行CFC检定。接着，基于群落内之一或多类造血系细胞的形态学识别来对CFC分类且计数。可籍由光显微术或藉由采集个别群落且接着使用细胞化学及免疫细胞化学方法将细胞染色来当场进行群落评估及计数。
已将包括甲基纤维素的各种胶凝剂用于CFC检定。甲基纤维素为形成具有良好光学透明度的稳定凝胶的相对惰性的聚合物。其通常用于补充有包括胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、2-巯基乙醇、胰岛素、运铁蛋白及重组细胞活素的化合物的培养基中或作为群落刺激因子来源的改良性培养基(conditioned medium)中。与其它类型的半固体基质相比，基于甲基纤维素的培养基允许红血球系细胞的较佳生长，因此允许在相同培养物内检定红血球、粒.细胞、单核细胞及多潜能CFC。此培养基允许侦测人类群落形成单位-红血球(CFU-E)、爆式形成单位-红血球(BFU-E)、CFU-粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)及CFU-粒细胞、红血球、巨噬细胞、巨核细胞(CFUGEMM)且对其计数。
尽管已产生进步，但仍需要改良脐带干细胞扩增以制造较多用于治疗人类病症的干细胞的方法。本发明为关于满足此需要。
发明内容
本发明基于以下发现，即来自脐带血的干细胞在与月经血细胞群体共同培养时以足够大的数目增殖。该发现已展示月经血干细胞在具有脐带血干细胞的培养物中提供支持功能以增强脐带血细胞增殖。根据用于收集、低温保藏(cryopreservation)及储存的目前行业标准来收集脐带血细胞。可根据美国专利公开案第20080241113号的教示来收集用于与脐带血干细胞共同培养的月经血干细胞。脐带血细胞与月经血细胞的共同培养产生促进表达CD34、SSEA4及HLA-Ⅱ的细胞扩增的培养环境。
美国专利公开案第20080241113号的教示提供多种用于收集适用于本发明中的月经血干细胞群体的方法。用于共同培养的月经血干细胞可自新鲜或经极冷保藏的月经血干细胞获得。月经血干细胞可关于CD117或其它细胞表面标记经分离且亦可经由细胞培养来扩增。月经血干细胞亦可关于某些细胞标记经分离且接着经培养以便扩增。美国专利公开案第20080241113号中所述的月经血干细胞的任何群体均可用于本发明的共同培养方法中。
因此，本发明提供共同培养脐带血细胞与月经血细胞以改良脐带血细胞的增殖的方法。
在一相关方面，本发明提供表达CD34的人类细胞的群体，其获自人类脐带血细胞在具有促进人类脐带血细胞群体倍增的人类月经血细胞的合适培养条件中的扩增。细胞的群体表达SSEA4及HLA-Ⅱ。
本发明的细胞的群体可悬浮于冷冻保藏剂、培养基、生长培养基或分化培养基中的任一中。
本发明的表达CD34的人类细胞的群体是由至少两次或两次以上群体倍增而产生的。
本发明的细胞的群体能够产生以下任一者：群落形成单位、群落形成单位粒细胞(CFU-GM)巨噬细胞、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。
在另一方面中，本发明还提供藉由以下方法获得的表达CD34的人类脐带血细胞的群体，该方法包含在适用于脐带血细胞扩增的条件下共同培养足量脐带血干细胞与足量月经血干细胞，且接着经由至少两次群体倍增使足量脐带血细胞在培养物中增殖。使足量脐带血细胞在培养物中增殖的步骤包含使脐带血细胞生长以产生以下任一者：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
在一实施例中，本发明的方法可包含使足量脐带血细胞在培养物中生长以产生以下任一者之步骤：群落形成单位(CFU)、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
在又一实施例中，本发明的方法可包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后分离表现CD34的脐带血细胞的步骤。
在另一实施例中，本发明的方法可包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后极冷保藏表现CD34的人类脐带血细胞的群体的步骤。
藉由本发明的方法获得的表现CD34的人类脐带血细胞的群体在使足量脐带血细胞在合适培养条件下增殖之后亦可表现CD34、SSEA4及HLA-Ⅱ中的至少一者。
在又一方面中，本发明提供获得经扩增的表现CD34的人类脐带血细胞的方法。本发明的方法包含以下步骤：在适于促进脐带血细胞扩增的共同培养条件下以足量月经血细胞接种足量脐带血细胞，且在支持脐带血细胞的至少两次或两次以上群体倍增的培养条件下共同培养脐带血细胞与月经血细胞。
在一实施例中，共同培养表现CD34的人类脐带血细胞包含扩增脐带血细胞以表现SSEA4及HLA-Ⅱ中的至少一或多者。
在另一实施例中，本发明的经扩增人类脐带血细胞表现高含量的CD34。另外，本发明的脐带血细胞的共同培养包含扩增脐带血细胞以产生以下任一者：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
在替代性实施例中，本发明的方法可包含以下其它步骤中的至少一者：关于CD34免疫选择经扩增人类脐带血细胞，自培养物分离经扩增人类脐带血细胞以便输注于人类中，极冷保藏经扩增人类脐带血细胞或使经扩增脐带血细胞分化为细胞系。
在又一实施例中，本发明的方法包含使经扩增人类脐带血细胞生长以产生以下任一者的步骤：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。
附图说明
图1展示本发明的示意性流程图。
图2a及2b为对于实例1中所述的造血群落形成细胞而言，在解冻之后经涂铺且在Methocult 4053半固体甲基纤维素培养基中培养的脐带871R细胞的细胞培养物的相片。脐带871R细胞以每孔50000个细胞涂铺于每孔1ml培养基中。图2a为在细胞培养8天后的细胞相片(200×)。图2b为在细胞培养9天后的细胞相片(40×)。图2a及2b说明在无群落形成单位(CFU)生长的情况下在半固体培养基中存在游离细胞。
图3a-3l为对于实例2中所述的CFIJ而言，在甲基纤维素培养基中培养的M28100RM月经血细胞的相片。图3a为展示BFU-E的培养物中细胞的相片(100×)，其说明在每孔涂铺10000个细胞且细胞培养8天之后由于血色素产生而引起的红色调。图3b为对于群落形成单位而言，在培养8天之后甲基纤维素培养基中的游离细胞的相片(100×)。图3c及3d为展示BFU-E的培养物中细胞的相片(200×)，其说明在以每孔21600个细胞涂铺细胞且在细胞培养物中8天之后由于血色素产生而引起的红色调。图3e为在以每孔5000掴细胞涂铺细胞且培养8天之后展示初始BFU-E产生的培养物中细胞的相片(40×)。图3f、3g及3h为展示BFU-E的培养物中细胞的相片(分别为100×、100×及40×)，其说明在每孔涂铺10000个细胞且细胞培养9天之后由于血色素产生而引起的红色调。图3i、3j及3k为展示BFU-E的细胞培养物的相片(分别为100×、100×及40×)，其说明在每孔涂铺21600个细胞且培养9天之后由于血色素产生而引起的红色调。图31为在此浓度下无群落形成可能的情况下，培养基中游离细胞的相片。
图4a-4d为每孔涂铺5000、10000及21600个细胞的M28101R月经血细胞的相片。图4a为在以每孔10000个细胞涂铺M28101R月经血细胞且细胞培养8天之后，展示CFU-GM的培养物中细胞的相片(40×)。图4b为在以每孔10000个细胞涂铺细胞且培养9天之后展示CFU-GM产生的培养物中细胞的相片(40×)。图4c为在以每孔21600个细胞涂铺细胞且细胞培养数天之后展示BFU-E产生的培养物中细胞的相片(100×)。图4d为在以每孔5000个细胞涂铺细胞且细胞培养9天之后游离细胞的相片(40×)。
图5a-5g为实例4中所述的M28100RM月经血细胞与脐带871R细胞的共同培养相片。图5d为具有以每孔5000个细胞涂铺的月经血细胞及以每孔50000个细胞涂铺的脐带血细胞的部分CFU-GM在培养9天后的相片(40×)。图5a、5e及5g展示以每孔10000个细胞涂铺的M28100RM月经血细胞及以每孔50000个细胞涂铺的脐带871R细胞在培养8天(图5a及5e)及培养9天(图5g)之后的相片(100×)。图5a及5e说明CFU-GM群落形成。图5g说明BFU-E群落形成。图5b、5c及5f为以每孔21600个细胞涂铺的M28100RM月经血细胞及以每孔50000个细胞涂铺的脐带871R细胞在细胞培养8天(图5b及5c)及培养9天(图5f)之后的相片(分别为200×、100×及100×)。
图6a-6c为实例5中所述的M28101R月经血细胞与脐带871R细胞的共同培养相片。图6a、6b及6c说明甲基纤维素半固体造血培养基中的游离细胞。单独培养的M28101R月经血细胞在以不同浓度涂铺时能够产生CFU-GM及BFU-E。
具体实施方式
参考图1-6，本发明提供共同培养脐带血细胞与月经血细胞以扩增表现CD34的细胞的数目的方法。还提供藉由本发明的方法获得的经扩增的表现CD34的人类细胞的组合物。
全脐带血为包括含有CD34+细胞的单核细胞的造血祖细胞的丰富来源。脐带血干细胞包含包括CD34+细胞的单核细胞。脐带血干细胞获自在分娩婴儿后但一般在已分娩胎盘之前自脐带立即提取的全脐带血。分娩之时为收集新生儿干细胞的唯一机会。且，收集对于阴道分娩及剖腹分娩均为安全的。为收集脐带血，将脐带血自脐带吸取至血液收集袋中。将脐带血封装于运送材料中且运送至实睑室中以便在收集的36至48小时内加以处理。
在婴儿出生之后，在夹掉脐带后自脐带收集全血。全脐带血的体积可为约110ml。在行业标准下将所收集的脐带血样品运送至实验室以进行处理。
在无菌条件下使用密度梯度分离(Fiooll/Hypaque)来处理脐带血以分离含有表现CD34的细胞群体的单核细胞。将脐带血等分至无菌50ml管中。在470g下将管离心约15分钟。在离心之后，压紧细胞(packed cell)应在每体积1∶3比率下。可在离心之后自管移除血浆，或可将DPBS添加至管中以达成1∶3的压紧细胞与体积的比率。各管应具有不大于约35ml的体积，各管下方置放有10ml LSM。将各管在400g下离心约30分钟。移除血浆顶层。移除含有单核细胞及血浆之下一层且将其转移至另一50ml管中。
应使用含有L-谷氨酰胺的RPMI01640 1X使50ml管中的细胞悬浮直至约45ml的体积，其中RPMI与细胞混合物的比率为约1∶2。可在470g下将具有细胞悬浮液的管离心约15分钟。在离心之后，移除上清液。添加少量RPMI以使小球再悬浮。将细胞悬浮液转移至15ml管中。在15ml管中将细胞悬浮液在400g下离心约15分钟。倾析上清液且使用RPMI使小球再悬浮直至5ml。逐滴添加5ml DMSO/自体血浆(1ml DMSO及4ml自体血浆)。在控制速率冷冻器中将DMSO/自体血浆中的细胞悬浮液的温度降至约-85℃。将管置于在约-185℃或-185℃以下的液氮槽中。
参考根据美国专利公开案第20080241113号的任一方法自月经收集的细胞来使用短语“月经血细胞”。月经血细胞包含表现包括(但不限于)CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166及I类HLA的细胞标记或细胞内标记中的至少一者，同时以低含量表现或不表现CD3及MHC Ⅱ的细胞。尽管将细胞的上述特征提供为例示性特征，但在美国专利公开案第20080241113号的整个揭示案中提供月经血细胞的额外及替代性细胞表面特征，包括(但不限于)其中任何表及图中所提供的特征(在极冷保藏之前及之后、在CD 117选择之前及之后、在细胞培养之前及之后)或美国专利公开案第20080241113号中所揭示的任何组合。另外，美国专利公开案第20080241113号以全文引用的方式并入本文中，且提供关于本发明的月经血细胞的其它揭示内容。根据美国专利公开案第20080241113号的教示，用于与脐带血干细胞共同培养的月经血细胞可自月经收集，浓缩且极冷保藏，且稍后根据本发明的方法来解冻。或者，美国专利公开案第20080241113号的教示提供获得适用于本发明中的月经血细胞的多种方法。
尽管术语“细胞”在本申请案中可以单数含义使用，但术语“细胞”亦可用以指用于本发明的一个以上细胞。
认识到由于某些细胞分化为多种独特细胞类型之能力，该等细胞在本质上为多能的。多能细胞具有分化为多种不同哺乳动物细胞类型的能力。举例而言，用于本发明中的月经血细胞展示分化为各种细胞系的潜力，该等细胞系诸如神经系、心脏生成系、软骨生成系、脂肪生成系及成骨系。
本发明的方法及组合物
出于多种原因，将经扩增CD34细胞用于治疗用途可为有益的。详言之，经扩增CD34细胞(a)与其它脐带血细胞扩增方法相比需要使用较少脐带血细胞来增殖，(b)在与月经血细胞的共同培养中增殖，(c)能够自体应用，(d)能够同种异体应用，及(e)可用作定制的再生保健溶液的来源。
本发明提供表现CD34的人类细胞的群体，其获自人类脐带血细胞在具有促进人类脐带血细胞群体倍增的人类月经血细胞的合适培养条件中的扩增。细胞的群体亦表现SSEA4及HLA-Ⅱ。
本发明的细胞的群体可悬浮于冷冻保藏剂、培养基、生长培养基或分化培养基的任一者中。
本发明的表现CD34的人类细胞的群体是由于至少两次或两次以上群体倍增而产生的。
本发明的细胞的群体能够产生以下任一者：群落形成单位、群落形成单位粒细胞(CFU-GM)巨噬细胞、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。
本发明还提供藉由以下方法获得的表现CD34的人类脐带血细胞的群体，该方法包含在适用于脐带血细胞扩增的条件下共同培养足量脐带血干细胞与足量月经血细胞，且接着经由至少两次群体倍增使足量脐带血细胞在培养物中增殖。使足量脐带血细胞在培养物中增殖的步骤包含使脐带血细胞生长以产生以下任一者：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BHU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
本发明的方法可包含使足量脐带血细胞在培养物中生长以产生以下任一者的步骤：群落形成单位(CFU)、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
本发明的方法可包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后分离表现CD34的脐带血细胞的步骤。
本发明的方法可包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后极冷保藏表现CD34的人类脐带血细胞的群体的步骤。
藉由本发明的方法获得的表现CD34的人类脐带血细胞的群体在足量脐带血细胞在合适培养条件下增殖之后也可表现CD34、SSEA4及HLA-Ⅱ中的至少一者。
本发明提供获得经扩增的表现CD34的人类脐带血细胞的方法。本发明的方法包含以下步骤：在适于促进脐带血细胞扩增的共同培养条件下以足量月经血细胞接种足量脐带血细胞，且在支持脐带血细胞的至少两次或两次以上群体倍增的培养条件下共同培养脐带血细胞与月经血细胞。
共同培养表现CD34的人类脐带血细胞包含扩增脐带血细胞以表现SSEA4及HLA-Ⅱ中的至少一或多者。本发明的经扩增人类脐带血细胞表现高含量的CD34。
本发明的脐带血细胞的共同培养包含扩增脐带血细胞以产生以下任一者：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
本发明的方法可包含以下其它步骤中的至少一个：关于CD34免疫选择经扩增人类脐带血细胞，自培养物分离经扩增人类脐带血细胞以输注于人类中，极冷保藏经扩增人类脐带血细胞，或使经扩增脐带血细胞分化为细胞系。
本发明的方法包含使经扩增人类脐带血细胞生长以产生以下任一者的步骤：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。
制备用于培养的细胞
脐带血细胞样品及月经血细胞样品可在储存中经极冷保藏。或者，脐带血细胞样品及月经血细胞样品中任一者或两者在自所收集的原始血液样品处理之后可为新鲜的。在极冷保藏脐带血细胞样品及月经血细胞样品中任一者或两者的情况下，必须使经极冷保藏的脐带血细胞和/或月经血细胞解冻以为培养作准备。在脐带血细胞样品及月经血细胞样品中任一者或两者新鲜的情况下，可制备细胞以进行培养。
使经极冷保藏的细胞解冻的方法包含使经极冷保藏的细胞解冻且接着经由离心来洗涤该等细胞的步骤。自极冷保藏移除一小瓶细胞且在约37-40℃水浴中搅拌该小瓶直至剩余几片冷冻样品，藉此使经极冷保藏的细胞解冻。经极冷保藏的细胞不应完全解冻。将部分解冻的细胞转移至具有DNase(每100ml10滴)的冷冻Chang氏完全培养基中且通过倒置使其轻微混合。Chang氏完全培养基应以5∶1的比率与部分解冻细胞混合。举例而言，使25ml Chang氏完全培养基与5ml解冻细胞混合。此时，可移除约100-200μl的Chong氏完全培养基及解冻细胞样品以用于下文进一步详细描述的流式细胞仪分析。
悬浮解冻细胞的Chang氏完全培养基溶液可接着经受在约环境温度下在约120g下离心约5分钟的第一步。一旦离心完成，即移除上清液且通过温和倒置使细胞小球及可能存在的其它碎片再悬浮于无DNase的Chang氏完全培养基中。悬浮于Chang氏完全培养基中的细胞可接着经受在约环境温度下在约120g下离心约5分钟的第二步。一旦第二离心步骤完成，即移除上清液且使细胞小球再悬浮于7ml的15％ FBS Chang氏生长培养基中。
Chang氏完全培养基包含MEMα培养基、Chang B、Chang C、盘尼西林/链霉素(Penicillin/Streptomycin)、L-谷氨酰胺及ES-FBS。藉由组合650mlMEMα培养基、180ml Chang B(基础培养基)(18％ v/v)、20ml Chang C(2％v/v)、10ml盘尼西林/链霉素(10000单位/ml盘尼西林G钠及10000μg/ml链霉素硫酸盐)、10ml L-谷氨酰胺200mM(100×)及150ml ES-FBS(19％v/v)来制备Chang氏完全培养塞。
可使用解冻及洗涤经极冷保藏的细胞的方法来制备经极冷保藏的脐带血细胞及月经血细胞以进行培养。
经由在烧瓶中培养来扩增细胞
将经解冻或新鲜月经血细胞涂铺于经解冻或新鲜脐带血细胞上以在烧瓶中共同培养细胞。可在T-25非经组织培养物处理的烧瓶中共同培养脐带血细胞与月经血细胞。细胞不应超过每个烧瓶约10000000个细胞。将足够数目化脐带血细胞与足够数目的月经血细胞在烧瓶中共同培养。在一实施例中，脐带血细胞可介于约1000个细胞至约10000个细胞的范围内，而月经血细胞可介于约10000个细胞至约50000个细胞的范围内。其它量的脐带血细胞及月经血细胞亦可为足够的，只要月经血细胞提供促进脐带血细胞扩增的支持功能即可。
先前培养的脐带血细胞及月经血细胞可以约2000个/cm2经涂铺，具有约48小时的继代时间。若涂铺更多细胞，则细胞可在约24小时内经历继代。脐带血细胞及月经血细胞可涂铺于分别具有约7ml、约15ml及约30ml Chang氏完全培养基的T-25、T-75及T-175非经组织培养物处理的烧瓶中。
脐带血细胞与月经血细胞的共同培养可在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育，直至细胞以约70-80％融合。
可藉由胰蛋白酶化(trypsinizing)步骤使脐带血细胞与月经血细胞的共同培养物与烧瓶分离。当显而易见共同培养的脐带血与月经血细胞准备分离时，应吸出烧瓶中的培养基且接着以对于T-25烧瓶而言体积为约5ml、对于T-75烧瓶而言体积为约10ml或对于T-157烧瓶而言体积为约25ml的无钙或镁的DPBS洗涤非组织培养烧瓶。在洗涤之后，可以TrypLE酶在约36℃至约38℃下对于T-25烧瓶而言以约1.5ml的体积、对于T-75烧瓶而言以约3ml的体积且对于175烧瓶而言以约6ml的体积来涂布细胞。TrypLE酶可与细胞一起在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育约5分钟。在培育之后，可移出细胞且可以相同体积的首先用于涂布细胞的TrypLE酶来稀释烧瓶的内容物。接着，可将含有悬浮细胞内容物的TrypLE酶的溶液转移至50ml离心管中。可使用无钙或镁的DPBS来洗涤烧瓶的内容物，对于T-25烧瓶而言以约5ml的体积、对于T-75烧瓶而言以约10ml的体积且对于T-175烧瓶而言以约25ml的体积进行洗涤。用于本发明实践中的烧瓶可为非经组织培养物处理的烧瓶。可将约50ml DPBS添加至含有TryPLE酶及悬浮细胞内容物的50ml离心管中。
可将50ml离心管在环境温度下在约120g下离心约5分钟。可移除小球的少量等分试样(诸如20μl)以用血球计手动地或用自动化装置进行细胞计数。在离心之后，移除且丢弃上清液，且使剩余小球悬浮于约7ml Chang氏完全培养基中。
悬浮于Chang氏完全培养基中的经共同培养且经扩增的细胞可为极冷保藏而作准备，经受关于CD34细胞的免疫选择，为输注于人类中而作准备或为沿任何数目的细胞路径进行细胞分化而作准备。
在细胞培养的过程期间，可获得共同培养信息。每隔约3天或3天以上可更换培养基。若共同培养物含有10000000个以上细胞，则可移除共同培养物中的细胞以在相同培养条件下继代培养或者根据本申请案中所述的极冷保藏方法进行极冷保藏。
经由在培养盘上培养来扩增细胞
可在无菌条件下使用涂铺技术来共同培养细胞。用于本发明的方法中的培养基可为含有hSCF、hGM-CSF、hIL-3、hG-CSF、hEPO的Methocult 4034以侦测CB中的BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM。在约2-8℃下或在室温下，使储存在-80℃下的培养基(MethoCult #4034)解冻。在涂铺之前将用于共同培养的经解冻培养基及细胞置于冰上历时约15分钟。将约0.3ml细胞悬浮液添加至含有培养基的管中，涡动且使其在冰上培育约30分钟。使用注射器将培养基均匀分布于四孔培养盘的三个孔中，每孔约1ml。将约1ml DPBS添加至培养盘的第四孔中。应在无菌条件下在约37℃下将培养盘培育约14至约21天。
流式细胞仪分析
可分析经共同培养的脐带血细胞及月经血细胞的任何样品(无论是否经扩增)的总细胞计数、细胞生存力(藉由锥虫蓝，经由染料排除)及细胞表面标记的表现。
经扩增的共同培养的脐带血细胞及月经血细胞的总细胞计数及细胞生存力可藉由用血球计进行的手动计数、流式细胞仪或其它适用于获得细胞计数的构件(诸如ViCell(Beckman Coulter)或适于计数显示于显微影像上的细胞的软件)来定量。
经扩增的共同培养的脐带血细胞及月经血细胞可籍由流式细胞仪来进行分析。可根据StomKit藉由将约36ml蒸馏水及4ml 10X溶解溶液添加至50ml管中来制备1X NH4CL溶解溶液。可将约50μl细胞样品添加至两个管中以进行分析。一个管用于CD34+/生存力分析且第二个管用于等纯系对照(isocloniccontrol)。可将约10μl 7-AAD生存力染料添加至各管中。可将约10μlCD45-FITC/CD34-PE添加至第一个管中。可将约10μl CD45-FITC/CTRL-PE添加至第二个管中。可将混合物涡动且接着在约15℃至约30℃下培育至少20分钟，同时使其避光。接着，可将约1ml 1x NH4CL溶解溶液添加至各管中且涡动。可将混合物在约15℃至约30℃下培育约20分钟。可将约100μl的干细胞计数荧光球(stem-Count Fluorosphere)添加至各管中且涡动。接着，应使样品在流式细胞仪上运行以进行分析。
经扩增的共同培养的脐带血细胞及月经血细胞亦可藉由流式细胞仪来进行分析以分析细胞表面标记、细胞生存力及其它细胞特征。在细胞溶解之后亦可根据以下方案来分析细胞的新鲜样品。
可在约2000rPm下将经扩增的共同培养的脐带血细胞及月经血细胞的样品离心约7分钟。可移除上清液且使细胞再悬浮于约100μl洗涤培养基(25％HSA、DNAse、肝素及HBSS w/Ca+及Mg+)中。接着，可在Blood Bank Serofuge中将再悬浮细胞离心约1分钟。可倾析上清液且使细胞再悬浮于约1.2ml鞘液(Sheath fluid)中且涡动。
可分析鞘液中的细胞的任何数目的细胞表面标记。举例而言，且并非为限制，可将鞘液中的细胞的约100μl样品添加至含有以下试剂(在各管中每个试剂的体积为10μl或20μl)的各管中且接着将管涡动以混合如表A中所述的试剂与样品。
表A：流式细胞仪负载概略
  管   FITC   PE   ECD   PC5
  1   IgG   IgG   IgG   IgG
  2   HLA-I   CD133   HLA-Ⅱ   7AAD
  3   CD9   CD54   CD45   CD10
  4   CD59   CD63   CD34   CD13
  5   CD49e   CD81   无   CD49f
  6   CD44   CD117   无   CD38
  7   CD29   CD105   CD41   CD3
  8   CD19   CD166   无   CD90
  9   NANOG   SSEA3   无   7AAD
  10   CD14   SSEA4   无   7AAD
  11   无   CD56   无   7AAD
在室温下(15-30℃)培育20分钟。使其避光。若运行含有RBC的新鲜样品，则添加500μl溶解溶液且在室温下再培育10分钟且使其避光。若运行密度梯度或解冻样品，则不溶解。若样品未溶解，则在20分钟培育之后以1ml洗涤培养基洗涤。离心1分钟且接着倾析上清液。若样品溶解，则将样品离心1分钟且倾析溶解液。添加1ml洗涤培养基，涡动，再次离心，且接着再次倾析。将500μl鞘液添加至各管中，涡动且在FC500流式细胞仪上运行。
在细胞标记分析之前，可对细胞样品进行总细胞计数。可设置任何数目的正对照以使用Kasumi-3对照细胞或其它对照细胞进行流式细胞仪分析。
用于细胞计数及细胞生存力分析的材料包括(但不限于)流式细胞仪、lsoflow鞘液、Coulter Clenz清洁剂及包括(但不限于)以下各物的试剂：CD45-FITC/CD34-PE、CD45-FITC/等纯系对照-PE、7-AAD生存力染料、干细胞计数荧光球、10×浓缩氯化铵(NH4CL)溶解溶液及22％牛白蛋白溶液。参见Stem KitTMCD34+HPC计数套组封装插页-03版(PNIM2390)；BeckmanCoulter产品校正作用，CXP 2.0及2.1面板中断-3/10/06、PCA-M-D-1013；14.3StemLab，构筑号200706260856，3.2.1版。用于流式细胞仪的材料亦包括(但不限于)Isoflow鞘液；Coulter Clenz清洁剂；及以下试剂(使用之前在约20-25℃下)：CD117-PE、CD29-FITC、CD34-ECD、CD44-FITC、CD45-ECD、CD90-PC5、CD105-PE、CD166-PE、lgG-IFITC、IgG-PE、IgG-ECD、IgG1-PC5、HLA-I-FITC、CD133-PE、HLA-IIECD、CD9-FITC、CD54-PE、CD10-PC5、CD59-FITC、CD63-PE、CD13-PC5、CD49e-FITC、CD81-PE、CD49f-PC5、CD44-FITC、CD38-PC5、CD29-FITC、CD105-PE、CD41-ECD、CD3-PC5、CD19-FITC、NANOG-FITC、SSEA3-PE、SSEA4-PE、CD14-FITC、CD56-PE、7-AAD生存力染料、10×浓缩氯化铵(NH4CL)溶解溶液、洗涤培养基(包含HBSS(具有Ca+及Mg+的汉克斯HBSS)500ml、肝素5ml、人血清白蛋白25％ 50ml、DNASE-1安瓿)、Kasumi-3细胞株-CD34+细胞、定时器及涡动混合器。
经扩增细胞的极冷保藏
使共同培养的经扩增细胞悬浮于自烧瓶中的组织培养获得的Chang氏完全培养基中以及可准备培养盘以用于极冷保藏。可使经扩增细胞再悬浮于Chang氏完全培养基中。在一实施例中，可使经扩增细胞与冷冻保藏剂以1∶1比率组合。举例而言，5ml小瓶可包含约2.5ml细胞及2.5ml冷冻保藏剂。应将经扩增细胞的悬浮液置于水上历时至少约15分钟，随后添加冷冻保藏剂。
藉由以4∶1的比率组合ES-FBS与DMSO(99％)来制备冷冻保藏剂。举例而言，可将约2ml ES-FBS添加至0.5ml DMSO中。可使ES-FBS在冰上冷冻至少约15分钟，随后添加DMSO。一旦经冷冻，即将DMSO添加至ES-FBS中。可使ES-FBS及DMSO冷冻至少约15分钟。
在一替代性实施例中，可使用其它极冷保藏培养基。举例而言，可使用冷冻保藏剂来保持解冻后高细胞生存力结果，诸如CryoStor CS10或CS5(Biolife)、补充有丙二醇及蔗糖的胚胎极冷保藏培养基(Vitrolife)或SAGE培养基(库珀外科(Cooper Surgical))。甘油可与诸如DMSO的其它冷冻保藏剂一起使用，或可以约10％的浓度单独用于具有合适蛋白质的培养基中。
在冰上时，可将冷冻保藏剂逐滴添加至经扩增细胞的悬浮液中。可轻微混合经扩增细胞的溶液与悬浮的经扩增细胞。可将溶液等分至所需体积的小瓶中以为极冷保藏作准备。小瓶可为极冷小瓶(cryovial)。将小瓶保持在冰上直至准备将其置于受控速率冷冻器中。
制备冷冻保藏剂中的经扩增细胞可经受利用受控速率冷冻器或其它合适冷冻器系统(经监测的堆存-冷冻或冷冻容器(Nalgene))进行的若干降温步骤以将经扩增细胞的温度降至约-90℃的最终温度。控制速率冷冻器的实例包括(但不限于)Cryomed Thermo Forma受控速率冷冻器7454(Thermo Electron，Corp.)、平面受控速率冷冻器Kryo 10/16(TS Scientific)、Gordinier、Bio-Cool-FTS系统及Asymptote EF600、BIOSTOR CBS 2100系列。
在受控速率冷冻器中，可使降温步骤程序化。冷冻保藏剂及经扩增细胞可经受受控速率降温以为最终储存于冷冻器中作准备。可设计受控速率降低以保持细胞生存力。可使用Cryo-Med冷冻器(Thermo Electron Corp.)、液氮筒及携带型Cryo-Med冷冻器来进行受控速率降低以为最终储存于冷冻器中作准备。可使细胞在极冷小瓶或极冷袋中经受受控速率降低以实现约-90℃的温度。
对于收集于极冷袋中的经扩增细胞的样品而言，经扩增细胞可经受以下受控速率降低概况：在约4℃下等待，1.0℃/分钟至-6.0℃(样品)、25.0℃/分钟至-50.0℃(腔室)、10.0℃/分钟至-14.0℃(腔室)、1.0℃/分钟至-45.0℃(腔室)、10.0℃/分钟至-90.0℃(腔室)及终点(样品等于或低于-85.0℃)。
对于收集于极冷小瓶中的经扩增细胞的样品而言，该等细胞可经受以下受控速率降低概况：在4℃下等待，1.0℃/分钟至-3.0℃(腔室)、10.0℃/分钟至-20.0℃(腔室)、1.0℃/分钟至-40.0℃(腔室)、10.0℃/分钟至-90.0℃(腔室)及终点。
一旦冷冻保藏剂与经扩增细胞的混合物等于或低于约-85℃，即将极冷保藏小瓶转移至低温储存单元中且将其储存于等于或低于约-135℃的温度下的液氮蒸气中，或者可将小瓶储存于液氮的液相中。举例而言，合适的低温储存单元包括(但不限于)LN2冷冻器MVE 1830(Chart Industries)。
经扩增细胞的免疫选择
可关于至少一种所需细胞标记来选择经由共同培养脐带血细胞与月经血细胞而扩增的细胞。举例而言，所需细胞标记可为CD34、HLA-Ⅱ或SSEA-4。亦可使细胞经受负选择步骤以移除非所需细胞。在整个细胞选择过程中，可使用无菌技术。细胞选择可用于新鲜细胞或先前经极冷保藏的解冻细胞及经共同培养的细胞。可对仅250万个细胞及至多1000万个细胞进行细胞选择。亦可自包含少于250万个细胞的样品或包含大于1000万个细胞的样品选择细胞。
用于细胞选择的材料包括(但不限于)DNase、Pulmozyme(Genentech.Inc.)-1安瓿、欲经负选择或正选择的任何抗细胞表面标记(例如抗CD34抗体、山羊抗小鼠IgG微珠)及磁场。
在约4℃下，将包含＞＝1.0×106个经扩增的共同培养的脐带血细胞与月经血细胞的细胞的细胞悬浮液在约300g下离心约7分钟。可在未扰乱细胞小球的情况下移除上清液。可用约100μl洗涤培养基使小球再悬浮。在一实施例中，抗细胞表面抗体为抗CD34抗体。可在冰上将溶液中的细胞培育约20分钟至约25分钟。在培育之后，可将约2ml洗涤培养基添加至细胞中且使其轻微混合。可在约4℃下将混合物在约300g下离心约10分钟。在离心之后，可在未扰乱小球的情况下吸出上清液。可使小球再悬浮于约80μl洗涤培养基中。可将约20μl山羊抗小鼠IgG添加至细胞悬浮液中且使其轻微混合。可在冰上将混合物培育约30分钟。在培育之后，可藉由添加约2ml洗涤培养基且接着混合该溶液来洗涤细胞。可在约4℃下将细胞在约300g下离心约10分钟。
可使用管柱以自未经选择的细胞中分离所选细胞。可藉由在约500μl工作缓冲液中润湿管柱来制备管柱。在离心之后，可在未扰乱小球的情况下吸出上清液。可使小球再悬浮于约500μl工作缓冲液中。为避免细胞黏着，可将额外DNase添加至细胞中。可使用吸移管将细胞悬浮液添加至管柱中。经抗体标记的细胞(阳性部分)应附着于经受MACS分离器所提供的磁场的管柱上。未经标记细胞(阴性部分)应流经管柱且被收集。
在细胞悬浮液流经管柱且作为阴性部分加以收集之后，可使用每次洗涤500μl的工作缓冲液将管柱洗涤至少3次。各洗涤液可在下一洗涤之前完全流经管柱。可与阴性部分一起收集各洗涤液。可移除约100μl阴性部分以进行分析。可进行使用血球计的细胞计数及使用锥虫蓝的生存力或另一方法。可使用如先前所讨论的流式细胞仪或使用另一流式细胞仪方法来进行表型分析。阴性部分可为极冷保藏作准备或可置于培养物中以用于进一步细胞生长及扩增及稍后处理。
在收集阴性部分且洗涤管柱之后，可将另一管置于管柱下方以收集阳性部分。可将约1ml工作缓冲液添加至管柱中且移除管柱内形成的磁场。应收集工作缓冲液及阳性部分。可使用活塞以自阳性部分的管柱移除尽可能多的经标记细胞。可移除约100μl阳性部分以使用锥虫蓝或流式细胞仪来分析包括(但不限于)细胞计数及生存力。阳性部分可经极冷保藏、培养或为用于治疗用途作准备。
可根据如图1中所示的本发明实施例而发生免疫选择表现所需细胞标记的细胞的步骤。具体来说，选择可至少在共同培养脐带血细胞与月经血细胞的步骤后发生。选择表现某些细胞标记的月经血干细胞的步骤提供表现所选细胞标记的富集细胞的群体，其可用于进一步细胞培养、极冷保藏或治疗用途。
在一实施例中，自细胞群体选译经扩增的表现CD34的细胞的步骤包含以抗人类CD34抗体标记经扩增细胞且接着以能够与抗人类CD34抗体结合的磁标记抗体标记CD34干细胞-抗人类CD34抗体复合物。另外，该方法包含以抗人类CD34抗体标记表现CD34的任何细胞且接着以能够与抗人类CD34抗体结合的磁标记抗体标记CD34细胞-抗人类CD34抗体复合物。选择表现CD34的细胞的方法可包括选择根据本发明实施或扩增的表现CD34的任何细胞。免疫选择细胞的步骤包含将包含CD34细胞、抗人类CD34抗体及磁标记抗体的复合物暴露于磁场以将磁标记抗体及复合物的其余部分吸引至管柱，且经由管柱洗涤所有其它CD34阴性细胞以进行分析。
在选择表现CD34的细胞的整个步骤中，可将细胞的细胞悬浮液及工作缓冲液(具有DNase的
Figure BPA00001168040700191
Separation电泳缓冲液，Miltenyi)保持在冷温度下。其它磁分离套组亦可适于使用(R&D systems)。
可在约300g下将细胞悬浮液离心约10分钟。可使小球悬浮于具有抗人类CD34抗体的工作缓冲液中。举例而言，工作缓冲液可(例如)包含PBS(在约pH 7.2下)、牛血清白蛋白、EDTA及约0.09％迭氮化物(或合适溶液)(BD Biosciences)。举例而言，可使小球悬浮于约100μl工作缓冲液与约5μg对人类CD34具有亲和性的经纯化抗体中。抗体可为单株或多株抗体。抗体可为经纯化IgG或能够结合人类CD34的其它抗体。抗体可为小鼠抗CD34抗体。
培育包含细胞、工作缓冲液及抗CD34抗体的溶液，历经一个培育期。举例而言，培育期可包含在冰上约20分钟至约25分钟。或者，若温度为至少约2℃至约8℃，则培育期可缩短至少于约20分钟，或若至少在室温下，则培育期可缩短至约5分钟至约10分钟。在培育期之后，可以工作缓冲液洗涤具有细胞的溶液以移除未结合的抗体且接着离心。举例而言，离心可在约300g下发生约10分钟。在离心之后，吸出上清液且可保留以用于分析，且使小球悬浮于工作缓冲液中。举例而言，工作缓冲液的体积可为约80μl。
将第二批附着有微珠且对抗人类CD34抗体具有亲和性的抗体添加至用以悬浮小球的工作缓冲液中。微珠可包含(例如)氧化铁及多糖。微珠可为生物可降解的。可经由Miltenyi Biotec获得微珠。举例而言，对于诸如山羊抗小鼠IgG抗体的对人类CD34具有亲和性的抗体而言，第二批抗体具有特异性。抗体可为单株或多株抗体。抗体可能够与小鼠抗体的轻链和/或重链结合。例如，抗体可为可作为产品130-048-401而经由Miltenyi Biotec获得的山羊抗小鼠IgG微珠共轭物。2ml小瓶的上述山羊抗小鼠IgG可用于共计约1.0×109个未分离细胞。
培育细胞悬浮液，历经第二培育期。举例而言，培育期可在约30分钟至约35分钟的范围内。或者，当培育在约2℃至约8℃下发生时，培育期可少于约30分钟，或当培育在约室温下发生时，培育期可为约5至约10分钟。在培育期完成之后，以工作缓冲液(诸如约2ml工作缓冲液)洗涤细胞，且接着将细胞离心。举例而言，离心可在约300g下发生约10分钟。可吸出上清液且保留以用于分析，且使含细胞的小球悬浮于工作缓冲液(诸如约500μl工作缓冲液)中。
细胞分离
可使用MS管柱自工作缓冲液中的细胞悬浮液分离CD34细胞以分离CD34干细胞。举例而言，可使用MS管柱(Miltenyi Biotec)或其它合适管柱。或者，可使用分离细胞的其它合适方法。可将可经由Miltenyi Biotec获得的包含一单元、多支架、MS管柱及微珠的MiniMACS套组用于CD34细胞选择。MS管柱可准备以工作缓冲液进行冲洗。举例而言，用以冲洗管柱的工作缓冲液的体积可为约500μl。将管柱置于可经由Miltenyi Biotec获得的MACS分离器或提供磁场的合适分离器的磁场中。
以吸移管或能够转移液体体积的其它器件将工作缓冲液中的细胞悬浮液添加至管柱中。由于MACS分离器的磁场，将与连接微珠的抗体结合的以抗人类CD34抗体标记的CD34细胞保持在管柱中。任何未经标记细胞均应连同工作缓冲液一起流经管柱且可收集于无菌管中以用于细胞表型化及细胞计数。可将流经管柱的未经标记细胞识别为阴性部分。在添加细胞悬浮液之后，可以工作缓冲液洗涤管柱。举例而言，可将管柱洗涤至少3次或任何次数，其使得所有或大体上所有未经标记细胞经过管柱。可收集洗涤步骤的流出物以用于细胞表型化及计数。亦可将流出物识别为阴性部分。
在洗涤管柱之后，可自管柱收集经标记CD34细胞。籍由将无菌管置于管柱下方且自磁场移除管柱来收集经标记CD34细胞。一旦自磁场移除管柱，经标记CD34细胞即经过管柱且进入无菌管中。可藉由将一工作缓冲液添加至管柱中以经由管柱洗涤细胞且视情况藉由以活塞汽提管柱以释放细胞来洗出管柱中的残余经标记CD34细胞。可将所收集的经标记CD34细胞识别为阳性部分。为获得经标记CD34细胞的进一步纯化群体，阳性部分可视情况在先前所揭示的洗涤程序后至少再一次经过管柱。可将阳性部分在约300g下离心约10分钟且吸出上清液。可使小球悬浮于约5ml工作缓冲液中。
以血球计分析阳性部分及阴性部分以获得活细胞的总计数。籍由流式细胞仪来分析阴性部分以用于表型化。视情况，可使用流式细胞仪使阳性部分表型化。
可制备含有表现CD3或其它所需细胞标记的细胞的阳性部分以根据本发明的方法进行极冷保藏。将约1ml人血清白蛋白、约3mlDPBS及约1mlDMSO添加至约5ml阳性部分中。或者，其它培养基亦可用于制备细胞以进行极冷保藏的步骤中，诸如完全培养法、牛血清白蛋白、胎牛血清(fetal calf serum)、胎牛血清(fetal bovine serum)、蛋白质血浆部分或自体血清。将含有经扩增细胞的溶液混合且在冰上冷却约10分钟。添加约1mlDMSO作为冷冻保藏剂。或者，可将约6％HES羟乙基淀粉与约5％DMSO的约1ml混合物用作冷冻保藏剂。将所得溶液等分至极冷小瓶中。或者，可将所得溶液等分至任何适用于极冷保藏的容器(诸如极冷保藏袋)中。接着，将极冷小瓶极冷保藏于根据本发明的受控速率冷冻器方案的受控速率冷冻器(Cryomed)中。一旦含有经扩增细胞的溶液实现约-90℃的目标温度，即将极冷小瓶转移至长期储存冷冻器中且储存在约-135℃或-135℃以下。或者，可将极冷小瓶或其它合适的极冷保藏容器置于经监测的堆存冷冻器中且冷冻至约-80℃，且接着将其转移至在约-135℃或-135℃以下的长期储存冷冻器中的液氮的气相中。
经扩增细胞的治疗用途
可制备籍由本发明获得的表现CD34的经扩增细胞以用于治疗人类病症的治疗用途。在一实施例中，可制备经扩增细胞、来自经由共同培养进行的扩增的经免疫选择CD34细胞或在极冷保藏之后已解冻的经扩增细胞以用于静脉输注于接受者中。
静脉输注技术可根据可为细胞输注于人类中所接受的规范而存在。静脉输注可包括经扩增CD34细胞的自体或同种异体输注。
经扩增细胞的分化
本发明的经扩增CD34脐带血细胞可能够分化为体内260种体细胞中的任一者。举例而言，该等细胞可能够分化为至少肝细胞、胰腺细胞、肌原细胞、成骨细胞、软骨生成细胞、脂肪细胞、上皮细胞、神经细胞、角质细胞及心肌细胞。如在共同培养系统中所见，当与诸如肝细胞、胰腺细胞、肌原细胞、成骨细胞、软骨生成细胞、脂肪细胞、上皮细胞、神经细胞、角质细胞及心肌细胞的其它易感染细胞一起培养时，该等细胞亦可具有分化能力。自分化获得的细胞及自共同培养获得的细胞亦可具有用于以下治疗的潜能：替代或再生疗法、其它治疗应用、药妆品(cosmeceutical)、器官排斥疗法及其它应用。
可制备藉由本发明获得的表现CD34的经扩增脐带血细胞以分化为特定细胞系。在一实施例中，可制备经扩增细胞、来自经由共同培养进行的扩增的经免疫选择CD34细胞或在极冷保藏之后已解冻的经扩增细胞以用于细鲍分化。
分化技术可根据可为人类细胞分化所接受的规范而存在。
以说明的方式而非限制的方式提供以下实例。尤其根据本文中引用的各种参考文献的教示(其揭示内容以全文引用的方式并入)，熟习此项技术者将认识到可产生实例中所体现的本发明的变化。
实例1-培养脐带871R
根据本申请中所述且用于脐带血收集行业中的方法来收集脐带血细胞871R。
脐带871R细胞的脐带血样品在收集后约2天经处理且根据本申请中所述的脐带血的处理及极冷保藏方法经极冷保藏。使脐带871R细胞保持极冷保藏历时约两年半。根据本申请中所述的解冻方法使脐带871R细胞解冻。
培养-培养盘
在室温下使约3ml培养基(Methocult #4034-半固体培养基)解冻且接着连同脐带细胞稀释液(500000个细胞/mL)一起置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将约0.3ml脐带细胞稀释液接种于培养基的管中。轻微涡动该管且接着在冰上培育约30分钟。在培育之后，将培养基及脐带871R细胞等分至4孔培养盘的前3个孔中。将1毫升DPBS添加至第四孔中以有助于湿度且在37℃下培育细胞。细胞培养的某些结果概括于表B中。
培养-烧瓶
使脐带871R细胞经受使经极冷保藏的细胞解冻且接着在Chang氏完全培养基中经由本申请中所揭示的离心来洗涤该等细胞的步骤，使细胞小球再悬浮于约7ml 15％ Chang氏完全培养基中。
在T25非经组织处理的培养烧瓶中，以7ml 15％ Chang氏完全培养基中约1000000个细胞来接种再悬浮的脐带871R细胞。在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育细胞。在第一继代不存在黏附细胞。
表B-M28100RM、M28100RM、M28101R、M28101R+871R及871R的培养盘培养
M28100RM   M28100RM+871R M28101R   M28101R+871R 871R
  每孔10000个
  BFU-E平均值 2 0.67 0 0 0
  CFU-GM平均值 0.67 3.67 0.33 0 0
  CFU-GEMM平均值 0 0 0 0 0
实例2-培养M28100RM月经血细胞
根据美国专利公开案第20080241113号的方法，收集约9ml月经且置于不含具有钙及镁的抗生素的DPBS与无防腐剂肝素的所得培养基中，并在约24小时至约48小时内运送至处理设备，藉此收集月经血干细胞M28100RM。将月经样品在抗生素中培育24小时，且随后洗涤，经由离心来浓缩，与10％DMSO冷冻保藏剂混合，且根据美国专利申请公开案第20080241113号的教示来极冷保藏。
处理M28100RM月经血细胞的月经样品且在收集之后约2天将M28100RM月经血细胞极冷保藏。使细胞保持极冷保藏历时约8个月且接着根据本申请案中所述的方法解冻以形成CFU。
培养-培养盘
在室温下使培养基(MethoCult #4034-半固体培养基)的三个3ml管解冻且接着以50000个细胞/ml、100000个细胞/ml及21600个细胞/ml的细胞稀释液形式置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将约0.3ml的各月经血细胞稀释液接种于Methocult #4034半固体培养基的管中。轻微涡动该等管且接着在水上培育30分钟。在培育之后，将培养基及月经血干细胞等分至4孔培养盘的前3个孔中。将1ml DPBS添加至第四孔中以有助于湿度，且在37℃下培育细胞。细胞培养的某些结果概括于表B中。
培养-烧瓶
使M28100RM月经血细胞经受使经极冷保藏的细胞解冻且接着在Chang氏完全培养基中经由本申请中所揭示的离心来洗涤该等细胞的步骤。使细胞小球再悬浮于约25ml 15％ chang氏完全培养基中。
在T25非经组织培养物处理的烧瓶中，以7ml 15％Chang氏完全培养基中约221000个细胞来接种再悬浮的M28100RM月经血细胞。在CO2培育箱中在约36℃约38℃下培育细胞，直至细胞以约70-80％融合。细胞经历表C中所展示的若干继代。在约三或四天之后出现包含表C中所示的15％ Chang氏完全培养基的完全改变的继代。
表c-M28100RM月经血细胞的培养
  继代   总计数   流   极冷   培养物   天数   倍增   PD时间(hr)
  P1   722656   722656   0
  P2   917500   917500   4   1.27
  P3   1136000   1136000   2   1.24   38.77
  P4   8960000   60000   5   7.89   15.21
  P5   1060000   1060000   6   17.67   8.15
实例3-培养M28101R
根据美国专利公开案第20080241113号的方法，收集约9ml月经且在收集于不含具有钙及镁的抗生素的DPBS与无防腐剂肝素之所得培养基中约24小时至约48小时内将其运送至处理设备，藉此收集月经血干细胞M28100RM。将月经样品在抗生素中培育24小时，且随后洗涤，经由离心来浓缩，与10％DMSO冷冻保藏剂混合，且根据美国专利申请公开案第20080241113号的教示来极冷保藏。
用于M28101R月经血细胞的月经在收集之后经处理且根据本申请中所述的月经血干细胞处理及极冷保藏方法在收集之后约3天经极冷保藏。使细胞保持极冷保藏历时约7个月。根据本申请中所述的解冻方法使M28101R月经血细胞解冻。
培养-培养盘
在室温下使培养基(MethoCult #4034-半固体培养基)的三个3ml管解冻且接着连同M28101R月经血细胞的细胞稀释液(50000个细胞/ml、100000个细胞/ml及216000个细胞/ml)一起置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将0.3ml的各月经血细胞稀释液接种于培养基的管中。接着，轻微涡动该等管且接着在冰上培育30分钟，在培育之后，将培养基中的月经血细胞等分至4孔培养盘的前3个孔中。将1毫升DPBS添加至第四孔中以有助于湿度且在37℃下培育细胞。细胞培养的某些结果概括于表B中。
培养-烧瓶
使M28101R月经血细胞经受使经极冷保藏的细胞解冻且接着在Chang氏完全培养基中经由本申请中所揭示的离心来洗涤该等细胞的步骤。使细胞小球再悬浮于约25ml 15％ Chang氏完全培养基中。
在T25非经组织培养物处理的烧瓶中，以7ml 15％ Chang氏完全培养基中约724780个细胞来接种再悬浮的月经血细胞。在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育细胞，直至细胞以约70-80％融合。细胞经历表D中所展示的若干继代。在约三或四天之后出现包含表D中所示的15％ Chang氏完全培养基的完全改变的继代。
表D-M28101R月经血细胞的培养
  继代   总计数   流   极冷   培养物   天数   倍增   PD时间(hr)
  P1   2170000   2170000   0
  P2   18200000   17800000   456000   4   4.76   20.17
  P3   3760000   3500000   260000   4   1.73   55.40
  P4   1619940   1619940   5   6.23   19.26
  P5   5170000   5032000   136000   3   3.19   22.56
实例4-培养M28100RM月经血细胞及脐带871R
根据美国专利公开案第20080241113号的方法，收集约10ml月经且在收集于不含具有钙及镁的抗生素的DPBS与无防腐剂肝素的所得培养基中约24小时至约48小时内将其运送至处理设备，藉此收集月经血干细胞M28100RM。将月经样品在抗生素中培育24小时，且随后洗涤，经由离心来浓缩，与10％DMSO冷冻保藏剂混合，且根据美国专利申请公开案第20080241113号的教示来极冷保藏。
用于月经血干细胞M28100R的月经在收集之后经处理且根据本申请中所述的月经血干细胞处理及极冷保藏方法在收集后约2天经极冷保藏。使细胞保持极冷保藏历时约6个月。根据本申请中所述的解冻方法使M28100R细胞解冻。
用于脐带871R细胞的脐带血样品在收集之后约2天经处理且根据本申请中所述的脐带血的处理及极冷保藏方法经极冷保藏。使脐带871R细胞保持极冷保藏历时约两年半。根据本申请中所述的解冻方法使脐带871R细胞解冻。
培养-培养盘
在室温下使培养基(MethoCult #4034-半固体培养基)的三个3ml管解冻且接着连同细胞稀释液(50000个M28100R细胞/ml+500000个脐带871R细胞/ml；100000个M28100R细胞/ml+500000个脐带871R细胞/ml；及216000个M28100R细胞/ml+500000个脐带871R细胞/ml)一起置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将0.3mL在培养基中的各细胞稀释液接种于培养基的独立管中。接着，轻微涡动该等管且接着在冰上培育30分钟。在培育之后，将培养基中的各细胞稀释液等分至独立4孔培养盘的前3个孔中。将1ml DPBS添加至各培养盘的第四孔中以有助于湿度，且在37℃下培育细胞。细胞培养的某些结果概括于表B中。
培养-烧瓶
使脐带871R细胞及M28101R月经血细胞独立地经受使经极冷保藏的细胞解冻且接着在Chang氏完全培养基中经由本申请中所揭示的离心来洗涤该等细胞的步骤。使细胞小球再悬浮于约7ml 15％Chang氏完全培养基中。
在T25非经组织培养物处理的烧瓶中，以7ml 15％Chang氏完全培养基中约221400个细胞(具有约1000000个脐带871R细胞)来接种再悬浮的M28101R月经血细胞。在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育细胞，直至细胞以约70-80％融合。细胞经历表E中所展示的若干继代。在约三或四天之后出现包含表E中所示的15％Chang氏完全培养基的完全改变的继代。
表E-M28101R月经血细胞及脐带871R细胞的培养
  继代   总计数   流   极冷   培养物   天数   倍增   PD时间(hr)
  P1   341028   341028   0
  P2   478275   478275   4   1.40   68.45
  P3   718622   718622   4   1.50   63.89
  P4   1700037   1700037   5   2.37   50.73
  P5   5080000   4950000   127000   6   84.67   1.70
实例5-培养M28101R+脐带871R
根据美国专利公开案第20080241113号的方法，收集约9ml月经且在收集于不含具有钙及镁的抗生素的DPBS与无防腐剂肝素的所得培养基中约24小时至约48小时内将其运送至处理设备，藉此收集月经血干细胞M28101R。将月经样品在抗生素中培育24小时，且随后洗涤，经由离心来浓缩，与10％DMSO冷冻保藏剂混合，且根据美国专利申请公开案第20080241113号的教示来极冷保藏。
用于月经血干细胞M28101R的月经在收集之后经处理且根据本申请中所述的月经血干细胞处理及极冷保藏方法在收集之后约3天经极冷保藏。使细胞保持极冷保藏历时约6个月。根据本申请中所述的解冻方法使M28101R细胞解冻。
用于脐带871R细胞的脐带血样品在收集之后约2天经处理且根据本申请中所述的脐带血的处理及极冷保藏方法经极冷保藏。使脐带871R细胞保持极冷保藏历时约两年半。根据本申请中所述的解冻方法使脐带871R细胞解冻。
培养-培养盘
在室温下使培养基(MethoCult #4034-半固体培养基)的三个3ml管解冻且接着连同细胞稀释液(50000个M28101R细胞/ml+500000个脐带871R细胞/ml；100000个M28101R细胞/ml+500000g个脐带871R细胞/ml；及216000个M28101R细胞/ml+500000个脐带871R细胞/ml)一起置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将0.3ml在培养基中的各细胞稀释液接种于培养基的独立管中。接着，轻微涡动该等管且接着在水上培育30分钟。在培育之后，将培养基中的各细胞稀释液等分至独立4孔培养盘的前3个孔中。将1ml DPBS添加至各培养盘的第四孔中以有助于湿度，且在37℃下培育细胞。细胞培养的某些结果概括于表B中。
培养-烧瓶
使脐带871R细胞及M28101R月经血细胞经受使经极冷保藏的细胞解冻且接着在Chang氏完全培养基中经由本申请中所揭示的离心来洗涤该等细胞的步骤。使细胞小球再悬浮于约7ml 15％Chang氏完全培养基中。
在T25非经组织培养物处理的烧瓶中，以7ml 15％ Chang氏完全培养基中约724000个细胞(具有约1000000个脐带血干细胞)来接种再悬浮的月经血细胞。在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育细胞，直至细胞以约70-80％融合。细胞经历表F中所展示的若干继代。在约三或四天之后出现包含表F中所示的15％ Chang氏完全培养基的完全改变的继代。
表F-M28101R月经血细胞+脐带871R细胞的培养
  继代   总计数   流   极冷   培养物   天数   倍增   PD时间(hr)
  P1   1200000   1200000   0
  P2   18430000   178000000   576000   4   15.36   6.25
  P3   3380000   3380000   4   5.87   16.36
  P4   12430000   12000000   430000   3   36.78   1.96
  P5   1450000   1450000   3   3.37   21.35
实例6-培养M2-048
根据美国专利公开案第20080241113号的方法收集约9.7ml月经且在收集于不含具有钙及镁的抗生素的DPBS与无防腐剂肝素的所得培养基中约24小时至约48小时内将其运送至处理设备，藉此收集月经血干细胞M2-048。将月经样品在抗生素中培育24小时，且随后洗涤，经由离心来浓缩，与10％ DMSO冷冻保藏剂混合，且根据美国专利申请公开案第20080241113号的教示来极冷保藏。
用于月经血干细胞M2-048的月经在收集之后经处理且根据本申请中所述的月经血干细胞处理及极冷保藏方法在收集之后约3天经极冷保藏。使细胞保持极冷保藏历时约3个月。根据本申请中所述的解冻方法使M2-048细胞解冻。
培养-培养盘
在室温下使培养基(MethoCult #4034-半固体培养基)的三个3ml管解冻且接着以50000个细胞/ml、100000个细胞/ml及216000个细胞/ml的细胞稀释液形式置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将约0.3ml的各M2细胞稀释液接种于Methocult #4034半固体培养基的管中。轻微涡动该等管且接着在冰上培育30分钟·在培育之后，将培养基及月经血干细胞等分至4孔培养盘的前3个孔中。将1ml DPBS添加至第四孔中以有助于湿度，且在37℃下培育细胞。
培养-烧瓶
使M2-048月经血细胞经受使经极冷保藏的细胞解冻且接着在Chang氏完全培养基中经由本申请中所揭示的离心来洗涤该等细胞的步骤。使细胞小球再悬浮于约7ml 15％ Chang氏完全培养基中。
在T25非经组织培养物处理的烧瓶中，以7ml 15％ Chang氏完全培养基中约1000000个细胞来接种再悬浮的月经血细胞。在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育细胞，直至细胞以约70-80％融合。细胞经历表G中所展示的若干继代。在约三或四天之后出现包含表G中所示的15％ Chang氏完全培养基的完全改变的继代。
表G-M2-048月经血细胞的培养
继代 总计数 流 极冷   接种以用于下一继代 天数 倍增   PD时间(hr)
  P7   1100000   1030000   64500   3
  P8   866700   866700   4   13.44   7.14
  P9   6640000   4180000   2340000   123000   3   7.66   9.40
  P10   855000   855000   3   6.95   10.36
  P11   12620000   4780000   7610000   217500   4   14.76   6.50
  P12   1620000   1530000   89976   3   7.45   9.67
  P13   110200   110200   4   1.22   78.38
  P14   9940000   4090000   5840000   0   4   90.20   1.06
实例7-培养M2-048+混合脐带(5006-2180与5013-2670)
根据美国专利公开案第20080241113号的方法，收集月经且在收集于不含具有钙及镁的抗生素的DPBS与无防腐剂肝素的所得培养基中48小时内将其运送至处理设备，藉此收集月经血干细胞M2-048。将月经样品在抗生素中培育24小时，且随后洗涤，经由离心来浓缩，与10％DMSO冷冻保藏剂混合，且根据美国专利申请公开案第20080241113号的教示来极冷保藏。
用于月经血干细胞M2-048的月经在收集之后经处理且根据本申请中所述的月经血干细胞处理及极冷保藏方法在收集之后约3天经极冷保藏。使细胞保持极冷保藏历时约3个月。根据本申请中所述的解冻方法使M2-048细胞解冻。
用于脐带5006-2180细胞的脐带血样品在收集之后约1天经处理且根据本申请中所述的脐带血的处理及极冷保藏方法经极冷保藏。使脐带5006-2180细胞保持极冷保藏历时约三年。根据本申请中所述的解冻方法使脐带5006-2180细胞解冻。
用于脐带5013-2670细胞的脐带血样品在收集之后约1天经处理且根据本申请中所述的脐带血的处理及极冷保藏方法经极冷保藏。使脐带5013-5670细胞保持极冷保藏历时约三年。根据本申请中所述的解冻方法使脐带5013-2670细胞解冻。
培养-培养盘
在室温下使培养基(MethoCult #40340-半固体培养基)的一个3ml管解冻且接着与50000个细胞/ml、100000个细胞/ml及216000个细胞/ml的脐带5006-2180细胞稀释液一起置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将约0.3ml的各细胞稀释液接种于MethoCult #4034半固体培养基的管中。轻微涡动该等管且接着在冰上培育30分钟。在培育之后，将培养基及月经血干细胞等分至4孔培养盘的前3个孔中。将1ml DPBS添加至第四孔中以有助于湿度，且在37℃下培育细胞。
培养-烧瓶
在两个T25非经组织培养物处理的烧瓶中，以7ml 15％Chang氏完全培养基中约2000000个细胞来接种再悬浮的脐带5006-2180细胞。在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育细胞，直至细胞以约70-80％融合，细胞经历若干继代。在约三或四天之后出现包含15％Charog氏完全培养基的完全改变的继代。
培养-培养盘
在室温下使培养基(MethoCult #4034-半固体培养基)的两个3ml管解冻且接着与50000个细胞/mL、100000个细胞/mL及216000个细胞/mL的脐带5013-2670细胞稀释液一起置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将约0.3ml的各M2细胞稀释液接种于Methocult #4034半因体培养基的管中。轻微涡动该等管且接着在水上培育30分钟。在培育之后，将培养基及月经血干细胞等分至4孔培养盘的前3个孔中。将1ml DPBS添加至第四孔中以有助于湿度，且在37℃下培育细胞。
表I-脐带5013-2670的培养盘培养
  象限1   象限2   象限3   象限4   总计
  孔1 BFU-E   2   0   0   0   2
  孔2 BFU-E   0   0   2   0   2
  孔3 BFU-E   0   1   0   0   1
  平均总BFU-E   1.6
  孔1 GM   0   0   1   0   1
  孔2 GM   0   0   0   0   0
  孔3 GM   0   0   0   0   0
  平均总GM   0.3
  孔1 GEMM   5   0   1   5   11
  孔2 GEMM   0   3   3   7   13
  孔3 GEMM   5   3   7   0   15
  平均总GEMM   13
培养-烧瓶
使脐带5013-2670细胞经受使经极冷保藏的细胞解冻且接着在Chang氏完全培养基中经由本申请中所揭示的离心来洗涤该等细胞的步骤。使细胞小球再悬浮于约7ml 15％ Chang氏完全培养基中。
在两个T25非经组织培养物处理的烧瓶中，以7ml 15％Chang氏完全培养基中约2000000个细胞来接种再悬浮的月经血细胞。在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育细胞，直至细胞以约70-80％融合。细胞经历若干继代。在约三或四天之后出现包含15％ Chang氏完全培养基的完全改变的继代。
培养-培养盘
在室温下使培养基(MethoCult#4034-半固体培养基)的三个3ml管解冻且接着连同细胞稀释液(100000个M2-048月经血细胞+250000个脐带5006-2180细胞/ml；10000个M2-048月经血细胞+250000个脐带5013-2670细胞/ml；及10000个M2-048月经血细胞+500000个脐带5013-2670细胞/ml)一起置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将约0.3ml的各细胞稀释液接种于Methocult#4034半固体培养基的独立管中。轻微涡动该等管且接着在冰上培育30分钟。在培育之后，将培养基及月经血干细胞等分至4孔培养盘的前3个孔中。将1ml DPBS添加至第四孔中以有助于湿度，且在37℃下培育细胞。
表J-脐带5013-2670+M2-048的培养盘培养
  象限1   象限2   象限3   象限4   总计
  孔1 BFU-E   1   5   1   0   7
  孔2 BFU-E   0   0   0   12   12
  孔3 BFU-E   0   0   0   0   0
  平均总BFU-E   6.3
  孔1 GM   0   2   2   1   5
  孔2 GM   0   1   3   0   4
  孔3 GM   0   0   0   0   0
  平均总GM   3
  孔1 GEMM   o   0   0   2   2
  孔2 GEMM   0   2   0   0   2
  孔3 GEMM   0   0   0   1   1
  平均总GEMM   1.6
培养-烧瓶
在T25非经组织培养物处理的烧瓶中，将1000000个取自第4继代的M2-048月经血细胞及100000个脐带5006-2180细胞接种于7ml 15％Chang氏完全培养基中。将1000000个M2-048月经血细胞及1000000个脐带5013-267细胞接种于7ml 15％ Chang氏完全培养基中。在胰蛋白酶化之后，将两个细胞培养物混合为M2-048且混合脐带5006-2180与脐带5013-2670。在CO2培育箱中在约36℃至约38℃下培育细胞，直至细胞以约70-80％融合。细胞经历若干继代。在约三或四天之后出现包含15％ Chang氏完全培养基的完全改变的继代。
表K-培养：M2-048-01 P4+混合的脐带5006-2180与脐带5013-2670
继代 总计数 流 极冷   接种以用于下一继代 天数 倍增   PD时间(hr)
  7   3420000   3240000   180000   4
  8   1260000   1150000   104970   3   7.00   10.29
  9   841000   841000   3   8.01   8.99
  10   9830000   4910000   4740000   175000   4   11.69   8.21
  11   1976000   1976000   4   11.26   8.53
  12   5720000   4420000   1300000   2   2.89   16.58
  13   12110000   4540000   7190000   378000   4   9.32   10.31
  14   4349000   3624000   725000   5   11.49   10.44
实例6及7的表型分析
根据本申请中所述的方法，使包含第7继代所收集的M2-048、脐带5006-2180及脐带5013-2670的混合培养物及M2-048月经血细胞培养物的3240000个细胞经受表型分析。表型分析的结果展示于表L中。
表L-细胞培养物的流式细胞仪分析
  M2-048+脐带(混合)P7日期：02-05-08   M2-048+脐带(混合)P11日期：02-15-08   M2-048P11日期：02-15-08   M2-048P14日期：02-26-08   M2-048+脐带(混合)P19日期：03-21-08
  ％POS   ％POS   ％POS   ％POS   ％POS
  HLA-I   100   86.6   97.1   98.5   96.6   HLA-I
  CD133   0   0   0   0   0   CD133
  HLA-Ⅱ   18   70.8   0.2   0.4   0.7   HLA-Ⅱ
  CD9   95   81.9   78.6   30.7   38.2   CD9
  CD54   0   0   1.5   4   2.3   CD54
  CD45   50   23.5   2   5.2   5.8   CD45
  CD10   15   59   31.1   27.4   15.2   CD10
  CD59   100   82.9   95   99.1   98.3   CD59
  CD63   100   7.7   13.1   8   3.8   CD63
  CD34   0   85.3   12.1   5.5   20.3   CD34
  CD13   83   96.5   98.5   98.3   95.2   CD13
  CD49e   88   86.5   94.4   90.4   69   CD49e
  CD49f   70   93   97.5   96   80.6   CD49f
  CD81   100   91.4   96.3   94.1   93.8   CD81
  CD44   100   86.4   93.2   99.4   99   CD44
  CD117   0   0   0   0   0   CD117
  CD38   0   0   0   0   0   CD38
  CD29   100   98.4   95   99.4   98.1   CD29
  CD105   98   91.8   96.9   98.6   96.2   CD105
  CD90   98   93.1   95.6   94.1   92.4   CD90
  CD166   99   91.7   97.3   98.8   98.8   CD166
  NANOG   ND   1   0.1   ND   0.6   NANOG
  SSEA3   0   0   0   ND   0   SSEA3
  SSEA4   0   43.9   44.9   ND   2.6   SSEA4
  CD3   ND   0   0   0   0   CD3
  CD19   ND   0   0   0   0   CD19
  CD14   ND   0   0   0   0.2   CD14
  CD56   ND   0   0   0   0   CD56
  CD41   ND   85   97.8   98.7   95.6   CD41
实例8-培养各种浓度的M2-048月经血细胞、5006-2180脐带细胞及5013-2670细胞
在室温下使培养基(MethoCult #4034-半固体培养基)的七个3ml管解冻且接着连同细胞稀释液(25000个细胞的5006-2180脐带细胞/ml；25000个细胞的5013-2670脐带细胞/ml；50000个细胞的5013-2670脐带细胞/ml；1000个细胞的M2-048/ml；25000个细胞的M2-048+1000个细胞的5006-2180脐带细胞/ml；25000个细胞的M2-048+1000个细胞的5013-2670脐带细胞/ml；及50000个细胞的M2-048+1000个细胞的5013-2670脐带细胞/ml)一起置于冰上历时15分钟。15分钟之后，将各细胞稀释液接种于Methocult #4034半固体培养基的独立管中。轻微涡动该等管且接着在水上培育30分钟。在培育之后，将培养基及月经血细胞、脐带细胞及月经血及脐带细胞组合各自等分至七个不同的4孔培养盘的孔中以进行培育。将1ml DPBS添加至七个不同的4孔培养盘各自之第四孔中以有助于湿度，且在37℃下培育细胞。
表M-脐带5006-2180细胞、脐带5013-2670细胞、M2-048月经血细胞、M2-048月经血细胞+脐带5006-2180细胞、M2-048月经血细胞+脐带5013-2670细胞及M2-048月经血细胞+脐带5013-2670细胞的培养盘培养
样品ID   每孔脐带细胞/每孔M2细胞   BFU-E平均值   CFU-GM平均值   CFU-GEMM平均值   培养天数
  5006-2180   25000   52.7   14.3   0   16
  5013-2670   25000   0.3   1.6   0.6   16
  5013-2670   50000   1.6   0.3   13   16
  M2-048 P4   1000   0   0   0   23
  M2-048 P4及5006-2180 25000/1000 27 11.3 2 16
  M2-048 P4及5013-2670 25000/1000 5.6 4.3 1.6 16
  M2-048 P4及5013-2670 50000/1000 6.3 3 1.6 16
尽管已展示且描述了本发明的较佳实施例，但熟习此项技术者显而易见在本发明的较广泛方面中在不脱离本发明的情况下可进行多种改变及修改。因此，随附申请专利范围意欲涵盖所有属于本发明的真实精神及范畴内的此等改变及修改。

Claims (19)

1.一种表现CD34的人类细胞的群体，其获自人类脐带血细胞在用以促进人类脐带血细胞群体倍增的具有人类月经血细胞的合适培养条件下的扩增。
2.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该人类细胞的群体还表现SSEA4。
4.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该人类细胞的群体还表现HLA-II。
5.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该表现CD34的人类细胞的群体悬浮于冷冻保藏剂、培养基、生长培养基或分化培养基中的任一中。
6.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该表现CD34的人类细胞的群体为至少两次或两次以上群体倍增的结果。
7.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该人类细胞的群体能够产生以下任一者：群落形成单位、群落形成单位粒细胞(CFU-GM)巨噬细胞、红细胞系爆裂样生成单位、和粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞群落形成单位(CFU-GEMM)。
8.一种表现CD34的人类脐带血细胞的群体，其通过包含以下的方法而获得：
在适于脐带血干细胞扩增的条件下共同培养足量的脐带血干细胞与足量月经血干细胞；及
经由至少两次群体倍增使足量脐带血细胞在培养物中增殖。
9.如权利要求8所述的方法，其中该方法进一步包含使足量脐带血细胞在培养物中生长以产生以下任一者的步骤：群落形成单位(CFU)、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
10.如权利要求8所述的方法，其中该方法进一步包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后，分离表现CD34的脐带血细胞的步骤。
11.如权利要求8所述的方法，其中该方法进一步包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后，冷冻保藏该表现CD34的人类脐带血细胞的群体的步骤。
12.如权利要求8所述的方法，其中，在使足量脐带血细胞在合适的培养条件下增殖之后，该表现CD34的人类脐带血细胞的群体还表现HLA-II。
13.如权利要求8所述的方法，其中，在使足量脐带血细胞在合适的培养条件下增殖之后，该表现CD34的人类脐带血细胞的群体还表现SSEA4。
14.如权利要求8所述的方法，其中该使足量脐带血细胞在培养物中增殖包含使脐带血细胞生长以产生以下任一者：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
15.一种获得经扩增的表现CD34的人类脐带血细胞的方法，该方法包含：
在适于促进脐带血细胞扩增的共同培养条件下以足量月经血细胞接种足量的脐带血细胞；及
在支持脐带血细胞的至少两次或两次以上群体倍增的培养条件下共同培养脐带血细胞与月经血细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中，表现CD34的人类脐带血细胞的共同培养包含扩增脐带血细胞以表现SSEA-4及HLA-II中的至少一种或多种。
17.如权利要求16所述的方法，其中，经扩增人类脐带血细胞表现高含量的CD34。
18.如权利要求15所述的方法，其中，脐带血细胞的共同培养包含扩增脐带血细胞以产生以下任一者：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
19.如权利要求15所述的方法，其中，该方法进一步包含以下步骤中的至少一种：免疫选择关于CD34的经扩增人类脐带血细胞；自培养物分离经扩增人类脐带血细胞以用于输注于人类中；极冷保藏经扩增人类脐带血细胞；或将经扩增脐带血细胞分化为细胞系。
20.如权利要求15所述的方法，其中该方法包含使经扩增人类脐带血细胞生长以产生以下任一者的步骤：群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
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