KR101348093B1

KR101348093B1 - 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101348093B1
Application number: KR1020120015093A
Authority: KR
Inventors: 이상훈; 에드워드 강
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-15
Filing date: 2012-02-15
Publication date: 2014-01-16
Also published as: KR20130093880A

Abstract

본 발명은 마이크로 유체 칩을 이용한 세포연구 및 조직공학을 위한 기초 기술이며, 보다 상세하게 공동 배양을 이용한 세포 간 상호작용연구 및 인공장기 개발을 위한 세포 조직 개발에 관한 것이다. 본 발명에 의해 2 종류 이상의 세포들을 마이크로 단위의 하이드로겔 섬유 내 코딩함으로써 상호작용이 발생하는 영역의 관찰이 용이하며 환경을 쉽게 제어할 수 있고, 마이크로 유체 컨트롤 이용하여 세포 코딩되는 범위를 조절할 수 있고, 종류를 다양하게 함이 가능하여 가장 상호작용이 잘되는 구간을 설정할 수 있을 뿐만 아니라, 3차원 섬유 내 길이 방향 및 지름 방향으로 코딩이 가능하여 실제 장기를 모사하거나 조직을 모사함에 있어 큰 장점을 가진다.

Description

공동 배양된 세포를 포함하는 섬유 및 그 제조방법{Microfiber commprising co-cultured cells and its preparation method}

본 발명은 마이크로 유체 칩을 이용한 세포연구 및 조직공학을 위한 기초 기술이며, 보다 상세하게 공동 배양을 이용한 세포 간 상호작용연구 및 인공장기 개발을 위한 세포 조직 개발에 관한 것이다.

세포 간의 상호작용은 세포의 성장, 이동, 및 분화에 매우 중요하다. 또한, 세포간의 상호 작용에 의해 조직의 기능이 수행되므로 in vitro에서 치료를 목적으로 하는 세포 연구의 경우, 세포간의 상호작용에 대한 연구가 더욱 중요하다. 따라서 이러한 세포간의 상호작용 연구를 가능하게 하는 수단이 필요하다.

구체적인 분자적 수준에서 고려해 보면 세포간의 상호 작용은 성장호르몬, 사이토카인 등과 같은 체액을 매개로 세포 간의 신호전달 및 세포간의 직접적인 접촉에 의한 신호 전달을 포함한다. 직접적인 접촉에 의한 신호전달의 예로는 대표적으로 조혈줄기세포와 SNO(Spindle-shaped N-cadherin Osteoblast) 간의 상호작용을 들 수 있다. 조혈줄기세포(HSC, hematopoietic stem cell)는 줄기세포성(stemness)를 유지하기 위해 SNO와 N-카드헤린을 통해 상호작용하여야 한다. 즉, 조혈줄기세포의 줄기세포성을 유지하기 위해서는 SNO가 필수적으로 조혈줄기세포에 인접하고 있어야 하는 것이다.

Shen Q 등은 트랜스웰 인서트를 이용하여 내피세포가 신경 줄기세포의 줄기세포성을 유지시켜 주는 환경을 제공한다는 것을 보고하였다. 이러한 내피세포와 신경 줄기세포 간의 상호작용의 연구는 트랜스웰 인서트를 이용하여 수행된 것이다[Shen Q et al., Endothelial cells stimulate selfrenewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 2004 May 28; 304(5675):1338-40].

종래에 세포 공동배양은 피더층(가용성 인자)을 이용한 세포 간 상호작용 연구가 일반적이었다. 최근에는 마이크로 기술을 이용하여 웰 타입으로 제작된 챔버를 이용한 기술이 소개되었고, 히드로겔을 사용한 캡슐의 내부와 외부에 분리하여 삽입하거나 파이버에 지름 방향으로 세포를 코딩하여 공동 배양하는 기술 등이 소개된 바 있다.

구체적으로 한국 특허등록 제10-0718158호는 챔버 제작을 통해 단일 세포들의 2차원적 접촉을 촉진하였고, 한국 특허출원 제10-2010-7011330호는 군집세포들의 공동 배양을 촉진시켰으나 이 역시 2차원 배양이고 일정한 영역이 아닌 무질서하게 세포 공동배양을 수행하였다.

그러나, 이러한 종래의 세포 공동배양 기술은 두 종류 이상의 세포 군집을 무질서하게 배양하는 정도에 그치는 한계가 있었다. 또한, 마이크로 머시닝 기술을 이용한 마이크로 구조물 내 세포들을 배양하여 수행하는 경우에도, 환경에 변화에 따라 매우 큰 차이를 보이며 모든 영역에서 공동 배양 효과를 기대할 수 없는 한계가 있으며, 또한 실제 생체 내 3차원 조직 안에서 발생하는 세포 간 상호작용을 관찰할 수 없다는 문제가 있다. 또한, 종래 히드로겔을 이용한 세포 배양 기술도 많은 종류의 세포들을 공동 배양할 수 없고, 여러 방향이 아닌 단방향 상호 작용만 관찰이 가능할 뿐만 아니라, (마이크로 단위의) 일정한 영역에 세포를 코딩하는 컨트롤이 불가능하다는 한계를 보인다.

이와 같은 문제 등을 해결하기 위하여, 본 발명은 실제 장기나 조직을 모사한 3차원 세포 공동배양, 여러 방향의 세포 간 상호작용을 통한 공동배양 기술 개발, 및 일정한 영역 (마이크로 단위) 내 세포 코딩 기술을 제공하고자 한다.

본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고, 상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 본 발명의 여러 구현예에 따른 공동 배양 세포 포함 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 이식용 키트에 관한 것이다.

본 발명은 2 종류 이상의 세포들을 마이크로 단위의 하이드로겔 섬유 내 코딩함으로써 상호작용이 발생하는 영역의 관찰이 용이하며 환경을 쉽게 제어할 수 있다.

또한 마이크로 유체 컨트롤 이용하여 세포 코딩되는 범위를 조절할 수 있고, 종류를 다양하게 함이 가능하여 가장 상호작용이 잘되는 구간을 설정할 수 있다.

3차원 섬유 내 길이 방향 및 지름 방향으로 코딩이 가능하여 실제 장기를 모사하거나 조직을 모사할 때 유리하다.

도 1(a)는 전체적으로 마이크로 밸브와 동축 채널(샘플 채널)이 결합된 칩을 만드는 개략도이다. 작은 구멍(직경 2mm-3 mm 혹은 그 이상)이 나 있는 칩의 윗 부분(혹은 아래 부분)을 OHP 필름 위에 부착하고 계산된 PDMS drop을 떨어뜨린다. 열로 이를 경화시키고 밑의 채널과 본딩한 후, 이용한다. 밸브 윗 부분으로 공기를 주입하면 아래 채널을 막을 수 있다.
도 1(b)는 본 발명에 따른 마이크로 밸브의 단면을 2D 축방향 시뮬레이션한 것을 나타내는 도면인데, 오른쪽 사진은 실제 제적된 밸브의 단면사진이다.
도 2는 2개의 반 실린더 채널의 성형체를 결합시킨 다양한 실린더 채널의 모양을 나타낸 것이다.
도 3(a)는 6개의 샘플 채널을 가진 미세유체칩의 스킴을 나타낸 것이고, 도 3(b)는 실제 제작된 미세유체칩이며, 도 3(c)는 알지네이트 칼슘 반응을 통해 미세 섬유를 제작하는 과정을 나타낸 스킴이며, 도 3(d)는 실제 미세 섬유를 제작하는데 사용되는 동축 채널의 한 면의 전자현미경 사진이다.
도 4는 2개의 샘플 채널을 가진 미세유체칩의 스킴을 나타낸 것이다. 각각 연결된 밸브의 제어를 통해 각각의 샘플 채널을 제어할 수 있으며, 이를 통해 다양한 모양과 종류의 섬유를 제작하는 스킴을 나타낸 것이다.
도 5는 실린더 채널과 동축 채널을 제조하는 공정의 개략도이다.
도 6(a)는 마이크로 밸브와 PC(Lab VIEW)를 연결하여 자동으로 밸브를 조절하는 실험을 나타낸 사진이고, 도 6(b)는 마이크로 밸브의 막 부분의 SEM 사진이며, 도 6(c)는 실제 칩과 연결된 밸브와 공기 채널 사진으로서, 공기 채널에 공기가 유입되면 밸브가 '막힘' 상태가 되어 샘플이 흐르지 않게 하고, 공기를 다시 빼내면(vnet) 채널이 '열림' 상태가 되어 샘플이 흐름을 알 수 있다.
도 7은 섬유 발생 칩(fiber generating chip)을 이용하여 만들어진 섬유상의 스캐폴드(fibrous scaffold) 이미지이다.
도 8(a)는 염색약을 이용하여 미세유체칩이 올바르게 작동되는지 테스트하는 사진이다. 도 8(a)의 오른쪽 사진은 6개의 샘플 중에서 밸브를 닫은 경우는 샘플이 채널을 흐르지 않고, 열린 상태의 샘플만 섬유 제작 부분으로 흐르는 것을 나타내는 사진이다.
도 8(b)는 마이크로 밸브를 이용한 두 개의 샘플 채널을 이용하여 절단된 섬유를 보여주는 도면이다.
도 9는 본 발명에 따른 미세유체칩에 의해 제조된 다양한 모양의 섬유를 나타낸 사진이다.
도 10은 본 발명에 따른 미세유체칩에 의해 제조된 다양한 종류의 섬유를 나타낸 사진이다.
도 11과 도 12는 본 발명에 따른 미세유체칩으로 섬유를 제조하는 방법을 나타낸 것이다.
도 13은 거미의 글랜드(gland)와 스피곳(spigot) 기관을 모사한 것으로 실제 거미가 섬유를 제조하는 것을 나타내는 그림이다.
도 14는 공기채널과 마이크로밸브를 나타낸 그림으로서, 공기채널로부터 압력을 받으면 마이크로밸브가 작동하는 것을 나타낸 것이다.
도 15(a), (b), (c)는 밸브 두께의 이론에 관한 공식에 관한 그래프이다.
도 16(a)는 밸브에 주입되는 공압의 크기에 따른 섬유 직경의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 16(b)는 샘플 재료로 알지네이트 파우더/물(powder/water) 1%를 사용하였고, 상기 샘플을 대략 5 ㎕/min-20 ㎕/min의 투입 속도로 주입하였으며, 알지네이트를 굳히는 용매로 1% Cacl2/물을 사용하였으며, 상기 용매의 투입 속도는 대략 20 ml/h-30 ml/h로 실험을 하여 그 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 16(c)는 도 9(a)에서 맺힌 물방울 크기를 볼록 부분의 크기에 따라 나타낸 것이다.
도 17(a)는 세포가 일정하게 배열된 마이크로 섬유의 모식도(상) 및 광학 사진(하)이고, 도 17(b)는 간세포와 섬유세포가 일정하게 배열된 바이오 섬유의 현미경 사진이며, 도 17(c)는 2개의 세포가 배열된 인공조직과 1개의 간세포로 구성된 인공조직 내 세포의 생존율 그래프이다.
도 18은 본 발명의 여러 구현예에 따른 섬유를 구현하기 위해 사용할 수 있는, 채널과 밸브를 포함하는 섬유 형성 시스템의 일 구현예를 보여준다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고, 상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

즉, 위 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역을 의미한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고; 상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역으로 구성되며; 상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역과 제2 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 2개의 영역으로 나뉘고; 상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

즉, 위 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은, 구체적으로 예를 들어 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 제1 세포가 배양되어 고형화되어 있는 영역과 상기 제1 세포와는 다른 종류의 제2 세포가 배양되어 고형화된 영역이 서로 나란히 인접하여 위치한 형태일 수도 있다. 또는, 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때, 제1 세포가 배양되어 고형화되어 있는 영역을 제1 세포와는 다른 종류의 제2 세포가 배양되어 고형화된 영역이 둘러싸는 형태일 수도 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고; 상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역, (a-3) 상기 제2 영역과 인접한 제3 영역으로 구성되며; 상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 3개의 영역으로 나뉘고; 상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제3 영역은 제3 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포는 서로 상이한 종류의 세포이며; 상기 제1 세포와 상기 제3 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

바람직하게는, 도 17(b)에 나타낸 것과 같이, 제1 세포(예: 간세포)가 배양되어 고형화되어 있는 영역의 좌측과 우측에 각각, 상기 제1 세포와 다른 종류의 제2 세포(예: 섬유세포)가 배양되어 고형화되어 있는 영역이 상기 제1 세포의 배양 영역과 서로 나란히 인접하여 위치한 형태일 수 있다.

그 중에 특히 도 17(b)에 나타낸 형태의 공동 배양 영역은, 예를 들어 도 18에 나타낸 것과 같은 시스템을 사용하는 경우에, 제1 샘플 채널에 예를 들어 간세포 및 알지네이트 같은 섬유 형성제를 투입하고, 제2 샘플 채널에 예를 들어 섬유세포 및 알지네이트 같은 섬유 형성제를 투입하고, 제3 샘플 채널에 예를 들어 섬유세포(또는 예를 들어 간세포 또는 섬유세포 외 제3의 세포) 및 알지네이트 같은 섬유 형성제를 투입함으로써 형성될 수 있다.

즉, 도 17(b)에 나타낸 형태의 공동 배양 영역은, 예를 들어 도 18과 같은 형태의 시스템을 사용하는 경우에, 위 3개의 샘플 채널 모두를 통하여 세포를 투입함으로써 형성시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고; 상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역, (a-3) 상기 제2 영역과 인접한 제3 영역, (a-4) 상기 제3 영역과 인접한 제4 영역으로 구성되며; 상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 4개의 영역으로 나뉘고; 상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포 및 제3 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제3 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제3 영역은 제3 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제4 영역은 제4 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포는 서로 상이한 종류의 세포이며, 상기 제3 세포와 상기 제4 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고; 상기 제1 세포와 상기 제3 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포이며, 상기 제2 세포와 상기 제4 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

즉, 도 18에 나타낸 것과 같이 샘플 채널이 3개인 시스템을 사용하는 대신, 샘플 채널이 2개 또는 4개 이상인 시스템을 사용할 수도 있다.

샘플 채널이 많은 시스템을 사용하게 되면 시스템 구축 비용이 상승하는 반면, 공동 배양 영역 내에 예를 들어 간세포 영역과 섬유세포 영역의 수가 많아질 수 있어, 섬유세포에서 간세포 영역으로 알부민 또는 성장인자의 확산이 더욱 균일하게 이루어 질 수 있어 유리한 면이 있다. 따라서, 이러한 점을 고려하여 샘플채널이 2-10개, 또는 3-5개인 시스템을 사용하여 공동 배양 영역을 형성시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고; 상기 섬유의 길이 방향으로 다른 일부분은 (b) 세포의 단일 배양 영역이며; 상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역이고; 상기 단일 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포 중 어느 한 종류의 세포만 배양되는 영역이며; 상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있거나 또는 서로 간극을 두고 떨어져 있고; 상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있는 경우에 상기 간극 부분은 세포를 포함하지 않는 섬유 구간인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

위 단일 세포 배양 영역은, 예를 들어 도 18과 같은 형태의 시스템을 사용하는 경우에, 위 3개의 채널에서 제1 샘플 채널에만 예를 들어 간세포 및 알지네이트 같은 섬유 형성제를 투입하거나, 또는 제2 샘플 채널에만 예를 들어 섬유세포 및 알지네이트 같은 섬유 형성제를 투입함으로써 형성될 수 있다.

또는, 위 단일 세포 배양 영역은 제2 샘플 채널과 제3 샘플 채널에 예를 들어 섬유세포 및 알지네이트 같은 섬유 형성제를 동일하게 투입함으로써도 형성될 수 있다.

즉, 단일 배양 영역은, 예를 들어 도 18과 같은 형태의 시스템을 사용하는 경우에, 위 3개의 샘플 채널 중 제1 샘플 채널, 제2 샘플 채널, 제3 샘플 채널 각각만을 통하여 세포를 투입함으로써 형성시킬 수도 있고, 또는 제1 샘플 채널을 이용하지 않고 제2 샘플 채널과 제3 샘플 채널만을 이용하여 형성시킬 수도 있다.

또는, 도 18과 같은 샘플 채널이 3개인 시스템을 사용하는 대신, 샘플 채널이 2개 또는 4개 이상인 시스템을 사용할 수도 있으며, 이때 샘플 채널 1개만을 통하여 세포를 투입하거나 또는 2개 이상의 샘플에 동일한 종류의 세포를 투입함으로써 형성시킬 수도 있다.

이와 같이, 공동 배양 영역 및 단일 배양 영역 모두를 포함하는 섬유에서 상기 공동 배양 영역과 상기 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있을 수 있다. 이와 같이 인접해 있는 패턴은 도 18과 같은 형태의 시스템을 사용하는 경우에 제1 샘플 채널만을 통하여 간세포를 투입하는 단계, 및 제1 샘플 채널을 차단함과 동시에 제2 샘플 채널 또는 제3 샘플 채널 각각 또는 제2 샘플 채널과 제3 샘플 채널 모두를 통하여 섬유세포를 투입하는 단계를 시간 차 없이 번갈아 수행함으로써 달성될 수 있다.

또는, 공동 배양 영역 및 단일 배양 영역 모두를 포함하는 섬유에서 상기 공동 배양 영역과 상기 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있을 수도 있다. 이와 같이 떨어져 있는 패턴은 도 18과 같은 형태의 시스템에 샘플 채널을 하나 추가로 두고 세포 없이 알지네이트와 같은 섬유 형성제만을 투입하는 단계를 중간 중간에 수행함으로써 상기 간극 부분을 형성시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고; 상기 섬유의 길이 방향으로 다른 일부분은 (b) 세포의 단일 배양 영역이며; 상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있거나 또는 서로 간극을 두고 떨어져 있고; 상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있는 경우에 상기 간극 부분은 세포를 포함하지 않는 섬유 구간이며; 상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역이고; 상기 단일 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포 중 어느 한 종류의 세포만 배양되는 영역이며; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고; 상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역으로 구성되며; 상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역과 제2 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 2개의 영역으로 나뉘고; 상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고; 상기 섬유의 길이 방향으로 다른 일부분은 (b) 세포의 단일 배양 영역이며; 상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있거나 또는 서로 간극을 두고 떨어져 있고; 상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있는 경우에 상기 간극 부분은 세포를 포함하지 않는 섬유 구간이며; 상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역이고; 상기 단일 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포 중 어느 한 종류의 세포만 배양되는 영역이며; 상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역, (a-3) 상기 제2 영역과 인접한 제3 영역으로 구성되며; 상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 3개의 영역으로 나뉘고; 상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제3 영역은 제3 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포는 서로 상이한 종류의 세포이며, 상기 제1 세포와 상기 제3 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서; 상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고; 상기 섬유의 길이 방향으로 다른 일부분은 (b) 세포의 단일 배양 영역이며; 상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있거나 또는 서로 간극을 두고 떨어져 있고; 상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있는 경우에 상기 간극 부분은 세포를 포함하지 않는 섬유 구간이며; 상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역이고; 상기 단일 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포 중 어느 한 종류의 세포만 배양되는 영역이며; 상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역, (a-3) 상기 제2 영역과 인접한 제3 영역, (a-4) 상기 제3 영역과 인접한 제4 영역으로 구성되며; 상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 4개의 영역으로 나뉘고; 상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포 및 제3 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제3 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제3 영역은 제3 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제4 영역은 제4 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포는 서로 상이한 종류의 세포이며, 상기 제3 세포와 상기 제4 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고; 상기 제1 세포와 상기 제3 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포이며, 상기 제2 세포와 상기 제4 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

일 구현예에 따르면, 본 발명의 여러 측면에 따른 공동 배양 세포 포함 섬유에 있어서, 상기 2종 이상의 세포 중 하나는 섬유세포, 지방세포, 내피세포, 외피세포, 상피세포 중에서 선택되고; 상기 2종 이상의 세포 중 다른 하나는 간세포, 신경세포, 줄기세포, 이자 세포 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유가 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 여러 측면 및 구현예에 따른 공동 배양 세포 포함 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 이식용 키트가 개시된다.

이하에서는, 본 발명의 여러 측면 및 구현예에 따른 공동 배양 세포 포함 섬유를 구현하기 위한 섬유 형성 시스템 또는 섬유 형성 방법 등에 관해 설명한다.

일 측면에 따르면, 미체칩을 관통하는 1.5-4 mm의 직경의 구멍의 하단에 고분자로 이루어진 얇은 막을 포함하는 마이크로 밸브를 개시한다.

상기 구멍의 직경은 1.5-4 mm인 것이 바람직하고, 2-3 mm인 것이 더욱 바람직한데, 1.5 mm 미만이면 구멍이 너무 작아 공기 채널에서 압력을 받았을 때, 리플렉션 반응을 제대로 받을 수 없어 바람직하지 않고, 4 mm를 초과하면 구멍이 너무 커서 공기 채널로부터 영향을 크게 받아 미세 조절이 어려워 바람직하지 않다.

상기 얇은 막은 중심부가 얇고 벽면이 두껍도록 곡면을 이루고, 상기 얇은 막의 중심부 두께(x)는 1-30 ㎛인 것이 바람직한데, 1 ㎛ 미만이면 막이 너무 얇아 압력에 견디지 못해 손상될 우려가 있어 바람직하지 않고, 30 ㎛를 초과하면, 막이 너무 두꺼워 공기 채널로부터의 압력을 받았을 때, 밸브 내에서 리플렉션이 제대로 이루어지지 않아 바람직하지 않다.

상기 고분자는 그 종류에 특별히 한정이 없고, 예를 들면 PDMS, 고무, 폴리부타디엔, 폴리이소부틸렌, 폴리우레탄, 이들의 조합 및 이들의 프리폴리머 중에서 선택된다.

다른 측면에 따르면, 칩에 구멍을 뚫고, 고분자 물질을 주입하여 경화시키는 단계를 포함하는 마이크로 밸브의 제조방법을 개시하며;

(a) 미세칩을 관통하는 구멍을 뚫는 단계, (b) 상기 칩을 필름 상에 놓는 단계, (c) 상기 구멍에 액상 고분자를 주입함으로써 얇은 막을 형성하는 단계, (d) 상기 얇은 막을 경화시키는 단계, (e) 상기 필름을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 (a) 단계에 있어서, 상기 미세칩을 관통하는 구멍의 직경은 1.5-4 mm인 것이 바람직하고, 2-3 mm인 것이 더욱 바람직한데, 1.5 mm 미만이면 구멍이 너무 작아 공기 채널에서 압력을 받았을 때, 리플렉션 반응을 제대로 받을 수 없어 바람직하지 않고, 4 mm를 초과하면 구멍이 너무 커서 공기 채널로부터 영향을 크게 받아 미세 조절이 어려워 바람직하지 않다.

상기 (b) 단계에 있어서, 상기 필름은, 그 종류에 특별히 한정이 없고, 예를 들면, PE 또는 PP 등이 있다.

상기 (c) 단계에서 사용되는 액상 고분자는, 그 종류에 특별히 한정이 없고, 예를 들면 PDMS, 고무, 폴리부타디엔, 폴리이소부틸렌, 폴리우레탄, 이들의 조합 및 이들의 프리폴리머 등과 같은 탄성체 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 프리폴리머 PDMS가 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 PDMS란 폴리(디메틸 실록산)을 의미하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 정도의 분자량이면 얼마든지 본 발명에서 사용 가능하다.

상기 (c) 단계에서 사용되는 상기 액상 고분자의 양은, 1.5-4 ㎕인 것이 바람직하고, 2.5-3 ㎕인 것이 더욱 바람직한데, 상기 범위를 벗어나면 원하고자 하는 막의 두께를 얻을 수 없어 바람직하지 않다.

상기 (c) 단계에서, 상기 얇은 막은 표면 장력에 의해 이루어지는 것으로서, 재료 그대로의 성질을 이용하여 제조하였기 때문에 공정이 매우 쉽고 재현성이 우수한 효과를 갖는다.

상기 얇은 막의 중심부 두께는 1-30 ㎛인 것이 바람직한데, 1 ㎛ 미만이면 막이 너무 얇아 압력에 견디지 못해 손상될 우려가 있어 바람직하지 않고, 30 ㎛를 초과하면, 막이 너무 두꺼워 공기 채널로부터의 압력을 받았을 때, 밸브 내에서 리플렉션이 제대로 이루어지지 않아 바람직하지 않다.

상기 (d) 단계에 있어서, 상기 형성된 얇은 막을 경화시키는 것은, 상기 얇은 막이 형성된 미세칩을 오븐에서 굽는 것으로, 70-90 ℃의 오븐에서 1.5-3 시간 동안 수행되는 것이 바람직한데, 상기 범위를 벗어나면 고분자 물질이 제대로 구워지지 않아 쉽게 변형되거나, 너무 구워져서 부서질 우려가 있어 바람직하지 않다.

46또 다른 측면에 따르면, 본 발명에 따른 얇은 막(이하, 고분자 얇은 막이라 칭하기도 함.)이 포함된 마이크로 밸브를 포함하는 미세유체칩을 개시하는데; 상기 미세유체칩은 (1) 공기 채널을 포함하는 제1층, (2) 마이크로 밸브를 포함하는 제2층, (3) 동축 채널의 샘플 채널을 포함하는 제3층을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체칩으로서,

상기 공기 채널은 일단은 공기투입구이고, 다른 일단은 상기 마이크로 밸브의 상부 일단과 연결되어 있어, 상기 공기 채널에 공기의 압력을 가하면 상기 마이크로 밸브에 공기압이 전달되며,

상기 마이크로 밸브는 상부 일단은 상기 공기 채널과 연결되어 있고, 하부 일단은 고분자 얇은 막으로 막혀 있으며, 상기 고분자 얇은 막은 동축 채널의 샘플 채널 상에 위치하며, 상기 마이크로 밸브에 가해진 압력에 의해 상기 고분자 얇은 막이 아래쪽으로 팽창함으로써 동축 채널의 샘플 채널에 직접 영향을 주어 유체의 흐름 및 샘플의 양을 제어할 수 있다.

상기 공기 채널은 공기의 출입이 가능한 채널로, 마이크로 밸브와 연결되어 있어, 공기 채널에 공기가 유입되면, 마이크로 밸브에 압력이 가해져 마이크로 밸브의 막이 리플렉션을 일으켜 샘플 채널이 눌러져 샘플 채널내를 흐르는 샘플의 양을 조절할 수 있고, 공기 채널에 유입된 공기를 다시 배출시키면, 마이크로 밸브의 막이 원래 상태로 되돌아와 샘플 채널의 샘플이 다시 원활하게 흐르도록 조절할 수 있다.

하나의 구현예로서, 도 6(c)를 살펴보면, 공기 채널에 공기가 유입되면 밸브가 '막힘' 상태가 되어 샘플이 흐르지 않게 하고, 공기를 다시 빼내면(vnet) 채널이 '열림' 상태가 되어 샘플이 흐름을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 미세유체칩은, 미세유체칩의 공기 채널의 입구(inlet)에서 공기를 주입하면 공기는 상층의 공기 채널을 통과하면서 상기 공기 채널과 맞닿은 중간층의 밸브의 구멍에 압력을 주고, 상기 압력이 리플렉션(reflectioin)되어 막의 상부보다 하부가 압력이 낮아져 막에서 그 압력 차에 의하여 막이 하부로 변형됨으로써, 샘플 채널을 흐르는 유체의 흐름 및 샘플의 양을 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 동축 채널은 동축 흐름을 생성시키는 실린더 채널로서, 1개 이상의 샘플 채널, 주 채널, 1개 이상의 외곽 채널로 이루어져 있고, 반 실린더 채널의 성형체가 결합된 것으로서, 상기 1개 이상의 샘플 채널, 주 채널 및 1개 이상의 외곽부 채널 중 적어도 하나는 단면이 원형 또는 타원형인 실린더 채널이며, 상기 1개 이상의 샘플 채널의 끝 말단이 상기 주 채널의 시작 말단과 연결되어 있고; 상기 1개 이상의 샘플 채널은 끝 말단 부분만 상기 주 채널과 연결되어 있는 부분으로 갈수록 점점 가늘어지는(tapered) 모양을 하고 있고, 나머지 부분은 단면의 크기와 모양이 일정하고, 상기 1개 이상의 외곽부 채널은 주 채널의 측면에 연결되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 채널의 시작 말단 혹은 끝 말단이란 채널 내 매질이 흐르는 방향을 기준으로 상기 채널을 통해 매질이 흐르기 시작하는 말단과 매질의 흐름이 끝나는 해당 채널의 말단을 각각 의미한다.

상기 실린더 채널의 단면이 원형 또는 타원형일 수 있다. 본 발명에 있어서, "원형 또는 타원형"이란 기하학적으로 완벽한 원형 또는 타원형만을 의미하는 것은 아니며, 이에 통상적으로 가깝다고 볼 수 있는 도형까지도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 위 2 개의 반 실린더 채널의 연결 부위가 매끄러운 곡면으로 연결되어 있는 모양뿐만 아니라(도 2a, 2b), 서로 대칭적인 2 개의 반 실린더 채널이 서로 연결되면서 연결 부위가 뾰족하게 꼭지점이 형성된 도형까지 포함하는 개념으로 이해되어야 한다(도 2c, 2d).

상기 채널은 (i) 길이 방향에 걸쳐 일정하거나, 또는 (ii) 길이 방향에 걸쳐 일정한 비율로 좁아지거나 넓어지거나, 또는 (iii) 홈이 길이 방향에 걸쳐 일정하다가 일정한 비율로 좁아지다가 혹은 넓어지는 등 홈의 폭 길이의 변화가 상기 (i)과 (ii)의 조합이 될 수도 있다.

상기 샘플 채널은 (i) 끝 말단 부분으로 갈수록 점점 가늘어지는(tapered) 모양을 하거나, 또는 (ii) 끝 말단 부분만 상기 주 채널과 연결되어 있는 부분으로 갈수록 점점 가늘어지는 모양을 하고 있고 나머지 부분은 단면의 크기와 모양이 일정할 수 있다.

상기 샘플 채널은 샘플(유체)이 이동하는 채널이고, 상기 샘플 채널의 말단과 연결된 주 채널에서는 상기 1개 이상의 샘플 채널의 말단으로부터 흘러 나오는 샘플이 주 채널로 들어와, 주 채널의 측면에 연결되어 있는 외곽 채널로부터 나오는 물질과 만나 샘플이 경화되어 나온다.

상기 주 채널 내부의 길이 방향 축과 상기 샘플 채널 내부의 길이 방향 축은 서로 일직선으로 위치하는 것이 바람직하며; 상기 외곽부 채널 내부의 길이 방향 축은 상기 주 채널 내부의 길이 방향 축과 교차하는 것이 더욱 바람직하며; 특히, 상기 주 채널, 샘플 채널 및 1개 이상의 외곽부 채널 내부의 길이 방향 축이 모두 동일 평면에 위치하는 것이 본 발명이 목적하는 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있다는 측면에서 가장 바람직하다.

또 다른 측면에 따르면, 상기 미세유체칩의 제조방법을 개시하는데; 상기 마이크로 밸브를 포함하는 제2층의 하단에 동축 채널의 샘플 채널을 포함하는 제3층을 위치시켜 산소 플라즈마에 의해 결합시키는 단계, 및 상기 제2층의 상단에 제1층을 위치시켜 산소 플라즈마에 의해 결합시키는 단계를 포함하며, 상기 제2층은 상기 (a), (b), (c), (d), (e) 단계를 포함하는 제조방법에 따라 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 동축 채널의 제조방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.

(가) 길게 홈이 파져 있는 베이스 몰드 위에 막을 위치시키고, 상기 막의 상부보다 하부가 압력이 낮도록 압력을 조절하여 그 압력 차에 의해 상기 홈 부분에서 상기 막이 하부로 변형되도록 하는 단계; (나) 상기 변형된 막 위에 광 민감성 물질을 위치시키고, 상기 광 민감성 물질 위에 광 투과성 물질을 위치시키고 나서, 상기 광 투과성 물질 위로 광을 조사하여 광 민감성 물질 포함 마스터 몰드를 제조하는 단계; (다) 상기 마스터 몰드를 이용하여 반 실린더 채널 포함 성형체를 제조하고, 상기 2개의 반 실린더 채널 포함체를 결합시킴으로써 동축 채널을 제조할 수 있다.

상기 마스터 몰드를 이용하여 반 실린더 채널을 제조하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 행해지는 방법에 의해 이루어질 수 있다.

상기 (가) 단계에 있어서, 상기 베이스 몰드의 재질은, 그 종류에 특별히 한정은 없고, 예를 들면, PDMS, PMMA, 플라스틱, 금이나 쇠와 같은 금속 주조물 등에서 선택되는 것이 바람직하고, PDMS가 더욱 바람직하다.

또한, 상기 막의 재질은, 그 종류에 특별히 한정은 없고, 예를 들면, PDMS, 고무, 폴리부타디엔, 폴리이소부틸렌, 폴리우레탄 등과 같은 탄성체 중에서 선택되는 것이 바람직하고, PDMS가 더욱 바람직하다.

상기 막과 베이스 물질은 재질이 동일할 수도 있고 다른 물질을 사용할 수 있으며, 상기 막은 본 발명이 개시하는 바에 기초한다면 당업자가 본 발명이 목적하는 효과를 달성할 수 있도록 그 두께를 적절히 선택할 수 있으나, 다만 10-20 ㎛의 두께를 가지는 것이 본 발명이 목적하는 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있다는 측면에서 바람직하다.

상기 베이스 몰드의 홈은 소프트 리소그라피 공정에 의해 형성할 수 있으나, 이에 한정하지 않고, 상기 홈은 상기 막이 압력 차에 의해 변형이 되더라도 바닥에 접촉되지 않을 정도로 충분한 깊이를 가지는 것이 바람직하며, 구체적으로 홈의 폭 길이의 절반 이상의 깊이, 더욱 바람직하게는 홈의 폭 길이 이상의 깊이를 가지는 것이 바람직하다. 홈의 바닥면 모양은 평평할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 (나) 단계에 있어서, 상기 광 민감성 물질의 재질은 SU-8, AZ 계열 PR, NOA(Norland Optical Adhesive) 중에서 선택되는 것이 바람직하고, SU-8이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 상기 광 투과성 물질의 재질은 유리, 석영, 플라스틱, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 등으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 유리 또는 석영이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 SU-8이란 하기 화학식을 갖는 물질을 의미하며, 역시 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 정도의 분자량이면 얼마든지 본 발명에서 사용 가능하다.

[화학식 1]

상기 광 민감성 물질 및 광 투과성 물질은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 정도의 분자량이면 얼마든지 본 발명에서 사용 가능하다.

또한, 상기 광은 자외선 또는 가시광선일 수 있으나, 본 발명이 목적하는 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있다는 측면에서 자외선인 것이 바람직하다.

상기 (다) 단계에 있어서, 상기 반 실린더 채널을 포함하는 성형체의 재질은 PDMS, NOA, PMMA, 아크릴 중에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 정도의 분자량이면 얼마든지 본 발명에서 사용 가능하고, 상기 PDMS는 폴리(디메틸 실록산)를 의미한다.

상기 베이스 몰드의 홈은 소프트 리소그라피 공정에 의해 형성할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 2개의 반 실린더 채널 포함 성형체의 결합은 산소 플라즈마에 의해 수행될 수도 있으나, 이에 한정하지 않는다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여 미세섬유의 제조방법을 개시하는데; 상기 제조방법은 (A) 상기 샘플 채널에 샘플 물질을 투입하는 단계; 및 (B) 상기 외곽부 채널에 외곽부 물질을 투입하는 단계; (C) 상기 마이크로 밸브를 조절하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

일 구현예에 따르면, 상기 (A) 단계와 (B) 단계는 서로 동시에 수행되는 것이 바람직하나, 순차적으로 수행될 수도 있으며, 연속적으로 또는 시간 차를 두어 간헐적으로 수행될 수도 있으나, 상기 (C) 단계는 상기 (A) 단계와 상기 (B) 단계가 수행된 후, 유체의 흐름 및 샘플의 양을 조절하기 위해 수행해야 한다.

다른 구현예에 따르면, 상기 샘플 물질은 (i) PLGA, 알지네이트, 키토산, 콜로겐 등과 같은 자외선 비경화성 스캐폴드 물질일 수도 있고, 또는 (ii) 4-HBA, PNIPAAM, NOA, PEG 등과 같은 자외선 경화성 물질일 수도 있으며, 또는 (iii) 상기 물질을 2종 이상 함께 사용할 수도 있으나, 상기 열거된 물질에 특별히 한정되지는 않는다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 외곽부 물질은 (i) 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드 등 2가 이온 물질 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 제1 외곽부 물질을 (ii) 물, 세포 배양액, PBS 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 제2 외곽부 물질에 용해시킨 용액을 사용하는 것이 본 발명이 목적하는 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있다는 측면에서 바람직하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여 샘플 물질의 섬유를 제조함에 있어서, (i) 상기 마이크로 밸브에 주입되는 공압의 크기, (ii) 상기 샘플 채널에 샘플 물질의 투입 속도, 및 (iii) 상기 외곽부 채널에 외곽부 물질의 투입 속도를 조절함으로써 미세섬유의 직경을 조절하는 방법을 개시한다.

일 구현예에 있어서, (i) 상기 마이크로 밸브에 주입되는 공압의 크기는, 특별히 한정은 없고, 0-300 kPa 범위 내에서 조절하는 것이 바람직하고, (ii) 상기 샘플 채널에 투입되는 샘플 물질의 투입 속도는, 바람직하게는 3-30 ㎕/min 범위 내, 더욱 바람직하게는 5-20 ㎕/min 범위 내에서 조절하고, (iii) 상기 외곽부 채널에 외곽부 물질의 투입 속도는 바람직하게는 10-50 ml/h 범위 내, 더욱 바람직하게는 20-30 ml/h 범위 내로 조절하는 것이 본 발명이 목적하는 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있다는 측면에서 바람직하다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 미세유체칩을 이용하여 미세입자를 제조하는 방법을 개시하는데; 상기 제조방법은 (A) 상기 샘플 채널에 샘플 물질을 투입하는 단계; 및 (B) 상기 외곽부 채널에 외곽부 물질을 투입하는 단계; (C) 상기 마이크로 밸브를 조절하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

다른 구현예에 따르면, 상기 샘플 물질은 (i) PLGA, 알지네이트, 키토산, 콜라겐 등과 같은 자외선 비경화성 물질일 수도 있고, 또는 (ii) 4-HBA, PNIPAAM, NOA, PEG 등과 같은 자외선 경화성 물질일 수도 있으며, 또는 (iii) 상기 물질을 2종 이상 함께 사용할 수도 있으나, 상기 열거된 물질에 특별히 한정되지는 않는다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 외곽부 물질은 (i) 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드 등 2가 이온 물질 중에서 선택된 제1 외곽부 물질; (ii) 올레산, 소이빈 오일, 메탄올, 도데칸 등 유기 용매 중에서 선택된 제2 외곽부 물질을 포함하는 것이 바람직하다.

특히, 상기 외곽부 물질은 (a) 상기 제1 외곽부 물질을 (iii) 2-메틸-1-프로판올, 이소프로필알코올, 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 제3 외곽부 물질에 용해하여 제1 외곽부 물질 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 제1 외곽부 물질 용액을 제3 외곽부 물질과 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계; (c) 상기 혼합 용액을 증류시키는 단계를 포함하는 외곽부 물질의 제조방법에 의해 제조된 것을 사용하는 것이 본 발명이 목적하는 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있다는 측면에서 더욱 바람직하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여 샘플 물질의 입자를 제조함에 있어서, (i) 상기 마이크로 밸브에 주입되는 공압의 크기, (ii) 상기 샘플 채널에 샘플 물질의 투입 속도, 및 (iii) 상기 외곽부 채널에 외곽부 물질의 투입 속도를 조절함으로써 미세섬유의 직경을 조절하는 방법을 개시한다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백하다.

실시예

<미세유체칩의 제조방법>

마이크로 밸브의 제조

도 1을 참조하면, 미세칩에 직경이 3 mm인 관통하는 구멍을 뚫고 OHP 필름 위에 얹었다. 그 후, 2 ㎕의 프리폴리머 PDMS(pre-polymer PDMS)를 주입하였고, 표면 장력에 의하여 구멍 밑쪽에 얇은 층이 만들어졌다. 그런 다음, 80 ℃ 오븐에서 2 시간 동안 베이킹 과정을 거쳐 구멍안쪽의 PDMS를 굳게 만들었다. 그 후, OHP 필름을 제거한 후, 마이크로밸브를 제조하였다.

PDMS 공기 채널의 제조

우선, 소프트 리소그라피 공정을 통해 PDMS 계열 몰드를 만들고 나서, 막의 변형 및 모사를 통해서 SU-8 마스터 몰드를 형성시켰다. SU-8 몰드의 PDMS 모사를 통해, 반실린더 PDMS 채널을 제조하였으며, 두 개의 오목한 반실린더 PDMS 채널을 산소 플라즈마 접합시켜 공기 채널을 제조하였다(도 5 참조).

PDMS 동축 채널의 제조

PDMS 계열 실린더 채널을 합성하기 위하여, 도 5에 나타낸 바와 같이 그대로 놓아둔 PDMS 막 및 이를 모사하는 방법을 사용하였다.

우선, 소프트 리소그라피 공정을 통해 PDMS 계열 몰드를 제조하고 나서, 이 몰드 위에 PDMS 막을 균일하게 펼쳐놓았다. 아래 부분을 감압하여, 오목한 반실린더 모양의 채널 구조를 형성하였다. 여기에 SU-8을 부어 자외선 경화를 시킴으로써 반실린더 형상의 변형된 막을 제조하고, 오목한 반 실린더 SU-8 마스터 몰드가 형성되었다. 이러한 방법을 이용하여, 다양한 형상 및 디멘션의 반실린더 구조, 예를 들어 도 5b에 나타낸 것과 같이 준장방형(pseudo rectangular) 구조 및 둥근 구조가 결합된 복합 구조, 점점 가늘어지는 구조, 동축 구조 등을 제조하였다.

예를 들어, 복합 구조를 형성하기 위해서 서로 다른 깊이를 가진 기초 몰드를 사용하였는데, 얕은 부분은 변형된 막이 채널의 바닥에 퍼져 준장방형 모양을 보이며, 반면 깊은 부분에서는 충분히 실린더 구조를 형성할 수 있도록 막이 변형하게 된다.

동축 채널을 제조하는 방법은 도 5c에 나타내었는데, 우선 PDMS 기초 몰드를 만들고 나서, 막의 변형 및 모사를 통해서 SU-8 마스터 몰드를 형성시켰다. SU-8 몰드의 PDMS 모사를 통해, 반-동축 PDMS 채널을 제조하였으며, 두 개의 오목한 반실린더 PDMS 채널을 산소 플라즈마 접합시켜 최종 동축 채널을 제조하였다.

또한, 상기와 같이 제조된 동축채널의 제조방법을 이용하여 도 4에 기재된 바와 같이 2개의 샘플 채널을 갖는 동축 채널과, 도면에는 나타내지 않았으나, 3개의 샘플 채널을 갖는 동축 채널, 그리고, 도 3(b)에 나타낸 바와 같이 6개의 샘플 채널을 갖는 동축 채널을 제조하였다.

미세유체칩의 제조

도 3(b)를 참고로 하면, 상기와 같이 제조된 마이크로 밸브를 동축 채널의 샘플 채널과 서로 맞닿도록 산소 플라즈마(plasma) 본딩시키고, 그런 다음, 상기와 같이 제조된 공기 채널을 마이크로 밸브의 상단에 위치시킨 후, 산소 플라즈마에 의해 결합시킴으로써 공기 채널, 마이크로밸브, 및 동축 채널을 포함하는 미세유체칩을 제조하였다.

<마이크로밸브의 막의 두께>

상기 형성된 미세유체칩의 상층의 공기 채널에 공기를 주입하면 마이크로 밸브에 공기압이 가해지고, 리플렉션을 일으켜 샘플 채널을 막을 수 있다. 도 1(b)는 밸브 단면을 시뮬레이션한 것으로서, 2D AXIS symmetry 모델을 사용하여 구멍 가운데의 막(membrane)의 두께를 예측할 수 있다. 예측할 수 있는 팩터는 홀의 반직경과 공기, 프리폴리머 PDMS, PDMS의 접촉각으로 계산되어지며, 그 방법은 도 15(a), (b)에 나타낸 것과 같으며, 하기의 내용은 밸브 두께의 이론에 관한 공식에 관한 것이다. 도 15(c)의 PDMS 양은 하기 식에 의해 계산되었다.

구멍 내의 프리-고분자 PDMS 표면은 상기 첫번째 그래프에 나타낸 굴곡의 적합한 반직경을 갖는 구의 일부분이고, 여기에서의 분석 방정식은, 대각선 부분의 부피(Vpre)는 물리적 접촉(a) 전에 프리폴리머 PDMS의 초기 부피와 같다는 원리를 근거로 한 것이다.

상기 두번째 그래프를 참고로 하면, 프리폴리머 PDMS의 부피에 대한 대각선 부분의 부피는 상기 실린더(V cyl)의 부피로부터 원형 부분(V seg)의 부피를 뺌으로써 얻어질 수 있다.

[수학식 1]

기하학적 특징에 근거로 하여, 원형 부분의 부피와 실리더는 다음의 방정식에 의해 표현될 수 있다.

[수학식 2]

[수학식 3]

여기에서, θ는 PDMS 표면에 대한 프리폴리머 PDMS의 접착각이고, s는 구멍의 직경(직경)이다. R은 PDMS(내부 밸브) 표면의 커브의 반직경이고, h는 벽에 대한 PDMS 프리폴리머의 접촉선에 대응하는 PDMS 밸브의 최대 두께이다.

반직경 R과 높이 H는 다음의 식으로 표현할 수 있다.

[수학식 4]

[수학식 5]

여기에서, x는 PDMS 밸브의 최소 두께(중심부 두께)이다.

따라서, 초기 부피(a)는, 하기와 같이 방정식 (1) 내에 방정식 (2), (3), (4) 및 (5)를 치환함으로써 최소 두께(x), 접촉 각(θ) 및 구멍의 직경(s)의 기능으로 표현될 수 있다.

[수학식 6]

마지막으로, PDMS 밸브의 최소 두께, x는 다음과 같이 정의될 수 있다.

[수학식 7]

여기에서 PDMS 벽내에서 측정되는 액체 PDMS 접촉 각인 θ는 ~ 15o이었고, 구멍의 직경인 s는 상기 시스템에서 정수이다. 그러므로, 멤브레인의 두께는 오직 PDMS 프리폴리머의 부피에 의해 측정되었다. 밸브 내에 최소 PDMS 두께의 시물레이션 결과는 전산 유체 역학(computational fluid dynamics)(COMSOL, MA)에 의해 분석되었고, 상기 두개의 치수좌표축(dimensional axis)-대칭 모델은, 각각 0.19N/m으로 셋팅된 액체 PDMS-공기 경계면의 표면 장력으로 사용되었다.

<마이크로 밸브의 작동 방법>

실제 유체가 흐르는 채널에서 밸브를 작동시키는 방법은 도 6에 나타낸 바와 같다. 일단 랩뷰 PC 보드(Lab view (PC) board)를 통해 온/오프(on/off) 시그널이 솔레노이드 밸브(solenoid valve)로 들어간다. 이 신호에 의해 솔레노이드 밸브의 스위치가 작동하며, 이는 콤프레서(compresser)에 의한 압축공기가 섬유 발생 채널(fiber generating channel)로 들어가는 시간을 제어할 수 있다. 상기 온/오프 신호는 1/100초의 주기까지 제거할 수 있게 프로그래밍되었고, 더욱 많은 신호를 응용하기 위해 딜레이(delay) 기능을 추가하였다. 각각의 채널에는 각각의 마이크로 밸브 및 솔레노이드 밸브가 연결되었으며, 이는 하나의 PC에서 제거되었다. 도 6(b)는 실제 실험에 사용된 막의 전자 현미경 사진이다. 실제 20 ㎛의 막을 움직이게 하기 위하여 대략 200 kPa의 공압이 사용되었다. 도 6(c)는 실제 실험한 사진으로 공기의 주입과 배출에 의하여 샘플 채널이 막히는 것을 나타낸 것이다.

인공 거미 모사 칩(섬유 발생 칩)의 제작

상기와 같이 제작된 미세유체칩의 한 예로 다양한 모양과 기능을 가진 미세 섬유를 제작하는 인공 거미 모사 칩을 제작하였다. 실제로 거미는 글랜드(gland) 부분을 통해 샘플의 양을 조절하며 스피곳(spigot)을 통해 거미줄을 뽑아내었다.

도 13에서와 같이, 동축 채널과 밸브를 이용하여 인공적으로 거미의 글랜드(gland) 와 스피곳(spigot) 기관을 모사할 수 있고, 이는 실제 거미처럼 밸브를 사용하여 섬유를 절단할 수도 있으며, 또한 여러 종류의 연결된 샘플 채널을 이용하여 여러 종류의 샘플이 섞인 섬유를 얻을 수 있다.

상기 기능을 실현하기 위해 도 3(a)에 나타낸 바와 같이 인공 거미 모사 칩은 얇은 샘플 주입 채널과 마이크로 밸브를 결합하여 유체의 양을 조절하는 부분(artificial gland)과 합성된 샘플을 모아 미세 섬유를 제작할 수 있는 부분 (artificial spigot)이 장착되어 있다. 유체 채널과 밸브가 하나씩 연결되어 각각의 유체 흐름을 제어할 수 있다. 실제 PDMS를 이용하여 만들어진 유체 칩의 모습은 도 3(b)에 나타낸 것과 같다. 도 3(b)에 나타낸 채널은 총 3개의 층으로 이루어져 있으며 제1층(상층), 제2층(중간층), 제3층(하층)으로 구분하였다. 제1층은 공기가 출입가능한 채널로 제작하였고, 이는 제2층에 제작된 밸브 구멍과 연결되어 있다. 또한 상기 밸브 구멍은 하층의 샘플 채널과 합쳐져 있지만 얇은 막으로 분리되었다. 또한 위의 채널로 들어간 유체는 배출구 쪽의 둥근 실린더 형태의 채널로 흘러가는데, 도 3(c)에 나타낸 바와 같이 알지네이트 칼슘 반응을 통해 미세 섬유를 제작하였다. 도 3(d)는 실제 미세 섬유를 제작하는데 사용되는 동축 채널의 한 면의 전자현미경 사진이다.

마이크로 밸브의 공압 및 샘플 물질의 투입 속도 조절에 따른 섬유 생성

도 7은 섬유 발생 칩(fiber generating chip)을 이용하여 만들어진 섬유상의 스캐폴드(fibrous scaffold) 이미지이다. 상기 스캐폴드를 제작할 때 밸브를 사용하여 섬유의 두께를 조절하였다. 안에 삽입된 이미지는 밸브의 압을 조절하여 섬유 두께를 조절할 수 있음을 보여주는 것으로, 이는 흐르는 샘플 채널에 연결된 밸브를 작동하되 압을 완전히 닫기지 않도록 작동하였으며 하나의 샘플 채널만이 섬유를 만드는데 이용되었다. 도 7을 참고로 하면, 마이크로 밸브에 주입되는 공압의 크기가 200 kPa, 100 kPa, 0 kPa(밸브 조절하지 않음)일 때의 섬유의 두께를 관찰하였는데, 200 kPa일 때 섬유의 두께는 가장 얇고, 압력을 전혀 주지 않을 때, 섬유의 두께가 가장 두꺼운 것을 알 수 있다.

또한, 도 16(a)는 밸브에 주입되는 공압의 크기에 따른 섬유 직경의 변화를 나타낸 것이다. 또한, 3종류의 다른 샘플 압력(유체 압력)을 이용하였을 때 나타나는 섬유 직경 두께로서, 밸브에 주어지는 공압이 같을 때, 유체 압력에 따라 섬유의 직경 두께가 달라짐을 알 수 있다.

미세유체칩으로 제조된 섬유

도 4는 두개의 샘플 채널을 가진 미세유체칩의 스킴을 나타낸 것으로서, 각각 연결된 밸브의 제어를 통해 각각의 샘플 채널을 제어할 수 있으며, 이를 통해 다양한 모양과 종류의 섬유를 제작하였다. 2개의 샘플 채널뿐만 아니라 6개의 채널을 가진 섬유 제작 칩도 개발하였으며, 이는 도 8(a)에 나타내고 있다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 염색약을 이용하여 상기 칩이 올바르게 작동되는지 테스트하였다. 도 8(a)의 오른쪽 사진에 나타낸 바와 같이, 6개의 샘플 중에서 밸브를 닫은 경우는 샘플이 채널을 흐르지 않고, 열린 상태의 샘플만 섬유 제작 부분으로 흐르는 것을 볼 수 있다.

도 8(b)는 밸브를 이용하여 두 개의 샘플 채널을 가진 섬유 제작칩으로 절단된 섬유를 보여주는 도면이다.

한쪽에는 알지네이트 샘플을 주입하고, 한쪽에는 PBS를 주입하여 밸브의 온/오프 시그널을 조절하였다. PBS를 주입한 샘플 채널에는 밸브에 ON 시그널을 주어, PBS가 흐르지 않았고, 알지네이트가 들어간 샘플 채널은 밸브의 온/오프 시그널을 조절하여 도 8(b)의 오른쪽 사진에 나타낸 바와 같이, 밸브가 열린 시간에 따른 길이가 다른 섬유를 제작하였다.

샘플 재료로 알지네이트 파우더/물(powder/water) 1%를 사용하였고, 상기 샘플을 대략 5 ㎕/min-20 ㎕/min의 투입 속도로 주입하였으며, 알지네이트를 굳히는 용매로 1% Cacl2/물을 사용하였으며, 상기 용매의 투입 속도는 대략 20 ml/h-30 ml/h로 실험을 하여 그 결과를 도 16(b)에 나타내었다.

그 결과, 알지네이트 샘플의 투입 속도와 밸브 오픈 시간을 조절하여 두께와 길이를 모두 제어할 수 있었다. 따라서, 섬유의 직경은 샘플의 투입속도에 의해 조절되는 것을 알 수 있다.

도 9는 상기 밸브가 장착된 2개의 샘플 채널을 가진 섬유 제작 칩으로 만든 여러 종류의 섬유들의 사진을 나타내었다(상기 섬유 제조방법은 도 11에 나타내었다.).

144도 9(a)는 실제 거미줄처럼 인공 볼록 부분(artificial spindle-knot)과 조인트(joint)를 가지는 알지네이트 섬유 사진이다. 상기 인공 볼록 부분은 알지네이트와 소금을 혼합하여 알지네이트 겔의 기공(porosity)을 크게 만든 것이다. 그 결과 물방울을 위에 떨어뜨렸을 때 표면적이 큰 인공 볼록 부분쪽으로 고여 있는 것을 볼 수 있다. 이는 실제 거미줄에 물방울이 맺히는 효과와 이론적으로 같다. 도 9(b)는 이 볼록 부분(spindle-knot)의 전자현미경 사진이다. 실제 소금이 빠진 알지네이트 부분에 커다란 구멍이 형성되는 것을 볼 수 있다.

또한, 도 16(c)는 도 9(a)에서 맺힌 물방울 크기를 볼록 부분의 크기에 따라 나타낸 것이다. 상기 실험 결과 물방울의 크기는 볼록 부분의 축방향 길이에 따라 선형적으로 변하는 것을 알 수 있었다. 도 9(d)는 섬유에 공기 방울이 트랩(trap)된 사진이다. 이의 제조방법은 도 11(a)에 기재된 바와 같다.

또한, 도 9(d)에 나타낸 SEM 사진은 한쪽 채널에 압축공기 10 kPa을 주입하여 제작된 것으로, 안에 트랩된 공기는 시간이 지나도 빠져나가지 않지만 용액에서 빼내서 보관할 경우, 빠져나가는 것이 관찰되었다. 섬유의 직경은 샘플의 투입속도에 의해 조절되며, 대략 5 ㎕/min-20 ㎕/min의 샘플의 투입속도를 사용하였다. 샘플 재료는 알지네이트 파우더/물 1%를 사용하였고, 알지네이트를 굳히는 용매로 1% Cacl2/물을 사용하였다. Cacl2의 투입속도는 대략 20 ml/h-30 ml/h의 투입속도를 이용하였다.

도 10은 3개의 샘플 채널을 가진 섬유 제작 칩을 이용한 것인데, 하나의 섬유안에 3개의 다른 종류의 샘플이 여러 패턴을 지닌 채 코딩된 형광 사진을 나타낸 것이다. 상기 3개의 샘플을 이용한 섬유 제조방법은 도 12에 나타낸 바와 같고, 샘플 재료는 알지네이트 파우더/물 1%에 각각의 300nm PS 형광 비드(bead)를 0.05%의 농도로 섞어서 사용되었으며, 알지네이트를 굳히는 용매로 1% Cacl2/물을 사용하였다. 샘플의 투입 속도는 5 ㎕/min-20 ㎕/min이었고, Cacl2의 투입속도는 대략 20 ml/h-30 ml/h이었다.

그 결과, 도 10(a)는 형광 현미경 사진을 이용한 것으로, 밸브를 사용하지 않고, 평행 코딩(parallel coding)하므로써 축과 평행하게 코딩되었다. 도 10(b)는 일정한 구간을 나누어 코딩한 형광 사진으로 3개의 밸브를 연속적으로 작동시켜 제조한 것이다. 도 10(c)는 도 10(b)와 유사하게 제조한 것이나, 겹치는 구간을 두어 볼록한 모양이 만들어졌다. 도 10(d)는 도 10(a)와 도 10(b)에 나타낸 코딩 방법을 혼합하여 제작하였다.

각각의 다양한 모양의 섬유와 코딩방법은 도면 10과 11에 나타내었으며 이의 자세한 제조방법은 하기와 같다.

다양한 형태를 갖는 섬유를 제조하기 위하여, 2개의 채널을 포함하는 스피닝칩(spinning chip)을 사용하였다. 두개의 샘플 유동액(fluids)은 각각 채널에 주입하였고, 전기적 시그널은 각각 채널의 "온-오프"로 조절하였다. 도 S3은, 솔레노이드 밸브를 조절하기 위하여 샘플 유동액과 전기 시그널 배열을 나타낸다.

상세한 제조방법은 다음과 같다.

1) 버블이 있는 섬유(bubble embedded fibers)

공기를 10-50 kPa의 압력으로 공기 채널에 주입하였다. 샘플 채널에는 1% 계면활성제가 포함된 2 wt%의 알지네이트 용액을 주입하였고, 계면 활성제는 버블 응고를 방지하기 위하여 사용하였다. 그런 다음, 균일하게 분산된 버블을 섬유 내에 넣었다. 알지네이트 용액과 CaCl2 용액의 유속은, 각각 20-50 ㎕/min이고, 20-40 ml/h이었다.

2) 컷-섬유(cut-fiber)

PBS와 알지네이트 용액은 임의적으로 각각의 샘플 채널에 주입하였다. 각각의 밸브를 임의적으로 열고, 일정한 길이를 갖는 컷-섬유을 성공적으로 제조하였다. 섬유의 길이는 각 밸브의 오프닝 타임(opening time)을 변화시킴으로써 조절하였다. 보다 긴 섬유를 위해서는, 알지네이트 채널의 장시간의 오프닝 타입을 필요로 한다.

3) 엠보싱된 섬유(embossed fiber)

동일한 알지네이트 용액을 각각의 샘플 채널 내로 주입하였으나, 각각의 채널에 다른 유속을 적용하였다. 채널을 임의적으로 변화시킴으로써, 크고 작은 직경을 갖는 섬유가 생산되었다.

4) 테이퍼 섬유(tapered fiber)

동일한 알지네이트 용액을 각각의 채널에 주입하였으나, 밸브의 "온/오프" 배열을 다르게 하였다. 예를 들면, 샘플 1의 시퀀스는 주기적으로 0.4초 '열림' 상태 및 0.2초 '닫힘' 상태였고, 반대로 샘플 2의 시퀀스는 0.2초 딜레이하며, 0.2초 '열림'상태 및 0.4초 '닫힘' 상태를 포함한다. 그런데, 총 부피의 단계적인 변화에 따라 테이퍼 섬유를 생성하였다. 두개의 유량이 닫힘 상태일 때, 상기 섬유 직경은 좁게 되었으나, 상기 섬유는 채널과 밸브의 컴플라이언스(compliance)로 인한 것은 아니었다.

섬유에 대한 다른 조성물의 시공(spatiotemporal) 인코딩

도 12는 평행 코딩(parallel coding)을 제외한 다른 조성물로 인코딩된 섬유를 제조하는 방법을 나타낸 것이다. 3개의 채널이 사용되었고, '온-오프' 시퀀스를 조절함으로써 사용되며, 다이버 코딩 스킴(diver coding scheme)을 포함하는 섬유를 생성하였다. 시리얼 코딩(serial coding)의 경우에, 세개의 샘플 채널을 차례로 열었고, 최소 오프닝 타임('오픈'시그널)은 3초였다. 이와 동일하게, 엠보싱되고, 시리얼하게 코딩된 섬유는 딜레이된 주입 샘플에 의해 제조되었다. 그러나, '열림' 신호는 ~ 0.1초 이하에서 오버랩되었다. 또한, 상기 시리얼 및 평행을 혼합하여 코딩된 섬유는, 시리얼 코딩과 같은 신호를 사용하여 제조하였고, 그 후에 모든 샘플의 열림 시그널의 주기를 추가하였다. 보다 잘 보이게 하기 위해서, 형광 마이크로스피어는 빨간색, 녹색, 파란색을 갖는 폴리스티렌(300nm 크기 PS 비드, Thermo)으로 제조하였고, 그것들은, 각각 0.05% 알지네이트 용액에 혼합하였다.

본 발명에서는, 채널과 완전히 분리되지 않은 마이크로 밸브를 개시하고, 미세칩을 관통하는 구멍을 뚫어, 액상의 고분자를 주입함으로써 얇은 막을 형성하여 구운 마이크로 밸브의 제조방법을 개시한다. 미세유체칩에 2-3 mm의 구멍을 뚫고, 상기 구멍에 액상의 고분자를 주입하여 얇은 막을 형성하고, 상기 형성된 얇은 막을 구움으로써 마이크로 밸브를 제조한 후, 상기 밸브를 작동시켜 다양한 모양의 섬유를 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 표면 장력에 의하여 간단하게 밸브의 막을 형성하고, 상기 밸브와 동축 채널을 결합시킨 마이크로칩을 제조함으로써, 다양한 모양의 미세 섬유를 제조할 수 있다.

또한, 동축 채널을 사용함으로써, 마이크로 섬유가 막힘 없이 연속적으로 제조되었다. 일반적으로, 장방형 직선 채널에서 입자 생성 채널의 경우에도 윤활을 위해 표면 처리가 필요하며, 섬유의 연속적 제조는 상당히 어렵다. 다만, PDMS 동축 채널을 이용하면 입자와 섬유를 매우 쉽게 제조할 수 있다. 또한 입자와 섬유의 균일성을 측정한 결과 편차가 ㅁ3% 이내임을 확인하였으며, 본 발명의 방법이 다양한 모양의 섬유와 입자를 생산하는데 현저히 향상된 효과를 나타낸다고 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 정방형 또는 장방형 채널 및 동축 채널을 결합한 복합 채널이라고 할 수 있으며, 이러한 복합 채널은 다양한 생의학 및 화학 분야를 포함한 광범위한 범위에 활용될 수 있음을 보여준다. 특히, 마이크로 유체 플랫폼을 본 발명에 따른 미세유체칩과 결합함으로써, 다양한 세포 및 생화학적 분자를 포함하는 섬유 및 입자를 제조할 수 있다.

또한, 종래의 시스템에서는 자외선 경화성 물질만을 사용할 수 있었음에 반해서, 본 발명의 시스템에서는 자외선 경화성뿐만 아니라, PLGA, 알지네이트, 키토산 등과 같은 자외선 비경화성 스캐폴드 물질을 사용할 수도 있다.

본 발명은 고분자 물질로 막을 형성함으로써 밸브를 생성하고, 상기 밸브 하층에 샘플 채널을 위치시켜, 간단하고 비용 효율적인 공정에 의해 제조될 수 있는 PDMS 미세유체 칩에 상기 마이크로 밸브를 적용함으로써, 이를 이용하여 다양한 모양의 미세 섬유 및 입자를 생산할 수 있는 신규한 방법을 개시하고 있다.

본 발명은 또한 장방형 또는 정방형 채널과 동축 채널을 결합한 복합 채널을 개시하고 있다. 이를 이용함으로써 기존의 마이크로 유체 기술을 섬유에도 적용할 수 있으며, 다양한 기능을 가지는 미세 구조를 생의학 또는 조직 공학 분야에 다양하게 활용할 수 있다.

이하에서는, 특히 본 발명의 여러 측면 및 구현예에 따른 공동 배양 세포 포함 섬유를 형성하는 단계에 관하여 설명한다.

1) 세포들을 히드로겔 재료인 알지네이트 용액 안에 혼합시켜 마이크로 유체 칩 안으로 주입한다.

2) 유체 칩 안으로 주입된 알지네이트 및 세포들을 마이크로 칩에 내장된 마이크로 밸브를 이용하여 제어한다. 이 과정에서 길이방향 및 지름방향으로 코딩될 세포들의 영역을 디자인하여 수행한다.

3) 제어된 세포 및 알지네이트 용액은 동축 채널의 CaCl₂ 용액에 의해 고형화한다. 또한 세포들은 이 과정에서 고형화된 알지네이트 히드로겔 안에서 고정화한다.

4) 유량을 조절하여 마이크로 섬유 내 세포 분포 범위를 조절할 수 있으며 혼합된 샘플 재료를 사용하여 세포의 종류에 따라 적합한 환경을 조정할 수 있다.

이에 따라 다음과 같은 단계를 수행함으로써, 본 발명의 일 구현예에 따른 공동 배양 세포 포함 섬유를 형성하였다.

1) 도 17a에 나타낸 것과 같이 섬유세포(fibroblast)와 쥐에서 고정시킨 간세포(hepatocyte)를 마이크로 섬유 내 원하는 위치에 고정하였다. 섬유세포는 일정하게 성장인자를 분비하고 이를 통해 간세포는 생존율과 세포 기능 발휘 능력을 높일 수 있다.

2) 도 17b에 나타낸 것과 같이 간세포 주위에 섬유세포를 밀접시킴으로써 간세포 기능이 올라간 생체 조직으로 제작하였다.

3)　도 17c는 간세포만으로 구성된 섬유 조직과 간세포와 섬유세포가 동시에 삽입된 섬유 조직의 생존율을 조사한 그래프이다. 5일 동안 배양시킨 결과 2개의 세포가 배열된 섬유의 생존율이 단일 세포로 구성된 섬유 조직보다 생존율보다 2배 이상 높은 것을 확인하였다.

Claims

2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고,
상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고;
상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역으로 구성되며;
상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역과 제2 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 2개의 영역으로 나뉘고;
상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포를 포함하지 않는 영역이며;
상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고;
상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역, (a-3) 상기 제2 영역과 인접한 제3 영역으로 구성되며;
상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 3개의 영역으로 나뉘고;
상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제3 영역은 제3 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포를 포함하지 않는 영역이며;
상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포는 서로 상이한 종류의 세포이며; 상기 제1 세포와 상기 제3 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고;
상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역, (a-3) 상기 제2 영역과 인접한 제3 영역, (a-4) 상기 제3 영역과 인접한 제4 영역으로 구성되며;
상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 4개의 영역으로 나뉘고;
상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포 및 제3 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제3 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제3 영역은 제3 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제4 영역은 제4 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며;
상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포는 서로 상이한 종류의 세포이며, 상기 제3 세포와 상기 제4 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고; 상기 제1 세포와 상기 제3 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포이며, 상기 제2 세포와 상기 제4 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고;
상기 섬유의 길이 방향으로 다른 일부분은 (b) 세포의 단일 배양 영역이며;
상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역이고;
상기 단일 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포 중 어느 한 종류의 세포만 배양되는 영역이며;
상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있거나 또는 서로 간극을 두고 떨어져 있고;
상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있는 경우에 상기 간극 부분은 세포를 포함하지 않는 섬유 구간인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고;
상기 섬유의 길이 방향으로 다른 일부분은 (b) 세포의 단일 배양 영역이며;
상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있거나 또는 서로 간극을 두고 떨어져 있고;
상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있는 경우에 상기 간극 부분은 세포를 포함하지 않는 섬유 구간이며;
상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역이고;
상기 단일 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포 중 어느 한 종류의 세포만 배양되는 영역이며;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고;
상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역으로 구성되며;
상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역과 제2 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 2개의 영역으로 나뉘고;
상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포를 포함하지 않는 영역이며;
상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고;
상기 섬유의 길이 방향으로 다른 일부분은 (b) 세포의 단일 배양 영역이며;
상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있거나 또는 서로 간극을 두고 떨어져 있고;
상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있는 경우에 상기 간극 부분은 세포를 포함하지 않는 섬유 구간이며;
상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역이고;
상기 단일 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포 중 어느 한 종류의 세포만 배양되는 영역이며;
상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역, (a-3) 상기 제2 영역과 인접한 제3 영역으로 구성되며;
상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 3개의 영역으로 나뉘고;
상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제3 영역은 제3 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포를 포함하지 않는 영역이며;
상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포는 서로 상이한 종류의 세포이며, 상기 제1 세포와 상기 제3 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
2종 이상의 세포가 공동 배양된 세포를 포함하는 섬유로서;
상기 섬유의 길이 방향으로 최소한 일부분은 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역이고;
상기 섬유의 길이 방향으로 다른 일부분은 (b) 세포의 단일 배양 영역이며;
상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역은 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 인접해 있거나 또는 서로 간극을 두고 떨어져 있고;
상기 (a) 공동 배양 영역 및 상기 (b) 단일 배양 영역이 상기 섬유의 길이 방향으로 서로 간극을 두고 떨어져 있는 경우에 상기 간극 부분은 세포를 포함하지 않는 섬유 구간이며;
상기 공동 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포가 각각 배양되는 영역이 서로 인접해 있는 영역이고;
상기 단일 배양 영역은 길이 방향과 수직하게 섬유를 절단하고 그 단면을 보았을 때 상기 2종 이상의 세포 중 어느 한 종류의 세포만 배양되는 영역이며;
상기 (a) 2종 이상 세포의 공동 배양 영역은 (a-1) 제1 영역, (a-2) 상기 제1 영역과 인접한 제2 영역, (a-3) 상기 제2 영역과 인접한 제3 영역, (a-4) 상기 제3 영역과 인접한 제4 영역으로 구성되며;
상기 공동 배양 영역에서 상기 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역은 상기 섬유의 길이 방향의 중심축과 평행하게 상기 섬유의 상기 공동 배양 영역에서 4개의 영역으로 나뉘고;
상기 제1 영역은 제1 세포를 포함하고, 제2 세포 및 제3 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제2 영역은 제2 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제3 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제3 영역은 제3 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포 및 제4 세포를 포함하지 않는 영역이며; 상기 제4 영역은 제4 세포를 포함하고, 제1 세포 및 제2 세포 및 제3 세포를 포함하지 않는 영역이며;
상기 제1 세포와 상기 제2 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포는 서로 상이한 종류의 세포이며, 상기 제3 세포와 상기 제4 세포는 서로 상이한 종류의 세포이고; 상기 제1 세포와 상기 제3 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포이며, 상기 제2 세포와 상기 제4 세포는 서로 동일하거나 상이한 종류의 세포인 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
제3항, 제4항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서;
상기 제1 세포는 섬유세포, 지방세포, 내피세포, 외피세포, 상피세포 중에서 선택되고;
상기 제2 세포 또는 상기 제3 세포는 각각 독립적으로 간세포, 신경세포, 줄기세포, 이자 세포 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공동 배양 세포 포함 섬유.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 공동 배양 세포 포함 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 이식용 키트.