CN101949846B - 一种无色孔雀石绿的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测水产品中无色孔雀石绿的方法，它是在弱酸性的HAc-NaAc缓冲液中加入阴离子、无色孔雀石绿，摇匀，再加入两性表面活性剂，定容，避光放置一段时间，得已知浓度的被测体系，然后用荧光光度计在激发波长等于发射波长，400-600nm范围内进行同步扫描，测得体系的光散射强度I和试剂空白I0，计算ΔI＝I-I0的值，求出被测物的ΔI，再根据工作曲线计算出某未知被测物的无色孔雀石绿。这种方法试剂廉价、易得，反应条件温和，操作简单，设备简单，灵敏度高，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及无色孔雀石绿的检测方法，特别是一种检测无色孔雀石绿的共振瑞利散射法。
背景技术
孔雀石绿(Malachite green，MG)，化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式C23H25ClN2，属三苯甲烷类染料，易溶于水、乙醇、甲醇、乙腈，溶液呈蓝绿色，是一种生物染色剂，也被用作水产动物的抗菌剂和保鲜剂。无色孔雀石绿(Leμcomalachite green，LMG)，化学名为是N，N-二甲基苯胺，分子式C23H26N2，其是孔雀石绿在水产动物体内经还原的代谢产物。经科研表明，孔雀石绿和无色孔雀石绿均具有高毒素、高残留、高致癌、高致畸和致突变的危害，但由于无色孔雀石绿在体内的代谢周期更长，危害更严重。一些国家如美国、英国、日本、中国已宣布禁止在经济鱼类(观赏鱼除外)的养殖过程中使用孔雀石绿。
目前，国内外已建立的测定无色孔雀石绿的方法有高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱联用法。近些年，又出现了一些检测方法，相关专利文献有水体及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留的快速检测方法和该方法所用的检测盒(专利申请号200810025045.9)，该专利涉及的是一种半定量方法且检测灵敏度低，而其他涉及无色孔雀石绿检测方法都是酶联免疫方法。所述这些检测方法中有些较复杂，仪器昂贵，前处理要求高、耗时长；有些虽操作简便，但灵敏度低，测量有误差。
发明内容
本发明的目的是提供一种无色孔雀石绿的检测方法，它具有简便快速、灵敏度高的特点。
本发明是通过下述技术方案来实现：
①制备已知无色孔雀石绿浓度的测试体系，移取HAc-NaAc缓冲液于试管中，再在试管中加入阴离子和已知各浓度的无色孔雀石绿，摇匀，再加入两性离子表面活性剂，用乙腈定容，避光放置；
②依照步骤①的方法制备未加入无色孔雀石绿的试剂空白体系；
③用荧光光度计在激发波长等于发射波长下进行同步扫描，得到步骤①和②体系的共振瑞利散射光谱，测定样品散射强度I和空白散射强度I0，计算ΔI＝I-I0的值；
④根据ΔI对应无色孔雀石绿的浓度关系做标准曲线；
⑤依照步骤①的方法制备检测体系，其中加入的无色孔雀石绿为含有无色孔雀石绿但浓度未知的被测物，求出被测物的ΔI值；
⑥依据④的标准曲线，计算出被测物相应ΔI值对应所含的无色孔雀石绿浓度。
在上述步骤①中，所述HAc-NaAc缓冲液的pH值为3.5～5.0，体积为0.5～2.0mL；所述阴离子可以是I3 -、ClO3 -、BrO3 -、IO3 -、S2O3 2-、PO4 3-中任意一种，均由相应的钠盐或钾盐配制，浓度为1.0×10-3mol/L，体积为0.05～1.5mL；所述两性离子表面活性剂可以是椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油基二甲基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱中任意一种，浓度为10mg/L，体积为0.1～1.5mL；所述的无色孔雀石绿浓度为100μg/L，体积为0.05～2.0mL；
在上述步骤③中，所述的激发波长或发射波长为400～600nm范围内。
在上述步骤①中，制备已知无色孔雀石绿浓度的测试体系完毕后应在试管避光放置5～20min。
在用荧光光度计进行同步扫描时，选择474nm、484nm、494nm中任一波长测定体系的光散射强度。
本发明的原理是：
共振瑞利散射(RRS)是瑞利散射位于散射分子吸收带时，由于电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量发生的再次散射，其散射强度比单纯的瑞利散射提高了几个数量级。
利用共振瑞利散射原理，即在弱酸性介质中，无色孔雀石绿以阳离子形态存在，与阴离子发生缔合形成离子缔合物，从而导致体系中电子产生共振，体系共振瑞利散射强度显著增强，同时在两性表面活性剂的作用下形成稳定的胶束体系，检测灵敏度得到显著提高。无色孔雀石绿在一定的浓度范围内分别与体系的共振瑞利散射强度呈线性相关。据此建立了一种灵敏度高、简便快速测定无色孔雀石绿的方法。
主要反应如下：
C23H26N2+H+→(C23H27N2)+ (1)
其中，R--代表阴离子，S-代表两性表面活性剂。
本发明的优点在于：
(1)反应在室温下就能进行，反应条件温和，反应时间短，适宜推广；
(2)设备简单、操作简便；
(3)试剂易得、价廉；
(4)灵敏度高、结果准确、应用价值高。
具体实施方式
下面的实施例描述了在HAc-NaAc缓冲液中，有两性离子表面活性剂存在时，无色孔雀石绿与阴离子结合形成(C23H25N2R)n缔合纳米粒子，导致体系共振光增强。据此，建立测定无色孔雀石绿的新方法。其主要反应如前所述。
实施例1：
(1)用微量取样器移取0.1mLpH值为3.5的HAc-NaAc缓冲液于10mL试管中，在试管的溶液中依次加入1.5mL浓度为1.0×10-3mol/L的I3 -溶液和已知不同浓度的无色孔雀石绿0.1mL，摇匀，再加入浓度为10mg/L的椰油酰胺丙基甜菜碱(CAB-35)0.1mL，用乙腈定容至10mL，避光放置5min，得被测体系；
(2)依照步骤(1)的方法制备试剂空白体系，不加入无色孔雀石绿；
(3)将上述制得的测定体系用荧光分光光度计，在激发波长等于发射波长，400～600nm范围内同步扫描，得体系共振瑞利散射光谱，在474nm波长处测定体系的光散射强度I和I0，计算ΔI＝I-I0的值；
(4)根据ΔI对无色孔雀石绿的浓度关系做工作曲线为；I＝3.7221C+23.097R2＝0.9992，其中C-无色孔雀石绿的浓度，单位是μg/L，线性范围是0.5～20μg/L，R-相关系数；
(5)按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是含有无色孔雀石绿但浓度未知的被测物，按照步骤(3)测得某被测物的ΔI值为29.211；
(6)根据步骤(4)的工作曲线，计算得被测物所含无色孔雀石绿浓度为1.643μg/L。
实施例2：
(1)用微量取样器移取1.0mLpH值为4.0的HAc-NaAc缓冲液于10mL试管中，在试管的溶液中依次加入1.5mL浓度为1.0×10-3mol/L的ClO3 -溶液和已知不同浓度的无色孔雀石绿0.1mL，摇匀，再加入浓度为10mg/L的椰油基二甲基甜菜碱(BS-12)0.5mL，用乙腈定容至10mL，避光放置10min，得被测体系；
(2)依照步骤(1)的方法制备试剂空白体系，不加入无色孔雀石绿；
(3)将上述制得的测定体系用荧光分光光度计，在激发波长等于发射波长，400～600nm范围内同步扫描，得体系共振瑞利散射光谱，选择484nm波长处测定体系的光散射强度I和I0，计算ΔI＝I-I0的值；
(4)根据ΔI对无色孔雀石绿的浓度关系做工作曲线为；I＝3.8742C+18.043 R2＝0.9992，C-无色孔雀石绿的浓度，单位是μg/L，线性范围是0.5～20μg/L，R-相关系数；
(5)按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是含有无色孔雀石绿但浓度未知的被测物，按照步骤(3)测得某被测物的ΔI值为24.389；
(6)根据步骤(4)的工作曲线，计算得被测物所含无色孔雀石绿浓度为1.638μg/L。
实施例3：
(1)用微量取样器移取1.5mLpH值为4.5的HAc-NaAc缓冲液于10mL试管中，在试管的溶液中依次加入0.5mL浓度为1.0×10-3mol/L的PO4 3-溶液和已知不同浓度的无色孔雀石绿0.1mL，摇匀，再加入浓度为10mg/L的月桂酰胺丙基甜菜碱(LAB-30)1.0mL，用乙腈定容至10mL，避光放置15min，得被测体系；
(2)依照步骤(1)的方法制备试剂空白体系，不加入无色孔雀石绿；
(3)将上述制得的测定体系用荧光分光光度计，以激发波长等于发射波长，400～600nm范围内同步扫描，得体系共振瑞利散射光谱，选择494nm波长处测定体系的光散射强度I和I0，计算ΔI＝I-I0的值；
(4)根据ΔI对无色孔雀石绿的浓度关系做工作曲线为；I＝3.5772C+17.39R2＝0.9996，C-无色孔雀石绿的浓度，单位是μg/L，线性范围是0.5～20μg/L，R-相关系数；
(5)按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是含有无色孔雀石绿但浓度未知的被测物，按照步骤(3)测得某被测物的ΔI值为23.307；
(6)根据步骤(4)的工作曲线，计算得被测物所含无色孔雀石绿浓度为1.654μg/L。
具体实施例4：
(1)用微量取样器移取2.0mLpH值为5.0的HAc-NaAc缓冲液于10mL试管中，在试管的溶液中依次加入1.0mL浓度为1.0×10-3mol/L的S2O3 2-溶液和已知不同浓度的无色孔雀石绿0.1mL，摇匀，再加入浓度为10mg/L的月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱(LHSB)1.5mL，用乙腈定容至10mL，避光放置20min，得被测体系；
(2)依照步骤(1)的方法制备试剂空白体系，不加入无色孔雀石绿；
(3)将上述制得的测定体系用荧光分光光度计，以激发波长等于发射波长，400～600nm范围内同步扫描，得体系共振瑞利散射光谱，选择474nm波长处测定体系的光散射强度I和I0，计算ΔI＝I-I0的值；
(4)根据ΔI对无色孔雀石绿的浓度关系做工作曲线为；I＝3.9955C+18.718R2＝0.9990，C-无色孔雀石绿的浓度，单位是μg/L，线性范围是0.5～20μg/L，R-相关系数；
(5)按步骤(1)的方法制备检测体系，其中加入的是含有无色孔雀石绿但浓度未知的被测物，按照步骤(3)测得某被测物的ΔI值为24.666；
(6)根据步骤(4)的工作曲线，计算得被测物所含无色孔雀石绿浓度为1.489μg/L。
Claims (4)
1.一种无色孔雀石绿的检测方法，其特征是包括如下步骤：
①制备已知无色孔雀石绿浓度的测试体系，移取HAc-NaAc缓冲液于试管中，再在试管中加入阴离子和已知各浓度的无色孔雀石绿，摇匀，再加入两性离子表面活性剂，用乙腈定容，避光放置；
②依照步骤①的方法制备未加入无色孔雀石绿的试剂空白体系；
③用荧光光度计在激发波长等于发射波长下进行同步扫描，得到步骤①和②体系的共振瑞利散射光谱，测定样品散射强度I和空白散射强度I0，计算△I=I－I0的值；
④根据△I对应无色孔雀石绿的浓度关系做标准曲线；
⑤依照步骤①的方法制备检测体系，其中加入的无色孔雀石绿为含有无色孔雀石绿但浓度未知的被测物，求出被测物的△I值；
⑥依据④的标准曲线，计算出被测物相应△I值对应所含的无色孔雀石绿浓度。
2.根据权利要求1所述的无色孔雀石绿的检测方法，其特征是：
在步骤①中，所述HAc-NaAc缓冲液的pH值为3.5～5.0，体积为0.5～2.0mL；所述阴离子是I3 -、ClO3 -、BrO3 -、IO3 -、S2O3 2-、PO4 3-中任意一种，均由相应的钠盐或钾盐配制，浓度为1.0×10-3mol/L，体积为0.05～1.5mL；所述两性离子表面活性剂是椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油基二甲基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱中任意一种，浓度为10mg/L，体积为0.1～1.5mL；所述的无色孔雀石绿浓度为100μg/L，体积为0.05～2.0mL；
在步骤③中，所述的激发波长或发射波长为400～600nm范围内。
3.根据权利要求2所述的无色孔雀石绿的检测方法，其特征是：制备已知无色孔雀石绿浓度的测试体系完毕后应在试管避光放置5～20min。
4.根据权利要求2所述的无色孔雀石绿的检测方法，其特征是：在用荧光光度计进行同步扫描时，选择474nm、484nm、494nm中任一波长测定体系的光散射强度。
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| US5949077A (en) * | 1992-08-10 | 1999-09-07 | Alfano; Robert R. | Technique for imaging an object in or behind a scattering medium |
| JP2007171213A (ja) * | 2007-02-19 | 2007-07-05 | Hamamatsu Photonics Kk | 蛍光免疫測定方法 |
| CN101358963A (zh) * | 2007-08-01 | 2009-02-04 | 中国计量学院 | 一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法 |
| CN101482559A (zh) * | 2009-02-12 | 2009-07-15 | 四川大学 | 测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法 |
-
2010
- 2010-08-11 CN CN201010250779.4A patent/CN101949846B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| I3-共振瑞利散射法测定孔雀石绿及相关效应分析;范翔等;《分析化学》;20070831;第35卷(第8期);第1207－1210页 * |
| 共振瑞利散射法测定孔雀石绿;范翔等;《中国卫生检验杂志》;20061031;第16卷(第10期);第1158－1159页 * |
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| 范翔等.共振瑞利散射法测定孔雀石绿.《中国卫生检验杂志》.2006,第16卷(第10期),第1158－1159页. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101949846A (zh) | 2011-01-19 |
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