CN107421938B - 一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，包括用APTS与有机染料ROX进行偶联，在碱性条件下与TEOS水解合成表面功能化修饰氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子，在刻蚀的硅片上制备出SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。本发明的制备过程包括如下三个步骤：首先是在乙醇体系中制备ROX‑APTS前驱体，然后，运用溶胶‑凝胶法将氨丙基和ROX染料功能化修饰到SiO2纳米粒子表面，最后，将SiO2@ROX纳米粒子荧光探针滴加到在刻蚀微洞的硅片上，抹去表面多余的粒子，制备出比表面积大、识别位点多、敏感性强的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列选择性识别和痕量检测目标分析物孔雀石绿。

Description

一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备 方法
技术领域
本发明涉及材料科学领域，特别涉及具有对痕量孔雀石绿检测的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法。。
背景技术
孔雀石绿（malachite green，MG）在生物体内快速代谢产生脂溶性隐色孔雀石绿，具有难分解、高毒性、高残留、高致癌、高致畸和致突变等危害，目前已被许多国家列为水产养殖禁用药。因此，对超痕量三苯甲烷类化合物的检测和相关荧光探针阵列的研究已经引起了社会研究机构广泛的关注和富有成效的探索。孔雀石绿等三苯甲烷物质的实验室检测已经通过酶联免疫法、液相色谱法、高效液相色谱法、薄层层析法等被广泛的应用。这些传统分析技术能够满足选择性、可靠性、准确性和可重复性等分析中的基本要求，但其成本高昂、耗时长、步骤繁琐，且检测样品必须脱离检测现场送往实验室分析，不能够实时实地进行检测。综上所述，有必要寻求一种能够快速便捷检测孔雀石绿的方法。因此，为了解决孔雀石绿的检测问题，迫切需要一种能够对环境中孔雀石绿目标分析物提供高选择性、高灵敏、快速响应、低成本和原位检测的荧光探针。
近年来，对孔雀石绿类化合物检测的方法层出不穷，例如吴青科研小组（CN201310350236.3）提供了一种孔雀石绿ELISA检测试剂盒以及孔雀石绿的检测方法。该检测试剂盒包括：SPG蛋白、包被缓冲液、封闭液、孔雀石绿抗体、偶联有HRP的孔雀石绿、显色剂和终止剂。该检测方法包括：将SPG蛋白与包被缓冲液混合并在固相载体上孵育；向该固相载体上加入封闭液并孵育；向该固相载体上加入孔雀石绿抗体并孵育；向该固相载体上加入待测样品，同时加入偶联有HRP的孔雀石绿；向该固相载体上先后加入显色剂和终止剂。该试剂盒成本低、灵敏度高以及样品通量较高，因此，可用作食品及环境中孔雀石绿的监测，尤其适合于现场监控及大样品检测。
这类酶联免疫检测法有许多优点，但是也存在不足之处。检测过程中出现的颜色反应需要依靠人眼判断，存在主观性且存在假阳性问题，易使结果产生误差。
上海海洋大学黄轶群科研小组（CN201210179713）也公开的一种孔雀石绿的检测方法，其特征是将孔雀石绿标准溶液滴加到纳米金颗粒修饰的具有表面活性的拉曼基底上，待溶剂蒸干后，使用激光波长为633nm的共聚焦显微拉曼光谱仪采集孔雀石绿表面增强拉曼光谱，该孔雀石绿表面增强拉曼光谱具有1610，1360，1170，798，913，432cm-1处特征峰。该检测方法的应用，是用以检测水体中的孔雀石绿或隐性孔雀石绿残留量，其结合纳米金颗粒修饰的SERS活性基底和SERS技术，可应用于检测水产品的渔药残留孔雀石绿和隐性孔雀石绿中。但该法成本较高，无法广泛使用，不能实时实地进行检测。
因此，对目标分析物具有高灵敏响应的理想材料——荧光分子开始进入众研究者眼帘。在应用方面，荧光分子是对目标分析物的高灵敏响应理想材料。在各种信号传感器中，基于荧光“关”或荧光“开”机理的光学可寻址传感器已经被证明是研究者在许多挑战环境中所期盼的对各种小分子目标分析物检测的方法，由于该检测方法的高信号输出和可靠的检测结果。荧光“关”机理的化学传感器对三苯甲烷类化合物用荧光方法检测是极其有利的。拥有缺电子的孔雀石绿是一个电子的接受体，这样就显示出对富电子的荧光材料表面拥有很高的亲和力。这种光致发光是在电子受体和给体之间通过电子转移π复合物机理直接淬灭的，这种淬灭主要依赖于孔雀石绿的接受电子能力。近来，Arduimi M（Langmuir，2007，23:8623-8636）等制备了掺杂有荧光染料并在表面进行硫醇基官能化的二氧化硅纳米粒子荧光探针，并验证此荧光探针是Pb2+离子的有效荧光化学传感器。通过在荧光探针上修饰巯基提供分析物结合位点，Pb2+离子一旦结合到颗粒表面，与掺杂的染料产生荧光淬灭，可以以良好的选择性检测1μM金属离子浓度。
近来，包裹荧光染料的二氧化硅纳米粒子荧光探针在检测方面取得了不少进展。Carrie L. John等人已经开发了靶诱导的二氧化硅纳米离子荧光探针，该荧光探针结合了荧光化合物的优点和纳米材料的小尺寸，用于鉴定、富集和检测痕量的Zn2+。作为目标分析物，Zn2+会改变纳米颗粒的荧光特性，并有效地“打开”荧光信号，不需要分离步骤来确认或量化结合过程（Analyst，2013，138:4950-4957）。此外，樊晶光等人用惰性基体纳米微球包埋荧光染料，将荧光纳米微球转运进细胞，改进了活细胞内游离钙离子浓度的测定方法。该方法与传统方法相比，染料不易泄漏，不会出现分室现象，不易光漂白，是一种非常有实用价值的测量活细胞内游离钙离子浓度的方法（科技通报，2003，19:282-284）。近几年，有许多研究专注硅荧光探针在医学中的光能疗法上的应用，Prasad等人将能够进行能量传递的有机改性的硅纳米粒子应用于双光子光能疗法中。在该实验中，双光子荧光染料的纳米聚合物被包覆在纳米粒子里面作为能量供体，光敏化的光能疗法药物HPPH光敏剂作为能量受体，两者都被包覆进硅纳米粒子内部。在肿瘤细胞的胞内环境中，硅纳米聚合物通过FRET作用间接激发光敏剂，激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡（J. Am. Chem. Soc. 2007，129:2669-2675）。
二氧化硅纳米粒子的量子尺寸、量子隧道效应和它的特殊光、电特性、高磁阻现象，以及高温下仍具有的高强、高韧、稳定性好等特性，使纳米二氧化硅可广泛应用于许多领域。由于二氧化硅纳米粒子具有优良的稳定性、生物兼容性以及水溶性，其在传感器领域也有很大的应用空间和前景。例如将灵敏度高的荧光分析方法与纳米技术相结合，为pH的检测开辟了一条新的途径。将对pH敏感的荧光纳米粒子制备成对pH有响应的纳米生物探针，在单细胞水平上测量pH的变化。另外，二氧化硅纳米粒子的低毒性和良好的兼容性，可应用于生物工程，作为酶等药物的载体，应用于药物控释放。而且二氧化硅表面含有大量的羟基，方便于化学修饰，与不同的生物大分子相连，可用于生化检测。
近年来，由于纳米荧光探针优良的性能，以纳米荧光探针为研究对象吸引了大批研究者的兴趣。2015年黄健等人公开了发明专利（CN201510888019）“一种改进Stöber法制备TiO2/SiO2气凝胶微球法的方法”。改进的溶胶-凝胶法在常压下进行，条件温和，反应温度低于80℃，设备要求不高，能降低生产成本，提高生产安全性。但是该方法制备的TiO2/SiO2气凝胶微球阻水性差、成型难度大，因此目前对其研究进展比较缓慢。2016年李鹿等人公开了发明专利（CN201611195709.7）“FITC-SiO2/PAA空心纳米粒子及其在潜指纹显现中的应用”。本发明公开了荧光二氧化硅纳/聚丙烯酸空心纳米粒子FITC-SiO2/PAA制备方法，它是采用一步PAA-NH4模版法制备的，既缩短了反应步骤又保证了粒子的高分散性；其吸附能力强、荧光强度高，可以显现各种质地表面（玻璃片、实验台面、刀具及杂志表面）的潜指纹，但是这种制备方法对技术要求较高，不利于普遍推广。2016年王耀斌等人公开了发明专利（CN201611068050）“滴落法制备毫米级疏水性SiO2气凝胶球的方法”。该发明主要阐述了一种制备毫米级疏水性SiO2气凝胶珠粒的方法，特别涉及通过滴加方法制备毫米级疏水性SiO2气凝胶珠粒的方法。但是制备过程中SiO2气凝胶尺寸大小不易控制，在实际应用中存在回收问题。
虽然上述方法有许多优点，但是未见文献报道制备出发射光谱带为红色荧光探针和其表面进行后功能化修饰，所以没有携带专识性的识别基团。同时未见文献报道在荧光探针表面修饰氨丙基对孔雀石绿痕量检测的报道。因此，合成拥有高选择性和高灵敏性的发射光谱带为红色荧光探针的SiO2@ROX纳米粒子的制备方法，实现对超痕量孔雀石绿分子识别和检测有其必要性。
在本发明中，我们报道了基于荧光共振能量转移原理在表面富含氨基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针，实现对痕量孔雀石绿的检测。SiO2@ROX是尤其适合作为纳米粒子荧光探针，因为SiO2@ROX纳米粒子荧光探针光学透明和光子物理惰性以及其表面能够很容易通过与硅烷化试剂缩合反应而修饰上新组装功能的亚单元。SiO2@ROX表面修饰的氨丙基能够与孔雀石绿目标分子通过形成电荷转移复合物，由于存在电子离域，这种电荷转移复合物在600-620nm波长范围类显示了一个很强的可见吸收峰。这一结果的发现，激发我们在SiO2@ROX表面通过共价偶联3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl triethoxysilane，APTS）来探索基于荧光共振能量转移化学传感器对孔雀石绿目标分子高选择性、高灵敏的检测。当选择一个合适荧光材料其拥有的荧光发射光谱与APTS-MG复合物的紫外-可见的吸收光谱相重合，当它们空间相互接近时，荧光材料的荧光通过共振能量转移将会被APTS-MG复合物所吸收，导致荧光探针的荧光强度下降，因此，SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的光致发光将会被有效的淬灭。由于在SiO2@ROX表面有许多的对孔雀石绿结合敏感性很强的氨丙基亚单元，所以可以选择性的对环境中孔雀石绿目标分子形成快速的响应。关于SiO2@ROX表面修饰上APTS，使其表面分别带有APTS残基的氨丙基。这种表面修饰了APTS的SiO2@ROX通过荧光共振能量转移在液相中能够检测到纳摩尔浓度级的目标分析物。这种对孔雀石绿分子具有专识性作用的SiO2@ROX纳米粒子，以荧光作为探针、氨丙基为识别位点显现出对孔雀石绿高选择性、高灵敏和痕量的检测。
发明内容
发明目的：针对目前现有技术存在的不足之处，本发明利用二氧化硅微球作为基质，在其表面修饰上ROX染料及氨丙基，合成了一种带有氨丙基且能对痕量孔雀石绿检测的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，并将SiO2纳米粒子表面进行功能化修饰用于对痕量孔雀石绿分子识别与检测。所述方法为化学合成法，首先是在乙醇体系中制备ROX-APTS前驱体，然后，运用溶胶-凝胶法合成表面修饰有氨丙基和ROX染料的SiO2纳米粒子，制备出对孔雀石绿识别和检测作用的SiO2@ROX荧光产物，形成高选择性、高灵敏、带有分子识别和检测性能纳米结构荧光探针阵列。
本发明的技术方案是：一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，其特征在于：所述SiO2@ROX纳米粒子表面拥有氨丙基，其表面的氨丙基可进一步与目标分子孔雀石绿作用，使其表面富电子的氨丙基作为电子供体同缺电子的孔雀石绿受体之间通过电荷转移作用形成蓝绿色的复合物，此蓝绿色复合物通过荧光共振能量转移可以吸收SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的发射光谱带为红色荧光，利用荧光强度的改变，实现对孔雀石绿的检测，所述SiO2@ROX荧光探针阵列的制备过程包括如下三个步骤：
第一步是ROX-APTS前驱体的制备：首先，分别准确量取10 mL ~ 12 mL无水乙醇，1mL ~ 3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl triethoxysilane，APTS），100 μL ~300 μL 5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯（5-Carboxy-X-rhodamine N-succinimidylester，ROX）置于50 mL单颈磨口烧瓶中，然后加入1 mL ~ 3 mL去离子水，将上述单颈磨口烧瓶在常温下遮光以600 rpm ~ 700 rpm搅拌10 h ~ 12 h，最后得到含有过量未反应APTS的ROX-APTS前驱体的溶液；
第二步是表面修饰ROX染料及氨丙基的SiO2纳米粒子荧光探针制备：首先，依次准确量取87.1 mL ~ 89.1 mL无水乙醇，2.6 mL ~ 4.6 mL正硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS），10.9 mL ~ 12.9 mL的氨水置于250mL单颈磨口烧瓶中，再加入2 mL ~ 4 mL去离子水，常温下将上述250 mL单颈磨口烧瓶用磁力搅拌器在N2氛围下搅拌10 h ~ 12 h，然后将上述制备的含有过量未反应的APTS的ROX-APTS前驱体的溶液加入到上述250 mL单颈磨口烧瓶中，继续用磁力搅拌器在N2氛围下遮光搅拌20 h ~ 24h，得到表面修饰了氨丙基和ROX染料的SiO2纳米粒子悬浮液，用无水乙醇超声清洗三次，最后将其分散在无水乙醇中，得到表面富含氨丙基和ROX染料的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针；
第三步是SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列制备：首先，采用光刻胶聚甲基丙烯酸乙酯均匀的涂抹在硅片上，在光掩膜下经过紫外灯曝光后，沉浸在显影液中显影，然后通过微加工技术和等离子蚀刻的方法，在硅片表面制作出微洞阵列，留在硅片表面的光掩膜用丙酮清洗去除，然后将上述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的悬浮液滴到硅片上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了纳米粒子荧光探针，用擦镜纸擦去上述硅片表面上的SiO2@ROX纳米粒子，留在微洞里的SiO2@ROX纳米粒子构成了荧光探针阵列，得到能够检测目标分析物的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。
作为对现有技术的进一步改进，所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针基质是二氧化硅；所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针粒径可控，可以通过调节TEOS、氨水和水的量来加以控制；所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针制备过程中用无水乙醇清洗三次，其目的是去除悬浮液中杂质和未反应的底物；所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针制备过程中正硅酸四乙酯发生水解反应，生成SiO2凝胶纳米粒子。
相对于现有技术的有益效果：近年来，由于纳米荧光探针优良的性能，以纳米荧光探针为研究对象吸引了大批研究者的兴趣。2015年黄健等人公开了发明专利（CN201510888019）“一种改进Stöber法制备TiO2/SiO2气凝胶微球法的方法”。改进的溶胶-凝胶法在常压下进行，条件温和，反应温度低于80℃，设备要求不高，能降低生产成本，提高生产安全性。但是该方法制备的TiO2/SiO2气凝胶微球阻水性差、成型难度大，因此目前对其研究进展比较缓慢。2016年李鹿等人公开了发明专利（CN201611195709.7）“FITC-SiO2/PAA空心纳米粒子及其在潜指纹显现中的应用”。本发明公开了荧光二氧化硅纳/聚丙烯酸空心纳米粒子FITC-SiO2/PAA制备方法，它是采用一步PAA-NH4模版法制备的，既缩短了反应步骤又保证了粒子的高分散性；其吸附能力强、荧光强度高，可以显现各种质地表面（玻璃片、实验台面、刀具及杂志表面）的潜指纹，但是这种制备方法对技术要求较高，不利于普遍推广。2016年王耀斌等人公开了发明专利（CN201611068050）“滴落法制备毫米级疏水性SiO2气凝胶球的方法”。该发明主要阐述了一种制备毫米级疏水性SiO2气凝胶珠粒的方法，特别涉及通过滴加方法制备毫米级疏水性SiO2气凝胶珠粒的方法。但是制备过程中SiO2气凝胶尺寸大小不易控制，在实际应用中存在回收问题。
虽然上述方法有许多优点，但是未见文献报道制备出发射光谱带为红色荧光探针和其表面进行后功能化修饰，所以没有携带专识性的识别基团。同时未见文献报道在荧光探针表面修饰氨丙基对孔雀石绿痕量检测的报道。因此，合成拥有高选择性和高灵敏性的发射光谱带为红色荧光探针的SiO2@ROX纳米粒子的制备方法，实现对超痕量孔雀石绿分子识别和检测有其必要性。
本发明首先是ROX-APTS前驱体的制备：分别准确量取11 mL无水乙醇，2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-amimopropyl triethoxysilane，APTS），200 μL 5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯（5-carboxy-X-rhodamine N-succinimidyl ester，ROX）置于50 mL单颈磨口烧瓶中，然后加入2 mL的去离子水，将上述单颈磨口烧瓶在常温下遮光以650 rpm搅拌12h，最后得到含有过量未反应APTS的ROX-APTS前驱体的溶液；
然后是表面修饰ROX染料及氨丙基的SiO2纳米粒子荧光探针制备：首先，依次准确量取88.1 mL无水乙醇，3.6 mL正硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS），11.9 mL的氨水置于250 mL单颈磨口烧瓶中，再加入3 mL去离子水，常温下将上述250 mL单颈磨口烧瓶用磁力搅拌器在N2氛围下搅拌11 h，然后将上述制备的含有过量未反应的APTS的ROX-APTS前驱体的溶液加入到上述250 mL单颈磨口烧瓶中，继续用磁力搅拌器在N2氛围下遮光搅拌23 h，得到表面修饰了氨丙基和ROX染料的SiO2纳米粒子悬浮液，用无水乙醇超声清洗三次，最后将其分散在无水乙醇中，得到表面富含氨丙基和ROX染料的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针；
最后是SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列制备：首先，采用光刻胶聚甲基丙烯酸乙酯均匀的涂抹在硅片上，在光掩膜下经过紫外灯曝光后，沉浸在显影液中显影，然后通过微加工技术和等离子蚀刻的方法，在硅片表面制作出微洞阵列，留在硅片表面的光掩膜用丙酮清洗去除，然后将上述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的悬浮液滴到硅片上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了纳米粒子荧光探针，用擦镜纸擦去上述硅片表面上的SiO2@ROX纳米粒子，留在微洞里的SiO2@ROX纳米粒子构成了荧光探针阵列，得到能够检测目标分析物的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。
综上所述，采用本发明的制备方法可以获得发射光谱带为红色的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。
其一：上述所制备的SiO2@ROX纳米粒子，既增大了荧光探针的比表面积，又增加了分子识别位点，提高了选择性、识别性和敏感性。
其二：表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针，能够对孔雀石绿分子选择性识别。当加入一定量的孔雀石绿目标分子后，SiO2@ROX二氧化硅表面的富电子氨丙基能够与缺电子孔雀石绿通过酸碱离子对作用形成蓝绿色的复合物，此蓝绿色复合物正好吸收ROX染料所发射的红色光谱带，从而导致荧光强度的下降，实现对孔雀石绿检测。合成表面富含氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针，同时也可以选择性用来检测其他三苯甲烷类物质，如结晶紫（crystal violet，CV）。可见，本发明所提供的方法是通用的，实用范围比较广泛。
其三：与传统的荧光染料相比较，表面修饰氨丙基的SiO2@ROX荧光探针具有较大的比表面积，拥有识别位点，提高对目标分子选择性识别，利用荧光共振能量转移原理，提高了对目标分析物的高敏感的检测。
其四：本发明所提供的方法中，SiO2@ROX粒径可控，可以通过调节TEOS、氨水和水的量来加以控制。
其五：选择在SiO2纳米粒子表面再修饰ROX染料及APTS的目的，因为其具有以下优点：（1）修饰ROX染料后的纳米粒子荧光寿命长;（2）容易合成二氧化硅溶胶和凝胶，相对成本较低，拥有较大的比表面积；（3）在反应过程中具有化学和热的稳定性，不与有机溶剂反应；（4）表面容易嫁接有机官能团；（5）对环境无害；（6）通过SiO2@ROX与孔雀石绿之间形成蓝绿色复合物，这种蓝绿色复合物与ROX染料的所发射的红色光谱带荧光之间在空间接近时发生了荧光共振能量转移，通过荧光强度的减弱，实现对目标分析物孔雀石绿的检测。
附图说明
图1是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列制备示意图。
图2是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针扫描电子显微镜图。
图3是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的FT-IR谱图。
图4是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针分散在无水乙醇溶液中归一化荧光发射光谱图（如a所示）和APTS-MG酸碱离子复合物归一化紫外-可见吸收光谱（如b所示）。图4中插图c表示的是SiO2@ROX纳米粒子荧光探针水溶液在365nm紫外灯照射下的图片，图4中插图d表示的是APTS-MG酸碱离子复合物在自然光下的照片。
图5是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针与孔雀石绿目标分子之间通过荧光共振能量转移原理实现对孔雀石绿高选择性、高灵敏检测示意图。
图6是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针分别对MG检测限的荧光强度变化图（A）和CV检测限的荧光强度变化图（B）。
图7是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针分别对不同浓度MG荧光光谱变化图（A）和CV荧光光谱变化图（C）及其分别所对应MG荧光淬灭常数图（B）和CV荧光淬灭常数图（D）。
图8本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列检测孔雀石绿图。
根据附图进一步解释具体实施方式
图1是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列制备示意图。在图1中第一步是ROX-APTS前驱体的制备：首先，分别准确量取无水乙醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷和5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯置于单颈磨口烧瓶中，然后加入去离子水，将上述单颈磨口烧瓶在常温下遮光搅拌，最后得到含有过量未反应APTS的ROX-APTS前驱体的溶液；第二步是表面修饰ROX染料及氨丙基的SiO2纳米粒子荧光探针制备：首先，依次准确量取无水乙醇，正硅酸四乙酯，氨水置于单颈磨口烧瓶中，再加入去离子水，常温下将上述单颈磨口烧瓶用磁力搅拌器在N2氛围下搅拌，然后将上述制备的含有过量未反应的APTS的ROX-APTS前驱体的溶液加入到上述单颈磨口烧瓶中，继续用磁力搅拌器在N2氛围下遮光搅拌，得到表面修饰了氨丙基和ROX染料的SiO2纳米粒子悬浮液，用无水乙醇超声清洗，最后将其分散在无水乙醇中，得到表面富含氨丙基和ROX染料的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针；最后是SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列制备：首先，采用光刻胶聚甲基丙烯酸乙酯均匀的涂抹在硅片上，在光掩膜下经过紫外灯曝光后，沉浸在显影液中显影，然后通过微加工技术和等离子蚀刻的方法，在硅片表面制作出微洞阵列，留在硅片表面的光掩膜用丙酮清洗去除，然后将上述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的悬浮液滴到硅片上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了纳米粒子荧光探针，用擦镜纸擦去上述硅片表面上的SiO2@ROX纳米粒子，留在微洞里的SiO2@ROX纳米粒子构成了荧光探针阵列，得到能够检测目标分析物的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。
图2是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针扫描电子显微镜图。本实验中采用溶胶凝胶法结合成SiO2@ROX，通过SEM图可以看到SiO2@ROX纳米粒子颗粒大小均匀，粒径在200nm-300nm之间。大部分纳米颗粒的球形度高，而且分散性较好。
图3是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的FT-IR谱图。图中1095cm-1附近处有强的吸收峰，对应于Si-O-Si的反对称伸缩振动，798cm-1处是Si-O的对称伸缩振动峰。在953cm-1处的吸收峰是由Si-OH的伸缩振动产生。3483cm-1附近出现较为尖锐且强度相当的双峰，是由-NH2对称和反对称伸缩振动产生的。由此可判断，所制备的荧光探针含有大量SiO2，并且纳米粒子表面成功修饰上氨丙基。
图4是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针分散在无水乙醇溶液中归一化荧光发射光谱图（如a所示）和APTS-MG酸碱离子复合物归一化紫外-可见吸收光谱（如b所示）。图4中插图c表示的是SiO2@ROX纳米粒子荧光探针水溶液在365nm紫外灯照射下的图片，图4中插图d表示的是APTS-MG酸碱离子复合物在自然光下的照片。作为电子的给体的富电子的APTS与作为电子供体的缺电子的MG，形成APTS-MG酸碱离子对，这种APTS-MG酸碱离子对在618nm处有最大的可见吸收峰，蓝绿色的酸碱离子对复合物的可见光谱吸收峰正好同发射光谱带红色的荧光探针的稳态荧光最大发射波长600nm谱图有很好的光谱重叠。根据荧光共振能量转移，当它们空间相互接近时，发生能量共振转移，发射光谱带红色的荧光SiO2@ROX的稳态荧光发射光正好被蓝绿色的APTS-MG酸碱离子对复合物所吸收，使得SiO2@ROX荧光强度的下降，实现了对孔雀石绿分子识别。
图5是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针与孔雀石绿目标分子之间通过荧光共振能量转移原理实现对孔雀石绿高选择性、高灵敏检测示意图。在孔雀石绿目标分子存在的条件下，SiO2@ROX荧光探针表面富电子的氨丙基作为电子对的给体与缺电子孔雀石绿目标分子作为电子对受体之间通过电荷转移作用形成绿色的酸碱离子对复合物，根据荧光共振能量转移，当它们空间相互接近时，发生能量共振转移，SiO2@ROX纳米粒子发射光谱带红色荧光正好能够被APTS-MG绿色酸碱离子对复合物所吸收，使得SiO2@ROX荧光强度发生改变，实现对孔雀石绿分子识别和检测。
图6是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针分别对MG检测限的荧光强度变化图（A）和CV检测限的荧光强度变化图（B）。图6（A）中表示的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针水溶液中自上而下随MG浓度从0，1×10-9mol·L-1、1×10-8mol·L-1、1×10-7mol·L-1、1×10-6mol·L-1和1×10-5mol·L-1荧光强度逐渐降低。图6（B）中表示的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针水溶液中自上而下随CV浓度从0，1×10-9mol·L-1、1×10-8mol·L-1、1×10-7mol·L-1、1×10-6mol·L-1和1×10-5mol·L-1荧光强度逐渐降低。从图中可以看出随着两种三苯甲烷类化合物浓度的不断增加，SiO2@ROX的荧光强度明显减弱，表明SiO2@ROX表面修饰的功能基团与目标分析物之间形成酸碱离子对，这说明三苯甲烷类化合物对制备的SiO2@ROX荧光探针具有荧光猝灭作用，且检测灵敏度达到1×10-9 mol·L-1，成功实现了对三苯甲烷类化合物的痕量检测。
图7是本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针分别对不同浓度MG荧光光谱变化图（A）和CV荧光光谱变化图（C）及其分别所对应MG荧光淬灭常数图（B）和CV荧光淬灭常数图（D）。图7（A）和（C）中可以看到随着目标分析物（MG、CV）浓度的自上而下随浓度从0，1×10-5mol·L-1、2×10-5mol·L-1、3×10-5mol·L-1、4×10-5mol·L-1、5×10- 5mol·L-1、6×10-5mol·L-1、7×10-5mol·L-1、8×10-5mol·L-1、9×10-5mol·L-1和10×10- 5mol·L-1不断增加，SiO2@ROX荧光探针的荧光强度逐渐减弱。用Stern-Volme方程探讨荧光淬灭效率，以孔雀石绿（MG）为例，它的Stern-Volme方程为：(I0/I)-1=Ksv·[MG]，I0、I分别为没有目标分析物和存在目标分析物的稳态荧光强度，Ksv为MG的淬灭常数，[MG]表示孔雀石绿的浓度。这种淬灭常数主要依赖于目标分子的溶液浓度，氨基对目标分子的亲和力和荧光淬灭机理。根据Stern-Volme方程分别求出MG和CV的淬灭常数分别为：12349 M-1，2850M-1，可以得到Ksv，[MG] > Ksv，[CV]，如图7（B）和（D）所示。可见，SiO2@ROX荧光探针表面的氨丙基对MG分子的捕获能力要比CV强的多，MG和CV的分子结构中均有吸电子氮阳离子，能够与富电子的氨丙基形成强烈的酸碱离子对绿色复合物，与荧光粉末分子空间接近时，形成共振能量转移，从而有效的淬灭荧光。然而，CV分子结构比MG分子结构多了一个N, N-二甲基，空间位阻增大，难以形成复合物，因此，对荧光的淬灭效率比MG要差很多。
图8本发明所述的表面修饰了氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列检测孔雀石绿图。在硅片微洞里的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列中滴加入浓度为10-9mol·L-1目标分析物，在共聚焦荧光显微镜下荧光探针在硅片微洞阵列中荧光强度下降。加入10-9mol·L-1孔雀石绿，SiO2@ROX表面的氨基与孔雀石绿形成复合物，吸收ROX染料所发射的荧光，致使SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列荧光强度下降，从而快捷和方便地实现对孔雀石绿分子识别和检测。
具体实施方式
一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，其特征在于：所述SiO2@ROX的荧光粒子表面拥有氨丙基，其表面的氨丙基可进一步与孔雀石绿目标分子作用，使其表面富电子的氨丙基作为电子供体同缺电子的孔雀石绿受体之间通过电荷转移作用形成蓝绿色的复合物，此蓝绿色复合物通过荧光共振能量转移可以吸收SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的红色荧光，利用荧光强度的改变，实现对孔雀石绿的检测，所述SiO2@ROX荧光探针的制备过程包括如下三个步骤：
第一步是ROX-APTS前驱体的制备：首先，分别准确量取10 mL ~ 12 mL无水乙醇，1mL ~ 3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl triethoxysilane，APTS），100 μL ~300 μL 5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯（5-Carboxy-X-rhodamine N-succinimidylester，ROX）置于50 mL单颈磨口烧瓶中，然后加入1 mL ~ 3 mL去离子水，将上述单颈磨口烧瓶在600 rpm ~ 700 rpm常温下遮光搅拌10 h ~ 12 h，最后得到含有过量未反应APTS的ROX-APTS前驱体的红色溶液；
第二步是表面修饰ROX染料及氨丙基的SiO2纳米粒子荧光探针制备：首先，依次准确量取87.1 mL ~ 89.1 mL无水乙醇，2.6 mL ~ 4.6 mL正硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS），10.9 mL ~ 12.9 mL的氨水置于250mL单颈磨口烧瓶中，再加入2 mL ~ 4 mL去离子水，常温下将上述250 mL单颈磨口烧瓶用磁力搅拌器在N2氛围下搅拌10 h ~ 12 h，然后将上述制备的含有过量未反应的APTS的ROX-APTS前驱体的红色溶液加入到上述250 mL单颈磨口烧瓶中，继续用磁力搅拌器在N2氛围下遮光搅拌20 h ~24 h，得到表面修饰了氨丙基和ROX染料的SiO2纳米粒子悬浮液，用无水乙醇超声清洗三次，最后将其分散在无水乙醇中，得到表面富含氨基和ROX染料且拥有对孔雀石绿具有选择性和敏感性检测的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针；
第三步是SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列制备：首先，采用光刻胶聚甲基丙烯酸乙酯均匀的涂抹在硅片上，在光掩膜下经过紫外灯曝光后，沉浸在显影液中显影，然后通过微加工技术和等离子蚀刻的方法，在硅片表面制作出微洞阵列，留在硅片表面的光掩膜用丙酮清洗去除，然后将上述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的悬浮液滴到硅片上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了荧光探针纳米粒子，得到能够检测目标分析物的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。
表面修饰氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列中滴加入目标分子，能够改变其识别性能。如加入孔雀石绿分子，SiO2@ROX表面的氨基与孔雀石绿形成复合物，吸收ROX染料所发射的荧光，致使SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列强度下降，从而实现对孔雀石绿分子识别和检测。
具体实施例
根据共价耦联反应，制备ROX-APTS偶合物作为前驱体，采用溶胶-凝胶反应可合成表面富含氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针，采用等离子刻蚀方法制备SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。
第一步是ROX-APTS前驱体的制备：首先，分别准确量取11 mL无水乙醇，2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl triethoxysilane，APTS），200 μL 5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯（5-Carboxy-X-rhodamine N-succinimidyl ester，ROX）置于50 mL单颈磨口烧瓶中，然后加入2 mL去离子水，将上述单颈磨口烧瓶在600 rpm ~ 700 rpm常温下遮光搅拌11 h，最后得到含有过量未反应APTS的ROX-APTS前驱体的红色溶液；
第二步是表面修饰ROX染料及氨丙基的SiO2纳米粒子荧光探针制备：首先，依次准确量取88.1 mL无水乙醇，3.6 mL正硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS），11.9mL的氨水置于250mL单颈磨口烧瓶中，再加入3 mL去离子水，常温下将上述250 mL单颈磨口烧瓶用磁力搅拌器在N2氛围下搅拌11 h，然后将上述制备的含有过量未反应的APTS的ROX-APTS前驱体的红色溶液加入到上述250 mL单颈磨口烧瓶中，继续用磁力搅拌器在N2氛围下遮光搅拌22 h，得到表面修饰了氨丙基和ROX染料的SiO2纳米粒子悬浮液，用无水乙醇超声清洗三次，最后将其分散在无水乙醇中，得到表面富含氨丙基和ROX染料且拥有对孔雀石绿具有选择性和敏感性检测的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针；
第三步是SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列制备：首先，采用光刻胶聚甲基丙烯酸乙酯均匀的涂抹在硅片上，在光掩膜下经过紫外灯曝光后，沉浸在显影液中显影，然后通过微加工技术和等离子蚀刻的方法，在硅片表面制作出微洞阵列，留在硅片表面的光掩膜用丙酮清洗去除，然后将上述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的悬浮液滴到硅片上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了荧光探针纳米粒子，得到能够检测目标分析物的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。
表面修饰氨丙基的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列中滴加入目标分子，能够改变其识别性能。如加入孔雀石绿分子，SiO2@ROX表面的氨基与孔雀石绿形成复合物，吸收ROX染料所发射的荧光，致使SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列强度下降，从而实现对孔雀石绿分子识别和检测。

Claims (5)

1.一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，其特征在于：所述SiO2@ROX纳米粒子表面拥有氨丙基，其表面的氨丙基可进一步与目标分子孔雀石绿作用，使其表面富电子的氨丙基作为电子供体同缺电子的孔雀石绿受体之间通过电荷转移作用形成蓝绿色的复合物，此蓝绿色复合物通过荧光共振能量转移可以吸收SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的发射光谱带为红色荧光，利用荧光强度的改变，实现对孔雀石绿的检测，所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备过程包括如下三个步骤：
1.1第一步是ROX-APTS前驱体的制备：首先，分别准确量取10 mL ~ 12 mL无水乙醇，1mL ~ 3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl triethoxysilane，APTS），100 μL ~300 μL 5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯（5-Carboxy-X-rhodamine N-succinimidylester，ROX）置于50 mL单颈磨口烧瓶中，然后加入1 mL ~ 3 mL去离子水，将上述单颈磨口烧瓶在常温下遮光以600 rpm ~ 700 rpm搅拌10 h ~ 12 h，最后得到含有过量未反应APTS的ROX-APTS前驱体的溶液；
1.2第二步是表面修饰ROX染料及氨丙基的SiO2纳米粒子荧光探针制备：首先，依次准确量取87.1 mL ~ 89.1 mL无水乙醇，2.6 mL ~ 4.6 mL正硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS），10.9 mL ~ 12.9 mL的氨水置于250mL单颈磨口烧瓶中，再加入2 mL ~ 4 mL去离子水，常温下将上述250 mL单颈磨口烧瓶用磁力搅拌器在N2氛围下搅拌10 h ~ 12 h，然后将上述制备的含有过量未反应的APTS的ROX-APTS前驱体的溶液加入到上述250 mL单颈磨口烧瓶中，继续用磁力搅拌器在N2氛围下遮光搅拌20 h ~ 24h，得到表面修饰了氨丙基和ROX染料的SiO2纳米粒子悬浮液，用无水乙醇超声清洗三次，最后将其分散在无水乙醇中，得到表面富含氨丙基和ROX染料的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针；
1.3第三步是SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列制备：首先，采用光刻胶聚甲基丙烯酸乙酯均匀的涂抹在硅片上，在光掩膜下经过紫外灯曝光后，沉浸在显影液中显影，然后通过微加工技术和等离子蚀刻的方法，在硅片表面制作出微洞阵列，留在硅片表面的光掩膜用丙酮清洗去除，然后将上述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针的悬浮液滴到硅片上，让其自然干燥，微洞里自发地填满了纳米粒子荧光探针，用擦镜纸擦去上述硅片表面上的SiO2@ROX纳米粒子，留在微洞里的SiO2@ROX纳米粒子构成了荧光探针阵列，得到能够检测目标分析物的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列。
2.根据权利要求1所述的一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，其特征是：所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针基质是二氧化硅。
3.根据权利要求1所述的一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，其特征是：所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针粒径可控，可以通过调节TEOS、氨水和水的量来加以控制。
4.根据权利要求1所述的一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，其特征是：所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针制备过程中用无水乙醇清洗三次，其目的是去除悬浮液中杂质和未反应的底物。
5.根据权利要求1所述的一种检测孔雀石绿的SiO2@ROX纳米粒子荧光探针阵列的制备方法，其特征是：所述SiO2@ROX纳米粒子荧光探针制备过程中正硅酸四乙酯发生水解反应，生成SiO2凝胶纳米粒子。
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